Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сывороточный уровень CD38 и CD50 антигенов при карциноме молочной железы

на правах рукописи

ВАРШАВСКАЯ Людмила Витальевна

Сывороточный уровень СВ38 и СВ50 антигенов при карциноме молочной железы

14.0036 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В. В. Новиков

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор А. К. Голенков,

доктор медицинских наук, профессор Р. С. Сахаров

Ведущая организация: Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН г. Москва.

Защита состоится «_»_2005 года в «_» часов на

заседании диссертационного совета К 208.046.01 при Московском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Автореферат разослан «___»_2004 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета; кандидат медицинских наук

Актуальность темы.

Важную роль в поддержании гомеостаза играет иммунная система. Физиологические основы сохранения внутреннего постоянства организма, в том числе и защита от неопластических процессов, базируются на эффективной и многосторонней работе молекулярных и клеточных механизмов иммунных реакций. Межклеточные контакты являются необходимым звеном реализации адекватного иммунного ответа как на инфекционные агенты, так и на злокачественно трансформированные клетки.

Молекулярной основой формирования межклеточных контактов являются белки адгезии. Если мембранные белки непосредственно участвуют в образовании межклеточных контактов, то их растворимые формы, появляющиеся в результате шеддинга или альтернативного сплайсинга мРНК, являются потенциальными иммунорегуляторными молекулами. Физиологическая роль ряда растворимых форм молекул адгезии при неопластических процессах во многом не исследована. Не изучена возможность участия растворимых форм мембранных антигенов СБ38 и СБ50 (1САМ-3) в регуляции иммунного ответа на такие широко распространенные солидные опухоли, как рак молочной железы, рак легкого, рак желудка. Не исследована возможная связь между сывороточным уровнем растворимых форм СБ38 антигена, СБ80 антигена и особенностями опухолевого процесса. Не установлены взаимоотношения между сывороточным содержанием данных белков и широко известных опухолевых маркеров: раково-эмбрионального антигена (РЭА) и раково-ассоциированного антигена МиС-1. Важным в практическом отношении является разработка новых подходов к прогнозированию течения неопластических процессов, основанных на изучении функциональной роли растворимых форм мембранных антигенов адгезии.

. Научный консультант: докт. мед. наук. А.В.Алясова

Цель: изучить роль растворимых форм мембранных антигенов СБ38 и СБ50 в механизмах регуляции противоопухолевого иммунитета.

Задачи:

1. Определить сывороточный уровень растворимых 0038 и 0050 антигенов при неопластических процессах на примере рака молочной железы, рака легкого, рака желудка.

2. Выявить характер изменения сывороточного содержания антигенов 0038 и 0050 в зависимости от особенностей неопластического процесса при карциноме молочной железы.

3. Провести сравнительное изучение сывороточного уровня вышеуказанных антигенов и относительного содержания 0038 и 0050-положительных мононуклеарных клеток периферической крови при раке молочной железы.

4. Дать сравнительную оценку сывороточного содержания антигенов 0038, 0050, РЭА и Ми0-1 антигена с целью определения возможности их совместного участия в механизмах модуляции иммунного ответа на опухоль.

Научная новизна работы.

Обнаружено повышение сывороточного содержания растворимых 0038 и 0050 антигенов на разных стадиях карциномы молочной железы. Их сывороточное содержание меняется в зависимости от: локализации очагов метастазирования, количества центров роста, гистологической формы опухоли, размеров первичного очага, морфологических изменений в опухоли и тканях молочной железы. Выявлено, что при карциноме молочной железы повышение сывороточного уровня растворимого антигена 0038 ассоциировано с увеличением относительного содержания С038-положительных мононуклеарных клеток периферической крови. Продемонстрировано, что изменение относительного содержания С050-положительных мононуклеарных клеток периферической крови и сывороточного уровня растворимого антигена 10АМ-3

имеет сложный характер. Высказано предположение, что это, вероятно, связано с индуцибельным и конститутивным типом мембранной экспрессии, соответственно, CD38 и CD50 антигенов и их шеддингом с поверхности клетки. Обнаружена корреляционная связь между сывороточным уровнем растворимых антигенов CD38, CD50 и раково-ассоциированным антигеном адгезии MUC-1, свидетельствующая о возможном совместном участии трех указанных протеинов в регуляции процессов клеточной адгезии при карциноме молочной железы. Представлена модель участия растворимого CD38 антигена в регуляции им-мунофизиологических механизмов ответа на солидные опухоли.

Научно-практическая значимость.

Обнаружена нормализация сывороточного уровня растворимого CD38 антигена в ответ на успешную цитостатическую полихимиотерапию, что позволило сделать заключение о мониторинговой значимости определения сывороточного уровня растворимого антигена CD38 при терапии карциномы молочной железы. Полученные данные расширяют представления о путях регуляции физиологических механизмов иммунного ответа организма на рост малигнизированных клеток.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При развитии опухолей происходит изменение сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов CD38 и CD50.

2. Увеличение относительного содержания CD38+ мононуклеарных клеток периферической крови при карциноме молочной железы сопровождается повышением уровня растворимого CD38 антигена.

Апробация работы.

Основные результаты представлены на 5 Всероссийском съезде онкологов (Казань, 2000), на IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), на VI Ежегодной Российской онкологической конференции (Москва, 2002), на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2002), на I, II, Ш Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2002,2003,2004).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 19 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы содержит 53 отечественных и 73 иностранных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

Для исследования сывороточного содержания растворимых форм белков CD38 и CD50 использовали образцы сыворотки крови 30 здоровых доноров крови, 14 больных раком желудка, 7 больных раком легкого, а также 129 образцов сыворотки крови от подвергавшихся терапии и впервые поступивших в стационар больных с гистологически подтвержденным диагнозом рака молочной железы. Образцы крови больных раком желудка, легкого и молочной железы были предоставлены кафедрой онкологии Нижегородской государственной медицинской академии.

Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови 168 женщин с гистологически подтвержденным диагнозом рака молочной же-

лезы и 30 сопоставимых по возрасту здоровых женщин-доноров проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител ИКО-20 (против CD38 антигена) и моноклональных антител ИКО-60 (против CD50 антигена).

Сывороточное содержание антигена CD38 определяли иммунофермент-ным методом с помощью поликлональных антител против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток периферической крови человека и меченых пероксидазой хрена моноклональных антител ИК0-20 против CD38 антигена. Сывороточное содержание антигена CD50 определяли иммуноферментным методом с помощью поликлональных антител против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток периферической крови человека и меченых пе-роксидазой хрена моноклональных антител ИКО-60 против CD50 протеина. Для оценки сывороточного содержания MUC-1 антигена и раковоэмбриональ-ного антигена использовали иммуноферментные тест-системы производства 000 "Хема-Медика" (Москва) и фирмы "Вектор-Бест" (Новосибирск), соответственно.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, коэффициента Стьюдента с использованием непараметрических методов анализа: критерия Крускала-Уоллиса, Манна-Уитни, критерия Уилкоксона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Обсчет результатов осуществлялся с помощью компьютерной программы "Биостатистика".

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью иммуноферментных методов, основанных на использовании моноклональных антител ИКО-20 и ИКО-60, определен сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов CD38 и CD50 при опухолях разной этиологии. Средний уровень растворимого антигена CD38 в сыворотке крови здоровых доноров составил 181,7±53 U/ml. Сывороточный уровень растворимого антигена CD50 в норме составил 342,2±10,0 U/ml. Являясь физиологическими, такие концентрации обеспечивают регуляцию процессов

к

межклеточной адгезии в здоровом организме. При исследовании сывороточного содержания антигена СБ38 и СБ50 при неоплазиях представленные средние значения были использованы в качестве нормы.

При раке желудка сывороточный уровень растворимого антигена СБ50 в сравнении с нормой был повышен в 2,0 раза (р<0,05). Рак легкого, наоборот, сопровождался понижением сывороточного содержания этого белка в 2,0 раза (р<0,05). Карцинома молочной железы характеризовалась статистически достоверным увеличением сывороточного уровня растворимого антигена СБ50 в 1,7 раза (Табл. 1).

В отличие от растворимого СБ50 антигена среднее сывороточное содержание антигена СБ38 повышалось во всех случаях. При раке желудка было зарегистрировано статистически достоверное повышение сывороточного уровня растворимого СБ38 антигена в 4,9 раза. Рак легкого приводил к увеличению содержания этого антигена в 3,1 раза (р<0,05). Наиболее выраженное повыше

Таблица 1

Сывороточный уровень растворимых антигенов СБ38 и СБ80 при различных неоплазиях

Здоровые Рак Рак легкого Рак

Антиген Доноры желудка п=7 молочной

п=20 п=14 железы

п=65

БС050 342,2±10,0 676,3±17,1* 173,8±26,1 * 585,6±179,2*

БС038 181,7±50,3 895,0± 127,5* 567,7±40,б* 1454,61329,9*

ние среднего сывороточного уровня CD38 антигена, составившее 700,5 %, происходило при раке молочной железы. Таким образом, развитие неопластических процессов сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм CD38 и CD50 антигенов.

Наиболее выраженные изменения были зарегистрированы при карциноме молочной железы. В связи с этим исследование роли растворимых форм CD38 и CD50 антигенов в регуляции иммунофизиологических реакций организма при неопластических процессах в дальнейшем проводилось на примере карциномы молочной железы.

Изучены особенности изменения сывороточного уровня растворимого антигена CD38 на разных стадиях карциномы молочной железы (Рис. 1). Начиная со второй стадии развития карциномы, у первичных больных сывороточное содержание растворимого антигена CD38 статистически достоверно повышалось в 8 раз по сравнению с нормой. На III и IV стадиях опухолевого процес-

Е | I I

Рис. 1. Сывороточное содержание растворимого антигена СВ38 на разных стадиях карциномы молочной железы

1 - норма, 2 -1 стадия, 3 - II стадия, 4 - III стадия, 5 - V стадия

* - статистически достоверные различия с нормой (р<0,05).

са уровень растворимого CD38 оставался достоверно повышенным.

Относительное количество СD38-положительных клеток, равное в норме 10,9+1,4 %, было одинаково повышено на всех стадиях и варьировало от 24,2±1,0 % до 25,7±2,1 %.

Проведен анализ зависимости сывороточного уровня растворимого CD38 антигена от гистологической формы опухоли. При инфильтрирующей прото-ковой форме было обнаружено повышение сывороточного уровня растворимого CD38 антигена в 5,4 раза (Рис. 2). Менее выраженное, но статистически достоверное повышение в 2,4 раза было зарегистрировано при инфильтрующей дольковой форме. При третьей форме - комбинированной - происходило по-

Рис. 2. Сывороточный уровень растворимой формы антигена CD38 при разных гистологических формах опухоли;

I - норма; 2 - инфильтрирующая протоковая; 3 - инфильтрирующая дольковая; 4 - комбинированная.

вышение сывороточного содержания растворимого 0038 антигена в 7,2 раза. Относительное количество 0038+ мононуклеарных клеток периферической крови увеличивалось при всех трех формах в 2,3-2,4 раза.

Исследована картина изменения сывороточного уровня растворимого 0038 в зависимости от размеров первичного опухолевого очага. Если при опухолевых узлах диаметром до 1 см сывороточный уровень растворимого антигена 0038 превышал норму в 4,2 раза, то опухоль диаметром от 1 до 2 см сопровождалась повышением сывороточного содержания данного антигена в 6,9 раза (р<0,05). При наличии более крупных первичных опухолевых очагов сывороточный уровень белка 80038 также оставался повышенным. С увеличением диаметра опухолевого узла происходило также нарастание относительного содержания 0038+ мононуклеарных клеток.

К факторам, которые могут оказывать влияние на течение заболевания и напряженность иммунного ответа, относятся такие морфологические изменения в опухоли и окружающей ее ткани, как появление очагов некроза и воспаления, эмболия кровеносных сосудов и лимфатических протоков, врастание опухоли в окружающие ткани. В связи с этим нами определена сывороточная концентрация растворимого 0038 при наличии таких морфологических изменений (Рис. 3). Сывороточный уровень растворимого антигена 0038 повышался при эмболии кровеносных сосудов и лимфатических протоков, очагов некроза и воспаления. Присутствие указанных морфологических изменений приводило к увеличению относительного содержания 0038+ клеток в 2,4-2,8 раза в сравнении с нормой. Уровень растворимого 0038 антигена у больных с врастанием опухоли в кожу и окружающие ткани превышал норму в 2,7 рам. Относительное содержание 0038+ клеток в этом случае было увеличено в 1,6 раза.

Проведен анализ изменения сывороточного уровня растворимого антигена 0038 в зависимости от количества центров роста опухоли. Как при множественных, так и единичном очаге поражения сывороточное содержание исследованного белка было статистически достоверно повышено. Сходным образом

увеличивалось относительное содержание CD38+ мононуклеарных клеток периферической крови.

Исследован сывороточный уровень растворимого CD38 при разной локализацией очагов метастазирования. При метастазах в мягкие ткани содержание растворимого CD38 было максимальным, превышая норму в 6,9 раза. Метастазы в лимфоузлы, легкие, печень, кости скелета сопровождались повышением среднего сывороточного уровня растворимого CD38 в пределах от 270 до 380 %. Количество CD38* мононуклеарных клеток также было статистически достоверно повышено.

1 2 3 4 5

Рис. 3. Сывороточное содержание растворимой формы С038 антигена в зависимости от морфологических изменений в опухоли и в ткани молочной железы.

1 - норма; 2 - очаги некроза и воспаления опухоли; 3 - эмболия кровеносных и лимфатических сосудов; 4 - некроз, воспаление + эмболия; 5 - врастание опухоли в кожу и окружающие ткани.

Таким образом, сывороточный уровень растворимого антигена CD38 повышается при карциноме молочной железы, начиная со второй стадии опухолевого роста и сохраняется повышенным на последующих стадиях вне зависимости от местоположения очагов метастазирования; наиболее высокое содержание исследуемого белка наблюдается при комбинировнной гистологической форме опухоли; статистически достоверно повышенные уровни растворимого CD38 сохраняются как при наличии единичных, так и множественных очагов поражения; высокая концентрация растворимого CD38 характерна для опухолей любого диаметра. Повышение сывороточного уровня растворимой формы мембранного антигена CD38 во всех случаях сопровождалось увеличением относительного содержания CD38+ мононуклеарных клеток периферической крови.

Совместно с A.B. Алясовой исследован уровень сывороточной формы растворимого антигена CD38 в процессе комплексной терапии рака молочной железы. Обнаружено, что выход в ремиссию приводил к нормализации сывороточного уровня растворимого CD38, а возникновение рецидива сопровождалось повторным повышением содержания CD38. Различия между сывороточным уровнем растворимого CD38 при ремиссии и при развитии рецидива послужили основанием для более детального исследования значимости концентрации этого антигена в качестве мониторингового показателя при проведении терапии рака молочной железы.

Обнаружено, что цитостатическая терапия чаще всего сопровождалась снижением сывороточного уровня растворимого CD38 антигена. При благоприятном прогнозе с последующей стойкой ремиссией сывороточный уровень растворимого CD38 приближался к норме. У 12 из 65 исследованных больных наблюдалось прогрессирование опухолевого процесса на фоне полихимиотерапии. Оно сопровождалось тенденцией к нарастанию сывороточного содержания белка CD38. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования сывороточной концентрации растворимого белка CD38 в качестве дополнительного критерия в мониторинге карциномы молочной железы.

Наряду с оценкой сывороточного уровня растворимого антигена СБ38 при карциноме молочной железы был изучен характер изменений сывороточной кон центрации растворимой формы еще одного мембранного белка адгезии - СБ5( антигена. На 1 и II стадиях неопластического процесса его содержание статисти чески достоверно не отличалось от нормы (рис. 4). На Ш стадии обнаруживалось статистически достоверное повышение сывороточного уровня растворимого ан тигена СБ50 на 40,6%. На IV стадии опухолевого процесса сывороточный уро-

1 2 3 4 5

Рис. 4. Сывороточное содержание растворимого антигена С050 на разных стадиях рака молочной железы.

I - норма; 2 -1 стадия рака молочной железы; 3 - II стадия; 4 - Ш стадия; 5 - IV стадия

* -статистически достоверные различия с нормой (р< 0,05).

вень растворимого антигена СБ50 был на 21,6 % выше нормы. Таким образом содержание растворимого антигена СБ50 не менялось на I и II стадиях рака мо лочной железы, но повышалось при последующем развитии неопластического процесса.

Относительное содержание С050-положительных мононуклеарных клеток периферической крови при карциноме молочной железы изменялось в сторону понижения. Если на I и III стадиях снижение было статистически недостоверным то на II и IV стадиях относительное содержание С050-положительных клеток падало статистически достоверно в сравнении с нормой, снижаясь с' 49,7+3,9 до 42,9+1,7 % и 42,7+1,6 %, соответственно.

Концентрация растворимого CD50 у больных с инфильтрирующей про-токовой или инфильтрирующей дольковой формой опухоли, не отличалась от нормы. При комбинированной гистологической форме опухоли сывороточный уровень растворимого CD50 антигена повышался в 1,9 раза. Относительное содержание СD50-положительных клеток не отличалось от нормы при всех изученных гистологических формах карциномы молочной железы.

Обнаружено статистически достоверное повышение сывороточного содер жания растворимого CD50 антигена при карциноме молочной железы, сопрово ждающейся очагами некроза и воспаления, эмболией кровеносных и лимфатиче ских сосудов и понижение его уровня при врастании опухоли в кожу и окру жающие ткани. Морфологические особенности, связанные с опухолевым ростом ассоциированы, таким образом, с альтерацией сывороточного уровня раствори мого антигена CDS0, проявляющейся как в повышении его концентрации, так и i понижении.

Относительное содержание СD50-положительных клеток имело иной характер изменений. Наличие очагов некроза и воспаления приводило к снижении среднего содержания СD50-положительных клеток в 1,6 раза. Достоверные из менения выявлены также при врастании опухоли в окружающие ткани.

Единичные очаги поражения не сопровождались статистически достоверным изменением среднего уровня CD50 антигена. В то же время мультицен-тричный рост приводил к статистически достоверному падению сывороточного содержания растворимого антигена CD50. Если в норме его содержание равнялось 342,8±56,1 U/ml, то в случае мультицентричного роста оно понижалось в среднем до 212,3±43,8 U/ml. Аналогичным образом менялось относительное ко-

личество С050-положительных мононуклекарных клеток периферической крови. При мультицентричном росте опухоли происходило статистически достоверное снижение количества С050-положительных клеток на 29,3 %. При моноцентрическом характере поражения количество СБ50+ мононуклеарных клеток не менялось.

Сывороточный уровень растворимого СБ80 антигена статистически достоверно повышался при метастазах в мягкие ткани и кости скелета. Однако содержание СБ50-положительных клеток периферической крови при этом не менялось. Различающиеся локализации метастазов не приводили к статистически достоверным изменениям в относительном содержании СБ50-положительных клеток за исключением метастазов в печень, когда количество СБ50-положительных клеток падало в 1,6 раза.

Чтобы определить, каким образом сывороточная концентрация растворимого антигена СБ50 зависит от опухолевой массы при карциноме молочной железы, нами был проанализирован его сывороточный уровень у больных, имеющих различный объем первичного опухолевого очага. При опухоли диаметром до 1 см зарегистрировано статистически недостоверное увеличение сывороточного содержания СБ50 антигена. Однако, при диаметре опухоли до 2 см его средний уровень достоверно повышался в 1,3 раза (табл. 2). Наличие опухолевого очага диаметром от 2 до 5 см сопровождалось повышением относительной концентрацией растворимого СБ50 уже в 1,5 раза, а при опухоли большего диаметра, средняя концентрация сывороточного уровня СБ50 антигена увеличивалась в 2,0 раза. Таким образом, увеличение диаметра первично-10 опухолевого очага сопровождалось выраженным повышением сывороточного содержания растворимой формы мембранного антигена СБ50.

Содержание СБ50-положительных мононуклеарных клеток периферической крови, в отличие от СБ38-положительных клеток, статистически достоверно снижалось по сравнению с нормой. Наиболее выраженное

Таблица 2

Относительное содержание CD50+ мононуклеарных клеток крови и растворимого антигена CD50 при разных размерах первичного очага опухоли

Показатель Норма Диаметр первичного очага опухоли (см)

до 1 1-2 2-5 5-8 и более

Растворимый СЭ50 342,2±10,0 367,4+48,9 436,7+51,2" 524,0+43,6* 689,0+75,8*

СЭ50* клетки 49,7±3,9 37,2±1,7* 41,1 ±2,0* 36,9+1,7* 25,1 ±0.8*

* - различия статистически достоверны в сравнении с нормой (р<0,05).

падение содержания CD50 мононуклеарных клеток отмечалось при опухоли диаметром больше 8 см. Наряду с максимальным снижением количества СD50-положительных клеток в крови больных, имеющих опухолевый очаг более 8 см, наблюдалось и наиболее выраженное повышение содержания растворимого CD50 антигена. Вероятно, это является следствием повышенной скорости шеддинга молекул CD50 с мембраны иммунокомпетентных клеток в результате которого происходит снижение плотности экспрессии на мембране клеток этого белка и соответствующее снижение количества CD50-положительных клеток, выявляемых в реакции иммунофлуоресценции.

Можно сделать заключение, что сывороточная концентрация растворимого антигена CD50 и относительное содержание СD50-положительных мононукле арных клеток периферической крови зависят от степени распространенности опухолевого процесса и ряда морфологических признаков, характеризующи опухоль. В целом, изменение сывороточного уровня растворимого антиген CD50 и относительного содержания СD50-положительных мононуклеарных кле

ток имеет сложный характер. При этом, повышение сывороточного уровня рас творимой формы мембранного белка СБ50 часто сопровождается снижением экспрессии мембранной формы антигена СБ50, выражающейся в уменьшении относительного количества С050-положительных мононуклеарных клеток. Из вестно, что мембранный СБ50 антиген обладает конститутивным характером экспрессии. При постоянной скорости синтеза, характерной для конститутивны) белков повышенный шеддинг СБ50 антигена, может привести к снижению экс прессии мембранной формы данного антигена и, соответственно, уменьшении относительного содержания СБ50-положительных клеток.

В отличие от СБ 50 антигена, повышение сывороточного уровня раствори мого антигена СБ38 во всех случаях сопровождалось увеличением относитель ного количества СБ38-положительных клеток. Необходимо заметить, что мем бранный СБ38 антигена, в противоположность конститутивному СБ50 антигена обладает индуцибельным характером экспрессии. Можно предполагать, чт< вследствие активации лимфоцитов, наблюдаемой при онкологических процесса; и продемонстрированной многими авторами, на мембране увеличивается плот ность экспрессии антигена СБ38. Результатом этого является повышение отно сительного содержания СБ38-положительных клеток, происходящее при карци номе молочной железы. В свою очередь, подъем сывороточного содержания рас творимого СБ38 является результатом повышенного шеддинга, происходящего за счет увеличения относительного содержания СБ38-положительных клеток Скорость шеддинга при этом может оставаться неизменной.

Отметим, что увеличенное сывороточное содержание растворимого СБ38 антигена, являясь отражением идущих в организме физиологических процессов связанных с активацией иммунной системы, может выступать и в роли фактора 01 раничивающего активационные процессы и тормозящего реакцию иммунного системы на чужеродные агенты. С одной стороны, повышенный сход с мембрань снижает плотность его экспрессии на клетке. В итоге меняется адгезионная спо собность клеток, реализующаяся при участии белка СБ38. С другой стороны, из мснение в крови и других тканях содержания этого антигена может модулиро вать механизмы взаимодействия клеток, идущие при его участии.

Широко известными растворимыми сывороточными маркерами карциномь молочной железы являются белки MUC-1 и РЗА, мембранные формы которых классифицированы в качестве CD66 и CD227 антигенов и участвуют в адгезии клеток. Растворимые формы CD66 антигена и CD227 антигена способны блоки ровать процессы адгезии. В связи с этим нами проведено сравнительное опреде ление сывороточного содержания антигена CD38, CD50 и содержания опухоле ассоциированных антигенов MUC-1 и РЭА. Как видно из таблицы 3, статистиче ски достоверная положительная корреляция была зарегистрирована между сыво роточными уровнями растворимых антигенов CD38, CD50 и MUC-1.

Таблица.'

Корреляционные взаимоотношения между сывороточным содержанием исследованных антигенов крови

вС038

вС038 ¡£050

¡¡С050 11=0,588 Р<0,001 мис-1

мис-1 Я=0,403 Р<0,001 Я=0,460 Р<0,001 РЭА

РЭА Я=0,237 РХ),05 К=0,189 РХ),05 Я=0,264 Р>0,05

Наряду с наличием корреляционных взаимосвязей между MUC-1 и растворимыми CD38 и CD50, обнаружена корреляционная взаимосвязь между сывороточным уровнем растворимых форм последних двух антигенов адгезии. Этот факт предполагает существование при раке молочной железы молекулярных механизмов иммунного ответа, в которых данные антигены принимают совместное участие.

Одновременное изменение концентраций 8СБ38, 8СБ50, и МИС-1 свидетельствует о возможности совместной модуляции активационных процессов иммунной системы на разных стадиях карциномы молочной железы. Учитывая тот факт, что белки СБ38, СБ50 и МИС-1 являются молекулами адгезии, можно предположить, что их растворимые формы принимают участие в торможении процессов адгезии клеток иммунной системы и тем самым нарушают эффекторные механизмы действия их мембранных гомологов.

Важным моментом в реализации иммунофизиологических функций являются процессы миграции активированных клеток из сосудистого русла к месту локализации чужеродных агентов, в частности, к опухолевому очагу. Повышенная сывороточная концентрация растворимого СБ38 антигена, обнаруженная при карциноме молочной железы, будет в такой ситуации блокировать взаимодействие мембранного антигена СБ38 и его лиганда - белка СБ31, предотвращая поступление эффекторных клеток в тканевое пространство и, соответственно, к опухолевому очагу. Увеличение концентрации растворимого СБ38, обнаруженное при всех трех формах исследованных неоплазий, является, таким образом, фактором, приводящим к угнетению иммунного ответа на опухоль и, соответственно, формированию элементов недостаточности иммунного ответа, характерных для организма, пораженного злокачественно трансформированными клетками.

В качестве еще одного показателя, отражающего формирование иммунной недостаточности, служит пониженное содержание СБ50-положительных клеток. Сниженное количество СБ50-положительных клеток свидетельствует о нарушениях в механизмах инициации и реализации иммунного ответа, в том числе иммунного ответа на опухоль. Повышенный уровень растворимого СБ50 также способен к блокаде инициации иммунного ответа, взаимодействуя с ЬЕА-1 на антиген-презентирующих клетках и мешая, тем самым, нормальной адгезии, а, следовательно, и взаимодействию клеток, участвующих в реализации противоопухолевого иммунитета.

выводы

1. Показано, что сывороточное содержание растворимого антигена CD50 увеличивается при карциноме молочной железы, раке желудка, но снижается при раке легкого. Содержание растворимого CD38 антигена повышается как при раке легкого, раке желудка, так и при карциноме молочной железы.

2. Сывороточное содержание растворимого антигена CD38 повышается, начиная со второй стадии карциномы молочной железы, при ее различных гистологических формах, при наличии как единичных, так и множественных очагов поражения. Обнаружена нормализация сывороточного содержания растворимого CD38 антигена на фоне ремиссии, что может быть использовано в качестве мониторингового прогностического показателя при терапии карциномы молочной железы.

3. В зависимости от стадии карциномы молочной железы, ее гистологической формы, размеров первичного опухолевого очага, от количества очагов поражения, от наличия и локализации метастазов сывороточный уровень растворимого антигена CDS0 меняется как в сторону повышения, так и в сторону понижения, что отражает сложную картину нарушений его сывороточной концентрации.

4. Относительное содержание СD38-положительных мононуклеарных клеток увеличивается с повышением сывороточного уровня растворимого CD38 антигена в отличие от СD50-положительных мононуклеарных клеток, содержание которых чаще всего снижается при повышении сывороточного уровня растворимого CD50 антигена.

5. Выявлены положительные корреляционные взаимосвязи между сывороточным уровнем растворимых антигенов CD38, CD50 и МТС-1, свидетельствующие о возможном совместном участии данных антигенов в ограничении адгезионных процессов при карциноме молочной железы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Алясова A.B., Тагиров О.Т., Варшавская Л.В., Копылова Г.Е., Новиков В.В., Барышников А.Ю. К вопросу об иммунологическом мониторинге рака молочной железы. // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. -№ 1.-C.4-4.

Алясова А.В, Варшавская Л.В., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Динамика растворимого CD50 антигена у больных раком молочной железы в процессе комплесного лечения. // Клиническая и лабораторная диагностика. -2004.-№3,-С. 42-43.

Варшавская Л.В., Алясова A.B., Новиков В.В. Повышенное содержание растворимых CD50 и CD38 антигенов в сыворотке крови при солидных опухолях. // Сб. работ 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН. Часть I. - Курск, 2002. - С. 77-78.

Варшавская Л.В., Алясова A.B., Кравченко Г.А., Тагиров О.Т., Козлов А.Ю., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Повышенное содержание растворимых CD50 и CD38 антигенов в сыворотке крови при солидных опухолях. // Вестник Нижегородского госуниверситета, Серия Биология. - 2002. -Выпуск 1(4).-С. 183-188.

Варшавская Л.В., Алясова А. В., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Мембранная и растворимая формы CD50 (1САМ-3)-антигена при раке молочной железы. // Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - № 2. - С. 1718.

Новиков В.В., Алясова A.B., Варшавская Л.В., Королева В.В., Тагиров Т.Г., Козлов А.Ю., Мартынова Т.Г., Барышников А.Ю. Прогностическое значение уровня растворимого CD38 антигена при раке молочной железы // Аллергология и иммунология. - 2001. - Т. 2, № 2. - С.116-116. Птицына Ю.С., Лебедев М.Ю., Королева В.В., Пугина A.C., Борнякова И.А., Крыжанова М.А., Варшавская Л.В., Мартынова Т.Г., Кораблев СБ., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Различия в содержании сывороточной

формы СБ38 антигена при иммунных нарушениях разной этиологии // Медицинская иммунология, 1999. - Т.1, № 3-4. - С.82-82.

Подписано в печать 14.12.04. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

_Усл. п. д. 1. Заказ № 1581. Тираж 100 экз._

Типография Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского. Лиц. ПД № 18-0099 от 4.05.01. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

( > ;ms

16 ФЕВ 2005 r- . -

s. - x

Актуальность темы.

Важную роль в поддержании гомеостаза играет иммунная система. Физиологические основы сохранения внутреннего постоянства организма, в том числе и защита от неопластических процессов, базируются на эффективной и многосторонней работе молекулярных и клеточных механизмов иммунных реакций. Межклеточные контакты являются необходимым звеном реализации адекватного иммунного ответа как на инфекционные агенты, так и на злокачественно трансформированные клетки.

Молекулярной основой формирования межклеточных контактов являются белки адгезии. Если мембранные белки непосредственно участвуют в образовании межклеточных контактов, то их растворимые формы, появляющиеся в результате шеддинга или альтернативного сплайсинга мРНК, являются потенциальными иммунорегуляторными молекулами. Физиологическая роль ряда растворимых форм молекул адгезии при неопластических процессах во многом не исследована. Не изучена возможность участия растворимых форм мембранных антигенов CD38 и CD50 (ICAM-3) в регуляции иммунного ответа на такие широко распространенные солидные опухоли, как рак молочной железы, рак легкого, рак желудка. Не исследована возможная связь между сывороточным уровнем растворимых форм CD38 антигена, CD50 антигена и особенностями опухолевого процесса. Не установлены взаимоотношения между сывороточным содержанием данных белков и широко известных опухолевых маркеров: раково-эмбрионального антигена (РЭА) и раково-ассоциированного антигена MUC-1. Важным в практическом отношении является разработка новых подходов к прогнозированию течения неопластических процессов, основанных на изучении функциональной роли растворимых форм мембранных антигенов адгезии.

Научный консультант: докт. мед. наук. А.В.Алясова

Цель: изучить роль растворимых форм мембранных антигенов CD38 и CD50 в механизмах регуляции противоопухолевого иммунитета.

Задачи:

1. Определить сывороточный уровень растворимых CD38 и CD50 антигенов при неопластических процессах на примере рака молочной железы, рака легкого, рака желудка.

2. Выявить характер изменения сывороточного содержания антигенов CD38 и CD50 в зависимости от особенностей неопластического процесса при карциноме молочной железы.

3. Провести сравнительное изучение сывороточного уровня вышеуказанных антигенов и относительного содержания CD38 и С050-положительных мо-нонуклеарных клеток периферической крови при раке молочной железы.

4. Дать сравнительную оценку сывороточного содержания антигенов CD38, CD50, РЭА и MUC-1 антигена с целью определения возможности их совместного участия в механизмах модуляции иммунного ответа на опухоль.

Научная новизна работы.

Обнаружено повышение сывороточного содержания растворимых CD38 и CD50 антигенов на разных стадиях карциномы молочной железы. Их сывороточное содержание меняется в зависимости от: локализации очагов метастази-рования, количества центров роста, гистологической формы опухоли, размеров первичного очага, морфологических изменений в опухоли и тканях молочной железы. Выявлено, что при карциноме молочной железы повышение сывороточного уровня растворимого антигена CD38 ассоциировано с увеличением относительного содержания С038-положительных мононуклеарных клеток периферической крови. Продемонстрировано, что изменение относительного содержания С050-положительных мононуклеарных клеток периферической крови и сывороточного уровня растворимого антигена ICAM-3 имеет сложный характер. Высказано предположение, что это, вероятно, связано с индуцибельным и конститутивным типом мембранной экспрессии, соответственно, CD38 и CD50 антигенов и их шеддингом с поверхности клетки. Обнаружена корреляционная связь между сывороточным уровнем растворимых антигенов CD38, CD50 и раково-ассоциированным антигеном адгезии MUC-1, свидетельствующая о возможном совместном участии трех указанных протеинов в регуляции процессов клеточной адгезии при карциноме молочной железы. Представлена модель участия растворимого CD38 антигена в регуляции иммунофизиологиче-ских механизмов ответа на солидные опухоли.

Научно-нрактичсская значимость.

Обнаружена нормализация сывороточного уровня растворимого CD38 антигена в ответ на успешную цитостатическую полихимиотерапию, что позволило сделать заключение о мониторинговой значимости определения сывороточного уровня растворимого антигена CD38 при терапии карциномы молочной железы. Полученные данные расширяют представления о путях регуляции физиологических механизмов иммунного ответа организма на рост малигнизи-рованных клеток.

Основные положснин, выносимые па защиту:

1. При развитии опухолей происходит изменение сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов CD38 и CD50.

2. Увеличение относительного содержания CD38* мононуклеарных клеток периферической крови при карциноме молочной железы сопровождается повышением уровня растворимого CD38 антигена.

Апробация работы.

Основные результаты представлены на 5 Всероссийском съезде онкологов (Казань, 2000), на IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), на VI Ежегодной Российской онкологической конференции (Москва, 2002), на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2002), на I, II, III Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2002, 2003, 2004).

Объем и структу ра диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 19 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы содержит 53 отечественных и 73 иностранных источников.

7. ВЫВОДЫ

1. Показано, что сывороточное содержание растворимого антигена CD50 увеличивается при карциноме молочной железы, раке желудка, но снижается при раке легкого. Содержание растворимого CD38 антигена повышается как при раке легкого, раке желудка, так и при карциноме молочной железы.

2. Сывороточное содержание растворимого антигена CD38 повышается, начиная со второй стадии карциномы молочной железы, при ее различных гистологических формах, наличии как единичных, так и множественных очагов поражения. Обнаружена нормализация сывороточного содержания растворимого CD38 антигена на фоне ремиссии, что целесообразно использовать в качестве мониторингового прогностического показателя при терапии карциномы молочной железы.

3. Сывороточный уровень растворимого антигена CD50 в зависимости от стадии карциномы молочной железы, ее гистологической формы, размеров первичного опухолевого очага, от количества очагов поражения, от наличия и локализации метастазов меняется как в сторону повышения, так и в сторону понижения, что отражает сложную картину нарушений его сывороточной концентрации.

4. Относительное содержание С038-положительных мононуклеарных клеток увеличивается с повышением сывороточного уровня растворимого CD38 антигена в отличие от С050-положительных мононуклеарных клеток, содержание которых чаще всего снижается при повышении сывороточного уровня растворимого CD50 антигена.

5. Выявлены положительные корреляционные взаимосвязи между сывороточным уровнем растворимых антигенов CD38, CD50 и MUC-1, свидетельствующие о возможном совместном участии вышеуказанных антигенов в ограничении адгезионных процессов в организме при карциноме молочной железы.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы рассматриваются в качестве участников глобальной иммунологической сети, тесным образом связанной со всеми физиологическими системами организма. В состав глобальной иммунологической сети включают антитела и антиидиотипические антитела, цитокины, рецепторы Т-клеток, В-клеток, множество других мембранных белков, осуществляющих лиганд-рецепторное взаимодействие, а также их растворимые формы, образующиеся за счет шеддиига и альтернативного сплайсинга матричной РНК. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы осуществляют чаще всего миогонаправленное воздействие, приводящее при нарушении их равновесного содержания к блокаде межклеточных мембранных взаимодействий и ограничению иммунного ответа (26). Повышение уровня растворимых белков адгезии является компенсаторным механизмом, не позволяющим процессам активации иммунной системе выходить за физиологические пределы. Вопрос о том, каковы физиологические пределы, за которыми механизмы активации приобретают патологические черты, остается открытым.

Межклеточные взаимодействия могут быть блокированы растворимыми молекулами гистосовместимости, взаимодействующими с Т-клеточным рецеп-торным комплексом, могут быть блокированы растворимыми формами белков, входящих в состав Т-клеточного рецепторного комплекса (например, антиген CD8), также другими белками, участвующими в межклеточных взаимодействиях (25). В первую очередь, такими белками являются белки адгезии, чьи растворимые формы могут взаимодействовать с лигандами мембранных форм адгезионных антигенов. Присутствуя в крови и других тканях в нормальной концентрации, растворимые формы мембранных белков не оказывают существенного влияния на интенсиность иммунологических процессов, протекающих в организме. Повышение или снижение их концентрации приводит к смещению равновесия в системе рецептор-лиганд. Значительное увеличение концентрации растворимых форм антигенов адгезии, происходящее, в частности, при чрезмерной активации того или иного звена иммунной системы, приведет к торможению адгезионных процессов.

Проведенное нами исследование сывороточного уровня растворимых форм антигенов адгезии CD38 и CD50 показало, что при таких широко распространенных формах опухолевых процессов, как рак легкого, рак желудка и рак молочной железы происходит изменение сывороточного уровня этих антигенов, то есть, развитие неопластических процессов сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм CD38 и CD50 антигенов. Если для растворимого CD50 выявлено разнонаправленное изменение сывороточного содержания при неопластических процессах разного генеза, то сывороточное содержание растворимого антигена CD38 изменялось во всех трех случаях в одном направлении, статистически достоверно повышаясь как при раке желудка и раке легкого, так и при карциноме молочной железы. Наиболее выраженные изменения были выявлены при карциноме молочной железы. В связи с этим исследование роли растворимых форм CD38 и CD50 антигенов в регуляции иммунофизиологических реакций организма при неопластических процессах в дальнейшем проводили на примере карциномы молочной железы.

Обнаружено, что сывороточный уровень растворимого антигена CD38 повышается при карциноме молочной железы, начиная с второй стадии опухолевого роста и сохраняется повышенным на последующих стадиях вне зависимости от местоположения очагов метастазирования наиболее высокое содержание исследуемого антигена наблюдается при комбинировнной гистологической форме опухоли, статистически достоверно повышенные уровни растворимого CD38 сохраняются как при наличии как единичных, так и множественных очагов поражения. Высокая концентрация растворимого CD38 антигена характерна для опухолей любого диаметра.

Выявлены различия между сывороточным уровнем растворимого CD38 антигена на фоне ремиссии и при развитии рецидива. Исследован характер изменения сывороточного уровня растворимого CD38 антигена при проведении полихимиотерапии рака молочной железы. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования теста на сывороточное содержание растворимого CD38 антигена в качестве мониторингового прогностического показателя при терапии карциномы молочной железы. Падение в ходе терапии уровня растворимого CD38 свидетельствует об ее успешности. Больные, не отвечающие на полихимиотерапию, имели повышенный уровень данного антигена.

В отличие от однонаправленных изменений сывороточного уровня растворимого CD38 антигена в сторону повышения, изменения в сывороточном содержании растворимого CD50 антигена имели иной характер. В зависимости от стадии заболевания, гистологической формы опухоли, размеров первичного опухолевого очага, характера морфологических изменений в опухоли и в ткани молочной железы, от количества очагов поражения, от наличия и локализации метастазов обнаруживались изменения сывороточной концентрация растворимого CD50 антигена как в сторону повышения, так и в сторону понижения. Так, повышенный уровень растворимого CD50 антигена регистрировался на III и IV стадиях карциномы молочной железы. В то же время снижение его содержания происходило при наличии множественных очагов опухолевого поражения.

Различия в направленности и ВЕлраженности изменений сывороточного содержания двух исследуемых антигенов с большой долей вероятности связаны с характером их экспрессии на мембране антиген-положительных клеток. Если CD38 антиген обладает на мононуклеарных клетках индуцибельной экспрессией, то антиген CD50 обладает конститутивной экспрессией, находясь на мембране в неизменном количестве вне зависимости от се активационного статуса. В связи с этим мы исследовали в крови больных раком молочной железы содержание мононуклеарных клеток, имеющих на своей мембране эти антигены.

Было обнаружено, что изменение относительного содержания CD38-ноложительных и С050-положительных мононуклеарных клеток периферической крови имеет при карциноме молочной железы различный характер. Если количество С038-положительных клеток во всех случаях было повышенным и характер повышения соответствовал характеру изменения сывороточного уровня растворимого CD38 антигена, то относительное содержание CD50-положительных клеток при карциноме молочной железы чаще всего снижалось. 'h Ранее З.Г. Кадагидзе было показано, что при ряде опухолей снижение относительного содержания С050-положительных мононуклеарных клеток имеет мониторинговое значение (18, 19).

В наших исследованиях наиболее выраженное снижение количества С050-положительных клеток сопровождалось значительным подъемом сывороточного уровня растворимого антигена CD50. Так, например, в крови больных, имеющих опухолевый очаг более 8 см, наряду со снижением количества С050-положительных клеток наблюдалось наиболее выраженное повышение содержания растворимого CD50 антигена. Вероятно, это является следствием повышенной скорости шеддинга молекул CD50 с мембраны иммунокомпетент-ных клеток, результатом которого служит снижение плотности экспрессии на rvv , мембране клеток этого белка и соответствующее снижение количества CD50положительных клеток, выявляемых в реакции иммунофлуоресценции.

Увеличение относительного количества С038-положительных клеток всегда было сопряжено с повышением сывороточного уровня растворимого CD38 антигена. Учитывая индуцибельный характер экспрессии на мембране белка CD38, можно предполагать, что подъем сывороточного содержания растворимого CD38 также является результатом повышения шеддинга, присходящего за счет повышения относительного содержания С038-ноложительных клеток. Скорость шеддинга при этом может оставаться неизменной. Повышение сывороточного уровня растворимого CD50 антигена, в свою очередь, может быть связано при карциноме молочной железы с повышением скорости его шеддинга с клеточной поверхности, сопровождающейся падением плотности экспрессии * Я этого белка на мембране и, как результат, снижением относительного количества CD50+ клеток, выявляемых в реакции иммунофлуоресценции.

Увеличение сывороточного содержания растворимых антигенов CD38 и CD50 является отражением идущих в организме физиологических процессов, связанных с активацией иммунной системы. Растворимые формы данных антигенов могут выступать в роли ограничителей активационных процессов, тормозя реакцию иммунной системы на чужеродные агенты. С одной стороны, повышенный сход с мембраны снижает плотность их экспрессии на клетке. В итоге меняется адгезионная способность клеток, реализующаяся при участии антигенов CD38 и CD50. С другой стороны, изменение в крови и других тканях содержания этих антигенов может модулировать механизмы адгезионного взаимодействия клеток, основанные на участии исследуемых антигенов.

Среди известных в настоящее время молекул адгезии хорошо известны такие антигены как MUC-1 и РЭЛ. Сравнительное исследование сывороточного уровня этих антигенов с уровнем растворимых CD38 и CD50, основанное на проведении корреляционного анализа, показало наличие статистически достоверных положительных связей между сывороточным содержанием sCD38, sCD50 и MUC-1 у больных раком молочной железы. Одновременное и однонаправленное изменение концентраций данных белков свидетельствует о возможности совместной модуляции активационных процессов иммунной системы при карциноме молочной железы. Учитывая тот факт, что CD38, CD50 и MUC-1 антигены являются молекулами адгезии, можно предполагать, что растворимые формы последних белков принимают участие в торможении процессов адгезии клеток иммунной системы и тем самым нарушают активационные и эффекторные механизмы действия их мембранных гомологов.

На основании полученных результатов представлена модель участия растворимого CD38 антигена в ограничении процессов миграции мононуклеарных клеток из сосудистого русла в тканевое пространство, а соответственно в месту локализации опухоли. Представленная модель отражает один из путей, с помощью которых формируются механизмы ускользания опухолевых клеток от надзора со стороны иммунной системы. Таким образом, повышенный уровень растворимого CD38 антигена можно рассматривать в качестве одного из факторов ухода опухоли от противоопухолевого ответа со стороны иммунной системы.