Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Роль молекул адгезии и цитокинов в противоопухолевом иммунитете

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕТСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ

¡43 ^

'} V На правах рукописи

ил

АЛЕКСАНДРОВ Антон Вениаминович

РОЛЬ МОЛЕКУЛ АДГЕЗИИ И ЦИТОКИНОВ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ

ИММУНИТЕТЕ

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.36 - аллергология н иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

>

Работа выполнена в Научно-Исследовательском Институте детской гематологии России и университете г. Эдинбурга, Великобритания.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор АХ. Румянцев, доктор биологических наук, профессор К. Джеймс.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ЕЛ. Владимирская, доктор медицинских наук, профессор А.М. Мороз.

Ведущая организация - Российский государственный ыедятаяский университет им. Н.И.Пирогева.

Защита состоится « . , . »..... 1993 года на

заседании специализировааного ученого совета при Научно-Исследовательском Институте детской гематологии России (Москва, 11753, Ленинский проспект, д.117).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «...». . . . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Ученного Совета, д.м.н„ профессор

А.Ф.Бухны

Принятые сокращения

"М КСФ - фанулошггарно-макрофагальньм! колонис-стнмулирующнй фактор;

Ш-1,-2,-4,-6,-8 - соответственно, ннтерлейкин-1,-2,-4,-6,-8;

1ФН-у,-а - пнтерфероп-гамма,-альфа;

1АК-клеткн - лцмфокни-активнрованные клетки-убийцы;

1КГ - переходио-клеточный рак (мочевого пузыря);

'ЗФР - рецептор для эпндермального фактора роста;

"ФРР - трансформирующий фактор роста-бетта;

ШОа - фактор некроза опухолн-альфа;

)ФР - эпндермальнын фактор роста;

1РМ - протокол Берлнн-Франкфурт-Мюнстер, нспользугащися для лечения

лейкемий; 'НХ - циклогекспмпд;

САМ-1,2 - внутриклеточная молекула ад1езни-1,2;

РА-1,2,3 - антиген, ассоциированный с функцией лейкоцитов-¡,2,3;

11САМ-1 - мембранная форма 1САМ-1;

4НС - главный комплекс шстосовиестнмоста;

ГСАМ - невральная клеточная молекула адгезии;

1САМ-1 - растворимая форма 1САМ-1;

'САМ-1 - васкулярная клеточная молекула адгезии-1;

:ЬА-4 - очеиь поздний антиген актнвацнн-4.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Иммунотерапия ифает важную роль в противоопухолевом иммунитете при ряде онкологических заболеваний, в частности, лейкозах, меланомах и некоторых раках (Бергольц В.М., 1973; Кисляк Н.С. 1978, 1982; Осипов С.Г., 1978; Румянцев А.Г., 1976, 1978, 1982; Dutcher J.P., 1987; Fisher R.L., 1987; Lejeune F., 1992; Palmer P.A., 1992; Scambia G., 1991).

Адъювантная иммунотерапия БЦЖ - один из наиболее распространенных методов иммунотерапии - широко используется для активации противоопухолевого иммунитета. Наибольшего успеха БЦЖ-иммуиотерапия достигла в лечении рака мочевого пузыря (Morales А., 1976; Lamm D.L., 1985, 1992), хоторый служит уникальной моделью для изучения механизмов противоопухолевого иммунитета н поиска путей его усиления.

Многое в этом отношении уже сделано: идентифицировании иммунокомпетентные клетки, инфильтрирующие опухоль; цитокины н биологически активные молекулы, появляющиеся в процессе БЦЖ-терапни, и, по всей вероятности, принимающие в ней участие (Bohle А., 1990; El-Demeri M.I.M. 1987; Fleischniann J.D., 1989; Haaf Е.О., 1986; Jackson А., 1992; Prescott S., 1989, 1990, 1992; Ratlif T.L., 1986; Wang M., 1991). Однако до сих пор остаются неясными механизмы взаимодействия клеток-эффекторов и опухолевые клеток. Ключевыми моментами в этом взаимодействии являются цитокины, рецепторы к ним как на опухолевых, так и на эффекторных клетках, молекулы адгезии и факторы их индуцирующие.

Изучение этих вопросов представляется весьма актуальным не только для понимания механизмов противоопухолевой защиты, но также и для разработки эффективных путей ее усиления, что н составляет смысл иммунотерапии опухолевых заболеваний.

Цель и зчдачи исслеппнания. Цель настоящей работы - изучение механизма межклеточных взаимодействий при проведении эффективной противоопухолевой БЦЖ-иммунотерапии карциномы мочевого пузыря. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Оценить функциональную роль молекул адгезии во взаимодействии клеток-эффекторов с клетками опухоли.

2. Исследовать механизмы индукции и активации молекул адгезии и факторы, влияющие на эти процессы.

3. Изучить роль факторов роста в иммунотерапии опухоли.

ШуУШЯ-ЦСПШНа. Впервые показано значение молекул адгезии ICAM-1,2 и LFA-I в механизме лизиса опухолевых клеток мочевого пузыря и изучен-механизм индукции молекул адгезии ICAM-1 на опухолевых клетках.

Выявлен факт продукции растр.оримой формы молекулы адгезии 1САМ-1 во время иммунотерапии рака мочевого пузыря, исследован механизм ее продукции и езязь с индукцией мембранной формы ICAM-1. Впервые продемонстрировано, что двухвалентные катионы марганца усиливают образование коньюатов между опухолевыми и ЛАК-клетками за счет LFA-1-завиекмых механизмов.

Впсрвне показано, что циготоксическое денстзпе цитокиноз на опухолевые клетки переходно-клеточного рака реализуются через модуляцию рецептора для эпщериальнот фактора роста.

Практическое значение. На основе токсического действия мочи больных, получавших иммунотерапию на чувствительную линию RT4 разработан в предложен для. практической работы универсальный тест оценки противоопухолевого ответа больного, использующимся для контроля иммунотерапии рдха мочевого пузыря.

Разработал и предложен для использования пеннвазшшмй прогностический тест для оценки чуЕСтвптелыюста опухоли к иммунотерапии, базирующийся на определении продукции растворимой формы молекулы адгезии ICAM-1.

Внедрение в практику н публикации. Разработанные тесты оценки противоопухолевого ответа больных на иммунотерапию БЦЖ рака мочевого пузыря представлены в виде информационного письма (план издания МЗ РФ -1993г.). Они используются в клинике хирургии г. Эдинбурга (Великобритания) и клинике солидных опухолей НИИ детской гематологии МЗ РФ. Материалы диссертации используются для подготовит грачей на выездных циклах и на рабочем месте в клинике НИИ детской гематологии МЗ РФ.

Результаты диссертации опубликованы в двух статьях.

Апробация диссертации. Материалы диссертации обсуждены на международных конференциях в Великобритании (Imperial Cancer Research Fund, London, dec. 1991; British Society of Immunology, Sheffield, apr. 1992; Ediriburg urologicnl festival, Edinburgh, aug. 1992; International symposium on the clinical potential of inter!eukin-2, London, sept. 1992;), Венгрии (8th International

Congress of Inuîiuaology, Budapest, aug. 1992), Германии (Uro-Onkologit Immunothérapie, Essen, feb. 1992), России (секция детских гематологш Московского общества детских врачей, март 1993- г.). Материаль диссертационной работы доложены также на Ученом Совете ннститутг детской гематологии МЗ РФ.

Структур» и объем пнссертапии. Диссертация изложена на стр. машинописного Текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа !щлюстрирована 63 таблицами и 36 рисунками, Библиография включает 227 источников, из которых 35 - отечественных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В данной работе мы использовали панель из 8 стабильных клеточных линий переходно-клеточиого рака мочевого пузыря 1-ГП степеней • аг.охачествеииости, предоставлены* доктором J. Masters из Института урологии (Лондон), доктором P. Périmasй (Стокгольм, Швеция), и доктором j. Boyd {университет Эдинбурга, Соединенное Королевство) (см. таб. 1).

-Таблица 1

Î Клеточная линия Степень злокачественности'

Родительская опухоль Культивируемая линия

j RT4 î I I

имисз ? I

RT1Î2 П П

MGH-U1 Ш 1П

EJ18 ш m

SD III m

J82 DI ш

15637 III m

Также били исследованы биологически активные вещества (цмтокннь/, растворимые молекулы адгезии) и бнопснГпшй материал от 10 больных в период ЕЦЖ-терапшг, находившихся на лечении в Urology, Western hospital, Edinburgh, UK (под руководством prof. G. D. Chisholm). Клинический материал получен благодаря Dr. S. Presott. Верификация диагноза проводилась п -ой же клинике и в университете г. Эдинбурга (Pathology, University of Edinburgh, UK).

Курс лечения пациентов поверхностным раком мочевого пузыря состоял пз б еженедельных инсталляций Evans БЦЖ-вакшшы (Glaxo юш), Непосредственно перед инсталляцией БЦЖ мочевой йузырь опорожняли. Каждая нкстилляция ссстояла из 1-5x1колоний формирующих единиц БЦЖ, растворенных в 60 мл физиологического раствора натрия. Инсталляция удерживалась в пузыре на протяжении 2 часов. Рутинная бнопснч с целью гистологического обследования проводилась перед курсом Б ЦЖ-терапии и через б недель после огмгыит едка.

В ссеязгозаинях npswaiietta стандгртые методы нкдуКЦин ЛЛК-клеток и iip©s<«rehti£i ЛАК-лнзясй с ювлбождеядом радиоактивного хрома (Jackson A.M., 15-J2; Клаус Д., 1590). Типцроышк ЛАК- и опухолевых клеток проводилось с использованием моноклозгздааих антител методами проточной цнгофлуометрин н пито- и шстстшугдахпмин (Клаус Д., 1990). Специфичность моноклональимх и поликлоналышх (♦) антител приведена в табл. 2. Номерами я таблице обозначены источник антител: 1- Scottish antibody production unit, 2-Dako, 3-Dccton Dickenson, 4-Dr. T. A, Springer, 5-Geuzime, 6-Dr. I. Trowbridge, 7-Britis!i Biotechnology, 8-Dr. A. Meager (NIBSC). Также показапи разведения, антител, в которых они были использованы для цитофлюеметрнческого исследования. Для проточной вдтофлуометрни первичные моноклоиальные антитела определялись с гозмощыо бараньих антимышннных-igG F(ab')2 фрагментов, меченных флуоресценшпоткоцнанатом (ФИТЦ). (Sigma Chemicals Со). С помощью этих же антител при необходимости проводилось блокирование антигенных детерминант so время ЛАК-лнзнса и других тестов.

Стимуляция ЛАК-клеток, а также модуляция молекул адгезии и других функциональных молекул, участвовавших в механизмах иммунотерапии, проводилась с помощью рекомбниантных цнтокинов (интерленкнна-2 (ИЛ-2), интерферона-гльфа и гамма (ИФН-а,-у), фактора некроза опухоли альфа (ФНОа), фанулоцитарно-ыакрофагального ксшониестнмулирущего фактора (ГМ-КСФ), трансформиру-ющего фактора роста бетта (ТФРр), эпндермального фактора роста (ЗФР) и др.). Для изучения процесса активации

молекулы ' адгезии ЬРА-1 применялся нитофлуометрический метод исследования конъюгирования эффекторных клеток и клеток-мишеней, описанный Са\'егес Ь. (Сауегес Ь., 1990). Количество цнтокннов и растворимых молекул адгезии в супернатантах клеточных культур и моче пациентов определялось с помощью колшерческнх нммуноферментных наборов (мочу исследовали по методу, описанному РгеБсои Б., 1990). Определение токсического действия цнтокинов на опухолевые клетки проводила с помощью инкорпорации витального красителя (модифицированный метод для определения цитотоксического действия ФНОа на линию Ь929).

Таблица 2.

Источник антител, использованных в исследованииях.

Антиген Альтернативное Источник Разведение для

название цитофлуометрии

CD2 1 1:50

CD3 - 1 1:50

CD4 • 1 1:50

CD8 - . 1 1:50

GDI la LFA-la 2 1:50

CDÎ8 LFA-ip 2 1:50

CD22 - 1 -

CD25 IL-2R 3 1:100

CB54 ICAM-1 . 4 1:200

CD56 NCAM 2 1:50

ICAM-2 4 1:100 . .

РЭФР 5 1:400

МНС класс И б 1:64

VCAM 7 1:50

ИФНу* 8 -

ФНОа* 8 -

Работа выполнена на базе Wilkie Lab, Surgery Dept., Uuiversity of Edinburgh,-UK (руководитель - проф. иммунологии К. James) и КИИ детской гематологии России, Москва (руководитель - проф. А.Г. Румянцев). Данная работа финансировалась Scottish-Sibirean Student Medical Exchange (Великобритания), The Cancer Research Campaign (Великобритания), Singapore

Cancer Society (Сингапур), University of Edinburgh (Великобритания), НИИ детской гематолопш (Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Роль молекул адгезии п ЛАК-лнзнсс клеток карциномы мочевого пузыря. В проведенной работе с помощью окраски моноклоналышмя антителами и щггофлуометрического анализа мы показали, что клетки переходно-клеточного рака (ИКР) постоянно эхспрессируют молекулы адгезии iCAM-1 и ICAM-2, а паске подтвердили данные других исследователей о том, что Л А К-клетки репрессируют лигавд для этих молекул - молекулу LFA-1 (Fïgdor C.G., 1990; Pierre L., 1992). При этом, в наших исследованиях, параллельно увеличению :тепенп злокачественности линий ПКР (от I степени.'к Ш) экспрессия [СЛМ-2 уменьшалась, а экспрессия ICAM-1 - возрастала.

Мают выявлена прямая достоверная корреляция между постоянной зкспрессчей молекз'л адгезии ICAM-1,2 на клетках ПКР и их ¡упстпптелшостыо к JlAK-лизису (р<0,01) (рис. 1).

Мы продемонстрировали, что антитела к молекулам адгезии ICAM-1,2' m клетках-! мишенях блокируют ЛАК-лнзис хлетсх карциномы мочевого ¡узыря. Копта клетки иреинкубировали перед ЛАК-лизпссм- с airra-ICAM-l ¡птителамн, а затем отмывали и проводили тест, то уменьшался лизис клеток тяни, которые постоянно эксирессировали значительное количество ICAM-1 'на линиях 182, SD, 5637, MGH-U1, EJ13), причем, степень суиресспи лизиса юотвествсвала уровню экспрессии молекул адгезии. Когда же блокаду етпггелами проводили как до, гак п непосредственно во время лизиса, то ггблтодалось дальнейшее зпачнтельпое нодаьпепне кшишпга клеток. Тем ие îeaee, антитела не могли подавить лизис клеток полностью.

Антптела к молекуле адгезии ICAM-2 подавляли ЛАК-кшшииг слабее и олысо у одной Я1шш: (лнния UMUC-3, единственная линия, которая [остоянно зкспресснросалэ значительное количество ICAM-2). Следует тмгтить, что песмотр.т на показанное ранее прогностическое значение кспресслн молекул МНС П класса, и их возможную роль в презентации пухоль-ассощшропанних антигенов при активации иммунной системы, казалось, что они де играют участия непосредственно в Л А К-лизисе (Altmann ).М., 1989; Batsman W.J., 1991).

Также нами продемонстрировано, что ЛАК-лнзис можно подавить при локаде молекулы адгезии LFA-1 (лнганд для ICAM-1,2) па ЛАК-клетках. При гоы супрессия ЛАК-лизиса была сильнее, нежели при блокаде апти-1САМ-1,2

¡с

Показаны коэфициент корреляции (К) и уровень достоверности (р).

Рис. 1. Корреляция между постоянной экспрессией молекул адгезии 1САМ-1 и 1САМ-2 на клеточных линиях ПКР и их чувствительностью к ЛАК-лизнсу.

втителами. Ми пнтепретнровали это как основание для существования ополшгсельного лнганда для ЬЕ;А-1, также играющего роль в иммунотерапии, [м может быть недавно идентифицированный 1САМ-3 (йе РоидегоНев АД., 992). К сожалению, ввиду отсутствия в настоящее время коммерческих НТП-1СЛМ-3 антител, нам не уда!ось проверить это предположение.

Так как в процесс ЛАК-лпзнса мо(уг быть повлечены другие молекулы дгезни, мы исследовали клеточные линии ПКР на предмет их экспрессии. 1аш не было выявленпо экспрессии других молекул адгезии, включая ЬРА-1, ,РА-2, ЬРА-З, 1МСАМ, УСАМ-! (последний является лнпшдом для УЬА-4, кспрссснрующсгсся па лейкоцитах). Таким образом, нам удалось показать, то ЛАК-лнзнс клеточных линий ПКР критически зависит от экспрессии на их молекул адгезии 1САМ-1.2 н молекул ЬРА-1 - на ЛАК-клетках.

Из изложенного ясно, что ряд молекул адгезии вовлечен в процесс ЛАК-пзпса. Также известно, что ЛАК-лнзнс требует непосредственного контакта Брондз Б.Д., 1937). Несколько исследований било предпринято с целью зучения влияния адгезии п соответствующих молекул в 1ЧК- и ЛАК-ктнвности. С помошыо цнтонммунохнмнческон окраски мы подтвердили бразование конъюгатов между опухолевыми к ЛАК-клеткамн. При этом, казалось, что ЛАК.-клеткн достоверно предпочитают коиъютровать с ■нухолсвыми клетками, экс премирующими молекулы адгезии 1САМ-1 р<0,02). Нами также выявлена прямая корреляция между между числом ЛАК-леток, одновременно конъюгируюшнх с одной опухолевой клеткой, и упствнтельнсстыо к ЛАК-лнзнсу. Несмотря на то, что изучено только 4 легочные линии, корреляция достигла достоверного уровня (р<0,01). 1олученные данные подтверждают значенне непосредственного контакта леток н молекул адгезии в процессе ЛАК-лтиса.

Дня дальнейшего изучения процесса адгезии было исследовано .онъюгированме с помощью цитофлуометрического способа. Было показано, то все линии конъюгаровали с ЛАК-клетками. Причем, этот процесс был ыстрым (наступал уже через 1 минуту после их сближения) и оставался табнльным. Преннкубацпя с моноклинальными антителами к молекулам дгезнн 1САМ-1, 1САМ-2 и ЬРА-1 подавляла образование конгюгатов. Тем не юнее, оказалось, что корреляция между процентом, конъюгнрующих пухолевых клеток и ЛАК-чувствительностью не достигла достоверного ровня (р>0,2). Более того линия ЛТ112, наименее подверженная ЛАК-лнзнсу, бразовывала максимальный процент конъюгатов. Как мы полагаем, это может ыть объяснено тем, что о Л А 1С-лизисе ведущую роль играет не общий рэнент образованных конъюгатов, а количество одновременно

взаимодействующих клеток. Возможно, биологически-активных веществ одной ЛАК-клетки недостаточно для киллинга мишени и необходима, так сказать, критическая масса атакующих ЛАК-клеток.

Рядом исследователей установление, что для ЛАК-лнзиса экспрессия LFA-1 обязательна, но недостаточна. В частности, требуется экспрессия ее активной формы (Dransfield 1., 1992; Figdor C.G., 1990). Например, свежевыделенные лимфоциты, несмотря на экспрессию LFA-1, не конъюшруют с опухолевыми клетками. Однако, после стимуляции интерлейкшюм-2 они приобретают способность к адгезии. Полагают, что в процессе активации молекула LFA-1 конформациоино изменяется, начиная экспрессировать эпитопы LI б и 24 (Dougherty G.J., 1988, Dransfield I., 1989, 1990; Keizer G.D., 1988; Van Kooyk Y., 1991). Показано, что для экспрессии активной формы LFA-1 и нормального протекания LFA-1-зависимых функций Т-клеток необходимо наличие двухвалентных катионов и ннтактность цитоскелета и энергетических процессов (Dransfield I., 19S9, 1990; Dustin M.L., 1989; Rothlein R., 1986; Figdor C.G., 1990; Marlin S.D., 1987). В наших исследованиях показано, что адгезия ЛАК-клеток к клеткам ПКР также критически зависит от энергетических процессов и присутствия двухвалентных катионов. При удалении катионов кальция с помощью ЭГТА уровень конъюгатов был снижен, а при удалении всех дивалентных катионов -практически подавлен. В литературе имеются данные о роли катионов кальция, магния и марганца в активации LFA-1 Т-клеток (Dransfield I., 1992). Эти исследования показали существование на LFA-1 эпитопа 24, экспрессия которого зависила от присутствия катионов магния. Катионы кальция ингибировали и экспрессию 24 эпитопа, и LFA-1-зависимое конъюгирование Т-клеток, при этом они конкурировали и с ионами магния, и с нонами марганца.

В наших исследованиях все три катиона (кальция, магния и марганца) усиливали конъюгирование ЛАК-клеток и клеток ПКР. В отсутствии кальция, катионы магния и марганца еще больше увеличивали формирование конъюгатов. Ионы кальция конкурировали с ионами магния, но не марганца. При этой исследования проводились при тех же концентрациях катионов, что и у Dransfield (0,1-10мМ). Основываясь на наших исследованиях, мы полагаем, что предположение Dransfield о том, что катионы кальция могут ифать отрицательную роль в регулировании активности LFA-1, возможно выполняются не всегда. Вопрос о том, существует ли разница между молекулами LFA-1 на ЛАК-клетках и на классических Т-клетках, требует дальнейших исследований. Следует отметить, что ранее, несмотря на

конкуренцию катионов кальция и магния, не было показано, что катионы марганца активируют Т-клеточную адгезию за счет изменения непосредственно' LFA-1, а не других клеточных структур (Dransfield I., 1992). Нам удалось ингибировать усиление коныогирования, обусловленное ионами марганца, с помощью азида натрия, холодовой реакции и анти-LF.'-l антител. Мы рассматриваем это как доказательство того, что ноны марганца усиливают конъгогирование опухолевых и JIAK-клеток за счет LFA-1-зависимых механизмов (возможно, связываясь с катион-связывающимися участками LFA-1, вызывая ее конформационные изменения и активируя ее).

Роль цитокниов, продуцируемых во время БЦЖ терапии, в индукции молекул адгезии, образовании конъгогатов и повышении чувствительности клеток опухоли к ЛАК-лизису. Рядом исследователей показано, что во время БЦЖ-терапил продуцируется ряд цитокинов, включая ИФНу, ФНОа, ИЛ-2 и ipyme (Prescoít S., 1990; Bohle А., 1990; Fleischmann J.D., 1989). С помощью тнтофлуомьгрлческсго анализа нами продемонстрировано, что ИФНу шдуцирует окнресспю молекул адгезии ÍCAM-1 на 7 из 8 клеточных линиях ТКР. Помимо увеличения ICAM-1 положительных клеток, также ■ возрастала шотность молекулы на клеточной поверхности. Индукция была быстрой (в ■ечешш нескольких часов), дозо- и время зависимой, и индуцировалась при юнцентрации цптокина, наблюдаемой in vivo (при концентрации 1-100 ед/мл). Отсутствие экспрессии и индукции ICAM-1 на одной линии (UMUC-3) даже [ри массивной и сверхдолгой стимуляции (более 200 часов при концентрации о 2000 ед/мл), мы полагаем, связано с общим нарушением регуляции кспрессин гена ICAM-1.

ФНОа также индуцировал молекулу адгезии ICAM-1 на линиях ПКР. 1пдухция была быстрой, дозо- и время зависимой, но слабее, чем при тимуляции ИФНу. Следует отметить, что in vivo наблюдается одновременная родукция ИФНу и ФНОа. Мы обнаружили, что ИФНу и ФНОа обладают инергизмом при индукции ICAM-1 на опухолевых клетках (рис. 2), Этот :}>фект обнаруживался в концентрациях, встречаемых in vivo (1-10 ед/мл).

В наших исследованиях с помощью метода коиъюгарования показано, то инкубация клеток ПКР с ИФНу усиливает адгезию, увеличивая процент мгьюгатов, что мы связали с индукцией ICAM-1. Кроме этого ИФНу араллелыго индукции молекулы адгезии ICAM-1 увеличивал восприимчивость петок ПКР к ЛАК-лизису (рис. 3). Этот эффект наблюдался для линий с гаосительно большим возрастанием скпрессии ICAM-1 (линии RT4, RT112). то же время нам не удалось увеличить чувствительность к ЛАК-лизису на

У

х

I &

ЯТ4

10 100

и

П)

8 о

е-

60

40

20

т

10

-г-

100

ЛТП 2

Концентрация цитопшов (ед/мл)

. I

Клетки стимулированы с ИФНу (♦), ФНОа (в), шш их комбинацией (■) течение 24 часов.

о

1

Рис. 2. Синергизм ИФНу и ФНОа в индукции 1САМ-1 на опухолевь клетках дл* 2 клеточных амниигЯТЧ ч КТИ2..

-8Т-

"7 80

Р

I 8*

а

я

ё

8 о о, С

60

40-

20

к

ИМ

ж

ш

Концентрация ИФНу (ед/ил)

.3

§ 1 6 I.

1*1 К 8

В

«

О 30 60 90

Процент специфической цитотоксичяости

Показано увеличение экспресии 1САМ-1 (и) и их чувствительности к ЛАК-лизису (0) для лнннв КТ4.

I

Рис. 3. Стимуляция опухолевых клеток ИФНу усиливает пх чувствительность к ЛАК-лизису.

линиях у которых либо постоянно экс премировалось большое количество ICAM-1 (линии EJ18, J82), либо совсем не удавалось нндуцнровать ICAM-1 (линия UMUC-3). Сходные данные были получены Naganuma на модели иейробластомы (Naganuma Н., 1991).

• Интересно, что увеличение чувствительности к ЛАК-лнзнсу под действием ИФНу блокировалось aimi-lCAM-1 антителами. Прн этом антитела подагляли ЛАК-активносгь не полностью. Кроме того, линия RT4, в покое экслресснрующая незначительное количество молекул адгезии (6% ICAM-2), тем не менее была чувствительна к JIAK-лизису (процент цнтотокспчности около 30%). Мы рассматривали это как доказательство существования дополнительных механизмов, участвующих в ЛАК-лнзисе (возможно эта роль принадлежит ICAM-3).

Нам не удалось нндуцнровать ICAM-1 с помощью друтх цптокинов, включая ИФНа, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-б, ИЛ-8, ГМ-КСФ, ТФРР, ЗФР. Также нами не бшю выяаленно возможности индуцировать с помощью ИФИу нлк ФНОа на опухолевых клетках другие молекулы адгезии, включая ICAM-2, LFA-1, LFA-2, NCA.M и VCAM-1.

Исследовав кммуноппстохнмнчески биопсии больных с карциномой мочевого пузыря до лечения, а также с помощью окраски монсхлоналышмн антителами и последующего цнтофпуомегрнческого анализа опухолевые клетки, выделенные из таковых, мы 'не обнаружили экспрессии молекул адгезии ICAM-1,2. Вопрос о том, индуцируются ли они во время терапия in vivo, требует дальнейшего изучения.

Действие цитокинов in vivo и in vitro может значительно отличаться, поскольку, in vivo их действие может моделироваться другими цнтокннаш или их растворимыми рецепторами (Englemann Н., 1989; Marcon L., 1988; Novivk D., 1989). Тем ие менее, в нашей лаборатории показано, что моча больных во время иммунотерапия; (как к чистые цитокшш in vitro) модулирует экспрессию молекул адгезии ц МНС II класса, н что действующим началом в ней является ИФНу (Jackson A.M., 1993).

Таким образом, мы показали что цнгокины, продуцируемые во время БЦЖ-терапии, а именно, "ИФНу или ФНОа синергачно увеличивают экспрессию молекул адгезии ICAM-1 на опухолевых клетках, что облегчает их ЛАК-лизис. Возможно в этом процессе дополнительно участвует ряд других компонентов, включая ICAM-3.

Механизмы индукции молекул адгезии. Были нзучены кинетика и механизм индукции молекулы адгезии ICAM-1. Показано, что значительная индукция

экспрессии ICAM-1 определяется уже через 4 часа после начала стимуляции ИФНу. Кроме того для индукции молекулы адгезии было достаточно небольшого промежутка времени. Такая быстрая индукция мота быть обусловлена наличием внутриклеточного пула либо мРНК, либо протеинов молекул адгезии ICAM-1 (Beuiler В., 1986а, 1986b; Coüart М.А., 1986; Fentoa M.J., 1987). Наши исследования с применением актиномпцнна Д (ингибитора транскрипции) и циклогскснмнда (CHX, блокатора протеинового синтеза) показали, что при индукции ICAM-1 необходима транскрипция и протеиновый синтез. У одной линии - MOII-U1 - шкпбицня транскрипции хотя и ие подавила индукцию полностью, но тем не менее снизила ее в 2 раза. Это, возможно, объясняется наличием некоторого внутриклеточного пула мРНК в покое. Исследования ингибншш протеинового синтеза с помощью CHX показали, что ситуация неоднозначна и, что для 2 из 3 линий (исключение -линия MGH-U1) при нвдукции 1САМ-1 необходим протеиновый синтез.

С другой стороны нами установлено, что при постоянной стимуляции ИФНу максимальная индукция 1САМ-1 достигает через 24 часа, а затем начинает снижаться (рис. 4). Когда ;ке мы после максимальной индукции 1САМ-1 (через 24 часа после начала стимуляции ИФНу) блокировали протеиновый синтез с помощью CHX, то неожиданно экспрессия ICAM-! ие только не уменьшилась, но стала возрастать.

Рядом исследователей показано существование растворимой формы ICAM-1 (sICAM-1) (Rothlein R., 1991; Tsujisaki M„ '991). Мы исследовали зозможность продукции sICAM-1 линиями ПКР. Оказалось, что в покое тетки ПКР не продуцировали большого количества slCAM-1, но после ггнмуляции ИФНу продукция sICAM-1 значительно возрастала (в 2x1Q2 раз). Следует отметить, что количество sICAM-1 в супернатаитах увеличивалось юстепенно н максимальная продукция достигалась только через 48-96 часов >т начала стимуляции (что по временн совпадало с уменьшением экспрессии САМ-1 на мембране после ее индукции).

Мы также исследовали продукцию sICAM-i после блокады фотеннового синтеза на высоте индукции экспрессии ICAM-1 (CHX добавили ерез 24 часа после начала стимуляции ИФНу). В отсутствии CHX продукция ICAM-1 с течением временн увеличивается, но а присутствии CHX родукция sICAM-1 практически прекращалась (рис. 5).

Клетки стимулировала И®- (100 ед/ил) в течение 24 часов, затем отмыта в инкубировала в отоутотака СИ) ш прдоутотаин (И) шшлогекоющца (I иг/ил). Показано стандартное отклонение.

Рис, 4. Ингабпция протеинового синтеза стабилизирует 1САМ-1 на мембране опухолевых клеток,

о

. «1

&

30

го-

ю

О 48 72

Общая про дсшштед изо о т ъ изшубярования в часах

Слетки стииулвроваш ШЬг С100 ед/мл) в течэнве 24 часов, затем >тнытн н шшубироваш в отсутствии СО) или присутствии С а 3 шклогексиннда (I иг/мл). Показано отаядартаов отклонение.

Рис. 5. Цнклогексяши прекршцает продукции растворимой формы 1САМ-1 лшшеЙ ИТ-4.

Таким образом, в нашей работе мы исследовали происхождение растворимой формы молекулы адгезии ICAM-1 и механизм ее образования. Нами показано, что растворимая форма является но существу мембранной формой, "спущенной" с клеточной поверхности активным путем, требующим предварительного протеинового синтеза. Это подтверждается связью кинетики этих двух форм, и тем, что их количество находится в обратной связи.

Мы также идентифицировали продукцию sICAM-1 in vivo во время БЦЖ-терапйн. Продукция sICAM-1 не обнаружена до иммунотерапии и у здоровых людей. В процессе ЕФК.-терапии она, кои правило, возрастала. Следует отметить, что продукция цнтокннов также обнаружена только со время иммунотерапии (Prescott S., 1990). Если учитывать количество sICAM-1 продуцируемого in vitro линией SD (это наиболее продуктивная линия), то продукция sICAM-1 in vivo (максимально около 6 цг за ннепшляцшо) (.оответствует 1,7x10^ клетох-продуцептов, In vivo нами не было отмечено корреляции ме;:;ау продукцией si САМ-J и продукцией ИФНу, ФНОа, что может быть объяснено влиянием других цитокшюв либо их растворимых рецептороь (Eng'emann Н., 1989; Mareen L., 1988; Novivk D., 1939). . Кроме того продукция sICAM-1 была отмечена с течении 12 часов после инетилляции, что отличается от ее продукции клетками ПКР in vitro. Источник slCAM-1 in vivo требует дальнейшего изучения. Продукция sICAM-1 может играть положительную пр'огасстическую роль, показывая чувствительность опухоли к иммунотерапии.

Нами исследована возможность пульс-стимуляции молекулы адгезии ICAM-Í. Выше уже обсухдалось, что при непрерывной стимуляции экспрессия ICAM-1 начинает снижаться после достижешш максимума (через 24 часа, от начала стимуляции). Однако, при повторных' стимуляциях экспрессия ICAM-1 возрастали пропорционально увеличению частоты стимуляций к умешьшецЕго шрерыва между ннмп. Мы предполагаем, что механизм кндукдна ICAM-1, возможно, регулируется по типу обратной связи, и добавочная стимуляция запускает era вновь. Тем не менее, оп требует дальнейшего изучения.

Mi; также моделировали in vitro лечение карциномы со стимуляцией клеток ПКР ИФНу по текущему протоколу (Prescott S., 1990). Прп добавочном стимулировании кам удалось повысить иядухдию молекул адгезии ICAM-1. Ранее мы показали, что экспрессия ICAM-1 усиливает чувствительность к ЛАК-лизису. Полученные данные позволяют объяснить большую эффективность протоколов с интенсификацией лечения (Haff Е.О., 1985). Возможно, данную терапию можно улучшить через ее дальнейшую

интенсификацию, как это недавно произошло при лечении лейкозов по протоколам BFM. Вероятно, токсичность таких протоколов будет также возрастать, но ее, возможно, смогут преодолеть с помощью эффективной впомогательной терапии.

Значение модуляция экспрессии рецептора к зпидермалиому фактору роста в цнтотоксичекком эффекте цитокинез на клетки ПКР. Hawkyard показал, что цитокнны, продуцируемые во время иммунотерапии, обладают цитотокснческнм эфс[>ектом на клетки ПКР, причем его степень варьирует для разных линий (Hawkyard S., 1992). Хотя не удалось выявить механизм этого явления, тем не менее, установлено, что он не связан с экспрессией или аффинностью рецепторов для самого ИФНу. Исследования в других клеточных системах показали, что токсический эффект цнтокинов на опухолевые клетки может опосредоваться через модуляцию рецептора для эпидермльнош фактора роста (РЭФР) (Bernstein W., 1981). В наших исследованиях показано, что экспрессия РЭФР на клетках ПКР, а также число живых опухолевых клеток может быть моделирована цнтокниами, секретируемыми при БЦЖ-гераиии. Следует отметить, что между клеточными линиями выявлены ратпчия в степени реагирования на цнтокнни, Линия RT4, наиболее подверженная модуляции рецептора, отвечала на цитотоксическое действие цнтокинов намного сильнее, по сравнению с линиями SD и UMUC-3. ИФНу практически уничтожал ее.

Ситуация in vitro и in vivo может сильно различаться, так как in vivo может одновременно действовать смесь цнтокинов и их растворимых рецепторов, которые могут взаимно усиливать, ослаблять, модифицировать или блокировать действие друг друга (Engleinana Н., 1989; Marc on L., 1988; Novivk D., 1989). Для проверки этой гипотезы, мы провели цнтотоксическнй тест с мочой пациентов во время БЦЖ терапии. Нам удалось показать, что моча гили пациентов после б инсталляции (но ни моча после первой инсталляции, ни моча здорового человека) практически полностью убивала клетки линии RT4 (показано, что щпчшшы содержатся в моче, главным образом, после шестой, но не после первой инсталляции). В то же время моча тех же Зольных практически не влияла на число живых клеток для линии SD н UMUC-3. С помощью нейтрализующих экспериментов с ионоклональнымн штнтелами к цнтокинам, мы показали, что действующим началом в моче зольных является ИФИу. Причина отсутствия достоверного эффекта ФНОа остается спорной, но ми полагаем, что либо его действие не достигло 'критического" уровня на модуляцию экспрессии рецептора, влекущего за

1,-1 - —ч

собой цитотохсический эффект, либо в мочу одновременно секретпроватшсь его рецепторы, киаетивироззвшне ею действие (Englemann Н., 1989).

На основе полученных данных мы предложили использовать эффект мЬчи больных во рромя иммунотерапии на линию RT4 как тест для прогноза терапии. Следует отиетить, что предлагаемый гест сравнительно дешев (а сравнении со стоимостью коммерческих кптоо дня определения цитокшсв) и в некг одновременно оценивается а?{>фект комбинации всех цитокгшап, продуцируемых во время БЦЖ-иммунотерашш.

На оснований проведенных исследований и данных литературы предлагаем следующую цепь событий, характеризующую цепь событий, характеризующих механизмы зффектиаиоа ЕЦЖ-нш.(употерагпш рака иочсбсго пузыря.

На первом этапе, происходит ннстклляцка БЦЖ микроорганизмов в мочевой пузырь. БЦЖ поглощаются резидентными макрофагами, процессируются ими, активируют и заставляют их сегрегировать цитокшш н хемотаксические факторы (например, ИЛ-1,-8, ФИОа).

На следующем этапе макрофаги, а также привлеченные хемотаксическими иеществамн и активированные цитохинами лимфоциты и нейтрофилы секрстчруют каскад цитокииов, включая ИЛ-1,-2,-6,-8, ИФНу, ФНОа и другие. ЛАК-оетки проявляют сьое цктотоксическое действие. Вшмсжио, что клетки карциномы, как и макрофаги, могут также процессироЕать БЦЖ, служить антиген-презентирующимн клетками для Т-клеток, секретнровать продукты типа Heat shot proteins и ФНОа, увеличивая активацию макрофагов и лимфоцитов. Действие цнтокинов многофакторно, они:

1) усиливают активность самих JlAK-клеток,

2) индуцируют молекулы адгезии на опухолевых клетках, увеличивая их вое примчи вость к ЛАК-лнзису,

3) индуцируют молекулы МНС II класса на опухолевых клетках, усиливая их антигенпрезентирующие свойства,

4) обладают непосредственным цито токсическим действием на опухолевые клетки, возможно, через модуляцию рецептора для эпидермального фактора ррста.

В данной модели роль растворимой формы ICAM-1 требует дальнейшего изучения. Представляется важным иммунологическая оценка отдаленных результатов иммунотерапии, так как элиминация опухачи происходит в течении 3 месяцев после начала первой инсталляции БЦЖ.

ВЫВОДЫ:

1. Иммунотерапия рака мочевого пузыря вакщшой БЦЖ является эффективным методом лечения опухоли и служит моделью для изучения механизмов ЛАК-лнзиса, опосредованного цитокшшш г молекулярными межклеточными взаимодействиями.

2. Необходимым условием ЛАК-лнзиса опухолевых клеток является участие молекул адгезии 1С AM-1,2 на опухолевых клетках мочевого пузыря п LFA-1 - на ЛАК-клетках.

3. Индукция экспрессии молекул адгезии ICAM-1 на опухолевых-клетках происходит под синергачным действием цитокинов (ИФНу и ФНОа), вырабатываемых нммунокомпетентными клетками в процессе иммунотерапии.

4. Непосредственное гогготокснческое действие цитЪюшоз (ИФНу и ФНОа) на опухолевые клетки реализуется через модуляцию рецептора для эпидермального фактора роста.

5. Опухолевые клетки при культивировании in vitro продуцируют растворимую форму молекулы ICAM-1 под действием цитокшгоз. Растворимая форма ICAM-1 выявлений в моче болышх в процессе инсталляций БЦЖ. Образование растворимой формы ICAM-1 происходит путем ее "слущивания" : клеточной поверхности активным путем, требующим предварительного протеинового синтеза.

6. Индукция экспрессии молекулы адгезии ICAM-1 возрастает при товторион пульс-стимуляции опухолевых клеток интерфероном-гаима.

7. Установлено, что двухвалентные катионы марганца усилились г образование конгюгатов между опухолевыми и ЛАК-клетками за счет LFA-1-1ависимых механизмов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ :

1. Определение растворимой формы молекулы адгезии ICAM-1 в моче )ольпых раком мочевого пузыря в динамике иммунотерапии БЦЖ может быть юпользовано для оценки чувствительности опухоли к иммунотерапии.

2. Тест токсического действия мочи больных раком мочевою пузыря на легочную линию RT4 отражает суммарный противоопухолевых! ответ юльного и предложен для контроля иммунотерапии рака мочевого пузыря.

CIÎHCQK PABOT, OnyBJIHKODAlfliLIX HO TEME flHCCEPTAUUiï:

1. Role of adhesion molecules in lymphokine-aciivaterj killer cell killing bladder cancer cells: further evidence for a third ligand for leucocyte functic associated antigen-1. - Immunology, 1992, V.76, P.286-291. (b eoacT. c A.! Jackson, S. Prescott, K. lames, G.D. Chisholm).

2. Expression of adliesioa molécules by bladdeï cancer cells: modulation interferon-garnma aud tumour nccrods factor-alpha, - The Journal of Urolo; 1992, V. 148, P. 1523-1586. (b conr.r. c A.M. Jaoksou, S. Prescott, K. James, G. Chisholm).

3Q№3 ^ №0 <Jiiuj3 Qjfc /00 J/?3

MfO P&