Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Цитокинсинтетическая активность лимфоцитов периферической крови при остром лимфобластном лейкозе у детей

На правах рукописи

Р Г Б од

15ЯНВ 2004

МАЗИТОВА ЕЛЕНА НАИЛЬЕВНА

ЦИТОКИНСИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ ЛИМФОБЛАСТНОМ ЛЕЙКОЗЕ У ДЕТЕЙ.

14.00.09 - педиатрия 14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2003 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте педиатрии ГУ Научного центра здоровья детей Российской академии медицинских наук.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Торубарова Надежда Анатольевна Тепаев Рустам Фаридович

Финогенова Наталья Анатольевна Погорелов Валерий Михайлович

Ведущая организация:

Российский Государственный Медицинский Университет МЗ РФ

Защита состоится « » ^/¿с^ё^/^-Л7_2004 года в У'*?' часов

на заседании диссертационного совета Д 001.023.01

при ГУ Научном центре здоровья детей РАМН

по адресу: 119991 Москва, Ломоносовский проспект, д.2/62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научного центра здоровья детей РАМН.

Автореферат разослан

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Фомина О.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Острый лимфобластный лейкоз (OJIJ1) является наиболее частым онкологическим заболеванием у детей. Использование современной программной химиотерапии в последние годы позволяет достичь выхода в ремиссию более чем у 90% больных, а пятилетней безрецидивной выживаемости у 77-80% детей [Harms DO at al.,2000; Schrappe M at al., 2000].

Несмотря на достигнутые успехи в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей, сохраняется группа больных, у которых проведение современной комплексной химиотерапии неэффективно. Это «первично рефрактерные» к лечению больные (2-3% пациентов), а также дети, у которых развиваются рецидивы заболевания. Результаты лечения этих больных остаются неудовлетворительными.

Рефрактерность лейкемических клеток к высокодозной химиотерапии, а также развитие рецидивов может быть обусловлено особенностями биологии резидуальных клеток и/или нарушениями противоопухолевого иммунитета. В механизме нарушений противоопухолевого иммунитета важную роль может играть изменение функции лимфоцитов и, в частности, нарушение синтеза таких цитокинов, как интерферон-гамма (IFN-y), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-a) и интерлейкин-2 (IL-2), участвующих в клеточном противоопухолевом иммунитете.

Имеются данные о прямой зависимости уровня фактора некроза опухоли-альфа в плазме крови и абсолютного и относительного содержания лейкемических клеток в периферической крови [Потапнев М.П., 2003]. Предполагается, что данный цитокин участвует в миграции лейкемических клеток из костного мозга в периферическую кровь.

Однако, особенности внутриклеточного синтеза цитокинов интерферона-гамма, фактора некроза опухоли-альфа и интерлейкина -2 лимфоцитами крови у детей в разные периоды острого лимфобластного лейкоза изучены мало. Имеющиеся данные противоречивы.

При остром лимфобластном лейкозе у детей выявлено снижение интерферон-гамма и интерлейкин-2 продуцирующих клеточных популяций Т-хелперов и Т-супрессоров, причем наиболее низким был уровень синтеза IL-2. Для восстановления нормального количества IL-2-синтезирующих клеток требовалось 2-3 года после прекращения химиотерапии (Хао-Li Z. et al., 2000). В других исследованиях обнаружено повышение уровня синтеза IFN-y в течение периода терапии и снижение после прекращения лечения (Duan Y. at al., 2001). Имеются данные о нормализации IL-2 и IFN-y синтезирующих клеточных популяций Т-хелперов и Т-супрессоров через 6 месяцев после прекращения химиотерапии (Zhang XL at al., 2000).

В связи со всем изложенным представляется актуальным проведенш исследований особенностей клеточного иммунитета у детей в разные периодь острого лимфобластного лейкоза с применением иммунопатологических методо! оценки фенотипа и функциональных свойств клеток, в частное™ цитокинсинтетической активности лимфоцитов крови.

Цель исследования.

Целью исследования являлось изучение цитокинсинтетической активносп лимфоцитов крови у детей в дебюте острого лимфобластного лейкоза и е различные периоды ремиссии заболевания.

Задачи исследования.

1. Изучить внутриклеточный синтез цитокинов: интерферона-гамма, факторг некроза опухоли-альфа и интеряейкина-2 лимфоцитами крови } практически здоровых детей.

2. Определить основные субпопуляции лимфоцитов крови и внутриклеточный уровень интерферона-гамма, фактора некроза опухоли-альфа и интерлейкина-2 в лимфоцитах крови у детей в дебюте острогс лимфобластного лейкоза.

3. Изучить иммунофенотип лимфоцитов крови и их цитокинсинтетическук: активность у детей в разные периоды ремиссии острого лимфобластногс лейкоза на фоне химиотерапии.

4. Определить основные субпопуляции лимфоцитов крови и их цитокинсинтетическую активность в периоде ремиссии острогс лимфобластного лейкоза у детей после прекращения программной химиотерапии.

Научная новизна.

Впервые определен внутриклеточный синтез цитокинов 1Ш-у, ЮТ-а и 11.-2 лимфоцитами крови у детей в различные периоды острого лимфобластногс лейкоза.

Впервые установлено, что уровень цитокинсинтезирующих лимфоцитоЕ тесно связан с количеством бластов в крови. Процент лимфоцитов, синтезирующих ПТЯ-у, Т№-а и 1Ь-2, у больных с низким бластозом соответствовал показателям группы сравнения. При высоком бластозе в крови уровень цитокинсинтезирующих лимфоцитов был резко снижен.

Получены данные о чрезвычайно высокой интенсивности экспрессии изученных внутриклеточных цитокинов в остром периоде заболевания независимс от уровня бластоза в крови и процента цитокинсинтезирующих клеток, чте отражает высокую функциональную активность лимфоцитов крови в дебюте острого лимфобластного лейкоза.

Показано, что процент цитокинсинтезирующих лимфоцитов крови ¡охраняется на уровне показателей группы сравнения в различные периоды эмиссии заболевания на фоне химиотерапии, а также после окончания [рограммной химиотерапии.

Установлено, что у больных ОЛЛ с низким уровнем бластных клеток в рови в дебюте заболевания состав популяций лимфоцитов периферической крови оответствовал показателям нормы. Изменения в составе субпопуляций имфоцитов выявлялись лишь у детей при уровне бластных клеток более 49%. На зоне лейкоцитоза за счет лейкемических клеток наблюдалось снижение как тносительных, так и абсолютных показателей содержания Т-лимфоцитов и их убпопуляций.

Установлено, что процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов и их СЭ4+ С08+ субпопуляций, а также Ж-клеток нормализуется к окончанию нтенсивной химиотерапии.

Выявлено, что на фоне проведения программной химиотерапии отмечается езкое угнетение В-линейного звена иммунитета. Содержание В-лимфоцитов озвращается в пределы нормальных значений после окончания программной имистарапии.

(рактнческая ценность.

Определена цитокинсинтетическая активность лимфоцитов периферической рови у практически здоровых детей, что может быть использовано в качестве ормативных показателей при оценке состояния иммунной системы.

Установлено, что в дебюте острого лимфобласгного лейкоза интенсивность люоресценции внутриклеточных цитокинов в лимфоцитах крови значительно ревышает показатели группы сравнения, что косвенно указывает на апряженность противоопухолевого иммунитета в остром периоде заболевания.

В различные периоды ремиссии В-линейного острого лимфобластного гйкоза процентный состав Т-лимфоцитов и их субпопуляций, а также нтенсивность экспрессии внутриклеточных цитокинов соответствует оказателям практически здоровых детей (группа сравнения). Полученные данные зидетельствуют о достаточной стабильности Т-клеточного иммунитета, что, зроятно, способствует поддержанию ремиссии В-ОЛЛ после окончания рограммной химиотерапии.

Выявлено значительное угнетение В-клеточного звена иммунитета, что гобходимо учитывать при выработке терапевтической тактики ведения данных эльных и при проведении вакцинации детей в период ремиссии ОЛЛ.

Полученные данные дают представление о функциональном состоянии ммунной системы при остром лимфобластном лейкозе.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты исследования, в частности определение функциональной активности лимфоцитов по их способности к внутриклеточному синтезу цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-2, внедрены в работу клинико-диагностической лаборатории ГУ НИИ педиатрии НЦЗД РАМН и могут быть использованы в работе иммунологических и гематологических лабораторий.

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИ педиатрии НЦЗД РАМН (Москва, 2002), на рабочем совещании по проточной цитометрии «BD FACS Users Meeting» (Санкт-Петербург, 2002), на VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003).

Структура и объем диссертации.

Диссертация построена по общепринятому типу, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. у

Материалы диссертации изложены на' ^страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована^/^таблицами и рисунками. Список литературы включает/ ^источников отечественных и ¿¿^аРУ®ежнЬ1Х авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Работа выполнена в отделе гематологии НИИ педиатрии ГУ Научного центра здоровья детей РАМН, директор - академик РАМН, профессор А.А.Баранов. В исследование были включены также дети, находившиеся на лечении в отделениях Онкологического научного центра РАМН им. H.H. Блохина (5 детей), 14-м отделении ДКБ №1 г. Москвы (6 детей).

Всего обследовано 52 ребенка. 40 детей были с B-линейным острым лимфобластным лейкозом в возрасте от 6 месяцев до 16 лет (средний возраст 6,8 лет); девочек было 18, мальчиков - 22 . 12 детей составили группу сравнения.

Пациенты были разделены на группы, соответственно следующим периодам наблюдения:

1) Острый период заболевания до начала химиотерапии;

2) По окончании интенсивной полихимиотерапии;

3) На поддерживающей терапии;

4) Пациенты после окончания программной полихимиотерапии.

Все пациенты были обследованы для получения комплекса клинических и лабораторных показателей - гематологических, цитологических, иммунологических, цитогенетических, молекулярно-биологических.

Иммунологическое фенотипирование лейкемических клеток проводили методом проточной цитофлюорометриии в реакции прямой иммунофлюоресценции, с одноцветным и двухцветным окрашиванием (FITC, РЕ). Для определения мембранных дифференцировочных антигенов использовался стандартный набор меченых флюорохромами моноклональных антител (МКА) Simultest ЗМК Plus фирмы "Becton Dickinson".

Внутриклеточные цитокины определяли методом проточной цитофлюорометрии в реакции прямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител фирмы "PharMmgen".

Оценку результатов проводили на аппарате FACStrak фирмы "Becton Dickinson" (USA) с использованием программ Simulset, PC LYSYS и WinMD 2.8 для обработки полученных данных. При проведении анализа результатов определялись среднее (М), ошибка среднего (т), уровень значимости (р). Результаты считались достоверными при р < 0,05.

При определении мембранных рецепторов клеток с одновременно с внутриклеточным исследованием синтеза цитокинов на первом этапе реакции определялась мембранная метка, а затем проводили пермеабилизацию клеточной мембраны и цитоплазматическую реакцию.

Кроме определения процента лимфоцитов, синтезирующих цитокины, проводили анализ интенсивности флюоресценции антигенов (цитокинов) по среднему номеру канала флюоресценции (Mean channel), что условно отражает число активных молекул в клетке.

В качестве контрольных данных использовали результаты флюоресценции в тестах с изотопическим негативным контролем, а также контроль флюоресценции нестимулированных лимфоцитов, меченных антителами к внутриклеточным цитокинам по аналогичной методике.

Сравнение содержания различных субпопуляций лимфоцитов периферической крови мы проводили с данными о составе субпопуляций лимфоцитов периферической крови практически здоровых детей Denny, Oleske (1991).

В качестве группы сравнения цитокинсинтетической активности лимфоцитов периферической крови мы использовали данные, полученные при исследовании крови 12 практически здоровых детей в возрасте от 3 до 12 лет (8 мальчиков, 4 девочки), которым проводилось оперативное вмешательство по поводу малых хирургических аномалий. Дети не имели хронических заболеваний, а также воспалительных и аллергических процессов в течение месяца, предшествующего исследованию. В составе лимфоцитов периферической крови у них отклонений от нормы не выявлено.

Результаты исследования внутриклеточного синтеза цитокинов гаимфоцитами крови детей группы сравнения представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Синтез цитокинов лимфоцитами крови у практически здоровых детей.

№ Фамилия Лф, синтезирую щие IFN-y M.Ch. Лф, синтезирую щие TNF-a M.Ch. Лф, интезирую щие IL-2 M.Ch.

% х]09/л % хЮ'/л % х109/л

1 Г-в О. 28 1,308 197 24 1,121 95 17 0,794 86

2 К-в П. 33 0,588 319 30 0,535 117 9 0,160 92

3 Т-о А. 19 0,490 430 42 1,084 98 5 0,129 94

4 Е-в П. 11 0,223 141 19 0,385 111 11 0,223 126

5 И-вК. 52 0,902 122 22 0,382 97 4 0,069 68

6 С-вП. 33 0,713 163 41 0,886 75 9 0,195 33

7 К-яВ. 14 0,692 122 14 0,692 62 9 0,445 113

8 С-чЕ. 47 1,686 198 28 1,005 52 6 0,215 94

9 С-аВ. 18 0,931 307 28 1,449 127 14 0,724 259

10 Ф-а И. 38 1,076 692 44 1,246 121 17 0,481 165

11 Т-аВ. 38 1,179 711 15 0,466 57 15 0,466 166

12 С-нД. 16 0,769 234 21 1,010 106 5 0,240 68

м 29 0,879 303 27 0,855 93 10 0,345 114

м 3,9 0,113 60,8 3,0 0,103 7,5 1,3 0,068 17,5

У детей этой группы средний процент лимфоцитов, синтезирующих IFN-y, составил 29+3,9% с колебаниями от 11 до 52%, TNF-a - 27+3,0% (от 14 до 44%), IL-2 - 10+1,3% (от 5 до 17%). Абсолютное количество цитокинсинтезирующих лимфоцитов составило для IFN-y - 0,879+0,113х109/л, TNF-a - 0,855+0,103x109/л, IL-2 - 0,345+0,068х109/л. Показатели среднего канала интенсивности флюоресценции внутриклеточного IFN-y колебались от 122 до 711 и составили в среднем 303+60,8. Средние каналы флюоресценции TNF-a колебались от 52 до 127, составив в среднем по группе 93+7,5. В среднем интенсивность флюоресценции IL-2 составила 114+17,5 (от 33 до 259).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ B-ЛИНЕЙНЫМ ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ.

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови и их цитокинсинтетическая активность у больных в дебюте острого лимфобластного лейкоза.

Нами было обследовано 11 детей с B-линейным острым лимфобластным лейкозом. На момент диагностики заболевания дети были в возрасте от 6 месяцев до 13 лет (медиана - 6 лег); 3 девочки и 8 мальчиков.

У 2 детей (18%) установлен про-В-ОЛЛ; общий иммунологический вариант («common») ОЛЛ определен у 8 больных (73%); у 1 больного - «зрелый» В-ОЛЛ (9%).

В группу стандартного риска вошло 4 ребенка (36%), 5 детей были средней группы риска (46%), высокого риска - 2 детей (18%). У последних 2 детей при проведении молекулярно-биологического исследования клеток костного мозга была обнаружена экспрессия MLL/AF4 гена, продукта транслокации t (4;11).

Цитогенетическое исследование клеток костного мозга проведено всем детям. У одного ребенка был выявлен гипердиплоидный клон 54-55 хромосом. У остальных детей хромосомные аномалии не были выявлены.

Все больные получили лечение по программе ALL-BFM-95. На 8-ой день терапии у всех пациентов отмечался положительный ответ на преднизолон.

Количество лейкоцитов периферической крови у детей данной группы колебалось от 3,2 до 56,0x107л, количество лейкемических клеток колебалось от 1 до 97%, что в абсолютных числах составило от 0,043 до 54,3 20x109/л. Процентное содержание лимфоцитов колебалось от 1 до 83%, в абсолютных числах - от 0,560 до 16,974х109/л. С учетом выявленных значительных различий в составе лимфоцитов крови мы условно разделили пациентов на 2 группы: с низким количеством бластных клеток в крови (менее 16%) - 5 детей и группа с высоким уровнем бластных клеток (более 49%) - 6 детей. Пациентов с количеством бластных клеток в крови от 17% до 48% в нашем исследовании не наблюдалось.

Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов крови приведены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2.

Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных в __дебюте ОЛЛ с низким бластозом. _

Фами ЛИЯ Лейко циты Бл.кл Лф CD3+ CD 16+56+ CD4+ CD8+ CD4. CD8

хЮ'/л % % х 109/л % х 109/л % х109/л % х109/л % хШ'/л

1 С-вД. 4,3 1 83 3,569 64 2,284 10 0,357 37 1,321 32 1,142 1,2

2 Б-в А. 5,3 4 78 4,134 58 2,397 10 0,413 29 1,198 22 0,909 1,3

3 Р-аР. 4,5 12 71 3,195 68 2,172 3 0,096 37 1,182 23 0,745 1,6

4 Б-н К. 7,8 13 57 4,446 50 2,223 11 0,489 30 1,334 24 1,067 1,2

5 С-нВ. 8,7 16 52 4,524 50 2,262 6 0,271 27 1,221 19 0,859 1,4

М 6,12 9,2 68 3,974 58 2,267 8 0,338 32 1,251 24 0,942 1,3

м 0,9 2,9 6 0,25 3,6 0,03 1,5 0,06 2,09 0,032 2,1 0,07 0,07

границы нормы 6177 1,1124,195 5-17 0,1810,654 3351 0,6062,784 2238 0,4991,923 1,02,3

ю

Популяция В-лимфоцитов у детей в дебюте заболевания не рассматривалась, так как не представлялось возможным разделить нормальные В-лимфоциты и лейкемические бласты.

При уровне бластов в крови менее 16% мы не выявили каких-либо отклонений относительных и абсолютных показателей содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций от показателей здоровых детей. Не отмечалось также изменения уровня МК-клеток.

У детей с высоким уровнем бластных клеток в крови (более 49%) отмечались изменения состава лимфоцитов (Таблица 3).

Таблица 3.

Содержание субпопуляций зрелых Т-лимфоцитов в периферической крови

больных ОЛЛ с высоким бластозом.

Фами ЛИЯ Лейко циты Бя.кл Лф С1)3+ С016+56+ С04+ С08+ СБ4. С08

х109/л % % х109/л % х109/л % х109/л % х10% % х109/л

1 Г-н Д. 3,2 49 44 1,408 14 0,197 8 0,113 6 0,085 7 0,099 0,8

2 М-вБ. 26,3 60 32 8,416 9 0,757 3 0,253 4 0,337 6 0,505 0,7

3 С-хЕ. 10,2 69 24 2,448 2 0,048 1 0,024 1 0,024 1 0,024 1,3

4 Г-вД. 48,5 69 35 16,974 4 0,678 0 0 3 0,509 2 0,339 1,5

5 Ш-аН. 29,0 79 13 3,770 12 0,452 12 0,452 5 0,188 9 0,339 0,6

6 Г-н Л. 56,0 97 1 0,560 8 0,045 3 0,017 5 0,028 4 0,022 1,3

М 28,9 70,5 24 5,596 8,3 0,362 4,5 0,143 4 0,195 4,8 0,221 1,0

м 8,5 6,7 6,5 2,59 0,2 0,12 1,8 0,07 0,7 0,07 1,2 0,08 0,1

границы нормы 6177 1,1124,195 5-17 0,1810,654 3351 0,6062,784 2238 0,4991,923 1,02,3

На фоне лейкоцитоза за счет лейкемических клеток наблюдалось снижение как относительных, так и абсолютных показателей содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций. У 50% больных наблюдалось снижение соотношения С04:СП>8 за счет более выраженного снижения уровня Т-хелперов/индукторов. Содержание МК-клеток в данной группе у 2 детей было в пределах нормальных значений, у 3 детей этот показатель был снижен и в одном случае маркеры 1ЧК-клеток отсутствовали. Эти изменения косвенно указывают на угнетение противоопухолевого иммунитета.

У 2 детей (18%) установлен про-В-OJIJI; общий иммунологический вариант («common») ОЛЛ определен у 8 больных (73%); у 1 больного - «зрелый» В-ОЛЛ (9%).

В группу стандартного риска вошло 4 ребенка (36%), 5 детей были средней группы риска (46%), высокого риска - 2 детей (18%). У последних 2 детей при проведении молекулярно-биологического исследования клеток костного мозга была обнаружена экспрессия MLL/AF4 гена, продукта транслокации t (4; 11).

Цитогенетическое исследование клеток костного мозга проведено всем детям. У одного ребенка был выявлен гипердиплоидный клон 54-55 хромосом. У остальных детей хромосомные аномалии не были выявлены.

Все больные получили лечение по программе ALL-BFM-95. На 8-ой день терапии у всех пациентов отмечался положительный ответ на преднизолон.

Количество лейкоцитов периферической крови у детей данной группы колебалось от 3,2 до 56,0x109/л, количество лейкемических клеток колебалось от I до 97%, что в абсолютных числах составило от 0,043 до 54,320х109/л. Процентное содержание лимфоцитов колебалось от 1 до 83%, в абсолютных числах - от 0,560 до 16,974x109/л. С учетом выявленных значительных различий в составе лимфоцитов крови мы условно разделили пациентов на 2 группы: с низким количеством бластных клеток в крови (менее 16%) - 5 детей и группа с высоким уровнем бластных клеток (более 49%) - 6 детей. Пациентов с количеством бластных клеток в крови от 17% до 48% в нашем исследовании не наблюдалось.

Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов крови приведены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2.

Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных в

дебюте ОЛЛ с низким бластозом.

Фами ЛИЯ Лейко циты Бл.кл Лф CD3+ CD16+56+ CD4+ CD8+ CD4. CD8

хЮ'/л % % х109/л % хЮ'/л % х109/л % х109/л % х109/л

1 С-вД. 4,3 1 83 3,569 64 2,284 10 0,357 37 1,321 32 1,142 1,2

2 Б-в А. 5,3 4 78 4,134 58 2,397 10 0,413 29 1,198 22 0,909 1,3

3 Р-аР. 4,5 12 71 3,195 68 2,172 3 0,096 37 1,182 23 0,745 1,6

4 Б-нК. 7,8 13 57 4,446 50 2,223 11 0,489 30 1,334 24 1,067 1,2

5 С-нВ. 8,7 16 52 4,524 50 2,262 6 0,271 27 1,221 19 0,859 1,4

М 6,12 9,2 68 3,974 58 2,267 8 0,338 32 1,251 24 0,942 1,3

м 0,9 2,9 6 0,25 3,6 0,03 1,5 0,06 2,09 0,032 2,1 0,07 0,07

границы нормы 6177 1,1124,195 5-17 0,1810,654 3351 0,6062,784 2238 0,4991,923 1,02,3

Популяция В-лимфоцитов у детей в дебюте заболевания не рассматривалась, так как не представлялось возможным разделить нормальные В-лимфоциты и лейкемические бласты.

При уровне бластов в крови менее 16% мы не выявили каких-либо отклонений относительных и абсолютных показателей содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций от показателей здоровых детей. Не отмечалось также изменения уровня №С-клеток.

У детей с высоким уровнем бластных клеток в крови (более 49%) отмечались изменения состава лимфоцитов (Таблица 3).

Таблица 3.

Содержание субпопуляций зрелых Т-лимфоцитов в периферической крови

больных ОЛЛ с высоким бластозом.

Фами ЛИЯ Лейко циты Бл.кл Лф СОЗ+ СО 16+5 6+ СБ 4+ СБ8+ С04: С08

х109/л % % х109/л % х109/л % х109/л % х109/л % х109/л

1 Г-н Д. 3,2 49 44 1,408 14 0,197 8 0,113 6 0,085 7 0,099 0,8

2 М-вБ. 26,3 60 32 8,416 9 0,757 3 0,253 4 0,337 6 0,505 0,7

3 С-хЕ. 10,2 69 24 2,448 2 0,048 1 0,024 1 0,024 I 0,024 1,3

4 Г-вД. 48,5 69 35 16,974 4 0,678 0 0 3 0,509 2 0,339 1,5

5 Ш-аН. 29,0 79 13 3,770 12 0,452 12 0,452 5 0,188 9 0,339 0,6

6 Т-н Л. 56,0 97 1 0,560 8 0,045 3 0,017 5 0,028 4 0,022 1,3

М 28,9 70,5 24 5,596 8,3 0,362 4,5 0,143 4 0,195 4,8 0,221 1,0

м 8,5 6,7 6,5 2,59 0,2 0,12 1,8 0,07 0,7 0,07 1,2 0,08 0,1

границы нормы 6177 1,1124,195 5-17 0,1810,654 3351 0,6062,784 2238 0,4991,923 1,02,3

На фоне лейкоцитоза за счет лейкемических клеток наблюдалось снижение как относительных, так и абсолютных показателей содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций. У 50% больных наблюдалось снижение соотношения СВ4:СВ8 за счет более выраженного снижения уровня Т-хелперов/индукторов. Содержание №С-клеток в данной группе у 2 детей было в пределах нормальных значений, у 3 детей этот показатель был снижен и в одном случае маркеры N К-клеток отсутствовали. Эти изменения косвенно указывают на угнетение противоопухолевого иммунитета.

Результаты исследования внутриклеточного синтеза цитокинов ^N-7, ТНР-сс и ГЬ-2 представлены в таблице 4. В таблицу включены сведения о процентном уровне лимфоцитов крови, синтезирующих исследованные цитокины, и сведения об интенсивности флюоресценции внутриклеточных ГШ-у, ТМР-с/. и 1Ь-2, косвенно отражающей функциональное состояние клеток.

Таблица 4.

Цитокинсинтетическая активность лимфоцитов периферической крови

у больных в дебюте В-ОЛЛ.

№ Фами ЛИЯ Бл.кл. (%) Лф, синтезирую щие П^Ы-у М.СЬ. Лф, синтезирую щие ТОТ-а М.СЬ. Лф, синтезирую щие 1Ь-2 МСЬ.

% х109/л % х109/л % х109/л

1 С-вД. 1 20 0,714 1387 16 0,571 264 21 0,749 316

2 Б-в А. 4 24 0,992 898 36 1,488 276 15 0,620 191

3 Р-аР. 12 34 1,086 1286 31 0,990 328 7 0,224 237

4 Б-нК. 13 34 1,512 1305 21 0,934 340 7 0,311 228

5 С-нВ. 16 22 0,995 1188 20 0,905 220 5 0,226 195

6 Г-н Д. 49 17 0,239 390 10 0,141 236 2 0,028 177

7 М-в Б. 60 4 0,337 442 3 0,252 271 1 0,084 439

8 С-хЕ. 69 1 0,024 910 2 0,049 436 2 0,049 566

9 Г-вД. 69 2 0,339 597 1 0,169 245 1 0,169 198

10 Ш-аН. 79 13 0,490 634 8 0,302 321 2 0,075 215

11 Т-н Л. 97 7 0,039 568 6 0,034 197 1 0,006 234

М.СЬ. - теап сЬаплс1 - средний номер канала флюоресценции

При анализе полученных данных выявлены значительные колебания показателей. В таблице 5 приведены средние значения цитокинсинтетической активности лимфоцитов крови детей обеих групп.

При оценке уровня лимфоцитов, синтезирующих цитокины ШЫ-у, ТМР-а и 1Ь-2, выявлено резкое снижение их процента в группе детей с высоким бластозом в крови. В то же время, в группе с низким уровнем бластных клеток в крови средний процент лимфоцитов, синтезирующих изученные цитокины, достоверно не отличался от данных контрольной группы.

Таблица 5.

Средние значения цитокинсинтетической активности лимфоцитов в острый период ОЛЛ._^__

Лф, синтезирую щие IFN-y, М±м M.Ch., М+м Лф, синтезирую щие TNF-a, М+м M.Ch., М+м Лф, синтезирую щие IL-2, М+м M.Ch., М+м

% х109/л % х10э/л % х109/л

кол-во бл.кл. менее 16% 26,8+3,Iх 1,059+ 0,128** 1213+ 86** 25+3,7* 0,978+ 0,146" 286+ 22,3' 11+3,0 0,426+ 0,108*" 233+ 22,8*

кол-во бл.кл. более 49% 7,5+2,7* 0,245+ 0,075* 590+ 75,8* 5+1,5* 0,158+ 0,043* 284+ 35,3* 1,5+0,2* 0,069+ 0,023* 305+ 66,4**

группа сравнения 29+3,9 0,879+ 0,113 303+ 60,8 27+2,9 0,855+ 0,103 93+7,5 10+1,3 0,345+ 0,068 114+ 17,5

MCh. - mean channel - средний номер канала флюоресценции * - достоверные отличия от группы сравнения х - достоверные отличия групп больных между собой

Абсолютное количество цитокинсинтезирующих лимфоцитов в группе с низким уровнем бластов в крови достоверно было выше, чем в группе сравнения, за счет относительного лимфоцитоза у детей с В-ОЛЛ. При высоким бластозе на фоне лимфопении количество клеток, синтезирующих IFN-y, TNF-a и IL-2, были достоверно ниже показателей группы сравнения.

Более интересным, на наш взгляд, было определение интенсивности флюоресценции внутриклеточных цитокинов, косвенно указывающей на функциональную активность лимфоцитов периферической крови. У всех детей в дебюте ОЛЛ отмечалось статистически достоверное повышение цитокинсинтетической активности лимфоцитов крови. Наиболее значительное повышение интенсивности флюоресценции внутриклеточной метки наблюдалось для IFN-y. У больных с низким бластозом показатель среднего канала флюоресценции достигал 1213+86; у больных с высоким бластозом - 590+75,8 при показателе группы сравнения 303+60,8 (р<0,001). Интенсивность флюоресценции внутриклеточного TNF-a в обеих группах была одинаковой, уровень также был значительно выше, чем в группе сравнения (р<0,001). Интенсивность экспрессии внутриклеточного IL-2 также статистически достоверно превышала показатель группы сравнения (р<0,001). Однако этот показатель в группе больных с высоким бластозом была выше, чем в группе с количеством бластных клеток в крови менее 16% (305+66 против 233+23, соответственно; р<0,001).

Диаграмма на рисунке отображает высокие показатели интенсивности флюоресценции внутриклеточных цитокинов у детей в дебюте ОЛЛ при различном уровне бластных клеток в периферической крови.

•вс

1400 1200 1000 800 600 400 200

1Р1\1-датпла ТЫР-а1р1га

И-2

□

Больные с низким бластозом. Больные с высоким бластозом. Дети группы сравнения. Рисунок 1. Цитокинсинтетическая активность лимфоцитов периферической крови у детей в дебюте В-ОЛЛ.

У части больных проводилось одновременное определение мембранных маркеров и внутриклеточного содержания цитокинов. В качестве мембранной метки использовался антиген зрелых Т-лимфоцитов СБЗ(рисунок 2).

И 6% ШШг отчего» 21%

-Л

' СИЗ* 45«

№1

10^ П1

10!

10*

Рисунок 2. Точечный график теста с двойным окрашиванием.

Также в качестве мембранной метки использовался один из антигенов лейкемических клеток. На рисунке 3 представлены графики больных В-ОЛЛ, на бластных клетках которых экспрессированы антигены НЬЛ-ОЯ и СОЮ.

1и31% ' ' ' '. •П№10+ 1%

■■•..■■:■ ':Со'ш+ 15е/.

ПЛ А

10*

Т№-а рЬа 0,1%

Г1 О 1%

N°

и. л'-."

сэ - * >0Е+ 87%

о .—'----

РИ Б

Рисунок 3. Точечный график теста с двойным окрашиванием у больных с низким (А) и высоким (Б) уровнем бластных клеток в крови.

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови и их цитокинсинтстическая активность у пациентов в различные периоды ремиссии острого лимфобластного лейкоза на фоне химиотерапии.

В данную группу вошло 18 детей с В-линейным ОЛЛ, из них 10 девочек и 8 мальчиков в возрасте от 1 года 9 месяцев до 15 лет (средний возраст составил 7,5 лет). Исследование проводилось в следующие периоды:

1) По окончании интенсивной полихимиотерапии;

2) На поддерживающей терапии;

У всех детей ремиссия заболевания была подтверждена морфологическим и иммуноцитологическим исследованием костного мозга на каждом этапе исследования.

Результаты обследования больных по окончании интенсивной полихимиотерапии.

Исследование крови в данной группе проводилось по окончании интенсивной терапии после восстановления кроветворения в сроки от 4 до 15 дней (в среднем на 11 день). У детей со средним фактором риска исследование проводилось до начала химиолучевой профилактики нейролейкоза. Во всех случаях программа интенсивной химиотерапии была выполнена полностью.

В данную группу вошло 7 детей: 4 мальчика и 3 девочки в возрасте от 1 года 9 месяцев до 14 лет (среднее значение составило 6,5 лет).

У одного ребенка имелся нро-В иммунологический подварианг ОЛЛ (14,3%), у 5 детей (71,4%) - «общий» иммунологический вариант ОЛЛ и у 1 ребенка (14,3%) - пре-В ОЛЛ. К группе стандартного риска отнесено 4 детей, к группе среднего риска - 3.

При исследовании иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови пациентов, обследованных после окончания интенсивной химиотерапии, выявлено повышение процента зрелых Т-лимфоцитов (86,9+2%) по сравнению с показателями нормы. Однако, на фоне лейкопении абсолютное количество СБЗ+ клеток у большинства больных было снижено. При этом не было выявлено значительных отклонений в процентном содержании ЫК-клеток, а также СБ4+ и СБ8+ лимфоцитов. Соотношение СП4:СВ8 также было в пределах нормы. На этом этапе химиотерапии обнаружено значительное снижение как относительных, так и абсолютных показателей содержания В-лимфоцитов, связанное с цитотоксическим влиянием программной химиотерапии на В-линейные клетки.

Результаты исследования внутриклеточного синтеза цитокинов представлено в таблице 6.

Таблица 6.

Синтез цитокинов лимфоцитами периферической крови у детей после окончания

интенсивной терапии.

№ Фами ЛИЯ Лимфо циты Лф, синтезирующие IFN-y M.Ch. Лф, синтезирующие TNF-a M.Ch. Лф, синтезирующие IL-2 M.Ch.

хЮ7л % х109/л % х109/л % х109/л

1 Л-в 1,46 14 0,204 224 26 0,379 172 6 0,088 156

2 К-н 1,225 11 0,135 60 24 0,294 50 1 0,012 356

3 В-а 1,134 22 0,249 418 43 0,488 96 14 0,159 135

4 Ш-в 1,344 11 0,148 285 45 0,605 125 19 0,255 133

5 А-в 1,508 19 0,286 449 49 0,739 185 7 0,106 151

6 Г-а 0,420 17 0,071 188 48 0,202 144 8 0,034 146

7 П-я 1,240 21 0,260 266 45 0,558 131 17 0,211 89

М+м 1,19+ 0,14 16,4+1,7 0,193± 0,029' 270+ 51 40+4 0,466+ 0,07 129+ 17 10+2,5 0,124± 0,034 167+ 33

группа сравнения М+м 29+ 3,9 0,879+ 0,113 303+ 60,8 27+2,9 0,855+ 0,103 93+7,5 10+1,3 0,345+ 0,068 114+ 17,5

MCh. - mean channel - средний номер канала флюоресценции

При оценке количества лимфоцитов, синтезирующих IFN-y, TNF-a и IL-2, было выявлено статистически достоверное снижение их абсолютного числа (р<0,001).

Выявлено также статистически достоверное снижение процентного уровня лимфоцитов, синтезирующих IFN-y (16% против 29% в группе сравнения, р<0,001). Показатель среднего канала интенсивности флюоресценции достоверно

не отличался от показателя группы сравнения. Была выявлена положительная корреляционная связь между абсолютным количеством лимфоцитов, синтезирующих №N-7, и интенсивностью флюоресценции внутриклеточного цитокина (г = 0,73).

Процент лимфоцитов, синтезирующих ТЫБ-а, в данной группе детей был повышен (р<0,001), абсолютное количество было достоверно ниже показателя контрольной группы (р<0,001). Средний уровень интенсивности флюоресценции этого цитокина составил 129+17, что не отличалось от показателей группы сравнения. Была выявлена положительная корреляционная связь между процентным и абсолютным содержанием в крови лимфоцитов, синтезирующих ЮТ-а, и интенсивностью внутриклеточной метки (г = 0,39 и г = 0,41, соответственно).

В этой группе не было выявлено статистически достоверных отличий количества лимфоцитов, синтезирующих 1Ь-2, и интенсивности флюоресценции от показателей группы сравнения. Однако установлена отрицательная корреляционная связь интенсивности экспрессии внутриклеточного 1Ь-2 с абсолютным содержанием в крови лимфоцитов, синтезирующих данный цитокин (Г =-0,75).

Программная интенсивная полихимиотерапия не повлияла на показатели интенсивности флюоресценции исследованных цитокинов - мы не выявили статистически достоверных отличий от данных группы сравнения, что свидетельствует о функциональной сохранности популяции лимфоцитов в этот период лечения.

Результаты обследования больных на фоне поддерживающей химиотерапии.

В группу вошло 11 детей; из них мальчиков 4, девочек 7, в возрасте от 5 до 15 лет (средний возраст - 8,7 лет). Один ребенок имел про-В ОЛЛ, 9 детей -«общий» иммунологический вариант ОЛЛ и 1 ребенок - пре-В ОЛЛ. К группе стандартного риска отнесено 4 детей, к группе среднего риска - 7.

Исследование лимфоцитов периферической крови проводилось на фоне поддерживающей терапии в сроки от 6 месяцев до 1,5 лет (18 месяцев): у 4 детей -при длительности поддерживающей химиотерапии 6 месяцев, у 3 детей - 12 месяцев и у 4 детей - при сроке 18 месяцев. Все дети получили интенсивный курс полихимиотерапии в полном объеме. Поддерживающая терапия проводилась в соответствии с протоколом лечения АЬЬ-ВРМ-95ш: 6-меркаптопурин 50 мг/м2/сут и метотрексат 20 мг/м21 раз в неделю до достижения общего 24-месячного срока лечения для пациентов всех прогностических групп.

В группе детей, обследованных на фоне поддерживающей терапии, сохранялась лейкопения и лимфоцитопения. У всех детей отмечены изменения в

составе лимфоцитов крови. У пациентов выявлено повышение процента СОЗ+ лимфоцитов: в среднем по группе 82+3,2%, максимально 96%. При этом за счет лейкопении в 82% случаев абсолютное количество зрелых Т-лимфоцитов было ниже нормальных значений (в среднем 0,858+0,134х109/л). Относительные и абсолютные показатели содержания В-лимфоцитов у пациентов на фоне поддерживающей терапии оставались резко сниженными, хотя и превышали показатели группы, обследованной после окончания интенсивной терапии (1,3±0,1% против 3,0+0,7% и 0,015+0,003х109/л против 0,035+0,012х107л). Относительные показатели содержания КК-клеток значительно варьировали и были как в пределах нормальных значений, так и выше или ниже нормы. В среднем по группе процентное содержание Т-хелперов/индукторов и Т-супрессоров/цитотоксических клеток не отличалось от нормальных показателей. Однако абсолютное количество СБ4+ и СБ8+ лимфоцитов оставалось снижешшм. Изменение соотношения С04:С08 было отмечено у 3 из 11 детей. В 2 случаях изменение соотношения было за счет преобладания СБ8+ клеток, в 1 - за счет снижения уровня СБ4+ лимфоцитов.

Результаты исследования внутриклеточного синтеза ГГМ-у лимфоцитами крови представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Синтез цитокинов лимфоцитами периферической крови у детей на фоне

№ Фами лия Лимфо циты Лф, синтезирующие IFN-y M.Ch. Лф, синтезирующие TNF-ot M.Ch. Лф, синтезирующие IL-2 M.Ch.

х109/л % хЮ'/л % х109/л % х109/л

1 Л-ко 1,392 48 0,668 88 25 0,348 108 4 0,056 130

2 А-в 2,220 32 0,710 289 36 0,799 110 12 0,266 128

3 Л-в 0,930 48 0,446 46 24 0,223 206 6 0,056 173

4 В-ва 1,148 20 0,229 505 23 0,264 178 14 0,161 141

5 В-на 0,370 27 0,099 114 32 0,118 81 9 0,033 128

6 Ф-в 0,444 18 0,079 107 42 0,186 85 14 0,062 87

7 И-на 1,092 29 0,317 181 43 0,469 103 15 0,164 117

8 П-в 0,744 8 0,059 88 27 0,201 63 8 0,059 72

9 К-а 1,254 20 0,251 258 20 0,251 298 12 0,150 202

10 И-ва 1,312 21 0,276 346 39 0,512 160 12 0,157 106

11 Л-ва 0,464 25 0,116 655 20 0,093 182 5 0,023 124

М±м 27+3,6 0,295+ 0,068 243+ 58 30+2,6 0,315± 0,063 143+ 21 10±1,1 0,108+ 0,023 128+ 11

группа сравнения М+м 29+3,9 0,879+ 0,113 303+ 60,8 27+2,9 0,855+ 0,103 93+7,5 10+1,3 0,345+ 0,068 114+ 17,5

Vf.Ch. - mean channel - средний номер канала флюоресценции

На описываемом этапе терапии процент лимфоцитов, синтезирующих цитокины ГЕМ-у, ЮТ-а и 1Ь-2, не отличался от показателей группы сравнения. При анализе абсолютного количества цитокинсинтезирующих лимфоцитов выявлено пониженное содержание этих клеток, достоверно отличающееся от показателей группы сравнения (р<0,001). Интенсивность флюоресценции внутриклеточных 1ЕКГ-у и 1Ь-2 также не отличалась от показателей контрольной группы. Однако отмечалось статистически достоверное повышение среднего показателя интенсивности флюоресценции ТОТ-а (143+21 против 93+7,5 контрольной группы; р<0,001).

Результаты обследования детей после окончания программной химиотерапии.

В данную группу вошло 11 детей в возрасте от 6 до 16 лет. Средний возраст составил 7,9 лет. Из обследованных детей девочек было 5, мальчиков 6.

Все дети получили полный курс химиотерапии по программе АЬЬ-ВРМ-95т в гематологической клинике нашего института.

Исследование периферической крови проводилось после окончания программной химиотерапии (минимум 6 месяцев без лечения) при поступлении пациентов в клинику на контрольное обследование. У 3 детей исследование проводилось при длительности периода без лечения 6 месяцев, у 2 детей - 1 год, у 4 - 1,5 года (18 месяцев) и у 2 детей - 3 года (36 месяцев).

При исследовании иммунофенотипа лейкемических клеток костного мозга в дебюте заболевания у 9 детей был выявлен «общий» иммунологический вариант ОЛЛ, у 1 ребенка - пре-В ОЛЛ; у одного ребенка - про-В ОЛЛ. В группу стандартного риска вошло 4 детей, среднего - 7.

При иммунофенотипировании лимфоцитов периферической крови пациентов после окончания программной химиотерапии отмечается нормализация процентного и абсолютного содержания субпопуляций Т-лимфоцитов.

Соотношение С04:СБ8 в 82% случаев также находилось в пределах нормальных значений, лишь у 2 детей было выявлено незначительное снижение эгого показателя до 0,9. В 6 случаях из 11 было выявлено снижение процентного и абсолютного количества В-лимфоцитов независимо от длительности периода без лечения.

Процент лимфоцитов, синтезирующих цитокины 1Ш-у и ТОТ-а, в данной группе пациентов соответствовал показателям группы сравнения. Однако при анализе количества лимфоцитов, синтезирующих 1Ь-2, было выявлено повышение содержания этих клеток, достоверно отличающееся от показателя группы сравнения - 16+1,8% против 10+1,3 (р<0,001). Абсолютное количество лимфоцитов, синтезирующих ИЪГ-у, было достоверно ниже показателя группы сравнения. Количество клеток, синтезирующих Т№-а и 1Ь-2, превышало

показатели практически здоровых детей (1,022x10% и 0,449х109/л против 0,855x10% и 0,345x10%, соответственно).

Средние каналы флюоресценции для исследованных цитокинов достоверно не отличались от показателей контрольной группы (таблица 8).

Таблица 8.

Синтез цитокинов лимфоцитами периферической крови у детей после окончания

программной химиотерапии

№ Фами ЛИЯ Лимфо циты Лф, синтезирующие IFN-y M.Ch. Лф, синтезирующие TNF-a M.Ch. Лф, синтезирующие IL-2 М Ch.

х109/л % х!09/л % х109/л % х109/л

1 Ч-а 2,160 34 0,734 694 43 0,929 125 9 0,194 140

2 С-а 3,519 12 0,422 77 24 0,845 61 6 0,211 64

3 А-в 2,700 20 0,540 209 26 0,702 62 21 0,567 89

4 Д-н 1,938 74 1,434 238 72 1,395 212 22 0,426 66

5 Ф-в 2,254 53 1,195 198 25 0,564 86 17 0,383 93

6 Г-а 1,748 25 0,437 426 35 0,612 137 10 0,175 123

7 П-а 2,948 21 0,619 605 44 1,297 157 22 0,649 140

8 С-к 5,175 26 1,346 460 47 2,432 74 23 1,190 136

9 Сн-а 3,248 28 0,909 686 45 1,462 266 14 0,455 136

10 В-а 1,856 27 0,501 114 31 0,575 83 19 0,353 80

11 С-в 2,394 26 0,622 168 18 0,431 419 14 0,335 89

М+м 2,722+ 0,272 31+5,2 0,796+ 0,111 352+ 69 37+4,5 1,022+ 0,178 153+ 33 16+1,8 0,449+ 0,087 105+9

группа сравнения М+м 29+3,9 0,879+ 0,113 303± 60,8 27+2,9 0,855+ 0,103 93+7,5 10±1,3 0,345+ 0,068 114+ 17,5

M.Ch. - mean channel - средний номер канала флюоресценции

Динамика изменений содержания субпопуляций лимфоцитов и их цитокинсинтетической активности в разные периоды острого лимфобластного лейкоза у детей.

Показатели содержания различных популяций лимфоцитов крови в разные периоды В-ОЛЛ представлены в таблице 9.

В дебюте заболевания в группе детей с низким бластозом содержание различных субпопуляций лимфоцитов не отличалось от показателей здоровых детей. У детей с высоким бластозом на фоне лимфопении отмечалось снижение как относительных, так и абсолютных показателей содержания различных популяций лимфоцитов.

Таблица 9.

Характеристика субпопуляций лимфоцитов крови у детей в разные периоды

СШ+ С04+ С08+ СЭ4: СБ8 СО 16+5 6+ СБ 19+

% хЮ'/л % х109/л % х109/л % х109/л % х109/л

дебют ОЛЛ бл.кл. <16% 58 2,260 32 1,251 24 0,942 1,3 8 0,338 - -

бл.кл>49% 8,2 0,400 4 0,195 4,8 0,221 1,0 4,5 0,143 - -

окончание интенсивной терапии 86,9 0,949 47,6 0,527 37,7 0,409 1,3 8,4 0,095 1,3 0,015

поддерживаю щая терапия 82 0,858 44 0,431 35 0,384 1,3 6,3 0,064 3 0,035

после окончания лечения 74 2,058 40 1,101 30 0,763 1,4 12 0,315 11 0,263

данные литературы 6177 1,1124,195 3351 0,6062,784 2238 0,4991,923 1,0-2,3 5-17 0,1810,654 6,422,6 0,1400,370

При исследовании мембранных маркеров лимфоцитов в динамике мы обнаружили, что относительное количество зрелых Т-лимфоцитов, их С04 ► и СБ8+ субпопуляций, а также естественных киллеров соответствовали норме к концу интенсивной терапии. Однако, в связи с лейкопенией на фоне цитостатической терапии нормализация абсолютного количества этих клеток отмечена только после завершения программной химиотерапии. Равновесие Т-хелперов/индукгоров и Т-супрессоров/цитотоксических клеток не было нарушено, соотношение СБ4:С08 в среднем было более 1,0 во всех группах больных В единичных наблюдениях этот показатель был снижен за счет преобладания Т-супрессоров/цитотоксических клеток. На всем протяжении химиотерапии выявлено резкое снижение как абсолютного, так и относительного количества В-лимфоцитов. Нормальные показатели восстанавились только после окончания лечения.

При исследовании синтеза цитокинов в остром периоде в группе больных с низким бластозом не было выявлено статистически достоверных отличий процента цитокинсинтезирующих лимфоцитов от показателей группы сравнения. В группе детей с высоким уровнем бластных клеток в крови процент цитокинсинтезирующих лимфоцитов был значительно снижен (р<0,001).

показатели практически здоровых детей (1,022х109/л и 0,449х109/л против 0,855x10% и 0,345х109/л, соответственно).

Средние каналы флюоресценции для исследованных цитокинов достоверно не отличались от показателей контрольной группы (таблица 8).

Таблица 8.

Синтез цитокинов лимфоцитами периферической крови у детей после окончания

программной химиотерапии

№ Фами лия Лимфо циты Лф, синтезирующие IFN-y M.Ch. Лф, синтезирующие TNF-ct M.Ch. Лф, синтезирующие IL-2 M.Ch.

х109/л % х109/л % х109/л % х109/л

1 Ч-а 2,160 34 0,734 694 43 0,929 125 9 0,194 140

2 С-а 3,519 12 0,422 77 24 0,845 61 6 0,211 64

3 А-в 2,7 00 20 0,540 209 26 0,702 62 21 0,567 89

4 Д-н 1,938 74 1,434 238 72 1,395 212 22 0,426 66

5 Ф-в 2,254 53 1,195 198 25 0,564 86 17 0,383 93

6 Г-а 1,748 25 0,437 426 35 0,612 137 10 0,175 123

7 П-а 2,948 21 0,619 605 44 1,297 157 22 0,649 " 140

8 С-к 5,175 26 1,346 460 47 2,432 74 23 1,190 136

9 Сн-а 3,248 28 0,909 686 45 1,462 266 14 0,455 136

10 В-а 1,856 27 0,501 114 31 0,575 83 19 0,353 80

11 С-в 2,394 26 0,622 168 18 0,431 419 14 0,335 89

М+м 2,722+ 0,272 31+5,2 0,796+ 0,111 352+ 69 37+4,5 1,022+ 0,178 153+ 33 16+1,8 0,449+ 0,087 105+9

группа сравнения М+м 29+3,9 0,879+ 0,113 303+ 60,8 27+2,9 0,855+ 0,103 93+7,5 10+1,3 0,345+ 0,068 114+ 17,5

M.Ch - mean channel - средний номер канала флюоресценции

Динамика изменений содержания субпопуляций лимфоцитов и их цитокинсннтетической активности в разные периоды острого лимфобластного лейкоза у детей.

Показатели содержания различных популяций лимфоцитов крови в разные периоды В-ОЛЛ представлены в таблице 9.

В дебюте заболевания в группе детей с низким бластозом содержание различных субпопуляций лимфоцитов не отличалось от показателей здоровых детей. У детей с высоким бластозом на фоне лимфопении отмечалось снижение как относительных, так и абсолютных показателей содержания различных популяций лимфоцитов.

Таблица 9.

Характеристика субпопуляций лимфоцитов крови у детей в разные периоды __острого лимфоблаетного лейкоза.__

СШ+ С04+ СБ8+ Сй4: СЭ8 СБ16+56+ СБ 19+

% х109/л % х109/л % х109/л % х109/л % х109/л

дебют ОЛЛ блкл. <16% 58 2,260 32 1,251 24 0,942 1,3 8 0,338 - -

бл.кл>49% 8,2 0,400 4 0,195 4,8 0,221 1,0 4,5 0,143 - -

окончание интенсивной терапии 86,9 0,949 47,6 0,527 37,7 0,409 1,3 8,4 0,095 1,3 0,015

поддерживаю щая терапия 82 0,858 44 0,431 35 0,384 1,3 6,3 0,064 3 0,035

после окончания лечения 74 2,058 40 1,101 30 0,763 1,4 12 0,315 11 0,263

данные литературы 6177 1,1124,195 3351 0,6062,784 2238 0,4991,923 1,0-2,3 5-17 0,1810,654 6,422,6 0,1400,370

При исследовании мембранных маркеров лимфоцитов в динамике мы обнаружили, что относительное количество зрелых Т-лимфоцитов, их С041 и С 1)8+ субпопуляций, а также естественных киллеров соответствовали норме к концу интенсивной терапии. Однако, в связи с лейкопенией на фоне цитостатической терапии нормализация абсолютного количества этих клеток отмечена только после завершения программной химиотерапии. Равновесие Т-хелперов/индукторов и Т-супрессоров/цитотоксических клеток не было нарушено, соотношение С04:СЭ8 в среднем было более 1,0 во всех группах больных. В единичных наблюдениях этот показатель был снижен за счет преобладания Т-супрессоров/цитотоксических клеток. На всем протяжении химиотерапии выявлено резкое снижение как абсолютного, так и относительного количества В-лимфоцитов. Нормальные показатели восстанавились только после окончания лечения.

При исследовании синтеза цитокинов в остром периоде в группе больных с низким бластозом не было выявлено статистически достоверных отличий процента цитокинсинтезирующих лимфоцитов от показателей группы сравнения. В группе детей с высоким уровнем бластных клеток в крови процент цитокинсинтезирующих лимфоцитов был значительно снижен (р<0,001).

Среднее абсолютное количество цигокинсинтезирующих лимфоцитов в группе больных с низким бластозом статистически достоверно было выше, а в группе с высоким бластозом ниже (р<0,001) показателей группы сравнения.

Интенсивность экспрессии внутриклеточных цитокинов НТЧ-у, ЮТ-а и 1Ь-2 у больных в дебюте ОЛЛ значительно превышала показатели детей группы сравнения (р<0,001), причем это не зависело от количества бластных клеток в организме больного. Однако при числе лейкемических клеток более 49% интенсивность флюоресценции внутриклеточных цитокинов ГРЫ-у и Т№-а снижалась, оставаясь при этом выше уровня, наблюдаемого в группе сравнения. Обратная картина интенсивности флюоресценции наблюдалась для 1Ь-2. Средний канал флюоресценции для 1Ь-2 в группе детей с высоким бластозом был достоверно выше интенсивности экспрессии этого цитокина в группе детей с низким уровнем лейкемических клеток в крови (305 против 233; р<0,001).

Таблица 10.

Синтез цитокинов ИЫ-у, ТОТ-сс и 1Ь-2 лимфоцитами крови у детей в разные

периоды острого лимфобластного лейкоза.

Лф, синтезирующие IFN-Y M.Ch Лф, синтез ирующие TNF-cx M.Ch Лф, синтезирующие 1L-2 M.Ch

% х109/л % хЮ'/л % х109/л

дебют ОЛЛ бл.кл.<16% 26,8 1,059 1213 25 0,978 286 11 0,426 233

бл.кл>49% 7,5 0,245 590 5,0 0,158 284 1,5 0,069 305

окончание интенсивной терапии 16,4 0,193 270 40 0,466 129 10 0,124 167

поддерживаю щая терапия 27 0,295 243 30 0,315 143 10 0,108 128

после окончания терапии 31 0,796 352 37 1,022 153 16 0,449 105

группа сравнения 29 0,879 303 27 0,855 93 10 0,345 114

M.Ch. - mean channel - средний номер канала флюоресценции

Диаграмма на рисунке 3 отображает процент лимфоцитов крови, синтезирующих цитокины у детей в дебюте и в разные периоды ремиссии ОЛЛ.

•лф, синтезируют ие ™ (%) группа

сравнения (%)

I

сы Т-лф,

синтезируют ие ТЫР (%) »—группа сравнения (%)

1

3

4

5

1а 16 ря

14 ■ 12 10 8 6 4 2 0 54 |ЕЭТ-лф, синтезируют ие И (%) —♦—группа сравнения 1 (%) |

Ж 1 1 щ -I- II -н 1 А 1

1 2 3 4 5

В

Рисунок 3. Динамика процентного содержания лимфоцитов кров1 синтезирующих ГРЫ-у (А), ЮТ-а (Б) и II.-2 (В) у детей в разные периоды ОЛЛ и у детей группы контроля.

1. Дебют ОЛЛ (количество бластов менее 16%).

2. Дебют ОЛЛ (количество бластов более 49%).

3. Период после окончания интенсивной терапии.

4. Период на фоне поддерживающей терапии.

5. Период после окончания программной химиотерапии.

После окончания интенсивной химиотерапии число лимфоцитов, синтезирующих 1Ш-у, прогрессивно увеличивалось, достигая уровня группы сравнения в период поддерживающей терапии. Процент лимфоцитов, синтезирующих ТОТ-а, в период после окончания интенсивной химиотерапии достоверно превышал показатель группы сравнения (р<0,001). В последующие периоды исследования уровень лимфоцитов, синтезирующих ЮТ-а, достоверно не отличался от группы сравнения. Процент лимфоцитов, синтезирующих 1Ь-2, достигал нормального уровня после окончания интенсивной терапии. Однако в группе детей, обследованных после окончания программной химиотерапии, среднее число лимфоцитов, синтезирующих 1Ь-2, значительно увеличивалось (р<0,001). Увеличенное количество этих клеток наблюдалось у детей, обследованных в период от 6 до 18 месяцев. У 2 детей при сроке наблюдения 30 и 36 месяцев количество лимфоцитов, синтезирующих 1Ь-2, соответствовало показателям группы сравнения.

Абсолютное количество цитокинсинтезирующих лимфоцитов при проведении химиотерапии было достоверно нюке показателей группы сравнения за счет лейкопении. После окончания программной химиотерапии выявлено снижение содержания клеток, синтезирующих ИЫ-у, и повышение уровня клеток, синтезирующих ТЫР-а 1Ь-2 (р<0,001).

Интенсивность внутриклеточной флюоресценции П^Ы-у восстанавливалась до нормальных величин после окончания интенсивной химиотерапии и в дальнейшем мы не отметили достоверных отличий от показателя контрольной группы. Показатель среднего канала интенсивности флюоресценции в группе детей, обследованных после окончания интенсивной химиотерапии, составил 129+17 против 93+7,5 группы сравнения (различие статистически не достоверно). Интенсивность флюоресценции в период поддерживающей терапии и после окончания терапии возросла до 143+21 и 153+33 при показателе контрольной группы 93+7,5 (р<0,001 для обеих групп детей). Интенсивность флюоресценции внутриклеточного 1Ь-2 во все периоды ремиссии не отличалась от интенсивности внутриклеточной метки группы сравнения.

Выводы.

1. У практически здоровых детей (группа сравнения) средний процент лимфоцитов, синтезирующих цитокины, составил: ТРЫ-у - 29+3,9%, ЮТ-а -27+3,0%, 1Ь-2 - 10,0+1,3%; абсолютное количество - ГЖ-у -0,879+0,113х109/л, ЮТ^-а - 0,855+0,103x10%, 1Ь-2 - 0,345+0,068x10%. Интенсивность экспрессии внутриклеточной метки для этой группы составила: ШИ-у - 303+60,8, ТЭТ-а - 93+7,5, 1Ь-2 - 114+17,5.

2. В дебюте острого лимфобластного лейкоза у детей с невысоким уровнем бластов в крови процентное содержание цитокинсинтезирующих лимфоцитов достоверно не отличается от показателей группы сравнения. Абсолютное количество цитокинсинтезирующих лимфоцитов в данной группе больных достоверно выше показателей группы сравнения (р<0,001).

3. У детей с высоким уровнем бластов в крови отмечается резкое снижение как абсолютных, так и относительных показателей лимфоцитов, синтезирующих цитокины. Обнаружена отрицательная корреляция между уровнем бластных клеток в крови и количеством лимфоцитов, синтезирующих цитокины П-Ы-у, ТМ:-а и 1Ь-2.

4. Лимфоциты периферической крови больных в дебюте ОЛЛ обладают высокой способностью к синтезу внутриклеточных цитокинов, оцениваемому по интенсивности флюоресценции внутриклеточной метки. Средние каналы флюоресценции ШЫ-у, ТКТ-сх и 1Ь-2 в 2-4 раза превышают показатели группы сравнения, что отражает высокую функциональную активность лимфоцитов крови.

5. Относительное содержание зрелых Т-лимфоцитов, Т-хелперов/индукторов, Т-супрессоров/цитотоксических клеток, а также МК-клеток нормализуется к окончанию интенсивной химиотерапии. В связи с лейкопенией на фоне лечения абсолютное количество этих клеток нормализуется после окончания программной химиотерапии.

6. Содержание В-лимфоцитов значительно снижено на фоне химиотерапии и возвращается в пределы нормальных значений только после окончания программной химиотерапии.

7. Восстановление процента лимфоцитов, синтезирующих ¡РЫ-у и 1Ь-2, происходит после окончания интенсивной химиотерапии, а Т№-а - только в период поддерживающей химиотерапии. Среднее абсолютное количество 1Ш-у-синтезирующих лимфоцитов остается низким во все периоды наблюдения, ЮТ-а- и 1Ь-2-синтезирующих клеток восстанавливается после окончания программной химиотерапии.

8. Интенсивность флюоресценции внутриклеточных цитокинов 1ЕЫ-у, ТЫР-а и 1Ь-2 сохраняется на высоком уровне во все периоды ремиссии, что свидетельствует о сохранности функциональных свойств лимфоцитов периферической крови.

Практические рекомендации.

1. Полученные данные о цитокинсинтетический активности лимфоцитов крови у больных В-ОЛЛ могут использоваться для оценки состояния их иммунной системы.

2. Значительное угнетение В-клеточного звена иммунитета необходимо учитывать при выработке терапевтической тактики ведения больных ОЛЛ и при проведении вакцинации детей в период ремиссии ОЛЛ.

Список работ, опубликованных но теме диссертации.

1. Мазитова Е.Н., Копыльцова Е.А., Семикина Е.Л., Тепаев Р.Ф., Торубарова Н.А. Цитокинсинтетическая активность лимфоцитов при остром лимфобластном лейкозе у детей. // Цитокины и воспаление,- 2002 - Т I-№2,- с.78.

2. Тепаев Р.Ф., Копыльцова Е.А., Семикина Е.Л., Мазитова Е.Н., Торубарова Н.А. Результаты лечения детей с острым лимфобластным лейкозом по модифицированным протоколам ALL-BFM-90m и ALL-BFM-95m. // Гематология и трансфузиология,- 2002.-Т. 47,- №4,- С. 11-14.

3. Kopylcova Е.А., Semikina E.L., Tepaev R.F., Mazitova E.N., Torubarova N.A. Apoptotic markers in acute lymphoblastic leukemia in children. // YII Congress of European Hematological Association, 2002. Abstract book. Abstract code 0465.

4. Семикина Е.Л., Тепаев Р.Ф., Мазитова E.H., Копыльцова Е.А., Торубарова Н.А. Fas-рецептор и апоптоз-контролирующие протеины при остром миелобластном лейкозе у детей.// Гематология и трансфузиология,- 2003,- Т. 48,-№3,-С 3.-8.

5. Тепаев Р.Ф., Мазитова Е.Н., Копыльцова Е.А., Семикина Е.Л., Торубарова Н.А. Результаты лечения острого лимфобластного лейкоза у детей по модифицированному протоколу ALL-BFM-95m. // Российский педиатрический журнал.-2003.-№4.-С.ЗЗ-35

Актуальность проблемы.

Острый лимфобластный лейкоз (OJIJI) является наиболее частым онкологическим заболеванием у детей. Использование современной программной химиотерапии в последние годы позволяет достичь выхода в ремиссию более чем у 90% больных, а пятилетней безрецидивной выживаемости у 77-80% детей [Harms DO at al.,2000; Schrappe M at al., 2000].

Несмотря на достигнутые успехи в лечении OJIJI у детей, сохраняется группа больных, у которых проведение современной комплексной химиотерапии неэффективно. Это «первично рефрактерные» к лечению больные (2-3% пациентов), а также дети, у которых развиваются рецидивы заболевания. Результаты лечения этих больных остаются неудовлетворительными. Все это стимулирует к поиску причин резистентности и возможных путей её преодоления.

Рефрактерность лейкемических клеток к высокодозной химиотерапии, а также развитие рецидивов может быть обусловлено особенностями биологии резидуальных клеток и/или нарушениями противоопухолевого иммунитета. В механизме нарушений противоопухолевого иммунитета важную роль может играть изменение функции лимфоцитов и, в частности, нарушение синтеза таких цитокинов, как IFN-y, TNF-a и IL-2, участвующих в клеточном противоопухолевом иммунитете.

В частности, имеются данные о прямой зависимости уровня TNF-a в плазме крови и абсолютного и относительного содержания лейкемических клеток в периферической крови [Потапнев М.П. и соавт., 2003]. Предполагается, что данный цитокин участвует в миграции из костного мозга в периферическую кровь лейкемических клеток.

Однако, особенности внутриклеточного синтеза цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-2, лимфоцитов крови у детей в разные периоды OJIJI изучены мало.

При OJIJI у детей выявлено снижение IFN-y и IL-2 продуцирующих клеточных популяций Т-хелперов и Т-супрессоров, причем наиболее низким был уровень синтеза IL-2. Для восстановления нормального количества IL-2-синтезирующих клеток требовалось 2-3 года после прекращения химиотерапии (Xao-Li Z. et al., 2000). Однако в других исследованиях обнаружено повышение уровня синтеза IFN-y в течение периода терапии и снижение после прекращения лечения (Duan Y. at al., 2001). Описана нормализация IL-2 и IFN-y синтезирующих клеточных популяций Т-хелперов и Т-супрессоров через 6 месяцев после прекращения химиотерапии во всех случаях исследования (Zhang XL at al., 2000).

В связи с изложенным представляется актуальным проведение исследований особенностей клеточного иммунитета у детей в разные периоды острого лимфобластного лейкоза с применением имуноцитологических методов оценки фенотипа и функциональных свойств клеток, в частности цитокинсинтетической активности лимфоцитов периферической крови.

Цель исследования:

Целью исследования являлось изучение цитокинсинтетической активности лимфоцитов крови у детей в дебюте острого лимфобластного лейкоза и в различные периоды ремиссии заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить внутриклеточный синтез цитокинов: интерферона-гамма, фактора некроза опухоли-альфа и интерлейкина-2 лимфоцитами крови у практически здоровых детей.

2. Определить основные субпопуляции лимфоцитов крови и внутриклеточный уровень интерферона-гамма, фактора некроза опухоли-альфа и интерлейкина-2 в лимфоцитах крови у детей в дебюте острого лимфобластного лейкоза.

3. Изучить иммунофенотип лимфоцитов крови и их цитокинсинтетическую активность у детей в разные периоды ремиссии острого лимфобластного лейкоза на фоне химиотерапии.

4. Определить основные субпопуляции лимфоцитов крови и их цитокинсинтетическую активность в периоде ремиссии острого лимфобластного лейкоза у детей после прекращения программной химиотерапии.

Научная новизна:

Впервые определен внутриклеточный синтез цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-2 лимфоцитами крови у детей в различные периоды острого лимфобластного лейкоза.

Впервые установлено, что уровень цитокинсинтезирующих лимфоцитов тесно связан с количеством бластов в крови. Процент лимфоцитов, синтезирующих IFN-y, TNF-a и IL-2, у больных с низким бластозом соответствовал показателям группы сравнения. При высоком бластозе в крови уровень цитокинсинтезирующих лимфоцитов был резко снижен.

Получены данные о чрезвычайно высокой интенсивности экспрессии изученных внутриклеточных цитокинов в остром периоде заболевания независимо от уровня бластоза в крови и процента цитокинсинтезирующих клеток, что отражает высокую функциональную активность лимфоцитов крови в дебюте острого лимфобластного лейкоза.

Показано, что процент цитокинсинтезирующих лимфоцитов крови сохраняется на уровне показателей группы сравнения в различные периоды ремиссии заболевания на фоне химиотерапии, а также после окончания программной химиотерапии.

Установлено, что у больных OJIJI с низким уровнем бластных клеток в крови в дебюте заболевания состав популяций лимфоцитов периферической крови s соответствовал показателям нормы. Изменения в составе субпопуляций лимфоцитов выявлялись лишь у детей при уровне бластных клеток более 49%. На фоне лейкоцитоза за счет лейкемических клеток наблюдалось снижение как относительных, так и абсолютных показателей содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций.

Установлено, что процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов и их CD4+ и CD8+ субпопуляций, а также NK-клеток нормализуется к окончанию интенсивной химиотерапии.

Выявлено, что на фоне проведения программной химиотерапии отмечается резкое угнетение В-линейного звена иммунитета. Содержание В-лимфоцитов возвращается в пределы нормальных значений после окончания программной химиотерапии.

Практическая значимость работы:

Определена цитокинсинтетическая активность лимфоцитов периферической крови у практически здоровых детей, что может быть использовано в качестве нормативных показателей при оценке состояния иммунной системы.

Установлено, что в дебюте острого лимфобластного лейкоза интенсивность флюоресценции внутриклеточных цитокинов в лимфоцитах крови значительно превышает показатели группы сравнения, что косвенно указывает на напряженность противоопухолевого иммунитета в остром периоде заболевания.

В различные периоды ремиссии В-линейного острого лимфобластного лейкоза процентный состав Т-лимфоцитов и их субпопуляций, а также интенсивность экспрессии внутриклеточных цитокинов соответствует показателям практически здоровых детей (группа сравнения). Полученные данные свидетельствуют о достаточной стабильности Т-клеточного иммунитета, что, вероятно, способствует поддержанию ремиссии B-OJIJI после окончания программной химиотерапии.

Выявлено значительное угнетение В-кпеточного звена иммунитета, что необходимо учитывать при выработке терапевтической тактики ведения данных больных и при проведении вакцинации детей в период ремиссии OJIJI.

Полученные данные дают представление о функциональном состоянии иммунной системы при остром лимфобластном лейкозе.

Внедрение результатов работы в практику:

Результаты исследования, в частности определение функциональной активности лимфоцитов по их способности к внутриклеточному синтезу цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-2, внедрены в работу клинико-диагностической лаборатории ГУ НИИ педиатрии НЦЗД РАМН и могут быть использованы в работе иммунологических и гематологических лабораторий.

ВЫВОДЫ:

1. У практически здоровых детей (группа сравнения) средний процент лимфоцитов, синтезирующих цитокины, составил: IFN-y - 29+3,9%, TNF-a -27+3,0%, IL-2 - 10,0+1,3%; абсолютное количество - IFN-y -0,879+0,113х109/л, TNF-a - 0,855+0,103x109/л, IL-2 - 0,345±0,068х109/л. Интенсивность экспрессии внутриклеточной метки для этой группы составила: IFN-y - 303+60,8, TNF-a - 93±7,5, IL-2 - 114+17,5.

2. В дебюте острого лимфобластного лейкоза у детей с невысоким уровнем бластов в крови процентное содержание цитокинсинтезирующих лимфоцитов достоверно не отличается от показателей группы сравнения. Абсолютное количество цитокинсинтезирующих лимфоцитов в данной группе больных достоверно выше показателей группы сравнения (р<0,001).

3. У детей с высоким уровнем бластов в крови отмечается резкое снижение как абсолютных, так и относительных показателей лимфоцитов, синтезирующих цитокины. Обнаружена отрицательная корреляция между уровнем бластных клеток в крови и количеством лимфоцитов, синтезирующих цитокины IFN-у, TNF-a и IL-2.

4. Лимфоциты периферической крови больных в дебюте ОЛЛ обладают высокой способностью к синтезу внутриклеточных цитокинов, оцениваемому по интенсивности флюоресценции внутриклеточной метки.

Средние каналы флюоресценции IFN-y, TNF-a и IL-2 в 2-4 раза превышают показатели группы сравнения, что отражает высокую функциональную активность лимфоцитов крови.

5. Относительное содержание зрелых Т-лимфоцитов, Т-хелперов/индукторов, Т-супрессоров/цитотоксических клеток, а также NK-клеток нормализуется к окончанию интенсивной химиотерапии. В связи с лейкопенией на фоне лечения абсолютное количество этих клеток нормализуется после окончания программной химиотерапии.

6. Содержание В-лимфоцитов значительно снижено на фоне химиотерапии и возвращается в пределы нормальных значений только после окончания программной химиотерапии.

7. Восстановление процента лимфоцитов, синтезирующих IFN-y и IL-2, происходит после окончания интенсивной химиотерапии, a TNF-a - только в период поддерживающей химиотерапии. Среднее абсолютное количество IFN-у-синтезирующих лимфоцитов остается низким во все периоды наблюдения, TNF-a- и IL-2-синтезирующих клеток восстанавливается после окончания программной химиотерапии.

8. Интенсивность флюоресценции внутриклеточных цитокинов IFN-y, TNF-a и EL-2 сохраняется на высоком уровне во все периоды ремиссии, что свидетельствует о сохранности функциональных свойств лимфоцитов периферической крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Полученные данные о цитокинсинтетической активности лимфоцитов крови у больных В-линейным острым лимфобластным лейкозом могут использоваться для оценки состояния их иммунной системы.

2. Значительное угнетение В-клеточного звена иммунитета необходимо учитывать при выработке терапевтической тактики ведения больных ОЛЛ и при проведении вакцинации детей в период ремиссии острого лимфобластного лейкоза.