Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Моноклональные антитела ИПО- 10 и их применение в исследовании лимфоидных форм лейкозов человека

Совершенствование методов диагностики опухолевых заболеваний лимфоидной ткани, является одной из актуальнейших проблем современной онкологии и гематологии. Многообразие цитологических вариантов лимфоидных форм лейкозов обусловлено злокачественной трансформацией различных по своей природе клеток-мишеней, отличающихся по стадиям созревания, на которых произошло нарушение диф-ференцировки клеток, наличием необычных фенотипических признаков при сохранении признаков нормальных клеток-аналогов (Н.С.Кисляк с соавт., 1972; Р.С.Самойлова с соавт., 1982; З.А.Бутенко с соавт. 1984; А.И.Воробьев, М.Д.Бриллиант, 1985; Murphy et al 1983).

В последние годы, наряду с классическими морфологическими и цитохимическими методами, в уточненной диагностике лимфоидных форм лейкозов стали шире применять иммунодиагностические методы с использованием моноклональных антител (МКАТ) С А. Ю.Барышников, 1984; Г. Ю.Мит ер ев с соавт., 1987; Bernard et al . , I98J; Poon , Todd , 1986; Greaves et al, 1983, 1988).

Обнаружение с помощью МКАТ новых поверхностных маркеров В-лим-фоцитов, которые являются субстратом ряда лимфоидных форм лейкозов человека, расширяет наши знания о стадиях дифференцировки клеток этого ряда, дает возможность выяснить принадлежность злокачественных клеток к одной из линий лимфопоэза, определить уровень блока дифференцировки клеток патологического клона при различных формах и цитологических вариантах заболеваний.

В нашей стране получен ряд МКАТ к поверхностным антигенам лимфоцитов человека. Среди них МКАТ против la-подобного антигена (ИКО-1), панель МКАТ против дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов серии ИКО, полученные А.Ю.Барышниковым с соавт.

1984, 1985, 1988) в Институте клинической онкологии ВОНЦ АМН СССР. В Институте иммунологии МЗ СССР А.В.Филатовым с соавт. (1986, 1987) создана панель цКкТ! против антигенов Т-лимфоцитов человека. Ими же получены МКАТ IB4, реагирующие как с В-, так и с Т-лимфоцитами. МКАТ к антигенам Т-лимфоцитов и других кроветворных клеток получены Т.И.Булычевой с соавт. в ВГНЦ МЗ СССР (1988). МКАТ к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов получены в лаборатории иммунологии ВКНЦ АМН СССР О.В.Рохлиным с соавт. (1986) и В.Б.Климовичем с соавт. (1988) в центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте МЗ СССР.

МКАТ, выявляющие дифференцировочные антигены, специфичные только для В-лимфоцитов, в отечественной литературе ранее не были описаны. Поэтому получение таких МКАТ и их использование наряду с морфологическими признаками, цитохимическими и иммунологическими маркерами для характеристики патологических клеток больных лимфоидными формами лейкозов человека является актуальной задачей.

Диссертация выполнена в соответствии с научно-техническими программами 0.69.02 "Злокачественные новообразования", 0.69.05 "Лейкозы человека и сельскохозяйственных животных" и проблемой 5.2.3 КП НТП стран-членов СЭВ "Создание новых диагностических средств и методов на основе биотехнологии, в том числе монокло-нальных антител для диагностики инфекционных, соматических, онкологических заболеваний, аллергических состояний, нарушений иммунитета".

Целью работы явилось получение и характеристика специфичности МКАТ к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов человека и их использование наряду с отечественными и зарубежными МКАТ для изучения, классификации и дифференциальной диагностики лимфоид-ных форм лейкозов человека.

Задачи исследования:

1. Получение МКАТ против дифференцировочного антигена В-лим-фоцитов человека.

2. Изучение специфичности полученных МКАТ на линиях клеток человека различного происхождения.

3. Определение специфичности МКАТ при изучении клеток крови, кроветворных и лимфоидных органов здоровых людей.

4. Изучение с помощью МКАТ антигенов поверхностных мембран культивируемых ин витро лимфоцитов при митогенной стимуляции.

5. Характеристика с помощью МКАТ поверхностного фенотипа патологических клеток крови при некоторых формах злокачественных лимфопролиферативных заболеваний (хронический лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, миеломная болезнь).

6. Выяснение возможности применения МКАТ для классификации и уточненной диагностики отдельных форм и цитологических вариантов лейкозов человека.

Научная новизна результатов исследования. Впервые в нашей стране получены и охарактеризованы МКАТ, обозначенные ИПО-Ю, выявляющие дифференцировочный антиген В-лимфоцитов человека, эк-спрессированный на различных стадиях их развития - от ранних предшественников В-лимфоцитов до иммунобластов. Антиген, распознаваемый МКАТ ИПО-Ю, не идентичен ранее охарактеризованным маркерам В-лимфоцитов таким как slg , Рс- и СЗ-рецепторы, GDI9 , CD20 , CD21 , CD22 , CD23 » CD24 , IILA-Dr энтигены.

С помощью панели МКАТ, включающей МКАТ ИПО-Ю, охарактеризован поверхностный фенотип патологических клеток больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), хроническим лимфолейкозом СХЛЛ), волосатоклеточным лейкозом (BKJI), миеломной болезнью и установлено, на каком уровне произошел блок дифференцировки клеток патологического клона. В зависимости от степени зрелости лимфоцитов периферической крови больных выделено четыре подварианта не-T-QJIJI, два подварианта Т-ОЛЛ, две группы больных ХЛЛ.

Практическая ценность работы. Проведенные исследования показали возможность использования МКАТ ИПО-Ю в комплексе с другими МКАТ к линейно-специфическим, а также дифференцировочным антигенам Т- и В-лимфоцитов, морфологическими и цитохимическими методами для уточненной дифференциации отдельных форм и цитологических вариантов системных опухолевых заболеваний лимфоидной ткани.

Внедрение результатов исследования в практику. МКАТ ИПО-Ю приняты в производство и выпускаются Кооперативным научно-произ водственным объединением "Д1агностикум". МКАТ ИПО-Ю применяются в диагностических исследованиях в лабораториях клинической иммунологии, гематологических и онкологических клиниках 33 науч ных и практических учреждений МЗ СССР, АМН СССР, МЗ УССР, МЗ РСФСР.

Основные положения диссертации изложены в 4 научных публикациях. Материалы работы доложены на конференции молодых ученых Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (1987), Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988), Всесоюзной конференции гематологов и трансфузиологов (Сухуми, 1988).

Основные научные положения, которые выносятся на защиту:

I. Получены МКАТ ИПО-Ю против антигена В-лимфоцитов человека, экспрессированного на различных стадиях дифференцировки кле ток этого ряда - от ранних клеток-предшественников до иммуно-бластов.

2. Антиген, распознаваемый ЖАТ ШО-Ю, не идентичен таким известным маркерам В-лимфоцитов, как поверхностные иммуноглобулины ( Big ), Рс- СЗ-рецепторы, антигены CD19 > CD20 ,HLA-Dr,

CD21 , CD22 , CD23, CD24 и, вероятно, участвует в процессе активации В-лимфоцитов.

3. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является маркером В-клеточных линий, В-лимфоцитов периферической крови, кроветворных и лимфоидных органов практически здоровых людей.

4. При изучении иммунологического фенотипа клеток крови больных с использованием панели реагентов, включающих МКАТ ИПО-Ю, выделено 2 подварианта T-QJDI, 4 подварианта не-Т-ОЛЛ, две группы больных с В-клеточным ХЛЛ.

Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является маркером клеток с волосатоклеточным лейкозом и не обнаружен на клетках периферической крови больных миеломной болезнью.

Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Библиографический указатель включает 236 источников литературы (48 отечественных и 188 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована II рисунками, 10 таблицами и 5 микрофотографиями. Работа выполнена в отделе цитологии опухолевого роста (зав. - чл. корр. АН УССР В.Г.Пинчук) и лаборатории цитохимии и йммуноцитологии (зав. - проф. Д.Ф. Глузман) Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР.

ВЫВОДЫ

1. С помощью гибридомной технологии получены МКАТ ИПО-Ю против дифференцировочного антигена В-лимфоцитов человека.

2. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, экспрессирован на поверхностных мембранах В-клеточных линий Daudi , Hamalva ,

Raji , ЕВ-3, PHS , КШ1-8226 и отсутствует на Т-клеточных линиях различной степени зрелости МОЬТ-4, CCRP-HSB2 , Jurkat .

3. Количество ИПО-Ю4" клеток з эмбриональной печени и в периферической крови практически здоровых людей соответствует относительному содержанию клеток с поверхностными иммуноглобулинами и цитоплазматическими jj -цепями.

4. Антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, экспрессирован на различных стадиях дифференцировки В-лимфоцитов: от ранних клеток-предшественников до иммунобластов.

5. Изменение экспрессии антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю, при бласттрансформации, вызванной различными митогенами (Кон А, ФГА, ЛПС, РШ ),.свидетельствует о его возможном участий в процессах активации В-лимфсцитов.

6. Антиген, распознаваемый МКАТ ИПО-Ю, не идентичен таким известным маркерам В-лимфоцитов, как I<g, Рс , СЗ-рецепторы, CD19 > CD20 , CD21 , CD22 , CD23 » CD24 , HIA- Dr антигены.

7. С учетом экспрессии на поверхностных мембранах бластных клеток антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю, выделены следующие подварианты острого лимфобластного лейкоза: нуль-ОЛЛ, подвариант ОЛЛ с 1а+ИЛ0-Ю+ клетками, npe-npe-B-OJUI, npe-B-QJDI, Т1-0ЛЛ, Т2-0ЛЛ.

8. При изучении иммунологического фенотипа клеток при хроническам лимфолейкозе выделены две группы больных, у которых лимфоциты периферической крови отличаются по степени зрелости.

9. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, служит маркером клеток при волосатоклеточном лейкозе. Он не обнаружен на клетках пери' ферической крови больных миеломной болезнью.

10. МКАТ ИПО-Ю, наряду с другими МКАТ и линейно-специфическим, дифференцировочным и активационными антигенами клеток лим-фоидной ткани, могут быть использованы для изучения, классификации и дифференциальной диагностики лимфоидных форм лейкозов человека.

-122-Список сокращений

МКАТ - моноклональные антитела slg - поверхностные иммуноглобулины cyig - цитоплазглатические иммуноглобулины TdT - терминальная дезокситрансфераза сЗ-рецепторы - рецепторы к третьему компоненту комплемента Ш - иг.Елунофлуopесцентная реакция ЭБВ - вирус Эпштейна-Барр pwm - митоген лаконоса ЛПС - липополисахарид Кон А - конканавалин А ФГА - фитогемагглютинин ЛПЗ - ли ш о пр о ли феративные заболевания ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз ХЛЛ - хронический лимфолейкоз ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз НЗЛ - неходшшнская злокачественнаялимфома calla - антиген ОЛЛ "общего типа"

V *

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы все больше внимания уделяется изучению структуры и функции антигенных детерминант клеточной поверхности. Представления о гетерогенности популяции лимфоцитов в настоящее время значительно расширились. Важным дополнением явились исследования, которые показали, что различным иммунокомпетентным клеткам присущи дифференцировочные антигены, которые приобретаются клетками по мере их созревания. Моноклональные антитела к дифференцировочным антигенам Т- и В-клеток являются одним из наиболее совершенных инструментов для выявления, характеристики субпопуляций лимфоцитов, составляющих морфологический субстрат лимфопролиферативных заболеваний. Применение классических морфологических, иммунологических и цитохимических методов часто оказывается недостаточным для установления гистогенеза и уровня дифференцирозки клеток патологического клона. Привлечение для этих целей МКАТ открывает новый этап в иммунодиагностике и классификации лимфопролиферативных заболеваний. Исходя из важности этих вопросов, целью работы явилось получение МКАТ к диф-ференцировочному антигену В-лимфоцитов человека, характеристика их специфичности и последующее использование в панели МКАТ для изучения лимфопролиферативных заболеваний.

При получении МКАТ к дифференцировочным антигенам лимфоцитов чаще всего исследователи используют в качестве иммунизирующего материала клетки больных или здоровых людей с заранее известным фенотипом /5, 53, 91, 109, 170, 179/.

Мы же пошли по другому пути и избрали в роли иммуногена линию клеток Daudi , клетки которой лишены антигенов главного комплекса гистосовместимости и -микроглобулина. Подобный подход к выбору иммуногена использовался исследователями, однако в нашей стране он был осуществлен нпервые. В результате селекции смешанной культуры клеток, продуцирующих и не продуцирующих антитела на ГАТ-, ГТ- и среде для культивирования гибридом, а также после клонирования и реклонирования методом лимитирующих разведений был отобран клон гибридомы А7, продуцирующий антитела, обозначенные ИПО-Ю.

На первом этапе изучения специфичности МКАТ ИПО-Ю были использованы 12 линий клеток человека различного происхождения. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, подобно cd19 > cd20 , 0121 , CD22 , сгез , СЕЕ4 антигенам, не был выявлен на Т-клеточных линиях Jurkat, CCRF-HSB2, molt4 , а также на клетках К-562, полученных от больного при бластном кризе хронического миелолейкоза. Также,как и МКАТ В2, В4, Blast-1 МКАТ ИПО-Ю реагировали с небольшой популяцией клеток линии RFMI-8226. Положительная реакция этих МКАТ с клеточной линией из миеломы не удивительна, поскольку она представляет собой дифференцирующуюся in vitro культуру, часть клеток которой представлена плазматическими клетками. В то же время, среди МКАТ, определяющих cd19, CD21 антигены, существуют антитела, которые не взаимодействуют с клетками RFMI-8226 (НВ5, HD37 ) /49, 91, 177, 187/. Если cd21, CD23 антигены выявляются на линиях клеток BPMI-8226, как и антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, то данные о . экспрессии этих антигенов на линии клеток Daudi в доступной нам литературе мы не встретили. Кроме того, большинство МКАТ*. определяющих эти антигены, не реагировали с .клетками линии Namalva » а с клетками Kaji не взаимодействовали антитела к

CD23 • Однотипность реакции МКАТ ИПО-Ю и большинства МКАТ, реагирующих с CD19, CD20, CD22 антигенами, установлена при сравнивании результатов взаимодействия этих МКАТ с ЭБВ+-линия-ми клеток Daudi, ЕВ-5, Namalva, Raji . В то же время CD19 , CD22 антигены не обнаружены на клеточных линиях Daudi, iTamalva Кроме того, МКАТ HD22 , взаимодействующие с CD22 антигеном, дают положительную реакцию с ЭБВ"линией клеток Ramos , что не характерно для МКАТ ИПО-Ю /91,212/. Только в случае МКАТ BI прослеживается корреляция во взаимодействии МКАТ BI и ИПО-Ю с одними и теми же линиями клеток. Однако нам не известно, реагируют ли МКАТ BI с клетками линии Ramos /54, 123, 156/.

Используя в качестве иммунизирующего материала линию клеток Daudi, Malavasi et al . (1984), Wiels et al • (1981) также получили МКАТ. Судя по тому, что МКАТ 38.13 взаимодействуют с линией клеток Ramos и принадлежат к IgM классу иммуноглобулинов, а МКАТ АЮ ( IgGJ ) реагируют с линиями клеток molt-4 , Jurkat они не обладают той же специфичностью что и МКАТ ИПО-Ю.

Таким образом, среди МКАТ, определяющих только антигены В-лимфоцитов и сгруппированных в кластеры дифференцировки, не установлен полный аналог МКАТ ИПО-Ю по специфичности связывания с клеточными линиями, использовавшимися в работе.

При параллельном изучении специфичности МКАТ ИПО-Ю, ИПО-З, ИКО-I на линиях клеток установлено, что эти МКАТ определяют различные антигены. Наш вывод основывался на сопоставлении относительного содержания клеток, реагирующих с МКАТ ИПО-Ю, ИПО-З, ИКО-I, характере флуоресценции различных МКАТ с клетками одной и той же линии' клеток. МКАТ ИПО-Ю давали положительную реакцию только с линиями В-клеточного происхождения.

Дифференцировка лимфоцитов традиционно изучалась по последовательности появления и исчезновения ряда маркеров на лимфоидных клетках крови, центральных и периферических органов лим-фопоэза. Эмбриональная печень является основным местом образования и развития лимфоцитов в антенатальном периоде жизни человека. В печени плода раньше, чем в костном мозге и периферической крови появляются В- и Т-лимфоциты. В то же время, тимус еще не функционирует как орган лимфопоэза и представляет собой зачаток в виде эпителиального тяжа. Исходя из этого, нам интересно было изучить экспрессию антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю. на лимфоидных клетках эмбриональной печени различных сроков развития.

Антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, появляется на клетках 8-9 недельной печени плода. На этот период приходится и появление, первых су^«+-клеток /45, 58/, что также было обнаружено в наших экспериментах. Поскольку в 8-9 недельной печени еще не обнаруживаются клетки с slg /18, 124/» а количество ИП0-Ю+ клеток превышает относительное содержание су^гДлимфоцитов, можно предположить, что антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, появляется раньше, чем обнаруживается экспрессия суju -цепей в лимфоцитах. Из-за недостаточности данных литературы о появлении В-дифференцировочных антигенов на кроветворных клетках эмбриональной печени, трудно сопоставить динамику экспрессии этих маркеров и антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю. Однако известно, что em9, ud20, cd24 антигены, возможно, как и ИП0~Ю+ клетки, предшествуют появлению сзгуи+-лимфоцитов в печени плода /18/. Подобно антигену, реагирующему с МКАТ ИПО-Ю, экспрессия cd20 антигена, определяемого МКАТ BI, приходится на 15-16 неделю эмбрионального развития.

В эмбриональной печени определяются клетки, несущие пан-Т-клеточный маркер Leu4 • единичные на 12-13-й неделе и довольно многочисленные на 20-21-й неделях /122/. В печени 12-17 недельных плодов до 3,0$ клеюк содержат специфические маркеры Т-лим-фоцитов, определяемые МКАТ ОКИ, ОКТЗ, 0КТ4, 0КТ5, 0KI6, 0КТ8. Относительное содержание этих клеток к 20-й неделе возрастает до 10,0-26,0$ /49/. Таким образом, учитывая данные доступной литературы, можно прийти к выводу, что антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, является В-дифференцировочным, поскольку он появляется подобно другим маркерам В-лимфоцитов на 8-9-й неделях эмбрионального развития, и его экспрессия достигает максимума на 12-14 неделе. Число клеток эмбриональной печени с маркерами Т-лимфоци-тов возрастало после 20-й недели антенатального развития. В этот же период уменьшалось относительное содержание ИПО-Ю4" клеток. Количество ИПО-Ю4" клеток в эмбриональной печени в различные сроки развития плода коррелировало с числом су^+-клеток.

Подтверждением нашего предположения о В-клеточной направленности дифференцировки лимфоцитов, содержащих антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, послужили результаты экспериментов по обнаружению этого маркера на тимоцитах. Максимальное число ИПО-Ю4" клеток не превышало 3,5$.и соответствовало числу зЛ^+-лимфо-цитов, тогда как относительное содержание ИПО-П+клеток составляло 90,0-95,0$.

В периферической крови здоровых людей 11,5-29,4$ мононуклеа-ров, а в миндалинах больных хроническим тонзиллитом 32,0-63,0$ клеток были ИПО-Ю4". У всех обследованных нами доноров число ИПО-Ю4" мононуклеаров периферической крови не превышало относительного содержания slg+ лимфоцитов. Среди В-лимфоцитов миндалин обнаружена популяция ИП0-Ю+ slg" клеток. Если среди клеток крови относительное содержание ИК0-1+ клеток находилось в пределах числа ИП0-10+ лимфоцитов, то среди клеток миндалин такая закономерность не была установлена. Число ИК0-1+ клеток значительно превышало количество клеток, реагирующих с МКАТ ИПО-Ю. Учитывая, что клетки миндалин являются моделью реактивно измененной лимфоидной ткани, столь высокий процент (96,0$) ИК0-1+ клеток объясняется присутствием среди популяции'выделенных лимфоцитов как В-клеток, так и активированных форм Т-кле-ток. Эти исследования подтверждают наш вывод о различной специфичности МКАТ ИПО-Ю и ИКО-1. По данным Dttrken et al • (1986), Hadler (1986), Horda et al . (1985), Link et al . (1986),

Anderson et al . (1935), антигены В-лимфоцитов человека CD19 CD20 , CD21 , CD22 обнаружены на 48,0-57,0% клеток миндалин. Наши результаты по определению относительного содержания ИПО-Ю клеток миндалин согласуются с этими данными и дают основания предположить, что МКАТ ИПО-Ю определяют В-клеточный дифференци ровочный антиген.

При изучении специфичности МКАТ ИПО-Ю на клетках периферической крови нами была использована фракция мононуклеаров. Приблизительно равное относительное содержание ИПО-Ю*" и slg+ -клеток позволяет нам судить о маркере, определяемом МКАТ ИПО-Ю как В-дифференцировочном. Кроме того, гранулоциты периферической крови не реагировали с МКАТ ИПО-Ю. Эти выводы были подтверждены результатами исследований, проведенных в Белорусском НИИ гематологии и переливания крови М.Н.Потапневым. Им были выделены отдельные субпопуляции Т- и В-лимфоцитов периферической крови доноров. При постановке ИФ-теста с МКАТ ИПО-Ю 97,0-98,0%

В-клеток реагировали с МКАТ ИПО-Ю. Т-лимфоциты с этими MI CAT не взаимодействовали.

Таким образом, в результате изучения экспрессии МКАТ ИПО-Ю на клетках крови и кроветворных органов здоровых людей нами было установлено, что содержание ИП0-Ю+ клеток соответствовало числу slg+ лимфоцитов, т.е. клеток, содержащих универсальный маркер В-лимфоцитов.

Следующим этапом нашей работы было изучение экспрессии антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю, при параллельном использовании МКАТ ИКО-I, ДАКО TI на клетках бласттрансформированных культур, которые являются моделью для изучения маркеров дифференцировки лимфоцитов. В стимулированных В-клеточными митогенами jEWM. и ЛПС клетках периферической крови не наблюдалось различий в динамике экспрессии антигенов, определяемых МКАТ ИКО-I и ИПО-Ю. В первые 24-72 часа культивирования наблюдалось снижение числа ИПО-Ю+-клеток, которое в некоторых случаях PWjf- -стимулированных культур достигало нуля. Клетки же, реагирующие с МКАТ ИПО-Ю, давали реакцию в виде "шапочек". В ходе дальнейшего культивирования клеток периферической крови доноров с В-клеточными мито

1 4генами происходило увеличение числа ИПО-Ю клеток, которое достигало, максимума на 7-й день после стимуляции :P.WM. и на 4-й день после воздействия ЛПС. Максимальное число ИП0-Ю+ клеток не на много превышало исходный уровень лимфоцитов, реагирующих с МКАТ ИПО-Ю, что мо?шо объяснить постепенной утратой клетками этого маркера на поздних антигензависимых стадиях дифференцировки В-лимфоцитов. Клетки с признаками плазматизации были лишены антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю. Чем же объяснить снижение числа ИП0-Ю+ клеток в первые 48-72 часа культивирования?

Возможно^это связано с тем, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является рецептором для митогенов или играет роль в процессах активации В-лимфоцитов. При этом в начале стимуляции идет его слущивание с клеточной поверхности В-лимфоцитов (о чем свидетельствует характер реакции по определению этого маркера в виде "шапочек" и потеря антигена клеткой), а затем дальнейший ресинтез антигена, что ведет к увеличению относительного содержания лимфоцитов, реагирующих с «КАТ ИПО-Ю.

ФГА и Кон А, которые стимулируют преимущественно Т-лимфоци-ты, не оказывали стимулирующего эффекта на ИП0-Ю+-клетки, число которых в ходе эксперимента уменьшалось.

Таким образом, при изучении поверхностного фенотипа бласт-трансформированных культур нами установлено, что экспрессия антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю, изменяется. При этом, увеличение относительного содержания ИПО-Ю+-клеток наблюдается лишь в культурах, подвергшихся действию ЛПС - В-клеточного тимус-независимого митогена и 2WM'. , вызывающего Т-зависимую диффе-ренцировку В-лимфоцитов.

Изучение поверхностных маркеров патологических клеток больных с ЛПЗ показало, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, обнаруживается только на клетках больных с В-кл'еточными формами и вариантами гемобластозов. Иммунологическое типирование клеток больных острым лимфобластным лейкозом, хроническим лимфолей-козом, волосатоклеточным лейкозом, миеломной болезнью позволило представить схему экспрессии некоторых маркеров В-лимфоцитов, а также антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю (рис. 16). ОЛЛ в зависимости от иммунологического фенотипа бластных клеток был подразделен на б подвариантов. Четыре из них - подварианты не-Т-СШ1. У больных с нуль-ОЛЛ лейкозные клетки были представле

1а-вариант ОЛЛ пренуль-ОЛЛ с ИПО-Ю клет- пре-В пре-В ХЛЛ-I ВКЛ ХМ-II Миеломна- болезнь | , qfftl , ш | .

1а-подобный антиген Z

ИПО-Ю

IL-2 су Ig slg cALLA ранние предшественники пре- пре-В незрелые зрелые В-лим-иммуно- плащматичэские

В лимЪопитон пре-В лимфо - В-лимфо- {юциты бласты клетки v ц лимфо- циты питы циты

Рисунок 16.

СХЕМА ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРОВ В-ЛИМФОЦИТОВ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ ДОФФЕРЕНЦИРОВКИ/ ны наименее зрелыми клетками, блок дифференцировки которых произошел на стадии ранних предшественников лимфоцитов. Они имели, следующий фенотип: ИК0-1+, ИПО-Ю", сАЫА", суJUT, slg" • Наличие МКАТ ИПО-Ю позволило выделить новый 1а-вариант ОЛЛ с ИП0-Ю+ клетками. Фенотип лимфоцитов этой группы больных соответствовал ИК0-1+, ИП0-Ю+, cALLA"» с у/С/", slg" клеткам. В-лимфоциты этой группы больных не содержали сАЫА, сyju , что привело нас к выводу о том, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-10, обнаруживается впервые на стадии ранних предшественников В-лимфоцитов,. вслед за la-подобным антигеном. По-видимому, появление ИП0-10+ клеток предшествует стадии сАИА+ В-лимфоцитов. , +

Лейкозные клетки больных с фенотипом ИКО-1 , ИПО-Ю , IB4", сА1ЬА+, су , slg" были выделены в подвариант пре-пре-В-ОЛЛ. В работах А.Ю.Барышникова (1984), Greaves et al . (1981), Katib (1985) выделен О-ОЛЛ, хотя'Foon, Told "(1986) больных с подобным фенотипом злокачественных клеток сгруппировали в пре-пре-В подвариант ОЛЛ. Нам кажется целесообразным выделение пре-пре-В подварианта ОЛЛ, поскольку он более точно характеризует степень зрелости клеток патологического клона.

Среди других не-Т разновидностей ОЛЛ подвариант пре-В ОЛЛ отличался наличием более зрелых клеток В-ряда по сравнению со злокачественными клетками больных ОЛЛ, дифференцировка которых блокировалась на стадии пре-В лимфоцитов. В этом случае бласт-ные клетки имели фенотип: ИК0-1+, ИП0-Ю+, 1В4+, сАЫА+, су(/+ slg".

Группа Т-ОЛЛ включала больных, бластные клетки которых имели характеристики незрелых Т-лимфоцитов и переходных тимоцитов -кортикально-медуллярных со следующим фенотипом: TI) ИКО-1", ИПО-Ю", ИК0-П+, ИК0-16+, TI", Т2+, Т8", суjlT, slg"

Т2) ИКО-1", ИПО-Ю", ИКО-П+, ИК0-1б+, TI+, Т2+, Т8", су Ju, slg"

При изучении морфологических и цитохимических особенностей клеток больных ХЛЛ, мы учитывали результаты исследований ранее проведенные в лаборатории цитохимии и иммуноцитологии Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (Д.Ф.Глузман и др., 1982, С.П.Сидоренко, 1980), данные Grossi (1982), Е.Н. Злобиной (1986), что дало основание выделить две'группы больных. Первую группу составляли больные, клетки которых по цитоморфоло-гическим признакам были представлены малыми или средними лимфоцитами с большим ядерно-цитоплазматическим отношением. Ядра округлой формы, иногда с выемкой. Эти клетки давали отрицательную, умеренно-диффузную или мелкогранулярную реакцию на кислую фос-фатазу и неспецифическуюэстеразу. Интенсивность реакции при определении кислой фосфатазы и неспецифической зстеразы в лимфоцитах больных ХЛЛ была значительно ниже, чем в норме, что, вероятно, связано с уменьшением числа лизосом или со сниженной активностью лизосомальных гидролитических ферментов. Такая реакция на кислую фосфатазу и неспецифическую эстеразу характерна для патологических В-лимфоцитов на ранней антнгензависимой или поздней антигеннезависимой стадии дифференцировки. Клетки этих больных не содержали СЗ-рецепторы. Вторая группа больных ХЛЛ характеризовалась довольно высокой степенью плазматизации лейкозных клеток. В большинстве клеток обнаружена высокая активность кислой фосфатазы с распределением продукта реакции в виде единичных крупных гранул и умеренная активность неспецифической эстеразы. Для клеток этих больных характерно наличие СЗ-рецепторов.

При параллельном исследовании поверхностных антигенов с помощью панели МКАТ, также выделено 2 группы больных. Иммунологический фенотип клеток больных ХИЛ I группы "соответствовал В-лимфоцитам, представленным на поздней аитигеннезависимой или ранней антигензависимой стадии дифференцировки - ИК0-1+, ИПО-Ю4", Т1+(ЛТ1+), су jlT» slg+ . Лимфоциты больных II группы ХЛЛ имели фенотип: ИКО-I4", ИПО-Ю", Т1+(ЛТ1+), суju+ , slg" . Лейкозные клетки больных II группы были более зрелыми, чем клетки больных ХЛЛ-I и часть имели признаки плазматизации. Потеря антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю на патологических клетках больных ХЛЛ-11; по-видимому происходит раньше исчезновения Tacit la-подобного антигенов.

При изучении иммунологического фенотипа больных миеломной болезнью обнаружено отсутствие ИП0-Ю+ клеток, что также свидетельствует об исчезновении этого антигена на поздних стадиях дифференцировки В-лимфоцитов.

Во всех изученных случаях ВКЛ МКАТ ИПО-Ю реагировали с клетками больных. Кроме того, антиген, определяемый -МКАТ ИПО-Ю, обнаруживался на волосатых клетках вместе с активационными антигенами, выявляемыми МКАТ ИПО-З, ИПО-4, ДАКО IL-2. Эти данные подтверждали результаты иммунологических исследований,, свидетельствующих о том, что волосатые клетки имеют характеристики В-лимфоцитов на антигензависимой стадии дифференцировки.

Таким образом, в результате изучения иммунологической характеристики патологических клеток больных ЛПЗ установлено, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю,' появляется на стадии ранних предшественников В-лимфоцитов и исчезает на поздних антигенза-висимых стадиях дифференцировки клеток В-ряда. Этот антиген не является маркером плазматических клеток, клеток гранулоцитарно-го ряда.