Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Полиморфизмы генов Р53,XRCC1 и CCR5 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ РФ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВОРОПАЕВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ Р53, ХКСС1 И ССК5 У БОЛЬНЫХ НЕХОДЖКИНСКИМИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ЛИМФОМАМИ

14 00 29 - гематология и переливание крови 14 00 16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2007

003173874

Работа выполнена в Новосибирском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

член-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Поспелова Татьяна Ивановна

Воевода Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Журавская Эмилия Яновна Поляков Лев Михайлович

Ведущая организация: НИИ гематологии и переливания крови, г Киров

Защита диссертации состоится « ^ » 2007г в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208 062 04 при Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава по адресу 630091, г Новосибирск, Красный проспект, 52

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава

Автореферат диссертации разослан « » (Р^^З^Щ^, 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Зубахин А А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Неходжкинские злокачественные лимфомы (HX3JI) - это гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и прогнозу В России они составляют 2,6 % всех злокачественных новообразований В последние годы заболеваемость НХЗЛ имеет неизменную тенденцию к росту [Поддубная И В , 2001, 2005, Jemal А , 2006] Несмотря на улучшение результатов терапии, связанных с применением высокодозной программной полихимиотерапии, смертность от НХЗЛ увеличивается на 2 % в год Это определяет необходимость дальнейшего изучения механизмов злокачественной трансформации лимфоидных клеток и опухолевой прогрессии [Савченко В Г , 2006, Воробьев А И , 2002]

В настоящее время не вызывает сомнений, что процесс онкогенеза заключается в патологических изменениях вначале на молекулярном, а затем на клеточном уровне [Бочков H П , 2002], а предрасположенность к злокачественным новообразованиям и опухолевая прогрессия могут модифицироваться аллельными полиморфизмами генов [Thiagalmgam S А, 2006, Имя-нитовЕ H, 2007]

В последние годы идентифицированы десятки полиморфных генов-кандидатов, которые могут принимать участие в формировании онкологического риска Достаточно широко изучена роль полиморфных локусов duplóbp 3 интрона, Arg72Pro 4экзона и G—>А 6 интрона гена р53 [ZhangZ W, 2003, WuX, 2002], Arg399Gln гена XRCC1 [CasseС, 2003, Gao W M, 2003, Hong Y С , 2005] и del32bp гена CCR5 [Чердынцева H В , 2007, Manes S , 1999, Murphy P M , 2001] при солидных новообразованиях Данные гены играют ключевую роль в таких процессах, как контроль клеточного цикла и запуск программированной клеточной смерти, репарация ДНК и хемотаксис, а их полиморфизмы могут изменять свойства кодируемых белков, вызывать нестабильность генома, что в ряде случаев способствует предрасположенности носителей этих генов к развитию опухолей различной локализации Вместе с тем, роль данных полиморфизмов в патогенезе гемобластозов остается неизученной

Ряд авторов указывают на то, что одни и те же аллели полиморфных локусов генов р53, XRCC1 и CCR5 могут иметь как проонкогенный, так и защитный эффект, в зависимости от этнической принадлежности популяции [KoushikA, 2004], типа ткани, из которой развивается опухоль [TadaM, 2001] и воздействия вредных факторов внешней среды [Murata M, 1998] По этой причине данные литературы по вопросу о роли полиморфных вариантов ДНК в онкологическом риске и опухолевой прогрессии часто являются противоречивыми, а результаты отдельных работ обладают плохой воспроизводимостью [Имянитов Е H , 2007]

Все это создает невозможность механического переноса результатов, полученных зарубежными авторами на солидных опухолях, на опухоли крови

Вместе с тем, изучение роли полиморфных вариантов генов репарации ДНК XRCC1 и запуска программированной смерти р53 в патогенезе гемо-

бластозов может быть важным, так как грубые изменения в них при HX3JI встречаются крайне редко [Duell Е J , 2001, Marmtchev А, 2000], и снижение их функциональной активности может быть связано с генетическими полиморфизмами Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5, оказывающий влияние на плотность рецептора на поверхности клеточной мембраны, может изменять чувствительность лимфомных клеток к провоспалительным хемокинам и, таким образом, модифицировать метастатический потенциал опухоли

Учитывая вышеизложенное, представляется важным и перспективным исследование врожденных генетических полиморфизмов duplöbp 3 интрона, Arg72Pro 4 экзона и G—>А 6 интрона гена р53, Arg399Gln гена XRCC1 и del32bp гена CCR5 у больных неходжкинскими злокачественными лимфо-мами с целью установления их роли в предрасположенности к развитию заболевания и особенностях его клинического течения

Цель работы: изучить полиморфизмы антионкогена р53, гена репарации ДНК XRCC1 и хемокинового рецептора CCR5 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами, и установить их связь с риском развития заболевания и особенностями клинического течения

Задачи исследования:

1 Изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфизмов duplöbp 3 интрона, Arg72Pro 4 экзона и G—>А 6 интрона генар53, Arg399Gln гена XRCC1 и del32bp гена CCR5 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами

2 Сравнить распределение частот аллелей и генотипов данных полиморфных локусов при индолентных и агрессивных лимфомах

3 Определить связь генотипов duplöbp 3 интрона, Arg72Pro 4 экзона и G—>А 6 интрона гена р53, Arg399Gln гена XRCC1 и del32bp гена CCR5 с особенностями клинического течения заболевания

4 Выявить ассоциацию изменений в исследуемых полиморфных локусах генов р53, XRCC1 и CCR5 с риском развития заболевания

Научная новизна. Впервые исследована распространенность полиморфизмов duplöbp 3 интрона, Arg72Pro 4 экзона и G—>А 6 интрона гена р53, Arg399Gln гена XRCC1 и del32bp гена CCR5 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами

Впервые показана генетическая неоднородность пациентов с HX3JI по данным полиморфизмам, свидетельствующая о повышении частот минорных аллелей 4 экзона и сочетанных нарушений в трех исследованных локусах антионкогена р53 при агрессивных вариантах заболевания, а также об увеличении доли пациентов с минорными аллелями интронных и экзонного полиморфизмов р53 и в гене XRCC1 при диффузной В-крупноклеточной лимфоме (ДВККЛ)

Получены данные о повышении частот минорных аллелей генов р53 и XRCC1, а также генотипов, их содержащих, у больных HX3JI высокой степени злокачественности по сравнению с популяционным контролем г Новосибирска и НСО Результаты свидетельствуют о различной степени предрасположенности индивидуумов популяции к развитию данных заболеваний

Выявлено значительное повышение риска развития агрессивных вариантов лимфом у носителей Gln-аллеля гена XRCC1, а также ДВККЛ у носителей Gln-аллеля гена XRCC1, Рго-аллеля 4 экзона и m-аллеля 3 интрона р53 в сравнении с популяционным контролем

На примере НХЗЛ подтверждена суммация эффекта Gln-аллеля XRCC1, заключающаяся в увеличении риска развития заболевания у Gln/Gln гомозигот относительно Arg/Arg лиц в большей степени, чем Arg/Gin гетерозигот

Доказано, что в реализацию опухолевой прогрессии НХЗЛ CCR5 может быть вовлечен как рецептор провоспалительных хемокинов Уменьшение уровня экспрессии рецептора на мембране клеток у носителей del-аллеля CCR5 может выступать благоприятным фактором, ограничивающим распространение опухоли по организму

У пациентов с НХЗЛ показано неблагоприятное влияние на прогноз, согласно международному прогностическому индексу IPI, сочетанных нарушений в 72 ко до не 4 экзона гена р53 и 399 кодоне гена XRCC1, а также по трем полиморфным локусам р53

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании полиморфизмов duplöbp 3 интрона, Arg72Pro 4 экзона и G—>А 6 интрона гена р53, Arg399Gln гена XRCC1 и del32bp гена CCR5 у больных неходжкин-скими злокачественными лимфомами вносят вклад в современные представления о роли генетических изменений в патогенезе злокачественных заболеваний крови

Данные о наличии минорных аллелей генов р53 и XRCC1, особенно при их сочетанном обнаружении, могут быть использованы в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска по НХЗЛ, в частности, у лиц, имеющих длительный контакт с экзогенными канцерогенами, а также при оценке риска раннего прогрессирования заболевания

Учитывая, что del32bp гена CCR5 может вносить существенный вклад в индивидуальную вариабельность метастазирования лимфомных клеток, исследование его генотипа у больных НХЗЛ может дать ценную информацию о течении опухолевого процесса

Обнаружена связь сочетания минорных аллелей трех исследуемых локу-сов р53, а также Pro-варианта 4 экзона р53 с Gin-вариантом гена XRCC1 с неблагоприятным прогнозом НХЗЛ, что может служить дополнительным критерием при планировании курсов программной полихимиотерапии Положения, выносимые на защиту:

1 Частота встречаемости генетических полиморфизмов р53 и XRCC1 различна при индолентных и агрессивных лимфомах при агрессивных вариантах заболевания отмечается снижение частоты диких аллелей и нормальных гомозиготных генотипов 3 интрона и 4 экзона антионкогена р53, увеличение минорного Gln-аллеля и гомозиготного Gln/Gln генотипа XRCC1, а также большая частота сочетанных нарушений по данным локусам в сравнении с больными индолентными лимфомами и здоровой популяцией

2 Дикий тип гена хемокинового рецептора CCR5 коррелирует с большей распространенностью опухолевого процесса при HX3JI, сочетание минор-

ных аллельных вариантов полиморфных локусов р53 и XRCC1 достоверно чаще регистрируется у больных лимфомами с неблагоприятным прогнозом

3 Риск развития агрессивных лимфом у лиц, имеющих изменения в 399 кодоне гена XRCC1 возрастает от Arg/Gin гетерозиготных к Gln/Gln гомозиготным лицам

Апробация материалов диссертации. Материалы исследования были представлены на конференциях студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2004, 2005, 2006, 2007), на городских научно-практических конференциях врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2004, 2005, 2006), на юбилейной конференции, посвященной 40-летию гематологической службы г Новосибирска (2004), на I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005), на X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006), на международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006), на городской научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы профилактической медицины» (Новосибирск, 2007), на 3-ей Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2007» (С-Петербург, 2007), на межрегиональной научно-практической конференции «Молекулярная генетика онкологических заболеваний» (Новосибирск, 2007)

Внедрение результатов исследования.

Полученные в работе результаты внедрены в практику работы гематологического отделения МУЗ ГКБ № 2 г Новосибирска Материалы диссертации получили отражение в учебном процессе на кафедре гематологии и трансфузиологии лечебного факультета и кафедре госпитальной терапии с курсом профессиональных болезней педиатрического факультета

Работа выполнена на кафедре гематологии и трансфузиологии лечебного факультета Новосибирского государственного медицинского университета (зав кафедрой - проф Т И Поспелова), на базе Городского гематологического центра МУЗ ГКБ № 2 (главный врач - проф Л А Шпагина, зав отделением - к м н И Н Нечунаева), отдельные фрагменты работы выполнялись на базе лаборатории рекомбинантных клеточных технологий ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (заведующая лабораторией - проф В А Белявская)

Публикации: по теме диссертации опубликовано 30 работ, в том числе 10 в центральной печати и 2 статьи Объем и структура диссертации.

Материал диссертации изложен на 178 страницах машинописного текста и содержит разделы введение, обзор литературы, главу «Материал и методы», 3 главы результатов собственных исследований, обсуждение результатов, 4 клинических примера, заключение, выводы и практические рекомендации Работа иллюстрирована 32 таблицами, 32 рисунками Указатель литературы состоит из 320 источников, из них 45 отечественных и 275 зарубежных авторов

Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика группы обследованных больных

Группу обследованных составили 100 пациентов с впервые установленным диагнозом неходжкинской злокачественной лимфомы, из них 44 (44 %) мужчины и 56 (56 %) - женщин Средний возраст больных был равен 52,2±15,5 года Пациенты были распределены по гистологическим вариантам лимфомы, стадиям заболевания и наличию B-симптомов, к которым относятся фебрильная лихорадка, проливные ночные поты и снижение массы тела на 10 % за последние 6 месяцев

Согласно классификации ВОЗ 2001 года, агрессивные лимфомы (высокой степени злокачественности), к которым относились - диффузная крупноклеточная, беркиггоподобная, плеоморфная, лимфобластная, центробластная, иммунобластная, плазмобластная, анапластическая, фолликулярная 3-го цитологического типа, были диагностированы у 43 пациентов (43 %), а индо-лентные (низкой степени злокачественности), к которым относились диффузная мелкоклеточная, пролимфоцитарная, центроцитарная, мантийнокле-точная, лимфоплазмоцитарная, фолликулярная 1-го цитологического типа, грибовидный микоз, маргинальноклеточная, MALT-лимфома - у 57 человек (57 %)

В обследованной группе больных HX3JI подавляющее большинство пациентов - 79 (79 %) имели продвинутые стадии заболевания (III и IV) Симптомы опухолевой интоксикации (B-симптомы) регистрировались у 68 человек (68 %)

У всех больных HX3JI была произведена оценка международного прогностического индекса (IPI), который определялся по наличию неблагоприятных факторов риска, включающих 1) возраст больного старше 60 лет, 2) увеличение уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ) сыворотки крови в 2 и более раз, 3) общее состояние больного, соответствующее 2-4 степени по шкале ECOG, 4) III-IV стадию лимфомы, 5) наличие более одного экстрано-дального поражения По совокупности неблагоприятных факторов риска выделяли группы низкого (0-1 фактор), низкого/промежуточного (2 фактора), промежуточного/высокого (3 фактора) и высокого (4 и более факторов) риска У больных индолентными лимфомами в 79 % случаев определялась низкая и низкая/промежуточная степень риска, в 12 % — промежуточная/высокая и в 9 % — высокая В группе с агрессивными лимфомами большая часть пациентов была отнесена к группам промежуточного/высокого - 42 % и высокого риска - 30 % Низкая степень риска регистрировалась у 7 %, а низкая/промежуточная - у 21 % обследованных

Больные НХЗЛ были обследованы до начала лечения, для исключения влияния ПХТ на результаты исследования Все пациенты, включенные в исследование, получили 6-8 курсов программной полихимиотерапии по стандартным протоколам I и II линии при агрессивных лимфомах (ВСЗ) -CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон), R-CHOP (с Ритуксимабом), СНОЕР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопо-зид, преднизолон), ESHAP (цисплатин, вепезид, цитозар, преднизолон), BFM

и терапия по протоколу Хельцера; при индолентных лимфомах (НСЗ) - СОР, R-COP и FC (флюдарабин, циклофосфан).

Контролем служили данные по распространенности полиморфизмов dupl6bp 3 интрона, Arg72Pro 4 экзона и G->A 6 интрона гена р53, Arg399Gln гена XRCC1 и del32bp гена CCR5 среди практически здоровых лиц - жителей г. Новосибирска и Новосибирской области, имеющих русскую национальность в 3 поколениях, полученные Н. А. Сметанниковой, 2006; В. А. Белявской и М. И. Воеводой, 2005.

Общеклинические методы исследования

Обязательный комачекс обследования больных включал сбор жалоб, анамнеза, объективный осмотр, лабораторные методы: общий анализ крови и мочи, биохимические тесты (общий белок, AJIT, ACT, протромбиновый индекс), тимоловая проба, СРБ, фибриноген, ЛДГ и щелочная фосфотаза для определения биохимической активности опухолевого процесса. Всем пациентам проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, компьютерная томография или МРТ малого таза, забрюшинного пространства, брюшной полости или грудной клетки - по показаниям, исследование пунктата костного мозга с подсчетом миелограммы и гистологическое исследование тре-панобиоптата. Диагноз неходжкинской лимфомы был установлен на основании гистологического исследования биолтатов лимфоузлов с иммуногисто-химической верификацией варианта опухоли с использованием широкой панели моноклональных антител к кластерам дифференцировки гемопоэти-ческих клеток.

Специальные методы исследования

Материалом для исследования служила периферическая кровь больных НХЗЛ. Из 5 мл цельной венозной крови была выделена ДНК с использованием протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом.

Выявление полиморфизма Arg72Pro 4 экзона гена р53 осуществлялось методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) (рис. I).

12 3 М 2 2 3 2 3 2 Рис. 1. Результаты анализа BstFN I - гидролиза на Arg72Pro 4 экзона гена р53 Примечание: 1 - 396 п. н. (генотип Pro/Pro); 2 - 231+165 п. н. (генотип Arg/Arg); 3 - 396+231+165 п. н. (генотип Arg/Pro); М - маркер по 100 п. н.

На первом этапе амплифицировали фрагмент гена размером 396 п. н., потенциально содержащий замену нуклеотида. На втором этапе для рестрикции данного фрагмента использовали эндонуклеазу BstFNl, распознающую только дикий Arg-аллель. Визуализацию и оценку результатов проводили электрофорезом в 3 % агарозном геле по количеству и размеру фрагментов рестрикции.

Типирование образцов на полиморфизм dupl6bp 3 интрона гена р53 проводилось с использованием аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплифицировали фрагмент гена размером 180 п. н., потенциально несущий дупликацию в 16 п. н., с использованием фланкирующих праймеров. Анализ результатов амплификации проводили в 10 % полиакриламидном геле (рис. 2) по количеству и размеру полос.

3 11 M 2 2 3 1 1

Рис. 2. Результаты электрофореза продуктов ПЦР на duplôbp 3 интрона р53

Примечание: 1 - 180 п. н. (генотип w/w); 2 - 180+196 п. н. (генотип w/m); 3 - 196 п. н. (генотип m/m); М- маркер по 100 п. н.

Для выявления полиморфизма G—>А 6 интрона гена р53 применяли ПЦР-ПДРФ. На первом этапе амплифицировали фрагмент гена размером 404 п. н., потенциально несущий замену нуклеотида. На втором этапе для рестрикции данного фрагмента использовали эндонуклеазу Mspl, распознающую только дикий G-аллель. Визуализацию рестрикционных фрагментов проводили путем электрофореза в 6 % полиакриламидном геле (рис. 3).

2 3 3 3 3 3 3 M 2 1 3 Рис. 3. Результаты анализа Mspl-гидролиза на G—> А 6 интрона гена р53

Примечание: 1 - 404 п. н. (генотип А/А); 2 - 404+336+68 п. н. (генотип G/A); 3 - 336+68 п. н. (генотип G/G); М-маркер по 100 п. н.

Генотипирование Аг§399С1п гена ХЯСС1 также применяли метод ПЦР-ПДРФ. На первом этапе амплифицировали фрагмент гена длинной 615 п. н., потенциально содержащий исследуемую замену нуклеотида. На втором этапе для рестрикции данного фрагмента также использовали эндонуклеазу Мэр 1, распознающую только дикий Arg-aллeль. Визуализацию рестрикционных фрагментов проводили электрофорезом в 1,5 % агарозном геле (рис. 4).

Для выявления полиморфизма с!е132Ьр гена хемокинового рецептора СС7?5 использовали аллель-специфичную ПЦР. Амплифицировали фрагмент гена размером 276 п. н., потенциально несущий делецию в 32 п. н. Электро-форетический анализ результатов ПЦР проводился в 6 % полиакриламидном геле (рис. 5) по количеству и размеру полос.

2 М 1 3 12 2 2 Рис. 4. Результаты анализа МврЬгидролиза на Ащ39901п гена ХЛСО

Примечание: 1 - 615 п. н. (генотип 01п/01п); 2 - 615+376+239 п. н. (генотип Аг^вЬ); 3 - 376+239 п. н. (генотип Аг|>/А^); М- маркер по 100 п. н.

2 11 11 111 2 M 1 1

Рис. 5. Результаты электрофореза продуктов ПЦР на del32bp гена CCR5

Примечание: 1 - 250 п. н. (генотип w/w); 2 - 250+218 п. н. (генотип w/del); М- маркер по 100 п. н.

Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel ХР, Microsoft Access ХР и статистической программы STATISTIKA, версия 6.0.

Для всех изученных полиморфных вариантов генов в выборках популя-ционного контроля и пациентов с HX3JI распределение генотипов соответствовало ожидаемому при сохранении равновесия Харди-Вайнберга, которое можно записать в виде формулы: p2AA+2pqAa+q2aa= 1.

Для оценки ассоциации между определенными генотипами и риском развития заболевания было рассчитано отношение шансов OR (odd ratio) с 95 % доверительным интервалом (ДИ) Если все значения ДИ были больше единицы, риск развития заболевания считался статистически значимо выше в группе с изучаемым изменением генотипа, в сравнении с популяцией При сравнении частот аллелей и генотипов, а также для сравнения наблюдаемых и ожидаемых частот, использовался стандартный критерий X2 Пирсона В случае, если абсолютные частоты более 20 % признаков в группе не превышали 5, использовали точный критерий Фишера Для обработки полученных материалов при оценке количественных признаков использовали альтернативный анализ, метод вариационной статистики вычисление средней арифметической (М) и ее ошибки (т), метод оценки достоверности отличий показателей между группами по критерию Стью-дента (t) с определением показателя статистической достоверности (р<0,05) С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г) Коэффициент корреляции считали значимым при р<0,05 [Власов, 2006]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Полиморфизмы генов р53, XRCC1 и CCR5 у больных неходжкин-скими злокачественными лимфомами

С высокой степенью достоверности обнаружены различия по полиморфизму Arg399Gln гена репарации ДНК XRCC1 в исследуемой и контрольной группах (рис 6) Среди больных лимфомами мутантный Gln-аллель несли 51 % пациентов, в то время как в контрольной выборке - лишь 40 % обследованных, частота Arg-аллеля в соответствующих группах составила 49 % и 60 % (р<0,05) В то же время нормальный гомозиготный Arg/Arg генотип среди пациентов отмечен лишь у каждого пятого (22 %), в то время как в популяционной выборке - у каждого третьего (34 %, р<0,05) обследованного Среди больных НХЗЛ в 1,9 раза чаще, чем в популяции отмечался гомозиготный Gln/Gln генотип 25 % против 13 % (р<0,05), при этом риск развития НХЗЛ превышал среднепопуляционный в 2,8 раза (OR=2,8, р< 0,05)

В целом в группе обследованных больных распределение аллелей и генотипов полиморфных локусов del32bp гена CCR5, а также duplöbp 3 интрона и Arg72Pro 4 экзона антионкогена р53 соответствовало популяционному

В то же время у пациентов с НХЗЛ в сравнении с популяционной выборкой отмечено достоверное (р<0,01) увеличение частоты дикого G-аллеля и нормального гомозиготного G/G генотипа (87 % и 78 % против 77 % и 63 % соответственно) 6 интрона р53, что может быть связано с конкурирующими генетическими или эпигенетическими механизмами, такими как нахождение в группе сцепления с 6 интроном р53 другого или других полиморфизмов, оказывающих существенное влияние на процессы лнмфомогенеза

70 60 50 40 30 20 10 О

Arg

Gin

Arg/Arg Arg/Gin Gln/Gln

Q контроль □ больные HX3JI

Рис. 6. Полиморфизм Аго39901п гена репарации ДНК ХЛСС1 в группе больных НХЗЛ Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,05 между больными НХЗЛ и контрольной группой.

Основываясь на утверждении М11г;1 Б. с!. а1. (2005г.), о том, что каждый изучаемый полиморфизм антионкогена р53 по отдельности обладает умеренным эффектом на биологические функции белка, был проведен комплексный анализ полиморфных локусов гена р53 (рис. 7) и выявлена сильная положительная корреляционная связь (г=0,75; р<0,001) между минорными аллелями 3 и 6 интронов и умеренная положительная корреляционная связь между минорными аллелями 4 экзона и 6 интрона (г=0,49; р<0,001) генар53.

dupl6bp in3 гена р53

г=0.36

G—»A in6 гена р53

г=0.49

Arg72Pro ех4 гена р53

Рис. 7. Корреляционная взаимосвязь минорных аллелей полиморфных локусов гена р53 в группе больных яеходжкинскими лимфомами

Полученные результаты подтверждают литературные данные, свидетельствующие об однонаправленности изменений в 4 экзоне и 3 и 6 интронах генар53 при солидных новообразованиях, что, вероятно, говорит об универсальности нарушений в данном антионкогене при опухолях различной тканевой принадлежности [MitraS., 2005; WuX., 2002; BirganderR., 1996; SjilanderA., 1996].

2. Полиморфизмы генов р53, XRCC1 и CCR5 у больных индолентны-ми и агрессивными лимфомами

Неходжкинские лимфомы представляют собой гетерогенную группу заболеваний и могут иметь значительный генетический полиморфизм, по-

этому был проведен сравнительный анализ полиморфизмов генов р53, ССИ5 и ХЯСС1 у пациентов с агрессивными и индолентными вариантами заболевания.

Поскольку наблюдаемые ранее различия в распределении генотипов и аллелей 399 кодона гена репарации ДНК ХИСС! между больными лимфома-ми и популяционным контролем в большей степени были обусловлены пациентами с агрессивными НХЗЛ, эта группа была проанализирована отдельно (рис. 8). С высокой степенью достоверности (р<0,01) обнаружены различия в частоте минорного (55 %) и дикого (45 %) аллелей 399 кодона ХКСС1 у больных агрессивными вариантами заболевания и в контрольной группе (40 % и 60 % соответственно).

Arg Gin Arg/Arg Arg/Gill Gln/Gln

□ контроль Ei индолентные лимфомы □ агрессивные лимфомы

Рис. 8. Распределение частот аллелей и генотипов А1^39901п гена ХИСС1 у больных агрессивными и индолентными лимфомами

Примечание: * уровень значимости отличия р < 0.01 между агрессивными лимфомами и контрольной группой; ** уровень значимости отличия р < 0,05 между агрессивными лимфомами и контрольной группой.

Также отмечено снижение частоты нормального гомозиготного генотипа в 2 раза - 17 % против 34 %, и повышение частоты гомозиготного минорного генотипа в 2,2 раза - 28 % против 13 % у больных агрессивными лимфомами в сравнении с популяционными значениями (р<0,05).

Отражением полученных результатов является тот факт, что у лиц с С1п/С1п генотипом риск развития агрессивных лимфом превышал популяци-онный в 2,7 раза (ОЯ=2,7, р<0,05). В отличие от агрессивных лимфом, частоты аллелей и генотипов 399 кодона ХЯСС1 при индолентных НХЗЛ соответствовали популяционному уровню, а ассоциации генотипа ХЯСС1 с риском развития индолентных лимфом не обнаружено.

Полученные результаты могут быть связаны с тем, что субстрат при индолентных и агрессивных лимфомах имеет разную пролиферативную активность, а, следовательно, и интенсивность мутационного процесса, дающего субстрату возможность приобретать генетические изменения с селекцией наиболее адаптированного и агрессивного клона. В то же время, ХИСС1 необходим для эффективного протекания процессов репарации по-

вреждений, возникающих в области репликативной вилки именно в период деления клетки [Taylor R. M., 2002; Moore D. J., 2000]. Таким образом, вероятность развития опухоли при несостоятельности XRCC1 значительно повышается в быстро делящихся клеточных популяциях.

Как в целом по группе больных HX3JI, так и между пациентами с агрессивными и индолентными лимфомами различий с популяцией в распространенности del32bp гена хемокинового рецептора CCR5, а также duplöbp 3 интронар53 получено не было.

Установлено, что наблюдаемое ранее увеличение частоты дикого G-аллеля и G/G генотипа 6 интрона р53 среди пациентов с HX3JI обусловлено более высокой их частотой у больных индолентными вариантами заболевания (91 % и 84 % против 79 % (р<0,01) и 63 % (р<0,01) в группе контроля соответственно), тогда как распределение аллелей и генотипов 6 интрона при агрессивных лимфомах (82 % и 69 %) соответствовало популяционному (рис. 9).

Рис. 9. Различия в частотах аллелей и генотипов б интрона гена р53 в группе больных лимфомами

Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,01 между больными индолентными лимфомами и контрольной группой.

Также выявлена гетерогенность обследованной группы пациентов по полиморфизму Arg72Pro 4 экзона р53 (рис. 10): у больных агрессивными лимфомами была достоверно снижена частота нормального Arg/Arg генотипа по сравнению с больными индолентными лимфомами - 36 % против 55 % (р<0,05). Гетерозиготы и Pro/Pro больные составили 64 % и 45 % в группах агрессивных и индолентных лимфом соответственно (р<0,05).

Большую частоту минорного аллеля 4 экзона у больных с неблагоприятными вариантами заболевания можно объяснить данными Bonafe et al. (2004г.) о том, что Arg-форма р53 имеет проапоптотическую активность в 5 раз превышающую Pro-вариант.

70 60 50 40 30 20 10 0

1 _

Arg

Pro

N> Г

К

$ —

rs

Arg/Arg Arg/Pro и Pro/Pro

□ контроль Q индолентные лимфомы □ агрессивные лимфомы

Рис. 10. Распределение аллелей и генотипов Arg72Pro 4 экзона гена р53 у больных индолентными и агрессивными НХЗЛ

Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,05 между агрессивными и индолентными лимф омами.

При индолентных лимфомах, наряду с низкой пролиферативной активностью, практически всегда имеет место блок апоптоза, часто за счет гиперэкспрессии BCL-2 [Morabito F., 1997], так что изменение активности р53 вследствие полиморфизмов имеет меньшее значение. При агрессивных НХЗЛ уход от апоптоза Pro-несущих клеток позволяет генетически измененным клонам выживать и делает популяцию опухолевых клеток изменчивыми, создавая основу для постоянного возникновения и отбора все более агрессивных вариантов [Duell Е. J., 2000].

При анализе взаимосвязи полиморфных генотипов было отмечено усиление положительных корреляционных взаимодействий (рис. 11) между минорными аллелями Зи 6 нитронов (г=0,91; р<0,001), 3 интрона и 4 экзона (г=0,64; р=0,001), а также 4 экзона и 6 интрона (г=0,77; р<0,001) р53 у больных агрессивными лимфомами в сравнении с группой больных НХЗЛ в целом, а также лимфомами НСЗ (г=0,89, г=0,38 и 1-0,30; р<0,001). Полученные данные свидетельствуют об увеличении среди пациентов с неблагоприятными вариантами НХЗЛ доли лиц с сочетанными нарушениями в гене р53.

1-0.91

duplóbp in3 гена р53

г=0.64

G^A in6 гена р53

г=0.77

Arg72Pro ех4 гена р53

Рис. 11. Корреляционная взаимосвязь минорных аллелей полиморфных локусов гена р53 в группе больных агрессивными НХЗЛ

Таким образом, были показаны достоверные различия между больными индолентными и агрессивными НХЗЛ по полиморфным локусам 6 интрона и 4 экзона антионкогена р53, а также выявлены достоверные отличия пациентов с лимфомами ВСЗ от популяции в целом по 399 кодону гена ХКСС1.

3. Полиморфизмы генов р53, ССЛ5 и ХЯСС1 у больных диффузной В-крупноклеточной и диффузной В-мелкоклеточной лимфомами

В связи с тем, что как агрессивные, так и индолентные НХЗЛ включают в себя множество морфологических форм, были проанализированы частоты аллелей и генотипов изучаемых полиморфизмов при наиболее часто встречающихся вариантах заболевания: диффузной В-крупноклеточной (ДВККЛ) и диффузной В-мелкоклеточной (ДВМКЛ) лимфомах. Проведенный сравнительный анализ полиморфизмов с1ир16Ьр 3 интрона, Аг§72Рго 4 экзона и в—>А 6 интрона гена р53, А^399С1п гена ХКСС1 и с!е132Ьр гена ССЯ5 между ними и контрольной выборкой выявил достоверные различия в характеристике большинства исследованных локусов.

Частота минорного СЛп-аллеля гена ХЯСС1 в группе пациентов с ДВККЛ составила 68 % и была достоверно выше, чем в группе больных ДВМКЛ, где минорный аллель выявлен лишь в 45 % (р<0,05) случаев, и выше, чем в популяции города Новосибирска и НСО - 40 % (р<0,01). А^-аллель имели только треть пациентов с В-крупноклеточной лимфомой (32 %), тогда как среди больных В-мелкоклеточной и в контрольной выборке - более половины обследованных: 55 % (р<0,05) и 60 % (р<0,01) соответственно (рис. 12).

□ контроль ИДВМКЛ РДВККЛ

Рис. 12. Распределение частот аллелей и генотипов Аг°39901п гена ХКСС1 у больных ДВККЛ и ДВМКЛ Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,01 между лимфомами ДВККЛ и контрольной группой; ** уровень значимости отличия р < 0,05 между лимфомами ДВККЛ и контрольной группой; # уровень значимости отличия р < 0.05 между ДВККЛ и ДВМКЛ.

Кроме того, получены достоверные различия в частотах генотипов по данному полиморфизму Среди пациентов с ДВККЛ Arg/Arg встречался в 4,6 и 4,9 раза реже (7 %), чем у больных ДВМКЛ (32 %, р=0,056) и в популя-ционном контроле (34 %, р<0,05) При этом в группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой Gln/Gln гомозиготами являлись 43 % пациентов, что в 2 раза превышало значения в группе ДВМКЛ - 22 % (р<0,05) и в 3,3 раза — популяционные значения (13 %, р<0,01)

При оценке ассоциации между генотипами полиморфизма Arg399Gln XRCC1 с риском развития НХЗЛ был выявлен «дозозависимый эффект» минорного аллеля, который проявлялся превышением среднепопуляционного риска развития ДВККЛ у Arg/Gin гетерозиготных лиц в 4,4 раза (OR=4,4, р<0,05), а у лиц Gln/Gln гомозиготных - уже в 5,6 раз (OR=5,6, р<0,05) В целом по группе пациентов, имеющих генотипы с Gln-аллелем, риск составлял 6,5 раз (OR=6,5, р<0,05) По данным Duell et al (2000) и Matullo G et al (2001), на молекулярном уровне эффект дозировки Gln-аллеля проявляется увеличением частоты обмена участками хроматид и появлением большего числа ДНК-аддуктов

Одним из наиболее важных в функциональном отношении полиморфизмов р53 является Arg72Pro 4 экзона р53 Частота диких гомозигот по данному полиморфизму в группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой - 21 % - в 2,6 раза ниже в сравнении с группой пациентов с диффузной В-мелкоклеточной лимфомой - 55 % (р<0,05), и в 2,3 раза ниже, чем в попу-ляционной выборке — 49 % (р<0,05) Среди пациентов с ДВККЛ преобладали (79 %) Arg/Pro или Pro/Pro лица, тогда как среди больных ДВМКЛ Pro-несущие генотипы имели менее половины (44 %, р<0,05), а в контрольной группе - 51 % обследованных (р<0,05) (рис 13) В то же время пациенты с В-мелкоклеточной лимфомой по характеристике Arg72Pro были близки популяции города Новосибирска и НСО

L Hsieh et al (2005) предполагают, что, поскольку Arg вариант р53 имеет более высокий проапоптотический потенциал, трансформированные клетки для реализации своих туморогенных свойств должны дополнительно приобрести соматические мутации данного антионкогена, что в меньшей степени требуется Pro-несущим клеткам Учитывая, что мутационный статус р53 в дебюте НХЗЛ - явление крайне редкое [Поддубная И В , 2005, Воробьев А И, 2003, Dohner Н , 2000], можно предположить большую роль именно Pro-варианта в определении онкологического риска у больных лимфомами Чтобы оценить этот риск, было рассчитано отношение шансов OR Оказалось, что у лиц, несущих Pro-аллель, риск развития ДВККЛ превышал сред-непопуляционный в 3,7 раза (OR=3,7, р<0,05)

В группе пациентов с ДВККЛ (рис 14) m-аллель 3 интрона выявлен у трети (29 %) обследованных, что в 4,1 раза превышало данный показатель в группе больных ДВМКЛ (7 %, р<0,05) и в 2,1 раза - в популяции (15 %, р<0,05) В группе пациентов с В-крупноклеточной лимфомой частоты генотипов, несущих ш-аллель, также были достоверно выше, чем в группе больных В-мелкоклеточной лимфомой и популяционной выборке 50 % против 14 % (р<0,05) и 25 % (р<0,05) Дикий w-аллель и гомозиготный нормальный

\уМ генотип 3 интрона р53 у больных ДВККЛ составили 71 % и 50 %, что было достоверно (р<0,05) меньше, чем у пациентов с ДВМКЛ (93 % и 86 % соответственно) и в группе контроля (86 % и 75 % соответственно).

Рис. 13. Частоты аллелей и генотипов Аг^72Рго 4 экзона гена р53 у больных ДВККЛ и ДВМКЛ Примечание: * уровень значимости отличия р < 0.05 между лимфомами ДВККЛ и контрольной группой; # уровень значимости отличия р < 0.05 между ДВККЛ и ДВМКЛ.

Рус. 14. Частоты аллелей и генотипов с!ир16Ьр 3 интрона гена р53 у больных ДВККЛ и ДВМКЛ Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,05 между лимфомами ДВККЛ и контрольной группой; # уровень значимости отличия р < 0,05 между ДВККЛ и ДВМКЛ лимфомами.

При оценке ассоциации между генотипами и риском развития заболевания выявлено, что у лиц, имеющих m-аллель 3 интрона гена р53, вероятность развития ДВККЛ превышала среднепопуляционную в 2,6 раза (OR=2,6, р<0,05)

Ранее значение минорных аллелей интронных локусов р53 в онкогенезе было показано лишь на примере ряда солидных опухолей различной локализации [Gemignani F, 2004, Wu X , 2002, Mavndou D , 1998, Avigad S , 1997] Полученные результаты дают возможность предполагать, что генетические изменения не только в экзонных, но и в интронных последовательностях р53 могут играть определенную роль в развитии отдельных вариантов не-ходжкинских лимфом высокой степени злокачественности

У пациентов с диффузной В-мелкоклеточной лимфомой характеристика 6 интрона сохраняла направленность изменений, выявленных у больных ин-долентными вариантами HX3J1 гомозиготный дикий генотип 6 интрона р53 встречался достоверно чаще (82 %), а содержащие минорный А-аллель -достоверно реже (18 %), чем в группе больных В-крупноклеточной лимфомой, где соответствующие показатели составили 50 % каждый (р<0,05), и контрольной выборке, где G/G лица выявлены в 63 % (р<0,05), a G/A и А/А -в 37 % (р<0,05) случаев (табл 1)

Следует отметить, что у больных ДВККЛ, в отличие от группы НХЗЛ в целом, в 2,8 раза чаще отмечалось сочетание минорных аллелей в трех полиморфных локусах гена р53 - 36 % против 13 % (р<0,05) В 100 % случаев ДВККЛ изменения duplôbp 3 интрона (р<0,05) и G—>А в 6 интроне сочетались с Рго-вариантом 4 экзона Это может свидетельствовать об отборе при агрессивных вариантах заболевания лиц с сочетанными нарушениями в антионкогене р53

Таблица 1

Полиморфизм G—>А б интрона гена р53 в группах больных ДВККЛ и ДВМКЛ

Полиморфизм Контроль 1 Больные ДВККЛ 2 Больные ДВМКЛ 3

Абс % Абс % Абс %

G—>А т6 (п=220) (№14) (п=22)

G 341 78,6 21 75 40 91 Р]_з<0,01

А 99 21,4 7 25 4 9 Pi_3<0,01

G/G 136 62,7 7 50 18 82 Р]_з<0,05 Р2-з<0,05

G/A и А/А 84 36,3 7 50 4 18 Pi_3<0,05 Р2_з<0,05

Примечание п - количество человек в группе

Биологический смысл такого отбора может заключаться в усугублении нарушений функционирования антионкогена р53 в условиях сочетания неблагоприятных полиморфных аллельных вариантов X \Уи й а1 (2002) и А V КЬгишп е1 а1 (2005) показали, что при одновременном увеличении числа редких вариантов аллелей в обоих интронных локусах и в 72 кодоне 4 экзона р53 происходит снижение эффективности репарации ДНК и запуска апоптоза в клетках Полученные данные подтверждают предположение о, вероятно, большем значении полиморфизмов гена р53 в предрасположенности к развитию именно агрессивных вариантов неходжкинских лимфом, при которых полный блок апоптоза явление крайне редкое В этой ситуации снижение функции белка р53, обусловленное полиморфизмами в кодирующей и интронных последовательностях гена, может давать возможность генетически измененным клеткам выживать

Распределение аллелей и генотипов с!е132Ьр гена ССК5 в группах больных ДВККЛ и ДВМКЛ, а также популяционной выборке были близкими Частота редкого с!е1-аллеля имела практически постоянную величину и составляла 11 % Это дает возможность сделать заключение, что делеция 32 пар оснований в кодирующей последовательности гена хемокинового рецептора ССЯ5 не модулирует риск развития НХЗЛ - как агрессивных, так и индолентных

4. Особенности клинического течения неходжкинских злокачественных лимфом у пациентов с полиморфизмами геновр53, ССЯ5 и ХЛСС1

Наибольшее влияние на особенности клинического течения НХЗЛ в обследованной группе пациентов оказывал с1е132Ьр гена хемокинового рецептора ССЖ5 Дикий вариант ССЯ5 был связан с большей распространенностью опухолевого процесса при лимфомах

Полученные результаты свидетельствуют о достоверном (р<0,05) снижении частоты генерализации опухолевого процесса у носителей с!е132Ьр (рис 15) начальные (I и II) стадии заболевания в момент диагностики регистрировались более, чем у трети больных (37 %), а продвинутые стадии (III и IV) имели 63 %, в то время как у пациентов с диким гомозиготным генотипом начальные стадии лимфом встречались в 2 раза реже (17 %), а продвинутые - у 83 % обследованных

Выявлены различия не только по частоте, но и по выраженности увеличения селезенки в группах с разными генотипами СС7?5 (рис 15) Только 27 % пациентов, несущих <3е1-аллель имели спленомегалию, и у 83 % из них она носила невыраженный характер - СИ=21-40 кв см (р<0,05) У больных с диким типом СС/?5, поражение селезенки отмечалось в 1,7 раза чаще (46 %) и почти у половины из них (48 %, р<0,05) оно было умеренно -СИ=41-60кв см, а у трети (31 %) значительно выраженным - СИ=более 60 кв см

Кроме большей распространенности опухоли по лимфоидной системе, отмечено достоверное увеличение доли пациентов с поражением костного мозга (рис 16) среди больных лимфомами с диким геном ССЯ5 - 74 %, против 45 % при наличии с1е!-аллеля (р<0,05)

□ w/del генотип □ w/w генотип

Рис. 15. Распределение больных HX3JI по стадиям и степени выраженности спленомегалии в зависимости от генотипа del32bp гена CCR5

Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,05 между группами.

Полученные результаты можно объяснить тем, что процессы миграции опухолевых лимфоидных клеток зависят от уровня экспрессии на их мембране хемокиновых рецепторов и набора вырабатываемых в определенных лимфоидных органах лиганд. В случае del32bp CCR5, уровень активного рецептора на поверхности клеток снижается вдвое, а, следовательно, уменьшается чувствительность клеток к провоспалительным хемоаттрактантным веществам (MIP-la, MIP-lß (macrophage-inflammatory protein), RANTES (regulated on activation normal T-cell expressed and selected) [Loetscher P., 1998; AlkhatibG., 1996].

26%

w/del генотип

74% I-------1

□ норма БЗ поражение к/м

□ норма EI поражение к/м

55';

Рис. 16. Частота поражения костного мозга в группах и \у/с!е1 по гену ССЯ5 пациентов с неходжкинскими лимфомами

Данным механизмом можно объяснить прогрессию только мелкоклеточных опухолей, субстратом которых являются зрелые лимфоциты. Крупноклеточные лимфомы имеют своим субстратом незрелые элементы, и экспрессия хемокиновых рецепторов на них не выражена. Тем не менее, и при индолентных, и при агрессивных лимфомах дикий гомозиготный генотип

был связан с генерализацией опухолевого процесса. Это может быть связано с участием провоспалительных хемокинов в лимфогенном метастазировании путем регуляции не только клеточной миграции, но и стимуляции роста сосудов [Орлова Ю. Ю„ 2006; Sakurai Е., 2003; Azenshtein Е., 2003]. Соответственно, чем выше уровень экспрессии CCR5, тем сильнее сигнал стромы на ангионеогенез, который способствует инвазии и диссеминации опухолевых элементов по организму.

В зарубежной и отечественной литературе ранее было показано, что при ряде новообразований, например раке почки, легкого, дикий тип гена CCR5 и высокая экспрессия соответствующего рецептора связаны с большим метастатическим потенциалом опухолевых клеток [van DeventerH. W., 2005; Bingle L., 2002; Hamada I., 2002; Murphy P. M., 2001].

Среди гетерозиготных по делеции гена CCR5 пациентов признаки опухолевой интоксикации имела лишь половина пациентов (50 %), тогда как при диком гомозиготном генотипе B-симптомы регистрировались в 88 % (р<0,001) случаев (рис. 17). М. Dean et al. (1999) считают, что RANTES (одна из лиганд CCR5) является митогеном для B-лимфоцитов. Таким образом, полученные результаты можно объяснить меньшим объемом опухолевой массы у носителей dd-аллеля в результате сниженного пролиферативного ответа опухолевого субстрата на митогенный эффект RANTES. В этой связи уменьшение уровня экспрессии рецептора на мембране клеток у носителей del-аллеля CCR5, а, следовательно, и меньший ответ на провоспалительные хемокины, может выступать благоприятным фактором, ограничивающим прогрессию НХЗЛ.

Рис. 17. Частота В-симптомов в группах больных НХЗЛ, имеющих «'Лу и \у/(1е1

генотипы ССЖ5

Примечание: * уровень значимости отличий р < 0,05 между группами.

Анализ особенностей клинического течения заболевания в зависимости от генотипов А^399Рго гена XRCC1, с!ир16Ьр 3 интрона, А^72Рго 4 экзона и О—>А 6 интрона гена р53 при их изолированном рассмотрении оказался малоинформативным. В то время были выявлены различия в распределении больных с различными сочетанными нарушениями в данных локусах антионкогена р53 на группы риска согласно международному прогностическому индексу 1Р1. Так, наихудший прогноз регистрировался у пациентов, одно-

временно имеющих минорные аллели в трех полиморфных локусах, в отличие от больных с диким типом р53: они в 1,7 раза реже относились к группам низкого или промежуточного/низкого риска (38 % против 65 %, р=0,078), но в 3,6 раза чаще - к группе промежуточного/высокого риска (54 % против 15 %, р<0,01) (рис. 18).

низкий и низкий/ промеж./ высокий высокий

промеж.

□ w/w-Arg/Arg-G/G □ m-Pro-A

Рис. 18. Распределение больных с лимфомами на группы риска согласно международному прогностическому индексу IPI, в зависимости от генотипа полиморфных локусов гена р53

Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,01 между группами.

Полученные данные показывают важность оценки комплекса генетических изменений р53 с целью выяснения их результирующего влияния на течение заболевания и прогноз, что может свидетельствовать о весьма умеренном эффекте каждого из полиморфизмов в отдельности и необходимости их сочетанного анализа в составе гаплотипных групп.

Упитывая, что значение полиморфных локусов возрастает при сочетании неблагоприятных вариантов, был проанализирован IP1 в двух группах больных: не имеющих изменений в 399 кодоне гена XRCC1 и в 72 кодоне 4 экзо-на р53 и имеющих минорные аллели одновременно по 2 изучаемым локусам (рис. 19).

Оказалось, что пациенты с гомозиготными дикими генотипами XRCC1 и р53 в 86 % случаев относились к группе низкого (35 %) или низкого/промежуточного (51 %) риска, тогда как в группе пациентов, несущих минорные аллели гена репарации ДНК XRCC1 и 4 экзона антионкогена р53 низкий и промежуточный/низкий риск отмечен только в 58 % (р<0,01) случаев (10 %, р<0,05 и 48 % соответственно).

Только по 7 % больных с диким типом обоих генов имели промежуточный/высокий или высокий риск раннего прогрессирования заболевания, а у носителей минорных аллелей - промежуточный/высокий регистрировался в 32 % (р<0,05), а высокий - в 20 % (р<0,05) случаев.

низкий низкий/промеж, промеж./ высокий высокий □ Лг§/Аг§ ХИСС! и Лг«/Лга ех4 р53 ®Сг1п-аллель ХЯСГ1 и Рго-аллель ех4 р53

Рис. 19. Распределение больных неходжкинскими лимф омами на группы риска согласно 1Р1, в зависимости от генотипа 399 кодона гена ХЯСС1 и 72 колона

4 экзона гена р53

Примечание: * уровень значимости отличия р < 0.05 между группами.

Объяснением полученных данных является то, что Рго-вариант р53 имеет слабую проапоитотическую активность и в большей степени способствует репарации ДНК. В этой связи у больных, несущих, помимо минорного алле-ля 4 экзона р53 еще и минорный аллель гена ХКСС1, может возникнуть снижение способности клеток восстанавливать повреждения макромолекул и одновременно проводить сигнал на активацию апоптоза, что может способствовать выживанию и селекции все более агрессивных клонов.

Резюме

Результаты исследования позволили выявить различные патогенетические механизмы участия полиморфизмов р53, ХКСС1 и ССМ5 в развитии агрессивных и индолентных вариантов неходжкинских злокачественных лимфом.

Выявлена большая частота изменений в полиморфных локусах как ин-тронных, так и кодирующих последовательностей антионкогена р53, а также в 399 кодоне гена репарации ДНК ХЯСС1 при агрессивных лимфомах в сравнении с популяционными значениями и больными лимфомами НСЗ. Полученные данные свидетельствуют об отборе при данных вариантах лиц с сочетанными нарушениями в полиморфных локусах гена р53. Это может быть связано с большим значением (1ир16Ьр 3 интрона, А^72Рго 4 экзона гена/;5.?, А^399С1п гена ХЯСС1 в быстро пролиферирующих опухолях.

Высокая митотическая активность недифференцированных лимфоидных клеток, являющихся субстратом опухоли при агрессивных НХЗЛ, сопровождается усилением мутационных процессов. На фоне нарушения функционирования систем апоптоза и репарации повреждений ДНК, обусловленных полиморфизмами генов р53 и ХЯСС1, создаются условия не только для закрепления онкогенного клона, но и последующей селекции в нем более агрессивных вариантов. Опухолевый субстрат при индолентных НХЗЛ имеет низкую иролиферативную активность и полный блок апоптоза, часто свя-

занный с геперэкспрессией антиапоптотических белков По этим причинам полиморфизмы антионкогена р53 и XRCC1 при индолентных НХЗЛ имеют меньшее значение

Вышеизложенные патогенетические механизмы обуславливают предрасположенность носителей минорных аллелей duplöbp 3 интрона и Arg72Pro 4 экзона р53, а также Arg399Gln гена XRCC1 к развитию именно агрессивных лимфом При этом риск развития заболеваний у Arg/Gin гетерозиготных по гену XRCC1 лиц значительно ниже, чем у Gln/Gln гомозиготных

Дикий тип гена хемокинового рецептора CCR5 ассоциирован с большим объемом и распространенностью опухолевой массы по организму при не-ходжкинских лимфомах вне зависимости от степени злокачественности Возможным механизмом ограничения диссеминации лимфомных клеток у носителей del32bp гена CCR5 при индолентных НХЗЛ может служить снижение экспрессии рецептора на мембране опухолевых элементов и меньшая их чувствительность к провоспалительным хемоаттрактантнам веществам При агрессивных же лимфомах, меньшая плотность CCR5 на поверхности стромальных клеток может приводить к уменьшению сигнала на ангионео-генез, который способствует инвазии и распространению опухоли

Необходим анализ комплекса имеющихся у пациента изменений в полиморфных локусах генов с целью выяснения их результирующего влияния на течение заболевания Применяя данный подход, удалось выявить ассоциацию сочетания редких аллелей одновременно по всем трем полиморфным локусам антионкогена р53, а также в 4 экзоне р53 и 399 кодоне гена репарации ДНК XRCC1 с неблагоприятным прогнозом НХЗЛ, согласно международному прогностическому индексу IPI В первом случае эти изменения формируют молекулярно-биологическую основу для усугубляющегося нарушения функционирования белка р53, а во втором - создают условия, когда субстрат опухоли имеет не только сниженный апоптотический потенциал, но и возможность восстанавливать возникающие генетические повреждения, что, в конечном счете, может приводить к быстрому накоплению в субстрате опухоли химиорезистентных клонов

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что полиморфизмы dupl6bp 3 интрона, Arg72Pro 4 экзона и G—>А 6 интрона антионкогена р53, Arg399Gln гена репарации ДНК XRCC1 и del32bp гена хемокинового рецептора CCR5 имеют модулирующее влияние на риск развития и течение неходжкинских злокачественных лимфом

ВЫВОДЫ

1 Распределение аллелей и генотипов по полиморфным локусам 3 интрона и 4 экзона гена р53, а также гена хемокинового рецептора CCR5 в группе пациентов с НХЗЛ соответствует популяционному

2 У больных лимфомами частота дикого G-аллеля (87 %), а также нормального G/G гомозиготного генотипа (78 %) 6 интрона р53 достоверно (р<0,01) превышает таковые у здоровых лиц (78 % и 63 % соответственно)

3 У пациентов с HX3JI в сравнении со здоровыми лицами частота встречаемости нормального гомозиготного Arg/Arg генотипа XRCC1 в 1,5 раза ниже (22 % против 34 %, р<0,05), а минорного гомозиготного Gln/Gln генотипа в 1,9 раза выше (25 % против 13 %, р<0,05)

4 Агрессивные лимфомы характеризуются увеличением, в сравнении с индолентными лимфомами, доли лиц с Pro-вариантами 4 экзона р53 (64 % против 45 %, р<0,05), сочетанными нарушениями в 3 и 6 интроне (г=0,91 против г=0,89, р<0,001), 3 интроне и 4 экзоне (г=0,64 против г=0,30, р<0,001), а также 6 интроне и 4 экзоне (г=0,77 против г=0,38, р<0,001) гена р53

5 У больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой достоверно чаще (р<0,05) встречаются генотипы, несущие минорный аллель 3 интрона (50 %), 4 экзона (79 %) и 6 интрона (50 %) гена р53, а доля Gln/Gln гомозиготных лиц по XRCC1 увеличена в 1,9 раза (43 %) в сравнении с пациентами с диффузной В-мелкоклеточной лимфомой (14 %, 44 7с, 18 % и 22 % соответственно)

6 Риск развития ДВККЛ, в сравнении с популяционным, значительно повышен у лиц, имеющих m-аллель 3 интрона (OR=2,6, р<0,05), Рго-аллель 4 экзона (OR=3,7, р<0,05) гена р53 и Gln-аллель гена XRCC1 (OR=6,5, р<0,05) Вероятность развития заболевания возрастает от Arg/Gin (OR=4,4, р<0,05) гетерозиготных к Gln/Gln гомозиготным лицам (OR=5,6, р<0,05) по гену XRCC1

7 При диком типе гена хемокинового рецептора CCR5 отмечается большая распространенность опухоли при HX3JI, что проявляется в достоверном (р<0,05) увеличении числа больных с продвинутыми (III, IV) стадиями заболевания (87 %), поражением селезенки (46 %), костного мозга (74 %), В-симптомами (88 %), в сравнении с пациентами, имеющими del-аллель гена CCR5 (63 %, 27 %, 45 % и 50 % соответственно)

8 При сочетанных нарушениях в трех изучаемых локусах р53, а также в 4 экзоне данного антионкогена и 399 кодоне гена XRCC1 у пациентов с лимфомами отмечается повышение группы риска, согласно международному прогностическому индексу IPI

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Значительное повышение частоты С1п-аллеля XRCC1 у больных агрессивными вариантами неходжкинских лимфом, а также С1п-аллеля гена XRCC1, Рго-аллеля 4 экзона и т-аллеля 3 интрона гена р53 у пациентов с ДВККЛ, позволяет использовать их в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска развития данных заболеваний, особенно у лиц, длительно контактирующих с вредными факторами внешней среды или с отягощенным семейным анамнезом

2 Учитывая большую распространенность опухолевого процесса у больных НХЗЛ с диким генотипом ССК5, полиморфизм с!е132Ьр может быть использован для оценки вероятности раннего прогрессирования заболевания

3 Полиморфизмы гена репарации ДНК ХЯСС1 и антионкогена р53 у пациентов с лимфомами целесообразно исследовать комплексно Обнаружение сочетания минорных аллелей трех исследуемых локусов р53, а также Рго-варианта 4 экзона р53 с С1п-вариантом гена ХЛСС1, позволит патогенетически обоснованно выделить группу пациентов с плохим прогнозом и обсуждать возможность планирования у них более агрессивной программной терапии

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Воропаева Е Н Определение р53 в опухолевой лимфоидной ткани как фактор прогноза при лимфопролиферативных заболеваниях // Тезисы ежегодного конкурса-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна -2003» - Новосибирск, 2003 - С 48

2 Скворцова Н В , Поспелова Т И , Зенков А Н, Лосева М И, Ковы-нев И Б , Воропаева Е Н, Макарец А А , Бурундукова М В Интенсивность накопления онкопротеинов ВСЬ-2 и р-53 как фактор прогноза при онкогема-тологических заболеваниях // Тезисы XIV научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» - Новосибирск, 2004 - С 87-88

3 Воропаева Е Н, Мармалева М В Интенсивность накопления онко-протеина ВСЬ-2 в мононуклеарах костного мозга и лимфоузлах - фактор прогноза при лимфопролиферативных заболеваниях // Тезисы докладов ежегодного конкурса-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2004 г » - Новосибирск, 2004 - стр 29-30

4 Ковынев И Б , Агеева Т А , Лосева М И, Поспелова Т И , Волковыс-ская В Б , Дьячкова Н Ю , Воропаева Е Н, Макарец А А Экспрессия белков-регуляторов апоптоза на клетках различных морфологических вариантов неходжкинских злокачественных лимфом // Журнал клинической и экспериментальной медицины - 2004 - № 1-2 - С 52-60

5 Воропаева Е Н , Поспелова Т И, Лосева М И, Ковынев И Б , Скворцова Н В , Дьячкова Н Ю , Гребнева Т С Влияние экспрессии р-53 и ВСЬ-2 на клиническое течение лимфом и эффективность терапии I линии // Тезисы докладов XV научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» - Новосибирск, 2005 - С 268-269

6 Скворцова Н В , Поспелова Т И, Лосева М И, Ковынев И Б , Лям-кина А С , Воропаева Е Н, Нечунаева И Н Клиническое и патогенетическое значение некоторых цитокинов при злокачественных неходжкинских лимфомах // Тезисы докладов XV научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» - Новосибирск, 2005 - С 265-266

7 Скворцова Н В , Лосева М И , Поспелова Т И , Ковынев И Б , Дьячкова Н Ю, Воропаева Е Н, Макарец А А Концентрация про- и противовоспалительных цитокинов как возможный фактор прогноза у больных ге-мобластозами // Тезисы докладов ежегодной научно-практической конфе-

ренции с международным участием «Медицина и образование в XXI веке» -Новосибирск, 2005 - С 166-168

8 Поспелова Т И, Лосева M И, Ковынев И Б , Дьячкова H Ю , Сквор-цова H В , Воропаева Е H Значение иммуно-морфологических маркеров апоптоза при оценке опухолевой прогрессии лимфобластой неходжкинской лимфомы // Журнал клинической и экспериментальной медицины - 2005 -№ 4 - С 190-195

9 Воропаева Е H Связь уровня экспрессии маркеров апоптоза р-53 и BCL-2 у больных ЛПЗ с особенностями их клинического течения и эффективностью ПХТ первой линии // Тезисы ежегодного конкурса-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2005» - Новосибирск, 2005 - С 42-43

10 Воропаева Е H Динамика накопления маркеров апоптоза MDM-2, р-53 и BCL-2 в опухоли у больных лимфопролиферативными заболеваниями и ее связь с эффективностью полихимиотерапии первой линии // Тезисы ежегодного конкурса-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна -2006» - Новосибирск, 2006 - С 53-54

11 Ковынев И Б , Агеева Т А , Поспелова Т И , Лосева M И , Дьячкова H Ю , Воропаева Е H Иммуноморфологическая характеристика Т-клеточных вариантов неходжкинских злокачественных лимфом // Сборник тезисов докладов «I съезд терапевтов Сибири и Дальнего Востока» - Новосибирск, 2005 - С 344-345

12 Ковынев И Б , Поспелова Т И , Лосева M И, Агеева Т А , Дьячкова H Ю , Воропаева Е H Молекулярно-биологические маркеры опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом // Сборник тезисов международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» - Новосибирск, 2006 - С 61

13 Ковынев И Б, Лосева M И, Поспелова Т И, Дьячкова H Ю, Скворцова H В, Воропаева Е H Особенности иммуно-морфологической диагностики лимфобластных неходжкинских лимфом // Вестник НГУ -2006 -Т 4,вып 3-С 15-23

14 Ковынев И Б , Лосева M И , Поспелова Т И , Воропаева Е H Хронический лимфоидный лейкоз\лимфома из малых лимфоцитов (ХЛЛЧЛМЛ) в структуре В-мелкоклеточных лимфоидных неоплазий // Проблемы гематологии и переливания крови -2006 -№ 1 -С 38

15 ПоспеловаТ И, ВоропаеваЕ Н, Ковынев И Б Интенсивность накопления MDM-2, р-53 и BCL-2 у больных лимфопролиферативными заболеваниями в динамике полихимиотерапии // Проблемы гематологии и переливания крови - 2006 - № 1 - С 63

16 Воропаева Е H , Поспелова Т И , Лосева M И, Ковынев И Б , Скворцова H В Экспрессия MDM2, р53 и BCL2 в опухоли при лимфомах и их связь с эффективностью химиотерапии I линии // X Российский онкологический конгресс Материалы конференции - Москва, 2006 - С 155

17 Поспелова Т И , Ковынев И Б , Агеева Т А , Лосева M И , Дьячкова H Ю , Воропаева Е H , Скворцова H В , Лямкина А С , Нечунаева И H Частота и структура неходжкинских лимфом в Новосибирске и Ново-

сибирской области // X Российский онкологический конгресс Материалы конференции - Москва, 2006 - С 160

18 Воевода М И, Поспелова Т И , Белявская В А , Воропаева Е Н , Лосева М И, Ковынев И Б , Сметанникова Н А , Скворцова Н В Полиморфизм СС115Д32 у больных лимф омами // Тезисы 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2007», приложение журнала «Вопросы онкологии» - С-Петербург, 2007 - С 10

19 Ковынев И Б , Поспелова Т И , Лосева М И , Агеева Т А, Дьячко-ва Н Ю , Нечунаева И Н , Воропаева Е Н, Скворцова Н В , Лямкина А С Частота и структура неходжкинских злокачественных лимфом в г Новосибирске и Новосибирской области // Сборник материалов первой городской научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы профилактической медицины» — Новосибирск, 2007 - С 195-196

20 Скворцова Н В , Поспелова Т И , Ковынев И Б , Воропаева Е Н , Мшпенин А В Исследование уровня цитокинов у больных лимфомами как дополнительный фактор прогноза опухолевой прогрессии // Сборник материалов первой городской научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы профилактической медицины» — Новосибирск, 2007 - С 212-214

21 Ковынев И Б , Поспелова Т И , Лосева М И , Агеева Т А, Дьячко-ва Н Ю , Воропаева Е Н, Скворцова Н В , Маслова Л М Молекулярно-биологические маркеры лекарственной резистентности неходжкинских злокачественных лимфом // Сборник материалов первой городской научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы профилактической медицины» - Новосибирск, 2007 - С 194-195

22 Воропаева Е Н , Поспелова Т И, Воевода М И , Белявская В А , Ковынев И Б, Сметанникова Н А Полиморфизм гена ХЯСС1 при лимфомах высокой и низкой степени злокачественности // Сборник материалов первой городской научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы профилактической медицины» - Новосибирск, 2007 - С 175-176

23 Ковынев И Б , Поспелова Т И, Лосева М И, Дьячкова Н Ю , Скворцова Н В, Воропаева Е Н, Борисенко Н Ю Прогнозирование множественной лекарственной резистентности у больных неходжкискими злокачественными лимфомами и множественной миеломой // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2007 - С 615-616

24 Воропаева Е Н, Сметанникова Н А , Скворцова Н В , Березина О В Молекулярно-биологические аспекты опухолевой прогрессии неходжкинских лимфом // Тезисы ежегодного конкурса-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2007» - Новосибирск, 2007 - С 45-46

25 Поспелова Т И, Воевода М И , Воропаева Е Н, Ковынев И Б , Белявская В А, Скворцова Н В, Березина О В Олигонуклеотидные полиморфизмы генов р53 и хемокинового рецептора ССЯ5 при неходжкинских злокачественных лимфомах // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике -2007 -Вып 11 — С 81-85

26 Ковынев И Б , Поспелова Т И , Агеева Т А, Дьячкова Н Ю , Воропаева Е Н, Скворцова Н В , Лямкина А С Экспрессиия молекулярно-

биологических маркеров апоптоза и множественной лекарственной резистентности при неходжкинских злокачественных лимфомах // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - 2007 - Вып 11 -С 86-92

27 Воропаева Е Н , Поспелова Т И , Воевода М И, Белявская В Б , Лосева М И, Ковынев И Б , Сметанникова Н А Влияние полиморфизма гена XRCC1 на клиническое течение неходжкинских злокачественных лимфом // Вестник гематологии -2007 -Т 3, № 2 - С 18

28 Ковынев И Б , Поспелова Т И , Лосева М И, Агеева Т А , Дьячко-ва Н Ю , Воропаева Е Н, Скворцова Н В , Маслова Л М Механизмы лекарственной устойчивости при неходжкинских злокачественных лимфомах // Вестник гематологии - 2007 - Т 3, № 2 - С 24-25

29 Скворцова Н В , Поспелова Т И, Ковынев И Б , Лосева М И , Нечу-наева И Н , Воропаева Е Н , Шамаева Г В Цитокиновый профиль больных лимфомами как дополнительный фактор прогноза опухолевой прогрессии // Вестник гематологии - 2007 - Т 3, № 2 - С 44-45

30 Ковынев И Б , Поспелова Т И , Воропаева Е Н, Дьячкова Н Ю , Скворцова Н В , Лямкина А С , Нечунаева И Н Дополнительные критерии иммуноморфологической диагностики неходжкинских злокачественных лимфом из T/NK клеток // Онкогематология - 2007 -№ 3 -С 9-14

Соискатель Е Н Воропаева

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВСЗ - высокая степень злокачественности

ДВККЛ - диффузная В-крупноклеточная лимфома

ДВМКЛ - диффузная В-мелкоклеточная лимфома

ДИ - доверительный интервал

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

НСЗ — низкая степень злокачественности

НСО - Новосибирская область

НХЗЛ - неходжкинские злокачественные лимфомы

ПДРФ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СИ - селезеночный индекс

IPI - международный прогностический индекс

MIP-la, MIP-lß - macrophage-mflammatory protein (провоспалительные хемокины)

RANTES - regulated on activation normal T-cell expressed and selected (провоспалительный хемокин)

Подписано в печать 03 10 07 г Формат 60 х 84/16 Уел печ л 1,0 Тираж 120 экз Изд №42п/07 Заказ № 309п

Оригинал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат» НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383)225-24-29 E-mail sibmedisdat@rambler ru

Отпечатано в типографии НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383) 225-24-29