Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Цистеиновые катепсины и их особенности в зависимости от состояния клетки и организма

Р Г Б ОД 1 7 ОКТ 1996

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ЖЛОБА АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

ЦИСТЕИНОВЫЕ КАТЕПСИНЫ И ИХ ОСОБЕННОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОСТОЯНИЯ КЛЕТКИ И ОРГАНИЗМА

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медшшнеких наук

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ЖЛОБА АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

ЦИСТЕИНОВЫЕ КАТЕПСИНЫ И ИХ ОСОБЕННОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОСТОЯНИЯ КЛЕТКИ И ОРГАНИЗМА

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой сгсиенн доктора медицинских паук

Работа выполнена в Санкт- Петербургском Государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор H.H. Петрищев доктор биологических наук, профессор А.И. Неворотин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Давыдов доктор медицинских наук, профессор В. С. Гуревич доктор медицинских паук, профессор Я. Ю. Багров

Ведущая организация: Научно-исследовательскш! институт онкологии им. проф. H.H. Петрова министерства здравоохранения и медшцшекой промышленности Российской федерации

Заипгга диссертации состоится У у 1996г. в"_"часов

на заседании диссертационного совета Д 074. 16. 02 по защите докторских диссертаций Санкт- Петербургской медицинской академии последипломного образования по адресу : 193015 Санкт-Петербург ул. Салтыкова Щедрина, д.41.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт -Петербургской медшцшекой академии последипломного образования.

Автореферат разослан "р" О ¿5 1996г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА

доктор медицинских наук

Тюкавин Александр Иванович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность .Участвующие в реализации процесса исчерпывающего протеолиза пептидпщролазы в лизосомах представлены множеством ферментов, активных в кислой и слабокислой области рН, с различной, но перекрывающейся субстратной специфичностью. У животных значительный вклад в тканевый протеолиз вносят цистеиновые катепсшпл, способные переходить из латентного в активное состояние в присутствии тиоловых соединений. При исследовании препаратов катепсина В постепенно открывали другие цистеиновые катепсины ( ЦК )- экзопептидазу катепсин В2 [ Otto К., 1967 ], катепсин L [ Kirschke Н., et al, 1977 ] , катепспн S [ Turk V., et al, 1980 ], катепсин H [ Kirschke Н., et al, 1977], катепсин N [ Turnsek et al, 1975], нешральные пепидгидролазы [Локшина Jl. A., et al 1983 ]. Цистеиновые катепсины - В, Н, L, N, S и другие ) участвуют в лизосомальном деструктивном [ Boliley P., et al 1979 ] и наряду с другими клеточными пептидгидролазами в ограничешшм протеолизе [ Young J. et al, 1993 ], в метаболизме межклеточного вещества [ Moin К., et al 1992 ]. Установлено их участие в ключевых стадиях процеалшга различных белков, в том числе, при пропессшггс и презентации антигенов [ Katunuma N., Matsunaga Y, Saibara Т., 1994 ]. Получешпле некоторыми авторами результаты указывают на то, что накопления в клетках значительных количеств промежуточных пептидов не происходит [Баррет А.Д., Хит М.Ф. 1980 ]. Изучение этого аспекта клеточного протеолиза в недалеком прошлом являлось ключевым в фундаментальной биохимии [ Крнцман М.Г., Контпсова А.С., 1968 ]. Нарушения протеолитических функции в тканях изучены недостаточно. Сложности возникают при идентификации активности пептидгидролаз и ее количественной характеристики.

Неполный протеолиз в патологических условиях может возшпсать из-за торможения активности отдельных пептидгидролаз, например, со стороны многочисленной группы эндогенных ингибиторов. Наиболее показательно протекает накопление промежуточных продуктов деградации белков при патолопш почек, в виде низкомолекулярного пептидного материала в крови [Дубикайтис А.Ю., Белоцерковский М.В., Конюхова С.Г., 1991 ]. В ходе протеолиза происходит образовать "вьпцепленных" при деградащш различных белков полипептидов с выраженной биологической активностью, которые могут реализовать патологические механизмы через их иммуномодулирующие свойства, хемотаксическую, цитотаксическую активность [ Янковский О.Ю., 1979, Katunuma N., Matsunaga Y., Saibara Т., 1994].

В связи с большой ролью почек в утилизации белка, исследование варьирования и роли цистеиновых катспсинов в данном органе в норме и при нарушении функции представляется весьма актуальным.

К числу наиболее актуальных направлений современной медицинской иатохимии и патофизиологии относятся исследования активности цистеиновых катепешюв в плазме крови при процессах опухолевого роста. Известно, что в опухолевых клетках не происходит образования специфических маркерных энзимов. При малигнизации ткани изменяется процессинг по крайней мере одного из ЦК- катепсшт В [ Poole A.R., et al, 1980 ]. Это сопровождается образованием устойчивой при рН выше 7 формы фермента, т.е. отличающейся от обычных форм, которые не могут сохраняться в нативном энзиматически активном виде в крови [Pietras R.J., et al, 1979, Recklies A.D., 1982]. Эти аномальные формы могут секретироваться различными малигнизированными клетками [Дилакян Э. A., et al 1994, Sloane B.F., 1990, Rempel al S.A., 1994 ]. Исследование щютеиновых катепешюв при процессах тканевого роста и усовершенствование методов их анализа весьма актуальны для развития практической энзимодиапюстики при онкопатологии [Pietras R.J., ct al, 1979, Poole A.R., et al 1970, Poole A.R., et al, 1980 ].

Цель исследования. Целью работы было выявление и характеристика некоторых важнейших модуляторов цистеиновых катепсинов, молекулярных форм этих ферментов, выяснение их варьирования и шщуцибельиости в тканях и плазме крови в норме, различных экспериментальных ситуациях и при некоторых видах патологии.

Основные задачи исследования.

1) Усовершенствовать методы получения высокоочшценных препаратов цистеиновых катепешюв В, Н, Ь из почек человека. Изучить феномен формирования множественных молекулярных форм катепсина В в целях выяснения спектра фермента в тканях почки и повышения выхода фермента при очистке.

2) Изучить важнейшие свойства цистеиновых катепешюв почек человека и животных, включая влияние восстановителей и окислителей, поверхностпоактивных веществ, ингибирование белками и пептидами.

3) Изучить возможность определения активности индивидуальных катепсинов В, Н, Ь в неочищенном материале. Усовершенствовать соответствующую методику анализа. Выявить влияние различных способов получения экстрактов тканей на активность катепсина В.

4) Изучить индуцибельность цистеиновых катепсинов в тканях. Исследовать это явление в отношении индивидуальных активностей цистеиновых катепсинов в условиях различных влияний на обмен веществ в тканях: а) при голодании экспериментальных животных, б) при усилении ассимиляции в условиях беременности экспериментальных животных, в) при резком изменении окислительного метаболизма за счет гипероксии экспериментального животного. Исследовать варьирование катепсин В- подобной активности в ткани почки человека. Изучить формирование крупномолекулярных форм катепсина В при отторжения трансплантата почки.

5) Изучить возрастание активности катепсина Н в крови онкологических больших по сравнению со здоровыми донорами с помощью модифицированной методики анализа. Выявить и сравнить диагностическую значимость модифицированного метода анализа цистеиновых катепсинов В и Н крови. Исследовать варьирование активности этих ферментов в плазме крови человека и крысы.

6) Провести экспериментальную апробацию препаратов цистеиновых катепсинов в качестве протеолитнческих агентов медицинского назначения. Исследовать препарат модифицированной формы цистсинового катепсина для парентерального введения, предназначенный для активации почечного протеолиза.

Научная новизна исследования. В настоящем исследовашш использованы существенно модифицированные методы очистки и определения активности цистеиновых катепсинов.

С помощью модифицированных методов анализа изучена индуцибельность цистеиновых катепсинов в тканях и активность в плазме крови человека и экспериментальных животных. Показано, что несмотря на высокий уровень в тканях, активность катепсина Н в плазме крови у здоровых доноров не обнаруживается. Bпq)выe выявлено, что при удалении злокачественных новообразований и при отсутствии их рецидива активность катепсина Н в плазме крови не исчезает. При экспериментальной гипероксии, голодании и беременности крыс впервые показана преобладающая индуцибельность катепсина Н в тканях печени и почек по сравнению с катепсином В и суммарной активностью цистеиновых

катепсинов. Показана индукция катепсина В в биоптатах почек человека при патологиях, сопровождающихся протеинурией, и, впервые обнаружено торможеш1е акт1шности фермента при нарастании протеинурии за счет эндогенных ингибиторов. При отторжении трансплантировашплх почек выявлено накопление инертного по отношению к белковым субстратам катепсина В, связанного с 0.2 - макроглобулином. Тем самым, впервые показана возможная роль эндогенных ингибиторов протеолиза плазмы крови в развитии патологических механизмов путем блокирования тканевого протеолиза.

Изучены реакции, катализируемые очищенными препаратами цистеиновых катепсинов. Показана пространственная удаленность существенной серы активного центра от поверхности контакта молекулы катепсина В с потенциальными субстратами. Выявлены особенности спектра молекулярных форм цистеиновых катепсинов в тканевом материале. Для тканей почек впервые показано существование двух основных форм катепсина В, а также образование крупномолекулярных форм этого фермента за счет способности а1регирова гь с эндогенными белками и ингибиторами.

При очистке катепсина В из почек человека показано, что этому ферменту не свойственна аминопептидазная активность, которая характерна для катепсина Н. Выявлено активирующее влияние восстановленных форм никотинамидных коферментов на существешшый атом серы активного центра цистеиновых катепсинов. Впервые показано, что окислительный путь регуляции активности цистеиновых катепсинов в тканях не представлен. Их окислительная инактивация возможна при участии синтетического переносчика электронов фенозинмеггасульфата ( ФМС ).

Практическая значимость работы определяется предложенными вариантами методов очистки и анализа активности цистеиновых катепсинов, а также изучением роли нарушении тканевого протеолиза при прогрессировашш патологического процесса почки в условиях протеинурии.

В нефрологической лечебной практике следует учитывать, что ингибиторы протеиназ из крови могут попадать в клетки тубулярного эпителия, блокируя сопутствующее протеинурии усиление тканевого протеолиза. В отличие от пептидгидролаз крови их угнетение в тканях эндогенными ингибиторами плазмы крови является неблагоприятным фактором при прогрессировании патологического процесса.

Усовершенствованный метод очистки может быть использован: 1) для производства коммерческих препаратов и 2) для получения перспективного для энзимотерапии модифицированного препарата цистеинового катепсина с неиспользованным ранее механизмом действия при парентеральном применении.

Усовершенствованный спектрофотометрическии метод анализа активности катепсина Н в крови больных с онкопатологиен, пригоден для практического использования в качестве дополнительного диагностического критерия.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Цистеиновые катепсины В, Н, Ь представлены в тканях почек человека и животных и могут быть выделены в результате многоэтапной процедуры очистки. Катепсин В в тканях почки обнаруживается в двух основных молекулярных формах I и II и нескольких минорных. Форма II катепсина В из тканей почек человека в отличие от формы I обладает более высокой активностью по отношению к белковым субстратам и меньшим сродством к некоторым синтетическим субстратам трипсиноподобиых пептид-гидролаз. Обе формы катепсина В характеризуются пространственной удаленностью существенной серы активного центра от поверхности контакта с субстратом. Наряду с обычными, имеющими молекулярную массу около 25 КД, в экстрактах тканей выявляются крупномолекулярные формы катепсина В, содержание которых возрастает при наругаешш функции органа. В составе крупномолекулярных форм катепенпа В в тканях почек, отторгнутых после трансплантации, обнаруживаются формы фермента в составе комплексов с эндогенным ингибитором аг макроглобулином.

2. Активность цистеиновых катепешюв в тканях может возрастать в несколько раз: А) за счет восстановления существенной серы активного центра и Б) более чем в 10 раз за счет активации биосинтеза (индуцибельностн). Высокая индуцибельность цистеиновых катепешюв крыс наблюдается в тканях печени и почек при гипероксии ( 100% 02 , 16 час ) и при беременности. При голодашш наблюдается еннжеиие этих активностей в почках и некоторое возрастание в печешь Окислительный путь угнетения активности цистеиновых катепешюв п тканях почек не представлен. Вне зависимости от вида воздействия катепсин Н примерно вдвое более индуцибелен по сравнешно с катепсином В. Катепсин В почек индуцибелен у человека при возрастании прогеннурии. Индуцибельность фермента может сменяться торможением активности,

вероятной причиной этого феномена шляется реабсорбния и накопление в лизосомальном аппарате канальцевого эпителия эндогенных ингибиторов протеиназ.

3. В крови здоровых доноров активность катепсина Н не обнаруживается. При злокачествешгых новообразованиях челюстно - лицевой облает у человека в плазме крови выявляется катепсин Н. Активность катепешм Н в плазме крови послеоперационных больных при отсутствии рецидива опухоли не исчезает полностью.

4. Из тканей почки могут быть выделены и посредством модификации получены формы катепсина В, приводящие при парентеральном введении к существенному усилению эндогенного протеолнза в тканях почки реципиента. Модифицированные формы этого цистеинового катепсина можно отнести к препаратам пептидгидролаз с неизвестной ранее биологической активностью, перспективным для использования с целью усиления протеолитических функций почки.

Апробация диссертационного материала. Материалы работы доложены

-на симпозиуме с международным участием - "Структура и функции лизосом", проходившем в 1976г. ( Москва ), 1980 г. ( Новосибирск ), 1986 г. (Тбилиси),

-на 4 Всесоюзном съезде биохимиков в 1979 г.,

-на конференции республик Прибалтики, Белоруссии, и Ленинграда в 1981 г. ( Рига ),

-на VI Пленуме Всесоюзного объединения нефрологов в 1984 г. (Ташкент),

-на Всесоюзной школе - семинаре для врачей биохимиков в Москве "Биохимический анализ в клшшко- диагностических лабораториях", в 1986 г,

-на Съезде нефрологов в 1986 г. ( Москва),

-на Всесоюзной конференции " Методы анализа биохимических препаратов ", в 1987 г. (Юрмала ),

-на школе- семинаре " Лазерная биология и лазерная медицина", в 1990 г, (Тарту),

на III конференции нефрологов северо-запада в 1991 г. (Новгород), -на симпозиуме " Опухоли головы и шеи" в 1991 (Таллш1), -на IV двугодичном конгрессе международной ассоциации патолопш ротовой полости в 1992 году ( Гамбург),

-на 12 - конгрессе Европейской ассоциации изучения рака в 1993 г (Брюссель).

Публыкащш: По теме диссертации опубликовано 30 работ, из них 3 Авторских свидетельства.

Структура и объем диссертации:

Тскст диссертации "Цистеиновыс катепсииы и их особенности в зависимости от состояния клетки и организма" изложен на 249 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Библиография включает 296 источников ( 79- отечественных и 217- зарубежных ). Работа иллюстрирована 31 рисунком и 21 таблицей.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В связи с отсутствием у цистеиновых катепсинов абсолютной или узкой субстратной специфичности при гидролизе синтетических и белковых субстратов важное место в работе отведено идентификации и выявлению их специфических активностей.

Определение и характеристика катепешюв В, Н, L и других пентадгадролаз.

Цистеиновыс катснсины ( ЦК ) выявляли с помощью синтетических и белковых субстратов в сочетании с использованием ингибирования ртуть- и фосфор- органическими соединениями, специфическими пептидными ингибиторами животного и микробного происхождения, а также данными определения молекулярных масс и сродства к ионообменшпеам [Otto К.,1967; Kirschke Н., et al, 1977; Towatari Т et al, 1979].

Активность катепсина В определяли по скорости гидролиза: N,a-6eH3oim- D,L- аргшшн-парашпроанилида ( БАЛА, спектрофотометрия продукта гидролиза при X 405 нм), ( Способ очистки синтетического субстрата // Рац. предложение, 1 ЛМИ 401/86, 1986 г.), ( Реакционная смесь для определения катепсина В в биологических объектах. Рац. предложение, 1ЛМИ, 1981 , № 112/81) и катепсина Н - D, L - лей г и п гп а р а нигр о а i шли д а ( ЛЕЙЛА спектрофотометрия продукта гидролиза при X 405 нм). В работе использованы также флюорогенные субстраты этих ферментов бензоил-D.L- аргинин- р- нафтиламнд, L- лейцшшафтиламид ("Reanal", Венгрия ). Ход опытов с азоказешюм (ОКА-АС К ) для выявления суммарных активностей катепстпюв В, Н, L ( KB, КН, KL), выражение их активности находились в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя субстрата (Ферменту, Вильнюс ) и соответствовали ГОСТ 20264.2-74. В качестве модуляторов тиолзависимых активностей нами использованы: цисте!ш ( Ц- SH ), меркаптоэтанол ( М- SH ), обе формы глутатиона,

NAD(P) ( восстановленные и окисленные формы), этнлендиаминтетрауксусной кислоты Na соль ( ЭДТА ), фенозинметасульфат ( ФМС )- фирмы "Reanal"-, ингибиторы - пара-хлормеркурибензойной кислоты натриевая соль ( ПХМБ ), S-этилмеркури-тиосалицмловую кислоту ( мергиолат ), лейпептин [Riemann S., 1979 ], пепстатин- фирм фирмы "Serva" и "Sigma". Для расчета активностей (в стандар тных единицах мкмоль/мин (ЕД) или нмоль/мин (мЕД) на мг белка или мл препарата ) пользовались калибровочными растворами свободного продукта реакции в средах, содержащих только буферные растворы или, дополнительно, растворы неионных ПАВ и.т.п., в зависимости от условий опытов. Кинетику гидролиза субстратов исследовали в соответствиями с рекомендациями изложенными в работах В.К. Антонова (1983), Э.Корщпп - Боуден (1979).

В качестве белковых субстратов были использованы наряду с альбумином сыворотки и гистонами тимуса, ферменты других классов. В работе использованы коммерческие препараты дегидрогеназ и фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы [ Nakai N. et al, 1978, Towatari Т. et al 1979 ], (Инкубационная смесь для определения активности глкжозо-6-фосфат-дегидрогсназы Рац. предложение, 1ЛМИ, 1982 г., №109/82 ), ( Способ определения активности никотинамидных дегидрогеназ // Изобретение.- заявка № 3682278/2814 (001149).- Положит, реш. 13 авг. 1985 г ). Существенное отличие использованного нами подхода при определении активности пептидгидролаз по отношению к апофермсгаам заключалось в том, что в реакционных смесях концентрации субстрата были 1шже возможных величш1 Код . Это приводило к кинетике реакции, описываемой уравнением реакций псевдопервого порядка.

Экспериментальное моделирование.

Моделирование условий для варьирования обмена белков осуществляли па крысах весом 150 - 180 г по 8 - 12 животных в каждой группе. Первая группа содержалась в обычных условиях пин ария- контрольная. Вторая и третья 1руипы животных получали только воду по потребности. На третьи и седьмые сутки после начала голодания животные выводились из опыта. Четвертая группа перед выведением из опыта в течение 16 часов находилась в условиях нормобарической гипероксии - в атмосфере 100% кислорода. Пятая и шестая группы включат животных с бсремещюстью, длящейся более семи суток ( органогенез эмбрионов контролировали при вскрытии ). Шестая экспериментальная группа перед выведением из опыта подвергалась голоданию в течение 3 суток.

Изучите влияния парентерального введения препаратов обычных и модифицированных форм катепсина В на собствеш!ую активность этого фермента почек проводили на лабораторных беспородных мышах ( массой около 20 г ) с применением общепринятой техники внутрибрюшннных инъекций. Животных всех экспериментальных групп выводили из опытов общепринятым, рекомендованным международными нормами способом.

До приготовления гомогенатов ткани печени и почек экспериментальных животных хранились в морозильной камере при -18° С. Гомогенаты тканей готовили используя 0,01 М натриевый фосфатный буфер рН 6,4, содержащий 5 мМ ЭДТА- натриевой соли и 0,1% ( объём/объём ) бутанола. Ткани органов и буфер соединяли в соотношении - 10 мг ткани/ 1 мл буфера. В надосадочной жидкости определяли концентрацию белка и активности ЦК по отношению к БАПА, ЛЕЙПА, ОКА-АС К в качестве субстратов. В качестве антимикробного средства использовали азид нагрия.

Материал для анализа активностей и получения препаратов цпстешшвых катспсшюв и других белков

Плазма крови 52 онкологических и 18 других больных и биоптаты мышечных тканей поступали из клиники чегаостно-лицевой хирурпш, биоптаты почек больных гломерулонефритом - из клиники нефрологии ( 35 образцов) и из отделения трансплантации почки ( 32 образца ), кровь 12 женщин с беременностью более 30 недель из акушерской клиники, 12 больных различными формами хронического гломерулонефрита из клшшки нефрологии и 12- из хирургической клиники Санкт - Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова. Плазма крови здоровых доноров получена от добровольцев ( 15 образцов ).

Для получения препаратов ЦК В , Н , Ь и приготовления экстрактов гомогенатов, использовали гкани почек человека, собаки, свиньи, быка, крыс, мышей. Материал для получения препаратов ЦК человека получали через морг ( всего исследовано 32- образца) и отделение трансплантации ( 18 донорских почек ) почки СПБГМУ им. акад. И.П. Павлова. Почки собаки предоставлены отделом экспериментальной хирургии научно-исследовательского центра СПБГМУ им. акад. И.П.Павлова, ( всего исследовано 14 - органов ). Почки свиньи ( 5 кг) и быка ( 2 кг ) получены через мясокомбинат.

Методы разделении и очистки белков.

При приготовлении экстрактов тканей, разделении белков путем гельфильтращш [ Детерман Г., 1970 ], другими фракционирующими воздействиями, использовано ряд оригинальных усовершенствований, позволивших повысить эффективность очистки цистеиновых катепсинов. ( Способ очистки катепегаш В1 // Изобретение.- Авт. свид. № 2474825/23-04 ( 047877 ), от 13 марта 1978г., Способ получения катепсина В. // Изобретение.-заявка 1989.- МКИ С12.-№ 9/14. Заявка № 4498660/28-14/151422.-Авт. свид. 3/20 02.03.89, 140374., Среда для повышения степени очистки и выхода катепсина. // Рац. предложение, 1ЛМИ, 1982 г. , № 43/82). Молекулярные сита ( гельфильтрация, ультрафильтрация ) использованы как на начальных этапах очистки, так и на завершающих стадиях после одного или нескольких этапов ионообменной хромато1рафии на колонках СМ- и ДЕАЕ-нонообмешшков ). Метода ионообменной хромотографии использованы в соответствии с известными приемами [ Гинодман Л.М., 1979 ]. В работе использованы- слабокислый катионообменник КМ - целлюлоза ( карбоксиметилцеллюлоза ионообменная порошковая ) и ДЕАЕ - целлюлоза производства Олайнского завода химреактивов , а также ионообменные сефадексы фирмы Farmacia (Швеция ) и др. ионообмешшки. Ионообменная хроматография на колонках с КМ - целлюлозой была проведена в соответствии с методикой, описанная P. Evans ( 1978 ). Изоэлектрофокусирование проводили в градиенте плотности сахарозы [ Остерман Л. А., 1983 ] (50- 500 г/л ) в колонке 0,8 - 30 см, содержащей сервалит ( Т 4 - 9 ). В работе использовали анолит- 0,15 M раствор ортофосфорной кислоты, католит- 0,25 M раствор этаноламина в растворе сахарозы (500 г/л ). Содержимое колонки после окончания изоэлектрофокусирования пропускали через две проточные кюветы в целях регистрации pH и оптической плотности ( X 280 нм ), ( Рац. предложение.-1 ЛМИ 311/85, 1985 г. ). Результат формирования градиента pH и соответствующего распределения белков регистрировали при помощи двухканального самописца. Иммобилизованная 5',5' дитиобиспаранитробензойная кислота для аффинной хроматографии приготовлена в соответствии с рекомендациями изложенными в работе Lin L.J. и Focter J.F. (1975). Для контроля за ходом очистки наряду с другими методами использовали электрофорез в полиакриламидном геле, [ Детерман Г, 1970 ]. СС2 макроглобулин получали из плазмы крови человека в соответствии с процедурой изложешюй в работе Barrett, 1973.

Вспомогательные метода

Определение белков и нуклеиновых кислот проводили общепринятыми методами по светопоглощению в УФ- области спектра [ Кочетов Г.А., 1980 ] , а белков также по методу Лоури с учетом возможных влияний со стороны сопутствующих компонентов буферных растворов [ Gregory J.D., 1970 ]. Эстеразпую активность по отношению к N,a-6emoiui- D,L- аргинин этиловому ( метиловому ) эфирам определяли электрометрическим методом [ Розенгарт В.И., Шмелева В.Г., Щербак И.Г., 1986 ]. Определение концентраций НАД(Ф)Н осуществляли спектрофотометрическим способом [Прохорова М.И., 1982 ]. Определение тиоловых групп проводили с использованием 5\5" дитиобиспаранитробензойной кислоты [Торчинский Ю.М.,1971].

Обработку экспериментальных данных осуществляли на компьютере фирмы "IBM", программное обеспечение фирмы "Microsoft". Статистическую обработку осуществляли общепринятыми методами [ Трохименко Я.К., Любич Ф.Д., 1980 ]. Нахождение кинетических параметров реакций осуществляли аналитическим путем с использованием метода наименьших квадратов [ Корннш- Боуден Э., 1979 ].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Свойства цистейповых катснсинов из тканей почкн человека и животных.

Экстракты гомогенатов почек человека характеризуются наличием, наряду с тиолзависимой активностью в слабокислой среде по отпошешпо к различным субстратам, иными типами пептндгидролазной активности со схожей с ЦК субстратной специфичностью. В трупной или донорской почках человека по нашим данным содержится, примерно, от 80 до 160 мг КВ. Выход фермента с использованием обычных процедур на начальных стадиях очистки не достигает 10%. Активность, которая обусловлена KB, распределена при элюции препарата с колонки сефадекса G- 150 (Рис. 1 ) так, что во фракциях близких к Mr 25 КДа, имеющих Kav 0,41- 0,63, активного материала содержится до 10%, что может быть обусловлено связыванием фермента с эндогенными белками и ( или ) сефадексом.

АКТИВНОСТЬ0/,. 14 " ю- ш- ^ БЕЛОК %

пуию/о ооосэоосэосэооо

1Л м ш

»ПЮС^СО^т-ЮШ

1111111111111

14,00

Рис.1. Распределение активностей и белка во фракциях при гельфильтращш ( колонка сефадскса в 150 -1,1 - 60 см ), препарата неперфузировашгон почки, ( хранение 2 мес -10°С ). Нанесено- 1,5 мл (11 мг белка ) диа.тшовашюго экстракта иочки человека. Обозначешш: Ка\ - константа элюировашш, белые столбики -превышеш1е активности нетиоловых БАЛА- пвдролаз, темные столбик» - превышение активности тноловых БАМА - шдролаз.

Эффективность удаления балластных белков из препаратов ЦК повышается при сдерживании аутопротеолиза на начальных этапах очистки. Надосадочную жидкость гомогената ( 9% ЫаС1, 4Мм ЭДТА Ыа, 2% объем/объем бутанола ), полученную после перфузии донорской почки человека и гомогешвации тканей коры почки в пятикратном объеме 20мМ фосфатного буфера рН 6,4 при 4° С использовали для получения препаратов КВ и других ЦК. Препарат содержал КВ с удельной активностью 0,14 ЕД/ мг белка по отношешпо к БАПА в качестве субстрата и другие трипсиноподобиые БАПА- гидролазы с удельной активностью 0,025 ЕД/ мг белка. При элюции данного препарата с колонки сефадекса С-100 ( Рис.2. ) происходит полное разделение указанных активностей, т.е. отделение БАПА- гидролаз серинового типа, обладающих более высокой молекулярной массой, чем ЦК и уменьшите потерь КВ ( и других ЦК ) за счет уменьшешш количества их комплексов с эндогенными белками.

Д дд.

■д ДД

Л

ДД

ДД ;А

Д .

0,6

0,5

0,2

lu! #

'¿f 0,1

Я Я Kav

Рис. 2. Гельфильтрации надосадочной жидкости гомогсната почки человека на колонке сефадекса G- 100 ( 2,8 х 104 си ). Орган перед гомогенизацией подвергнут перфузии физраствором с 4мМ ЭДТА-Na при 2-4° С. Нанесено 10 мл препарата, 84 мг белка, в 0,02 M фосфатом буфере рН 6,4. Объем фракции 6 мл.

Значительное снижение количеств балластного материала, аналогичного по Мг ЦК, достигается за счет другого приема-гидролиза балластного белка в условиях внесения в препарат пепенна. При гельфильтрации этого препарата наблюдали более чем двукратное улучшение степени очистки препаратов КВ.

Фракция тиолзависимых пептидгидролаз, полученная после гельфильтрации, содержала КВ, KL, КН. После отделения основной массы балластных белков была проведена очистка и выявление спектра молекулярных форм с использованием ионообменников (СМ- и ДЕАЕ- целлюлозы и сефадексы ). В отличие от имевшихся данных [ Thomas G. J., 1980 ], в почках человека были идентифицированы две основные формы КВ, разделяемые на колонках СМ-целшолозы ( Рис 3 ). Эти формы КВ получены в элюате после ступенчатого повышения концентрации NaCl до 0,2 М. Обе формы КВ представлены почти в одинаковой пропорции. Форма с большим сродством к ионообмешшку ( форма II ) обладала также и большей активностью к белковым субстратам. В табл. 1 приведены данные исследовашм ннгибирования КВ пептидами и белками. Нативныс белки, не являющиеся субстратами КВ, не ингибируют обе формы фермента.

0,4 0,35 0,3

0,4

0,2

Ш |

0,1 о.

0,2 М №С1

|\ ж 0.3 М

!\/\ ™

I Ж

0,3

.— А405

--А405

—*-А280 БЕЛОК

0,05

Рис. 3. Хроматография 10 мл препарата цистсшювых катепсшюв на колонке СМ- целлюлозы (1,0 - 13 см ). Нанесено 35,6 мг белка. Активности по отношению к БАЛА (*) и ОКА-АС-К (+). З.иопии и ступенчатом градиенте №С1 и среде ацетатного 20 мМ буфера рН 5,1. Отсчет объема элющш после нанесения препарата.

Значительное ингибирование по конкурентному типу оказывают пептиды небольшой молекулярной массы, характерным свойством которых является наличие остатка иеполярной аминокислоты в центре полипептида и гидрофильного- в самом конце С- терминала. Присутствие положительного аминокислотного остатка в этой области пептида усиливает его ингибирующие свойства. Не исключено, что в ходе протеолиза в естественных условиях сами продукты протеолиза могут вызывать существенное ингибирование ЦК. Активность к гистоновому субстрату проявляла только форма II. По отношешпо к синтетическим субстратам эта форма, напротив, обладала меньшим сродством. Несмотря на высокую, почти такую же как у КЬ, активность формы II по отношешпо к белкам и более высокое сродство к СМ-ионообмешшку, нет оснований рассматривать ее как вариант КЬ, так как для этой формы КВ характерна высокая БАПА- гидролазная активность и отсутствие протеолитической инактивации апоферментов дегидрогеназ и инактивирующая способность по отношешпо к фруктозо-1,6-дифосфатальдолазе. В отличие от обеих форм КВ, трипсин инактивировал дегидрогеназы, снижая начальную активность на 20 - 25 % в минуту в пересчете на 1 мкг трипсина, взятого в опыт. В отличие от КВ апоферменты малат-, алкоголь-, лактат- дегидрогеназ инактивировались также плазмином, тромбином, каликреином.

Табл. 1. Ингабпрованне реакций гидролиза БАПА, катализируемых катепсшюм В почек человека.

Равновесные константы

ингибирования реакций

Пептиды и белки катепсина В Ki (Мм)

формой I формой II

1 .Тир-О-ала-гли-фал-лей-арг 0,63 ±0,05 0,69 ±0,06

2.Тир-0-ала-гли-фал-М02- 1,09 ±0,15 0,74 ±0,08

NH2 15,90 ±7,05 17,40 ±8,80

З.Тир-Е)-ала-гли-фал-МН2 нет угнетения нет угнетения

4. Ала-гли-гли то же то же

5. Ала-ала то же то же

6. САЧ , 1 мг/мл то же то же

7. Г-6-ФДГ, 0,55 мг/мл то же то же

8. МДГ, 0,55 мг/мл то же то же

9. ЛДГ , 0,55 мг/мл

Исследованные нативные белки в условиях оптимума для гидролиза синтетических субстратов не являлись субстратами и ингибиторами КВ. Не обнаружено взаимодействие этого катепсина также с мицеллами ТХ- 100 и других неионных ПАВ, ингибирующих реакции фермента за счет связывания синтетического субстрата (БАПА ). При хроматографии на колонке СМ целлюлозы во фракциях, элюируемых непосредственно перед КВ, сосредоточен материал, соответствующш! КН, а во фракциях при повышешш концентрации соли выше 0,3 М- обладающий значительной активностью при гидролизе казенна ( ОКА-АС ) и идентичный KL. Препараты обеих форм КВ, полученные в результате хроматографии на колонке КМ -целлюлозы, подвергали дополнительной очистке на колонках ДЕАЕ - сефадекса А50. В каждом из препаратов обнаружено по одной превалирующей фракции ферментативной активности и нескольких минорных. Все препараты ЦК при гидролизе различных субстратов характеризовались максимальной активностью в присутствии тиоловых соединений и не проявляли активности в присутствии ПХМБ (1-10-4 М). Лейпенпш в концентрации па 95 % угнетал гидролиз БАПА препаратами КВ, тогда как пепстатин в такой же концентрации не оказывал существенного влияния. Формы "I" и "II" КВ в реакции гидролиза казеина угнетались лейпептином на 75 % и 40 % соответственно.

Катепсины H и L в реакциях гидролиза азоказсина иигибировались лейпептииом на 95 % и 15 %, соответственно. Ингибитор Кунитца (контрикал ), соевый ингибитор трипсина и пепстатин ( ингибитор кагепсина D ) не уг нетали реакций, катализируемых катепсинами В, H, L. NAD(P)H активировали препараты очищенных ЦК подобно тиоловым соединениям.

Усовершенствованный способ очистки ЦК был использован при получешш их препаратов из почек различных животных. Эти препараты характеризовались близкими удельными активностями по отношению к изученным субстратам. Ни одна из главных фракций КВ и KL не обнаруживала активности по отношешпо к ЛЕЙПА. По- видимому, сообщения о том, что КВ почек может иметь заметную аминопептидазную активность [Thomas G. J., 1980 ] объясняются недостаточным разделением ЦК. В данной работе показано, что использование ЛЕЙПА в качестве субстрата в большинстве случаев дает возможность выявить специфическую активность КН. При изучении свойств ЦК из различных источников показано, что основной вклад в тиолзавнеимый гидролиз БАПА вносит КВ, тогда как КН практически может не учитываться при рассмотрении данной активности экстрактов почки и, по-видимому, других органов.

Сравнительная оценка протеолитическои активности препарата KL и используемых в медицинской практике препаратов ПГ поджелудочной железы при де1радации в качестве субстрата некротических масс экспериментального очага лазерной хирургической раны показала аналогичную другим пепгадгидролазам эффективность KL.

Гомогешшсть различных препаратов изучена путем электрофореза в полиакриламндном геле. Препараты ЦК, выделенные модифицированным методом очистки, после этапа гельфильтрации быгш гомогенны. Часть препарата КВ, полученного после фракционирования на колонке КМ - целлюлозы, была переведена в SH - форму обработкой в течение 60 мин. цистеином в концентрации 8 мМ при 20 С. После освобождения препарата от цистсина посредством гельфильтрации на колонке сефадекса G - 25 (2,5 х 14 см ) отмечено сохраните пч^воначальной удельной активности препарата в течение 3 сут. Этот препарат хроматографировали на колонке ДТНБ (5',5'-дитиобис-парашпробензойная кислота)- ссфарозы ( 1,6 х 4,0 см). В отличие от растворимой ДТНБ, иммобилизованная ДТНБ не обладает способностью образовывать ковалентные связи с существенной тиоловой группой КВ. Для проверю! реакционной способности

иммобилизованной ДТНБ использовали восстановленный глютатион и восстановленный глутатионом альбумин. Вследствие элюции через колонку ДТНБ - сефарозы растворов этих веществ тиотггробензойная кислота ( максимум светопоглощсния X = 409 нм) высвобождается в элюат, что свидетельствует о способности иммобилизованной ДТНБ вступать в да1шухо реакцию. Отсутствие ковалентной сорбции KB не связано с изменением реакционной способносги ДТНБ после иммобилизации. Полученный препарат KB катализировал гидролиз БАПА в отсутствие тиоловых активаторов и полностью терял активность после прибавления ПХМБ, выдерживания при рН 8,0 в течение 30 мгаг. После окисления в присутствии 0,1 мМ ФМС, получали модифицированные формы КВ. Способность к окислению и инактивации KB в присутствии ФМС свидетельствует о возможности транспорта электронов от существенной серы ЦК к кислороду. Отсутствие влиянии со стороны окисленных НАД(Ф) и глутатиона на активность ЦК и высокая стабильность активированных их форм в гомогенатах, впервые выявленные в данном исследовании, свидетельствуют об отсутствии окислительной инактивации ЦК в тканях почки и, по-видимому, других органов. Высокая устойчивость по отношению к KB нативных белковых субстратов ( трипсина ) , может найти свое объяснение в пространственной удаленности существенной серы каталитического центра от места контакта фермента с субстратом, продемонстрированной в экспериментах с ДТНБ- сефарозой.

Активность KB почек человека в норме при нротеинурии и

отторжении трансплантата.

После обработки экстрактов тканей в кислой среде наблюдается резкое уменьшение активности сериновых пептидгидролаз и увеличение суммарной активности КВ. Увеличение активности не может происходить за счет биосинтеза фермента в гомогенате de novo. Латентные формы фермента могли переходить в активное состояние за счет ряда механизмов, не считая сопутствующей активации после восстановления существенной серы в активных центрах молекул фермента. Среди этих механизмов для лизосомальных протеиназ наиболее вероятными можно считать -переход предшественников в активное состояние, высвобождение из комплексов с эндогенными белками и ингибиторами в том числе, дезинтеграция мембранных структур в подготавливаемых препаратах, также , по- видимому, имеет значение. Уш1фикацшо условий обработки тканей в целях определения активности ЦК в силу отмеченных тенденций изменения их активностей следует считать целесообразной.

Результаты анализа экстрактов коры почек человека в присутствии различных модуляторов ЦК, представлены в табл.2.

Табл 2. Активность ( при пщролизе БАПА

ЕД х мг белка ) экстрактов трупной почки (N=4) в присутствии различных модуляторов.

Особенности процедуры получения экстракта

В

присутствии 4 мМ цистеина

В

присутствии 40 мкМ ПХМБ

В

присутствии 1 мкМ ФМС

1. Без экстракции тканей ТХ -100

0,080 ±0,020

0,046 ±0,035

0,042 ±0,026

2. Экстракция в присутствш! ТХ-100,рН 6,2

0,232 ±0,069 р<0,05(к 1)

0,084 ±0,045

0,078 ±0,053

3. Экстракция в присутствии ТХ-100,рН 5,1

0,231 ±0,048 р<0,05(к 1)

0,064 ±0,024

0,067 ±0,028

4. Экстракция в присутствии ТХ-100,рН 4,0

0,398 ±0,095 р<0,05 (ко 2)

0,008 ±0,002

0,012 ±0,002 р<0,05 (к 3)

Экстракция как тиолового, так и сопутствующего ( угнетаемого фосфороргаш1чсским ингибитором) компонентов активности существенно улучшается в присутствии тритона Х-100. Использование этого детергента при рН 6,2 увеличивает активность серинового типа в 2 раза, тиолзависимую активность в 3,5 - 4 раза. Большее влияние тритона X - 100 на экстракцию КВ , чем сериновых гидролаз можно объяснить тем, что КВ локализован в лизосомах, а сериновые БАПА-гидролазы представлены цитоплазмагическими и связанными с плазматической мембраной ферментами, например , такими как фермента фибринолиза и активации плазмипогена.

Результаты, представленные в табл.2 показывают, в частности, что для разграничения общей гидролазной ак тивности на тиолзависимую и сериновую, пригодны все предложенные процедуры, поскольку обработка ПХМБ, ФМС приводят к сходному результату ( разница между величинами во втором и третьем столбцах отсутствует- р>0,5 ). В дальнейшем при анализе БАПА -гидролаз с целью одновремешшго выявления активированных форм

КВ ( без латентных форм ) и выявления дота нетиоловых гидролаз, экетракщпо тканей проводили при рН 6,2 - 6,4. Тиолзависимая БАПА - гидролазная активность представлена в подавляющей своей части катепсином В ( различными молекулярными формами этого фермента ). С учетом маловероятного вклада других гидролаз в тиолзависимую БАПА - гидролазную активность в экстрактах может быть использован, термин катепепн В- подобная активность -катепсин* В (К*В). Указанная активность отличается в гомогенатах высокой стабильностью при инкубации в течение 6 часов при 37° С, несмотря на значительное снижение содержания ЭН- групп с 4,19 до 2,23 мэкв/л.

Благодаря изучению активности очищенных препаратов КВ, КН, КЬ по отношению к БАПА, ЛЕЙПА и ОКА-АС-К существенно облегчилась интерпретация данных по изучению активности этих пептидгидролаз в неочищенном материале. Показана шщуцибелыюсть К*В в условиях патологии или нарушения функции почки человека. Обнаружена достоверная корреляция между активностью К*В и суточной протеинурней ( г = 0,714 , р < 0,05 ) и клубочковой фильтрацией ( г = 0,765 , р < 0,05 ), только в группе больных с невысоким уровнем протеинурии. В канальцах почки независимо от вида гломерулонефрита отмечается активация К*В параллельно поступлению реабсорбционного белка, но до определенного предела, так как исчезала зависимость между суточной протепнурией и активностью фермента при высокой протеинургаг. Резко снижалась активность К*В у больных с суточной протеинурней, достигающей 9 г. Выявляемый компонент активности в этом случае находился на грани чувствнтеш>ности метода анализа. При гельфильтрацшг экстрактов, отторгнутых после трансплантации образцов почек, отчетливо выделяется не только фракция основной формы катепсина В с Мг около 25 КДа, но и крупномолекулярные формы тиолзависимой БАПА - гидролазной активности характеризовались Ка\г меньше 0,27. ( Табл.3 ). Содержание суммарной активности и суммарных белков во всех фракциях элюата принимали за 100%. В табл. 3 обобщены результаты гельфильтрации препаратов донорских почек без патологических процессов ( 1,2 ) и препаратов отторгнутых трансплантатов ( 3,4 ). Проведены опыты по анализу причин появления крупномолекулярной тиолзависимой активности в препаратах почек. Как показано в строке 2 табл. 3, обработка препарата экстракта донорской почки тритоном Х- 100 в мицеллообразующей концентрации приводит к некоторому снижению активности в крупномолекулярном материале.

Табл.3. Влияние трнтона Х- 100 на элюцию КВ и белка при гельфилътращм препаратов почек человека._

Препарат почки (количество наблюдений ) Процентное содержание катепсин В-подобной активности ( 1 ) и белка ( 2) во фракциях с параметром элгоции К а\7: до 0,27 от 0,28 до 0,51 более 0,52 ( Мг >50 кДа ) ( 50> Мг > 14кДа) (Мг<14кДа)

1.0т донора Контрольная группа (N = 18 ) (1) (2) 6,39 54,4 ± 1,72 ±6,80 (1) (2) 60,40 20,50 ± 5,98 ±4,06 (1) (2) 33,17 25,05 ± 5,93 ±7,38

2.То же, что и 1 после внесения ТХ-100 (N = 12) 4,57 47,34 ±1,38 ±8,58 0,2<р(1)<0,5 58,14 16,48 ±8,4 ±2,62 37,56 34,07 ±8,9 ±5,88

З.Гомогенат трансплантатата почки после от-торжеия 14) 16,55 55,20 ±3,68 ±4,85 р(1)< 0,05 к контролю 57,35 21,11 ±6,63 ±2,12 28,07 23,68 ±10,71 ±4,32

4.То же, что и 3 после внесения ТХ-100 (N = 8) 15,48 45,76 ±1,91 ±3,16 р(1)< 0,05 к контролю 59,23 18,53 ±2,11 ±1,35 25,29 35,71 ±3,46 ±2,88

Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что повышение активности крупномолекулярных фракций не было обусловлено выявлением неизвестной формы тиолзависимого фермента, а являлось результатом связывания КВ с белковым материалом с образованием стабильных энзиматически активных комплексов. Неионный детергент приводил к разрушению исследуемых комплексов эндогенного материала, спонтанно сформировавшихся с участием КВ. Это явление особенно наглядно проявляется при хранении различных препаратов в ходе очистки. Обработка экстрактов отторгнутых трансплантатов почек детергентами в концентрациях выше критических для мицеллообразования не вызывала существенных изменений в распределении активностей во фракциях гомогенатов ( Строка 4 ). Эти препараты отличались от препаратов донорских почек более высоким содержанием устойчивого к разрушению детергентом энзиматически активного материала ( р < 0,05 ). Устойчивые к действию детергентов препараты подвергали дальнейшей хроматографии с помощью колонок ультрагеля АСА- 22, характеризующимся значительно большим пределом эксюпозии (более 500 КД). Эти опыты выявили сходство крупномолекулярных

форм катепсина В из тканей отторгнутых трансплантатов и комплексов, реконструированных из очищенных гомогенных препаратов КВ и о^-макроглобулина ( Рис. 4).

Ю ТГ т* го т- цэ см со со. ю

СО СМ со" чг" о" со" см" со" т)-" Т-" Уе мл

-щ— КВ - МГ I ---БЕЛОК

1'ГГГГГГгггт |

со т- со см_ со см со ю см_ см" со ТЗ-" о" со" (М со" тГ г-" смсмсо^-^-ююсоь-

Уе мл

-Я— МГ- КАТ* В

---- БЕЛОК

Рис 4. Гельфильтрация круиномолекулярнон фракции (Мг>50 кДа ) гомогената отторгнутой поч1сн ( А ) и реконструированного комплекса очищенных- катепсина В и а2 -макроглобулина ( Б ) на колонке ультрагеля АСА - 22 (1,2 х 63 см). Нанесено по 1,5 мл материала.

В отличие от тканей нормального органа при нарушениях клубочковой фильтрации обнаруживаются формы KB , идентичные по каталитическим особенностям комплексам катепсина В и МГ, реконструированным in vitro из очищенных препаратов пептидгидролазы и ингибитора. Установленные в работе данные о попадании в клетки почечного эпителия эндогенных ингибиторов протеиназ следует, по- видимому, квалифицировать как негативный фактор, усугубляю until повреждение нефрона из-за подавления протеолиза и накопления в клетках балластных продуктов. Таким образом, в отличие от плазмы крови, для почечной ткани в норме характерна высокая активность свободных форм ЦК, которые однако могут быть блокированы при прогрессировашш патологического процесса. С лечебной целью было бы рационально компенсировать относительный дефицит ЦК.

Для изучения возможности коррекции прогеолитических функций почек животным ( белые мыши) внутрибрюпшнно в объеме 1,5 - 2 мл вводили активированный цистеином препарат модифицированного KB- 50 мкг, энзиматически латентный препарат модифицированного KB ( получены из почек свиньи ), трипсин (марка А, мясокомбината А/О " Самсон " )- 150 мкг и физ.раствор (Табл. 4 ), Спустя 12 час после введения препаратов, животных выводили из опыта и готовили гомогенаты почек и печени. В эксграктах гомогепатов определяли К*В.

Табл. 4. Влияние парентерального введешш активных протеиназ и модифицированных форм катепсина В на его активность в экс грактах гомогенатов тканей печени и ночек.

Группа экспер I гмс! на льных мышей ( N ) Активность К*В (мЕД/ мг белка ) в экстрактах почек Активность К*В ( мЕД/ мг бежа) в экстрактах печени

Контрольная, введен физ. раствор ( 8 ) 0,27 ±0,039 0,16 ±0,033

Введено 0,15 мг трипсина (8 ) 0,28 ±0,038 0,18 ±0,044

Введено 0,05 мг активного катепсина В ( 8 ) 0,26 ±0,040 0,18 ±0,041

Введено 0,05 мг модифицированного катепсина В ( 8 ) 0,53 ±0,047 р<0,05 0,19 ±0,047 р>0,5

Введение физ.раствора и энзиматически активных пептидгидролаз не вызывало изменения исследуемой активности в тканях почек и печешь После введения модифицированной формы КВ обнаружено достоверное увеличите активности фермента в тканях почек ( р < 0,05 ). В тканях печени не обнаружено отклонений активности от ее уровня в других экспериментальных группах (р > 0,5 ).

В результате этих исследований с очищенными препаратами КВ можно сделать два основных вывода- 1) все исследованные препараты не вызывали гибели экспериментальных животных непосредствешю после введения препаратов и на протяжешш всего периода наблюдения за ними, 2) усиление протеолитического потенциала после введения наблюдается в тканях почки за счет катепсин В- подобной активности. Модифицированные ( энзиматически латентные ) их формы извлекаются из кровотока, по-видимому, до связывания с эндогенными шппбиторами путем пинощггоза. Благодаря относительной молекулярной массе у модифицированных форм КВ меньшей, чем у сывороточного альбумина, следует считать весьма вероятным фильтращпо части введенного препарата через мембрану клубочка и последующий эндоцитоз в тубулярный эпителий.

Индуцибельность цистсиновых катснсинов почек и печет! крыс.

В опытах на моделях с группами экспериментальных живо тных при изучении ЦК в тканях печени и почек нами выявлялся максимальный уровень активности исследуемых ферментов в присутствии 4 мМ цнетеина (меркаптоэтанола). Результаты анализа активностей ЦК в гомогенатах тканей печени и почек крыс при голодании, беременности и гнпероксии представлены в табл. 5.

Голодаш1е. Эксперименты с голоданием животных в течение трёх и семи суток выявили различия в изменениях актшнюстей катепсинов в исследуемых органах. В печени при голодашш наблюдается достоверное выраженное повышение рассматриваемых активностей, тогда как в почках на седьмые сутки спустя от начала голодания наблюдается достоверное снижение их активностей. Эта тенденция в большей степени относится к К*Ь, так как при анализе активности по отношению к ОКА-АС-К выявляется 30% уровень её падения. Снижение активности по отношению к этому субстрату, сопровождается значительным падением тиолзависимой активности экстрактов по отношению к ЛЕЙПА ( К*Н ). Снижение активности всех ЦК в почках и возрастание их активностей в печени

четко проявляется при 7-дневном сроке голодашш. Полученные данные о различных изменениях активностей катепсинов в печаш и почках указывают на различную роль этих органов в эндогенном питании в условиях голодания. Несмотря на исходно более высокий уровень активности ЦК в почках, чем в печеии, последняя начинает играть более важную роль в поддержании аминокислотного пула при переходе к эндогенному питанию за счёт внутренних резервов. Роль исследованных пептидгидролаз почек в реализации протеолитических функщш при усилении утилизации эндогенного белка при голодании становится по сравнешпо с нормой значительно меньшей.

Табл.5. Иидуцибельность цистсиповых катепсинов в экстрактах гомогаштов печени и почек крыс при различных экспериментальных условиях._

Группа животных (количество) Тиолзависимая активность по отношению к БАПА ЛЕЙПА ОКА-АС - К

печень ПОЧКИ печень ПОЧКИ печень почки

1. Контроль (12) 0,082 ±0,004 0,380 ±0,005 6,16 ±0,132 14,73 ±0,83 1,93 ±0,13 3,60 ±0,09

2. Голодание Зсут.( 12) 0,096+* 0,005 0,321-* ±0,005 8,83+* ±0,443 16,5*» ±0,09 2,20+* ±0,554 3,52 ±0,048

3. Голодание 7сут.( 12) 0,128+® 0,005 0,262"* 0,005 9,57+* 0,30 11,1-е ±0,20 2,99+* ±0,125 2,20-* 0,063

4.Беременность более 7 сут.( 6 ) 0,843+* 0,024 0,637** 0,015 168,3+* ±4,09 91,1+* ±1,66 17,55+* 0,96 9,41+* ±0,46

5. То же, что 4 голод.З сут.( 7 ) 0,449+* 0,033 0,551+* ±0,012 81,04+* ±3.27 64, Г* ±0,84 7,89+* ±0,31 5,73+* ±0,10

6. Гипсроксия (6) 0,578+* ±0,093 0,541+* ±0,028 30,5+* ±1,75 43,8+* ±4,3 5,5+* ±0,21 6,4+* 0,66

Достоверность различий по сравнению с контрольной 1руппой отмечена при р < 0,05 *, р< 0,01 О, р < 0,001 • и знаками + и - при увеличении и уменьшении значений активностей экстрактов тканей по сравнешпо с контрольной группой.

Беременность. Активности по отношешио ко всем трём субстратам при возрастают потребности в белковом материале у беремешплх животных варьируют в печени и почках в одинаковых направлениях. Обращает на себя внимание многократное возрастание активности ЦК, как в печаш, так и в почках.

Стимулы, регулирующие снижение уровня почечного протеолиза при голодают беременных животных ( 5 группа ), оказываются не достаточными для значительного, приближающегося к контрольному уровню, снижения активности. Активности в органах беременных крыс по отношению ко всем трём субстратам после голодания в течение трёх суток в почках остаются значительно выше ( р< 0,001 ), чем в контрольной группе. Колебания активностей катепсинов при беремешюсти, в том числе на фоне голодания, в печени более выражены по сравнению с колебаниями в почках. При рассмотрешш возрастания активности индивидуальных катепсинов, наблюдается более значительная индукция катепсина Н.

Голодание беременных животных вызывает снижение уровня активности катепсинов печени, тогда как при голодании у не беременных в этом органе отмечается повышение этих активностей, что ещё раз подчёркивает различия роли печени и почек в обеспечении эндогенного протеолиза в различных условиях. По -видимому, на стадии органогенеза плода наблюдается секреция плацентарных факторов активации клеточного протеолиза материнского организма, действие которых частично может быть ограшгчено истощением резервных форм пластического материала, например,в условиях голодания.

Гнпероксия. При нормальной диете животных и содержании в атмосфере 100% кислорода наблюдается индукция ЦК печени и почек. Так же как у беременных животных ( 4 группа ) при гипероксии наблюдается высокая индукция различных ЦК, в особенности,- К*Н. Диспропорциональность в нарастании активности ЦК может быть расценена как наблюдаемая избирательность в механизмах их активации в одном и том же органе. О высокой скорости индукции ЦК свидетельствует значительное возрастание активности К*Н и других пептидгидролаз спустя 16 часов после начала эксперимента. Высокая индуцибельность ЦК свидетельствует о существенной роли этих пептидгидролаз ( и соответственно тиолзависимого протеолиза ) в обновлении клеточных белков при приспособлениях клетки к новым условиям. Таким образом, значительная индукция ЦК наблюдается не только в условиях дефицита белка, но и в связи с новыми метаболическими условиями при достаточном поступлении пищевого белка, например, при пзменешш количества кислорода во вдыхаемом воздухе.

Суммируя приведенные данные можно сделать заключение о существовании регуляторных механизмов, приводящих к многократной активации цнетеиновых катепсинов как в печенн, так

и в почках животных. В отличие от нормального состояния при голодании печень вносит больший вклад в обмен белков, за счет индукции ЦК, активность которых приближается к ее уровню в почках на седьмые сутки от начала голодания. Активация К*Н значительно превосходит активацию других кагепешюв при беременности в исследуемых органах и снижение уровня этой активности при голодании в почках также более выражено. При различных экспериментальных воздействиях в тканях печени и почек КН претерпевает более значительные колебания активности. Регуляторные стимулы, направленные на снижение рассматриваемых активностей, оказывают различные влияния на печень и почки.

Изучение особенностей варьирования катепсина Н и некоторых других иеитидгидролаз при явлешшх тканевого роста.

Табл.6. Активность ЛЕЙЛА- и БАПА-гидролаз в бионтатах мышечных тканей челюстнолицсвои области.

АКТИВНОСТЬ (нмоль/мин мл ) в

СУБСТРАТ присутствии

Ц-БН ЭДТА ПХМБ

ЛЕИПА Образцы от

1) онкопогич. б-ных(б) 286*121 206*±23 160'118

2) без онкопатолог.(б) 160117 132119 122117

БАПА

1) 82*±15 62111 58"112

2) 76±12 72112 56* ±11

Достоверность различий показателя у больных с онкопатологией и без - ^достоверно р< 0,05,0,1<р<0,2, р >0,5.

Данные, представленные в табл. 6, показывают, что различные тиолзависнмые активности ( разность активностей в присутствии Ц-БН и ПХМБ ) в тканях онкологических больных выше, чем в тканях пациентов с банальной травмой. Это подтверждает наличие значительной перестройки обмена белков в организме опухоленосителей. Одним из последствий такой перестройки, позволяющих относительно легко проследить за выраженностью онкологического процесса, является измерение активности специфических форм цистенновых катепсинов в биоптатах тканей. В нормальной клетке активные катепсины в значительных количествах содержатся в свободном состоянии в лизосомах

и других структурах, тогда как в крови любые протеиназы, включая и собственные протеиназы крови, не считая предшествешппсов, связаны с эндогенными ингибиторами, определенная часть из которых выявляется энзиматическими методами в комплексе с ингибиторами группы он макроглобулина. Тканевые катепсины в клетке реализуют свои функции в ограшгченном ( частичный протсолнз ) и деструктивном ( как правило исчерпывающем ) протеолизе вне подобных комплексов. В регулящш активности протеолитических систем клетки большое значение имеют окислительно - восстановительные условия, регуля-ция рН, особое устройство молекул внутриклеточных катепсинов и других белков (потенциальных субстратов пептидгидролаз), при которых последние сохраняют высокую устойчив осп, молекулы даже при опшмальных для ЦК условиях среды .

Рис.5 . Влияние модуляторов цистешювых катеисииов на БАЛА -шдролазную активность плазмы крови женщип с беременностью более 30 недель.

На рис. 5 отражаш результаты анализа БАПА -гидролазной активности в 12 образцах плазмы крови женщин с беременностью более 30 недель. Для каждого образца приведены средние активности в присутствие Ц - БН, ЭДТА и ПХМБ. У здоровых доноров БАПА- гидролашая активность представлена исключительно нетиоловыми гидролазами, т. к. угнетешш активности в присутствие ПХМБ или ФМС не наблюдалось. В спектрах влияния этих модуляторов на активность плазмы крови беременных по сравнению со спектрами

активности тканевых гомогенатов обнаруживается два существенных отличия: 1) парадоксальное действие цистсина на БАПА - гидродазную активность в сторону ее уменьшения (1,5-7, 11, 12 ) и 2) небольшие уровни угнетения общей БАПА- гддролазной активности в присутствии ПХМБ в остальных пробах.

В предыдущем разделе настоящей работы показано, что активность КН в тканях по отношению к ЛЕЙПА в качестве субстрата значительно превосходит активность КВ по отношению к БАПА. Из рассмотренных методик определения активностей пептидгидролаз плазмы крови наиболее перспективна методика определения КН. С учетом изученных свойств цистеиновых катепешюв нами сделана попытка выявления катепсин Н-подобной активности плазмы крови с целью усовершенствования методики избирательного определения КН в качестве диагностического теста.

нмоль/мин мл

Рис. 6. Влияние модуляторов цистешювых катепешюв на ЛЕИПА -гидролазную активность плазмы крови больных со злокачественными новообразованиями.

Из данных анализа образцов плазмы крови £ больных различными новообразованиями челюстнолицевой области следует, что с помощью субстрата лейцинаминопептидаз - ЛЕЙПА в плазме крови может быть специфически выявлена активность К*Н ( Рис. 6 ). В составе лейцинаминопептидаз у части больных выявляется чувствительная к угнетающему действию ПХМБ и ФМС активность, которая отображена двумя, почти одинаковыми

рядами графических диаграмм, что наглядно представлено совпадением кривых. Небольшие недостоверные различия в действии этих ингибиторов цистеиновых катепсинов обнаружены в седьмом и восьмом анализируемых образцах. Далее проанализируем эффекты, связанные с влияниями активаторов, которые отражешл на рис.6 в виде столбцов. Активатор цистеиновых катепсинов меркаптоэтанол, как это видно при сопоставлении столбцов диаграммы, в большом числе случаев (пробы 1, 4, 5, 8. ) оказывает ингибирующее влняеие на ЛЕЙПА - гидролазную активность плазы крови. Во всех этих же пробах, за исключением восьмой, выявлено, что в присутствии ЭДТА натриевой соли ЛЕЙПА - гидролазтле активности выше, чем в присутствии ингибиторов ПХМБ и ФМС. Разница этих активностей связана с сегрегируемой формой катепсина Н. При анализе ЛЕЙПА-гидролазпой активности гомогенатов тканей меркаптоэтанол, цистеин и другие тиоловые соединения оказывают исключительно активирующее влияние (Табл.2 и табл.6). В настоящей работе впервые показано, что активность плазмы крови по отношению к БАПА и ЛЕЙПА может подавляться в присутствии тиоловых соединений. Из этого следует, что выявление тиолзависимых активностей целесообразнее осуществлять за счет уже активной доли фермента, путем ингибируюндах влияний ПХМБ или ФМС- (ингибитор, выявленный в настоящем исследовании).

Изменение процесснига цистешювых катепсинов обеспечивает феномен ах появления в крови. В отличие от высших животных и человека организм крыс продолжает расти после полового созревания. Не исключено, что секреция устойчивых форм ЦК является результатом действия регулягорпых механизмов тканевого роста, что может у крыс в норме привести к интенсивной секреции их в кровь. Нами проведено изучение этого явления в эксперименте на белых беспородных крысах ( Табл. 7 ).

Табл. 7. БАПА - гидролазная активность плазмы крови крыс.

ГРУППА ЖИВОТНЫХ (N ) БАПА-ГИДРОЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ( нмоль/мин мл) в присутствии Ц - БН ЭДТА ПХМБ

КОНТРОЛЬНАЯ (12) 0,43±0,034 0,5810,047 0,3610,021

БЕРЕМЕННЫЕ КРЫСЫ (7 ) 0,6810,023 0,6910,07 р<0,05 0,2910,048

В табл.7 отражены результаты определения активности БАПА- и ЛЕЙПА- гидролаз в плазме крови этих животных при нормальной диезе ( контроль ) и в таких же условиях при беременности более недели, т.е. на стадии интенсивного органогенеза плода. В контрольной группе также как и ранее обнаружено отчепшвое снижение рассматриваемых активностей в присутствии тиолового активатора. Обращает на себя внимание наличие катепсин В- подобной активности в контрольной группе животных, что существенно отличает организм этих животных по состоянию секреторных процессов ЦК от организма человека. Возможно, это отличие связано с продолжающимся после полового созревания ростом животного.

1 - ЛЕЙПА - гидролаэная активность натиоловы* аминопагпмдаэ.

2 - туюлзааисимая активность (катепсин Н ), 3,4 - соответствующие средние ошибки

Рис.7. ЛЕПА- гадролазная активность в плазме крови больных с опухолями челюстполпцевой области ( внизу ) и у здоровых доноров (вверху).

При беременности животных наблюдается усиление секреции как катепсин- Н подобной активности, так и катепсин В подобной активности ( тиолзависимая, угнетаемая ПХМБ ). В связи с низкой скоростью гидролиза БАПА в присутствш! образцов плазмы крови, этот субстрат не целесообразно использовать для определения тиолзависимой активности в этом материале. Как показано в настоящем исследовании КН более индуцибелен в тканях, чем КВ, что может обеспечивать более высокий уровень этого катепсина при секреции в условиях малигнизации.

На рис.7 представлены результаты анализа плазмы крови 32 больных ( верхний столбец диаграммы ) до операщш по поводу злокачественных новообразований челюстно-лицевой области различной локализации и морфологии и 10 здоровых доноров (нижний столбец диаграммы ). Незаштриховашшми участками столбцов представлены средние ошибки совокупности наблюдений (обозначено номерами 3- для нетиолзависимых лейщшаминопептидаз и 4 - для катепенн Н подобной активности (К*Н). Заштрихованные области 1 и 2 - средние уровни активностей лейнинаминопептвдаз и К*Н активности, соответственно. Суммарная протяжённость столбцов отражает общие лейцинаминопептидазные активности плазмы крови здоровых доноров и больных. Использованная модификация метода анализа четко выявляет существенные различия в спектрах ЛЕЙПА-гидролаз в плазме крови здоровых доноров и больных с новообразованиями чешостнолицевой области. Эти данные показывают, что нетиолзависимая, а с учетом отклонений отдельных наблюдении и суммарная лейщшамшюпептпдазная активность у здоровых и больных не имеет значимых различий. Тогда как, тиолзависимая активность К*Н в плазме здоровых доноров не обнаружена. Это соответствует сложившимся представлениям о том, что в норме образуются и секретируются формы ЦК не устойчивые при рН выше 7,0. В плазме крови больных со злокачественными новообразованиями катепенн Н- подобная активность в среднем составила 1/4 часть общей лейщтам1Шопептидазной активности. КН-подобная активность не выявлена также в плазме крови 16 больных с различными формами хронического гломерулонефрига и 12 больных, у которых анализируемые образцы были взяты непосредствешш после завершения обширного торакального оперативного вмешательства с применением аппарата искусственного кровообращешш. Значительная активность К*Н была обнаружена у одного пациента с неонкологической патологией ( явления васкулита, с недостаточностью функции почки, сопровождающейся пефротичеекпм сшщромом ) на среднем уровне 1,75 имоль/мин мл плазмы.

Проведено сравнение тиолзависимого компонента ЛЕЙПА-гидролазных активностей - К*Н у больных с различным течением послеоперационного периода н лучевой терапии (Рис.8).

нмоль/мин мл

1,6 г

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О

средняя ошибка

Тиол-зависимая активность

1

2

3

4

Рис.8. Динамика катепсин Н- подобной активности в плазме крови больных- 1.До лечения (N=32). 2.После оперативного лечения (N=10).

3.После операций и лучевой терапии без рсци.шва опухоли (N=4).

4.После операций и лучевой терапии с рецидивом опухоли (N=4).

На рис. 8 приведены данные исследования плазмы крови больных с рецидивами и безрецндивов опухолей. В отличие от активности К*Н, другое ЛЕЙПА - гидролазы не обнаруживают достоверных различий у больных до и после лечения, с рецидивами и без рецидивов опухолей. Активность К*Н у больных после лечения без рецидивов опухолей отчетливо снизилась ( Р < 0,01). У больных с рецидивами опухолей не обнаружено достоверного отклонения этой активности по сравнению с неоперированными больными и больными непосредственно после оперативного лечения (1-7 суток), т. е. К*Н не исчезает из крови сразу после удаления опухоли. Не наблюдается и в дальнейшем исчезновения активности К*Н из крови больных без рецидивов опухолей ( Столбец 3 на диаграмме 8 ). В соответствии с этим ткани опухолей не являются в организме опухолсносителя единственным источником секреции устойчивых форм КН. В отличие от здорового человека секреция КН является свойством разшгчных тканей онкологического больного. Скрытые нарушения обмена белков, регулируемые цистеиношлми катепсинами, возможно, наблюдаются в тканях организма до появления опухолевого роста и не устраняются в ближайшем после оперативного лечегатя периоде.

ВЫВОДЫ

1. В тканях почки человека и животных катепсин В представлен в виде двух основных форм ( I и II ), выделенных при помощи усовершенствовашюго метода очистки в результате: а) обработки препарата пепсином в конечных концентрациях до 0,1 мг/мл, б) обработки препаратов раствором детергента ( тритон X -100 ) в конечной концентрации выше критической для мицеллообразования. Введение процедур "а" и "б" в сочетании с многоэтапной очисткой известными методами обеспечивает высокий выход обеих форм катепсина В, свободных от примесей катепсина Н.

2. Общим для I и II форм катепсина В шляется: а) уменьшенная, по сравнению с другими пептидазами, стсричсская доступность существенной серы активного центра для субстратов, б) Мг около 25 КД, в) ингибирование не только ПХМБ, но и ФМС, г) исключительно высокая скорость инактивации фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы, д) угнетение до 95% лейпептином (7,5 . 10-5 М) гидролиза БАПА, е) конкурентное ингибирование низкомолекулярными синтетическими пептидами с преобладающими гидрофобными аминокислотными остатками. Формы I и II различаются по удельной активности и сродству по отношению к БАПА ( 0,100 ед/мг белка при Км = 2,44 мМ для формы I и 0,350 ед/мг при Км 3,84 мМ для формы II ), б) более высокой ( в 5 раз) активности к казеиновому субстрату для формы II, в) наличие протеолитическон активности к гистонам только у формы II.

3. Катепсин В и пептидазы той же группы - катепсииы Н и Ь, активируются ЫАОН и ЫАОРН. В гоже время окисленные формы последних не влияю) на указанную активность . Активность катепаша В в гомогенате тканей почки сохраняется длительное время ( 6 час ) при 37° С , несмотря на значительное снижение содержания БН- групп с 4,19 до 2,23 мэкв/л. Это свидетельствует о высокой устойчивости существенной серы активного центра фермента к эндогашым окислителям, на что указывает также высокая чувствительность катепсина В к ФМС, естественного аналога которому в данном гомогенате не обнаружено.

4. Цнстеиновые катепешпл высоко индуцибелыш в тканях экспериментальных животных в ответ на изменения состояний организма. Так, при гипероксии ( 100% 02 , 16 час ) у крыс наблюдается многократное возрастание активности всех цистеиновых катепсинов, что является также дополнительным аргументом отсутствия механизма окислительной инактивации для данных энзимов (см.З ). При беременности у крыс активности

цистеиновых катепсинов возрастают еще в большей степени, особенно - катепсин Н- подобной активное™ ( для печени от 6,16 ±

0.001 до 168,3 ±4,09 нмоль мип/мг белка). При голодашш наблюдается снижение этих активностей в почках и некоторое возрастание в печени. Вне зависимости от вида воздействия катепсин Н примерно вдвое более индуцибелен по сравнению с катепсином В.

5. При заболеваниях, сопровождающихся протеинурией в тканях почки возрастает содержание крупномолекулярных форм катепсина В, выявляемых методом гельфильтрации. Ферментативно активные по отношению к БАПА и устойчивые к действию неиошплх детергентов крупномолекулярные формы цистеинового катепсина В являются комплексами этого фермента с а2-макрогло-булином. Наибольшее количество этих комплексов обнаружено в экстрактах тканей отторгнутых трансплантатов почки.

6. При злокачественных новообразованиях челюстно- лицевой области у человека в плазме крови выявляется специально разработанным вариантом метода катепсин Н- подобная активность (0,952 ±0,132 нмоль/мин мл). Эта активность отсутствует в норме и при патологиях воспалительного характера. Показатели катепсин Н- подобной акгшшости могут быть рекомендованы в качестве дополнительного диагностического теста верификации наличия (отсутствия ) опухолевого процесса или его рецидива.

7. Парентеральное введение мышам модафицированных форм КВ, выделенных и очищенных из тканей почек свиньи, вызывает повышение соответствующей активности в почках реципиента, т. с. эти формы цистеиновых катепсинов в отличие от обычных форм увеличивают протеолитический потенциал почки.

8. Совокупность данных , полученных на разнообразном экспериментальном и клиническом ма'щшале позволяет сделать следующие обобщения: а)цистеиновые катепсины обладают высокой индуцибельностью на уровне тканей, при любых исследованных изменениях состояний оргашпма, б) у больных с новообразованиями обнаруживается высокое содержание цистеинового катепсина Н, не устраняемое после комбинированного лечения, в том числе при отсутствии рецидивов опухолей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложенные способы обработки экстрактов тканей могут быть использованы при промышленном получешш цистеиновых катепсинов. Способ очистки цистеиновых катепсинов из животного материала ( Авт. свид. 3/20 02.03.89, 140374) внедрен в рамках

программы МНТК " БИОГЕН " Разработка методов получения и создания опытного производства ферментов ", тема 16/80 - 90 АН СССР.

2. Предложен новый способ энзимотерагаш, апробированный в эксперименте, при помощи препаратов модифицированных цистешювых катепсинов, пригодных для усиления протеолитнческой активности в тгканях почки, что может быть оправдано при значительной протеипурга!.

3. Усовершенствованная методика анализа активности цистешювого катепсина Н может быть рекомендована в качестве вспомогательного теста для прогнозирования течения восстановительного периода после лечештя больпых опухолями челюстно-лицевой области.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Исследование лизосомалыгых катепсинов В1 из нейтрофилов человека // В сб. "Структура и функции лизосом".- М.- 1979,- С. 54-56 (Соавтор- И.Г.Щербак )

2. Разработка нового метода определения активности внутриклеточного фермента катепсина В1 // Нейрофизиологическая регуляция биологических процессов. Л.- 1 ЛМИ.- 1976. - С. 43-44.

3. Катепсин В1 и процессы протеолиза в почке человека // Молекулярные и общебиологичсские закономерности патогенеза и клиники заболевашш. Л,- 1 ЛМИ.-1977. С. 108-111.

4. Способ очистки катепсина В1 // Изобретение.- Авт. свид. №2474825/23-04 (047877), от 13 марта 1978 ( Соавтор- И.Г. Щербак)

5. Флюориметрическое определение никотинамидных нуклеотидов в ткани печени и крови // Лабораторное дело.- 1977.-№3,- С. 177-178.( Соавтор- А.А.Чнркин )

6. Исследование механизма активации лизосомальной эндопептндазы катепсина В // Проблемы адаптации в кгашгасе и эксперименте,- Л.- 1ЛМИ,- 1978.- С. 27-29.

7. Молекулярные формы катепсина В1 человека // 4 Всесоюзный съезд биохимиков.- М. Наука.- 1979.- Т 2,- С.68-69 (Соавторы- И.Г.Щербак Н.Н.Тихонов )

8. Активация катепсина В1 восстановленшлми формами пнридиннуклеотидов и тиоловыми соединениями // Биохимия, -1979.. т 44.- вып. 12. - С. 2218-2226 ( Соавтор- И.Г.Щербак )

9. Влияние различных форм пиридшшуклеотидов и глутатиона на активность катепсина Bj//B сб. " Структура и функции лизосом": Тез. докл.- Новосибирск.- 1980.- С. 66 ( Соавтор H.H. Тихонов )

10. Исследование условий сошобилизащш и активации лшосомальной эндопсптидазы катепсина В ¡.//В сб." Структура и функции лизосом": Тез. докл.- Новосибирск.- 1980.-С. 202 - 203 (Соавтор- И.Г.Щербак).

11. Варьирование активности лшосомальной эндопсптидазы катепсшт В j в экстрактах гомогепатов тканей // Сб. трудов биохимиков республик Прибалтики, Белорусе™ и Ленинграда.-Рига .- 1981.- С. 441 - 442. ( Соавторы- И.Г. Щербак, H.H. Тихонов )

12. Роль нарушения функции вакуолярно-лизосомального аппарата канальцев в патогенезе тубуло-шперстициальных изменений при гломерулонефрите // Тубуло-интерстициальное поражение почек.- Тез. докл. VI Пленума Всесоюзного Объединения нефрологов.- Ташкент.- 1984 г.- С. 29-30 ( Соавторы - В.Я. Плоткин, И.К. Клемина, А.И. Неворотин. )

13. Способ определешш активности никотгашмидных дегидрогеназ // Изобретение,- заявка № 3682278/28-14 (001149). (И-Г- UJ

14. Роль прогеинурии в прогрессировании гломерулонефрита // Тез. докладов.- Съезд нефрологов. - М.- 1986 г. - С. 114 ( Соавторы -В.Я. Плоткин, И.К. Клемина, А.И. Неворотин )

15. Активность катепсина В и сериновых трипсиноподобных пептидгидролаз в экстрактах почки человека II. Вопросы медицинск. химии.- 1986 г.- № 1. - С. 71-76 (Соавтор- И.Г. Щербак)

16. Очистка и свойства цистеиновых катепешюв тканей животных // Укр. биохнм. журн.- 1986,- № 4.- С. 100-113.

17. Изучение активности катепсшт В коркового слоя почек человека // В сб. "Структура и функции лизосом". Тез. докл. III Всесоюзн. снмпоз. Тбилиси, 1986. - С. 68-69 (Соавтор -В.Я. Плоткин)

18. Способ получения катепсшт В. // Изобретение.- заявка 1989.-МКИ С12.-№ 9/14. Заявка № 4498660/28-14/151422.- Авт. свид. 3/20 02.03.89, 140374 ( Соавторы - Э.А.Арснс, Я.Я.Гибнетис)

19. Резорбция тканей, коагулированных инфракрасным лазерным излучением // В кн. Лазерная биология и лазерная медицина: Материалы докладов школы-семинара. 4. - 2 Тарту-Пюхаярве, 23-30 апреля 1991 г., - С. 13-18 (Соавторы- Р.Р. Мачулайтис , М.М. Куль , Г.Л Зельцер)

20. Катепсин Н-емия при опухолях челюстно-лицевой области // Сб. тр. "Компенсаторно-приспособительные механизмы биологических систем ". СПбМИ им. акад. И.П.Павлова 1991 г. - С. 18-20 (Соавторы- И.М. Юлдашев, М.А. Жданова)

21. Каталитические свойства катепсина В почек человека // Укр. биохим. журнал.- 1991. - Т. 63. - №2. - С. 45-51.

22. Исследование механизмов торможения лизосомального протеолиза при прогеинурин // Тез. докл.- Третья конференция нефрологов Северо-Запада РСФСР.-. 17-18 окт. 1991 Новгород. -1991.- С. 163 ( Соавторы - А.И. Куликова, А. Ш. Румянцев, В.В. Козлов ).

23. Излучение НИАГ-лазера изменяет протсолитическую устойчивость белков тканн печени крыс // Бюллетень эксп. биол. мед. 1991. - Т. 111, № 2. - С. 217-219 ( Соавторы - P.P. Мачулайтис, Г.Л. Зельцер, А.И. Неворотин ).

24. Морфофункцнональная характеристика раны, нанесенной ультразвуковым деструктором // Бюллетень эксп. биол. мед. 1992.-Т.113, №2. - С. 308 - 311 ( Соавторы - Г.Л. Зельцер, М. М. Куль ).

25. Влияние тубулошперстициального компонента на мочевую экскрецию "средних молекул" при хроническом гломерулопефрите // Сб. докладов : "Клиническая морфология в нефрологии" ,СПб. 1994.-С. 117.- 22- 25 июня 1994 ( Соавторы - А. Ш. Румянцев, В. В. Козлов).

26. Варьирование активностей цистеиновых катепсшюв почек и печени // Бюллетень эксп. бнол. мед. 1995.-Т.120.- № 12.- С.586 - 589 (Соавтор А.Ю. Дубикайтис).

27. Активность секретируемых форм цистеиновых катепсннов в крови в качестве маркеров тканевого роста // Вопросы онколопт.-1996.- Т. 42, № 1.- С. 70 - 76 ( Соавтор В. А. Дунаевский ).

28. Activity of cathepsin Н in blood of patients with radioosteo-myelitis of oral cavity // Symp.of Head and Neck Tumours.-Tallinn/Estonia.-19-20th March 1991.-P.7 ( I.M. Yuldashev, Yu.A. Shelomentsew).

29. Evaluation of cathepsin H activity in blood of patients with radioosteomyelitis of mandible and cancer of the oral cavity // VI th Biennial congress of the international association of oral pathologists. July 27-30.- 1992.- Hamburg/Germany (I.M.Yuldashev, V.A.Dunaevsky).

30. Biochemical analysis of cathepsin H is activity in the blood of patients with radioosteomyelitis of the mandible and cancer of oral cavity II The European association for cancer research. The Belgian cancer association. Twelfth Biennial meeting of the European Association for Cancer Research ( EACR-XII ) Brussels ADE (Belgium).- April 4 - 7.1993 (I. M.Yuldashev, V.A.Dunaevsky ).