Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Нейрохимические механизмы церебральных патологий

На правах рукописи

ОНУФРИЕВ МИХАИЛ ВАЛЕРИЕВИЧ

НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЙ: НИТРЕРГИЧЕСКАЯ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМЫ

14.03.03 - патологическая физиология

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 5 и!Д? Ш1

МОСКВА-2011

005014309

005014309

Работа выполнена в Лаборатории функциональной биохимии нервной системы (зав. лаб. -доктор биологических наук, профессор Н.В. Гуляева) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор - доктор биологических наук, профессор П.М. Балабан).

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Наталия Валерьевна Гуляева Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Наталия Александровна Крупина Доктор биологических наук, профессор Юрий Владимирович Архипенко Доктор медицинских наук, профессор Владимир Вячеславович Шерстнев

Ведущее учреждение:

Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «29» марта 2012 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" Российской академии медицинских наук по адресу: 125315, Москва, Балтийская улица, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « ¿-о »

2012 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Лариса Николаевна Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследование механизмов церебральных патологий продолжает оставаться актуальной задачей, без решения которой невозможно патогенетическое обоснование лечебных мероприятий. К важнейшим системам, нарушения которых играют существенную роль в патогенезе практически всех церебральных патологий, относятся система оксида азота (N0) и протеолитические системы. Несмотря на различия в функциях, обе системы принимают участие как в нормальной пластичности мозга, обеспечивая динамическое равновесие сигнальных и модифицирующих белки стимулов, так и в механизмах патологических изменений в ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях и других патологиях мозга.

Функционирование нитрергической системы в мозге при физиологических условиях обеспечивают две Са2+/кальмодулин-зависимые изоформы NO-синтазы, которые присутствуют в эндотелиальных клетках (эКОС, III тип NOC) и нейронах (hNOC, I тип NOC). N0, генерируемый эЫОС, необходим для контроля мозгового кровотока, тогда как N0 синтезируемый hNOC функционирует также как нейротрансмиттер, модулирует нейроэндокринные функции, память и поведение (Szabo, 1996; Guix et al., 2005). При различных патологических условиях, включая нейродегенеративные заболевания и ишемию мозга, большие количества N0 синтезируются индуцибельной NOC (hNOC, II тип NOC), экспрессия которой повышается в ответ на локальное усиление биосинтеза провоспалительных цитокинов и связана с повреждающим действием N0. Экспрессия hNOC выявлена в инфильтрующих мозг фагоцитах, эндотелии сосудов и глиальных клетках - астроцитах, олигодендроцитах и микроглии (Bachschmid et al., 2005; Moneada and Bolanos, 2006).

Среди основных групп протеаз, регулирующих физиологические функции в головном мозге, выделяют группу цистеиновых протеаз, к которой относятся три семейства - каспазы, калпаина и папаина (Chwieralski et al., 2006). Протеазы этой группы присутствуют во всех типах клеток ЦНС, локализуются в различных компартментах клетки и принимают участие в расщеплении разнообразных субстратов при физиологических стимулах и в процессе повреждения и гибели клеток. К важнейшим цистеиновым протеазам из этих семейств относятся каспаза-3, калпаин и катепсин В.

Согласно одной из классификаций, каспазы, расщепляющие пептидную связь у остатка аспартата в белках, подразделяют на активаторные, провоспалительные и эффекторные (Liu et al., 1996; Orth et al., 1996; Muzio et al„ 1997; Thornberry et al., 1997). Каспаза-3 относится к эффекторным каспазам и ее считают фактором терминальной стадии апоптотической гибели нервных и глиальных клеток (Nunez, 1998, Yuan, Yankner, 2000, Timmer, Salvesen, 2007). Каспаза-3 синтезируется в виде неактивного профермента (32 kDa), в результате протеолитического расщепления которого образуется активная протеаза (12 kDa и 17 kDa).

Наряду с апоптотическими функциями, каспаза-3 может принимать участие и в физиологических событиях, например, в регуляции клеточного цикла, пролиферации, дифференцировке, а также пластических перестройках клеток мозга (Cohen, 1997; Concha and Abdel-Meguid, 2002; Гуляева, 2003).

Калпаин - нейтральная цистеиновая протеаза, которая активируется кальцием. В головном мозге экспрессируется две изоформы калпаина ц-каппаин и m-калпаин, каждая из которых состоит из каталитической субъединицы (80 kDa) и регуляторной субъединицы (28 kDa) (Bevers and Neumar, 2008). Повышение внутриклеточной концентрации свободного Са2+ выше пороговой величины, специфичной для каждой изоформы (~1 цМ для ц-каппаина и ~1 тМ для т-калпаина), приводит к связыванию Са2+, информационным изменениям, аутолизу обеих субъединиц и активации калпаина (Hosfield et al., 1999). В результате кратковременной активации калпаины принимают участие в физиологических функциях, осуществляя частичный протеолиз субстратов, таких как структурные белки, Са2+-регулируемые и сигнальные белки (Goll et al., 2003). Однако повышенная активация калпаина наблюдается на ранних этапах экзайтотоксического повреждения нейронов (Siman et al., 1989; Faddis et al., 1997) и задействована в реализации апоптотической гибели клеток (Nath et al., 1996; Squier et al.,1999). В процессе апоптоза и гипоксии-ишемии мозга каспаза-3 может расщеплять эндогенный ингибитор калпаина калпастатин (Blomgren et al., 1999; Wang, 2000). Показано, что калпаин расщепляет профермент и активирует каспазу-3 после воздействия майтотоксина и кислородно-глюкозной депривации (КГД) кортикальных культур (McGinnis, 1999; Malagelada, 2005).

Катепсины - кислые эндопептидазы семейства папаиновых протеаз (Turk et al., 1997). Катепсины локализуются преимущественно в лизосомах, где они принимают участие в деградации белков до аминокислот при кислых значениях рН (Kirschke et al., 1980). Катепсины В и L являются основными лизосомальными цистеиновыми протеазами в ЦНС и экспрессируются как в нейронах, так и в глии (Yamashima, 2000). Различные патологические ситуации, в том числе ишемия мозга, приводят к высвобождению катепсинов в цитоплазму клетки, а избыточная активность этих протеаз вызывает повреждение и гибель клеток (Boya et al., 2003). Катепсин В принимает участие в различных видах клеточной смерти, в частности, влияя на активность других цистеиновых протеиназ, в том числе провоспалительных и эффекторных каспаз (Kingham and Pocock, 2001; Benchoua et al., 2004). Калпаин-катепсиновая гипотеза гибели клетки основывается на том факте, что активированный эксайтотоксичным стимулом калпаин повреждает лизосомы и обеспечивает выход в цитозоль клетки лизосомальных протеаз, включая катепсин В, с последующим расщеплением клеточных белков и гибелью клетки по некротическому пути (Yamashima, 1998; Yamashima, 2003).

Взаимодействие нитрергической и протеолитических систем во многом определяется плейотропными эффектами NO и реактивными формами азота (РФА), которые индуцируют как

некротическую, так и апоптотическую гибель клеток в зависимости от интенсивности токсического воздействия (Bonfoco et al., 1995). NO и пероксинитрит могут индуцировать каспазо-зависимую и/или калпаин-опосредованную клеточную гибель с участием различных механизмов (Zhang et al., 2004; Takadera et al., 2004; Moneada and Balanos, 2006; Kawano et al., 2006; Kosuge et al., 2008). Так NO индуцирует каспазо-опосредованную гибель клеток через высвобождение из митохондрий цитохрома С и активацию каспазы-9, повышение экспрессии р53, активацию митоген-активируемых протеинкиназ и изменение экспрессии белков, регулирующих апоптоз, в том числе из семейства Bcl-2 (Choi et al., 2002; Moneada and Balanos, 2006). NO индуцирует также каспазо-независимую гибель посредством активации калпаина, стимуляции высвобождения возбуждающих аминокислот и активных форм кислорода (АФК), повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция и нарушения функционирования митохондрий (Prast and Philippu, 2001; Choi et al., 2002; Moneada and Balanos, 2006). Действие ингибиторов изоформ NOC подтверждает активирующий эффект NO и его производных на калпаин и каспазу-3 (Dingman et al., 2006; Sun et al., 2009).

С другой стороны, присутствие цистеина в активном центре протеаз делает их уязвимыми для NO, поскольку тиолы чувствительны к окислительно-восстановительным модификациям и могут подвергаться S-нитрозилированию. В исследованиях in vivo и in vitro продемонстрирована способность NO нитрозилировать тиолы в активном центре каспаз и ингибировать их протеолитическую активность (Li et al., 1997; Kim et al., 1997, 2000; Rossig et al., 1999; Tôrôk et al., 2002). Также NO ингибирует активность катепсина В, папаина и калпаина через S-нитрозилирование остатков цистеина в активном центре протеаз (Stamler et al., 1992; Venturini et al., 1998; Koh and Tidball, 2000). Считают, что присутствие в клетке Fe-S комплексов является критическим фактором для опосредованного NO S-нитрозилирования in vivo (Kim et al., 1998, 2000). Таким образом, NO может выступать в качестве общей регуляторной молекулы для цистеиновых протеаз.

Воздействие протеаз на нитрергическую систему проявляется в протеолитическом расщеплении изоформ NOC. Известно, что ковалентно модифицированная hNOC подвергается убиквитинилированию и протеосомальной деградации (Bender et al., 2000; Noguchi et al., 2000). Однако и избыточная активация калпаина приводит к расщеплению всех трех изоформ NOC -hNOC, эШС и iíNOC (Osawa et al., 2003; Копе et al., 2003; Stalker et al., 2005).

Дисрегуляция продукции и/или метаболизма NO и РФА, которая происходит при нитрозативном стрессе, может повлечь за собой модификацию структуры и функций белков, нарушение внутриклеточного сигналлинга, повреждение и гибель клеток. NO реагирует с супероксидным анионом с образованием сильного окислителя пероксинитрита, который участвует в нитровании остатков тирозина в белках (Gow et al., 1996). hNOC и hNOC играют доминирующую роль в образовании нитротирозина в мозге на разных стадиях ишемии и

реперфузии (Eliasson et al., 1999; Hirabayashi et al., 2000). Присутствие нитрованных белков м пептидов может активировать иммунную систему и продукцию иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин (Ischiropoulos, 2009). Наряду с нитрозативным стресом происходит интенсификация окислительного стресса, который является общим знаменателем для многих церебральных патологий, в том числе ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний (Sayre et al., 2008).

Наличие стимулов, которые ведут к усиленной продукции NO, может быть причиной повреждений нейронов. Примером этого является глутаматная токсичность (Lipton et al., 1993). Показано, что Р-амилоидный пептид (АР) действует синергично с глутаматом, вызывая повреждение нейронов по NO-зависимому пути (Aksenov et al.; 1995; Le et al., 1995; Noda et al., 1999; Yang et al.,1998) и индуцирует окислительный стресс (Miranda et al., 2000; Varadarajan et al., 2000). Однако изменения NOC при болезни Альцгеймера (БА) неоднозначны, а имеющиеся на этот счет данные очень противоречивы (Dorheim et al., 1994; Thorns et al., 1998; Tohgi et al., 1998; Tao et al., 1999; Yew et al., 1999; Gargiulo et al., 2000).

Эксайтотоксичность глутамата играет важную роль и в патогенезе эпилепсии. Ранние исследования свидетельствуют о том, что продукция NO повышается в результате активации hNOC глутаматом после введения пентилентетразола (PTZ) (Endoh et al., 1994; Garthwaite and Boulton, 1995) и инъекции ингибиторов биосинтеза NO снижают чувствительность к индуцированным PTZ судорогам (Kaneko et al., 2002; Itoh et al., 2004). Тем не менее, NO проявляет и антиконвульсантный эффект при судорогах, индуцированных каинатом (Przegalinski et al., 1994), а-гуанидиноглутаровой кислоты (Yokoi et al., 1994) и NMDA (Buisson et al., 1993). На различных моделях судорожной активности было вьивлено повышение экспрессии и активности каспазы-3 (Gillardon et al., 1997; Faherty et al., 1999; Ferrer et al., 2000; Henshall et al., 2000), a ингибитор каспазы-3 z-DEVD-fmk снижал индуцированную судорогами гибель нейронов (Henshall et al., 2000; Kondratyev and Gale, 2000). Остается малоизученной проблема взаимодействия нитрергической системы и каспазы-3 в механизмах церебрального повреждения после судорог, индуцированных PTZ.

Механизмы развития стрессорной реакции и ишемического повреждения мозга имеют много общих звеньев. Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, которая задействована в реакции на стресс, является одним из первых физиологических ответов на церебральную ишемию, которая приводит к длительному повышению в крови концентрации глюкокортикоидов (Getz et al., 1981; Olsson, 1990; Fassbender et al., 1994; Johansson et al., 1997). Нейротоксические эффекты стресса связаны также с повышением внеклеточного уровня возбуждающих аминокислот, в первую очередь глутамата, модуляцией активности и экспрессией изоформ NOC (Moghaddam, 1993; Olivenza et al., 2000). В научной литературе

практически отсутствуют данные о роли цистеиновых протеаз, таких как калпаин, катепсин В и каспаза-3, в нейродегенерации, вызванной хроническим стрессом.

Гибернация является уникальной физиологической адаптацией к изменяющимся условиям окружающей среды. Несмотря на то, что мозговое кровообращение кардинально изменяется на стадиях гибернационного цикла, проявляя схожесть с ишемией/реоксигенацией, повреждения мозга не происходит (Lust et al, 1989; Frerichs et al, 1994; Ma et al, 2005). В мозге гибернирующих животных выявлены сезонные изменения эндогенных регуляторов гибернации, таких как серотонин, катехоламины, нейропептиды и гормоны (Popova et al., 1993; Nürnberger, 1995; Gui et al., 1996), однако исследования роли нитрергической системы в таком природном механизме адаптации практически отсутствуют. Существенное снижение температуры тела, кровообращения в мозге и нейрональной активности во время спячки сопровождается изменениями в микроструктуре нейронов (Popov et al., 1992; von der Ohe et al., 2006). Причем вхождение в спячку сопровождается 50-65% потерей синапсов, не связанной с деградацией синаптических белков, а, как предполагают авторы исследования, связанной с их диссоциацией из синапса в аксон, тело нейрона или дендрит во время вхождения в спячку, их пребыванием там во время спячки и быстрым реструктурированием синапсов во время выхода из спячки (von der Ohe et al., 2007). Однако нейроны, подверженные апоптотической гибели, проявляют ретракцию дендригов похожую, как и у нейронов, гибернирующих животных. В подобные структурные и функциональные изменения как правило вовлечены протеолитические ферменты, а роль каспазы-3 участвующей как в апоптозе, так и в реализации нейрональной пластичности, остается практически не изученной при гибернации.

Таким образом, сравнительное исследование нитрергической и протеолитической систем с использованием моделей церебральных патологий способствует комплексному пониманию механизмов этих патологий на примере взаимодействия ключевых систем, обеспечивающих нейрональную пластичность и ответственных за повреждение и гибель клеток. Цель работы и основные задачи исследования

Основной целью данной работы явилось исследование состояния нитрергической системы и системы цистеиновых протеаз при экспериментальных и клинических церебральных патологиях. Для сравнения была использована модель гибернации как модель естественного (сезонного) изменения нейропластичности. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать показатели нитрергической системы, иммунный ответ и модуляцию активности цистеиновых протеаз в спинномозговой жидкости (СМЖ) больных в острый период инсульта.

2. Исследовать показатели нитрергической системы, иммунный ответ и активность цистеиновых протеаз в мозге и СМЖ на модели фокальной ишемии мозга у крыс.

3. Исследовать продукцию метаболитов N0 и интенсивность гибели клеток в нейроглиальных культурах и переживающих срезах мозга крыс на модели кислородно-глюкозной депривации (ишемия/реоксигенация).

4. Исследовать влияние окислительного стресса на активность NOC на модели фокальной или глобальной ишемии мозга, после введения нейротоксина AF64A, после введения Р-амилоидного пептида (25-35), а также при непосредственном действии окислителей in vitro.

5. Исследовать соотношение активности NOC и активности каспазы-3 при физиологических состояниях (гибернационный цикл) и патологических воздействиях (PTZ-индуцированные судороги).

6. Исследовать состояние нитрергической и протеолитической систем на различных моделях стресса.

Научная новизна

В работе впервые проведено систематическое исследование биохимических показателей, характеризующих состояние нитрергической и протеолитической систем мозга при моделировании различных патологических процессов, а также с использованием клинического материала.

У больных впервые выявлено появление активности NOC в СМЖ в острый период после ишемического и геморрагического типов инсульта, а также увеличение иммунной реакции на нитрованные белки в этот период.

Впервые показана способность СМЖ контрольной группы пациентов модулировать активность цистеиновых протеаз - калпаина, каспазы-3 и катепсина В, тогда как для СМЖ больных после инсульта выявлены существенные изменения в степени активации или ингибирования протеаз.

На моделях постреанимационной патологии и болезни Альцгеймера (введение холинотоксина AF64A) впервые продемонстрировано, что усиление окислительного стресса сопровождается снижением активности NOC, а в экспериментах in vitro впервые установлено, что окислители вызывают дозозависимое ингибирование активности NOC в гомогенатах коры больших полушарий.

Установлено, что разные типы стресса оказывают разнонаправленное влияние на активность NOC. Более интенсивный стресс, хронический эмоционально-болевой стресс, способствует снижению активности NOC в коре больших полушарий и мозжечке крыс, тогда как умеренный вариант, такой как ранняя социальная изоляция, приводит к активации NOC в отделах мозга цыплят и в коре мозга и гиппокампе крыс.

Впервые обнаружена активация катепсина В и ингибирование активности калпаина и каспазы-3 в коре мозга и гиппокампе крыс в результате хронического эмоционально-болевого стресса.

Впервые удалось выявить секрецию катепсина В нейроглиальными и глиальными культурами мозжечка крысы при метаболическом стрессе, индуцированном заменой культуральной среды на солевой раствор.

Впервые установлено, что при кислых значениях рН катепеин В проявляет способность расщеплять субстрат каспазы-3.

При различных функциональных состояниях мозга в гибернационном цикле сусликов впервые обнаружена активация N00 и каспазы-3 на разных стадиях цикла, а именно на стадии пробуждения и на стадии спячки соответственно. Теоретическая и практическая значимость

Полученные в настоящей работе результаты расширяют представление о возможной связи между генерацией оксида азота и свободнорадикальными механизмами развития постреанимационной патологии и холинергической нейродегенерации, вызванной введением холинотоксина АР64А или рА(25-35).

Ингибирование активности N00 активными формами кислорода и/или продуктами свободнорадикального окисления обусловливает непреходящую актуальность применения антиоксидантной терапии для предотвращения повреждающего действия свободнорадикального окисления и создания дефицита N0 в мозге.

Появление иммуноглобулинов в поврежденных ишемией участках мозга, а также наличие иммунной реакции на продукты нитрозативного стресса, индуцированного инсультом, расширяют представление о системах организма, задействованных в механизмах этой патологии, а также ставят вопрос о способах терапевтического воздействия, которые включают в том числе и коррекцию иммуного ответа.

Выявленные в настоящем исследовании перекрестные эффекты ингибиторов цистеиновых протеаз, играющих ключевую роль в развитии церебральных патологий, характеризуют применение ингибиторов в клинической области достаточно проблематичным и предопределяют, наряду с получением более специфических ингибиторов, масштабную проверку их селективности. Положения выносимые на защиту

I. Изменения состояния нитрергической и протеолитической систем при церебральных патологиях и их моделировании на животных отражают участие этих систем в патогенезе (в т.ч. нейродегенерации) и адаптивном ответе мозга. Регион-специфичная и постадийная модуляция продукции N0, активности N00 и цистеиновых протеаз в мозге происходит при нейродегенерации, вызванной ишемией, судорожной активностью, введением холинотоксина

AF64A, ß-амилоидного пептида, а также при стреесорных воздействия различного типа и интенсивности, сезонной нейропластичности - гибернации.

2. Степень деструктивных последствий в острый период инсульта определяется типом инсульта, участием и взаимодействием нитрергической, протеолитической и иммунной систем. Развитие нитрозативного стресса в мозге сопровождается индукцией иммунного ответа, появлением аутоантител к нитрованным белкам и изменением соотношения активаторов/ингибиторов цистеиновых протеаз в ликворе.

3. Ацидоз (в частности, при ишемии) приводит к расширению субстратной специфичности катепсина В мозга (появлению способности расщеплять субстраты каспазы-3), а метаболический стресс стимулирует секрецию катепсина В из нейронов и глии. Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на 1-м региональном конгрессе FAONS (Патайя, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), XXXIII Международном конгрессе физиологических обществ (Санкт-Петербург, 1997), 12-м съезде Европейского нейрохимического общества (Санкт-Петербург, 1998), конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), XXX Всероссийском Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), 15, 17 Съездах Европейского нейрохимического общества «Достижения в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Варшава, 2003; Саламанка, 2007), XIX-XXI Съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Екатеринбург, 2004; Москва, 2007; Калуга, 2010), I Съезде РНО «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), 20 Съезде Международного нейрохимического общества (Инсбрук, 2005), 6 и 7 Европейских Форумах по нейронаукам (Женева, 2008; Амстердам, 2010) и апробированы на межлабораторной конференции ИВНДиНФ РАН. Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор данных литератры, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (6) и иностранных (729) языках. Диссертация изложена на 262 страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 42 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовано 163 самцов-крыс линии Вистар, 21 беспородных самцов, 105 взрослых сусликов Citellus undulatus обоего пола, 24 двухдневных домашних цыплят Gallus Gallus Domesticus.

Модели ишемического воздействия

Глобальную ишемию мозга создавали системной остановкой кровообращения внутриторакальным пережатием сосудистого пучка сердца крысы (Корпачев и соавт., 1982) (модель постреанимационной патологии). Фокальную ишемию мозга (модель ишемического инсульта) создавали с использованием интралюминального введения филамента и окклюзии левой средней мозговой артерии (ОЛСМА) по методу, описанному Zea Longa и соавт. (1989). Диссоциированные клетки-зерна мозжечка 7-дневных крысят линии Wistar подвергали ишемическому воздействию - кислородно-глюкозной депривации (КГД), для чего их переносили из питательной среды в деоксигенированный безглюкозный солевой раствор на 1,52 ч (Хаспеков и соавт., 2000). Поперечные срезы гиппокампа 7-9-дневных крыс через 14-16 дней культивирования переносили из питательной среды в деоксигенированный безглюкозный солевой раствор на 30-40 мин (Хаспеков и соавт., 2003). Клинический материал

СМЖ от 24 больных через 22-24 ч после 2-х типов инсультов, а также от 10 больных без каких-либо церебральных патологий (контрольная группа). Модель судорожной активности

После однократного введения PTZ в дозе 85 мг/кг внутрибрюшинно животных разделяли на 2-е группы - проявивших клонические или тонические судороги (Racine, 1972) и декапитировали через 20 мин. Группа киндлинг ежедневно в течение 31-го дня получала инъекцию PTZ в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно и через два дня после последней инъекции крыс декапитировали. Модели болезни Альцгеймера

Для моделирования болезни Альцгеймера использовали два вида нейротоксинов -холинотоксин этилхолин азиридиний (AF64A) и ß-амилоидный пептид (фрагмент ßA(25-35)). Крысам-самцам линии Вистар стереотаксически билатерально вводили в желудочки мозга AF64A (3 нмоль), растворенный в искусственной спинномозговой жидкости (Chrobak et al., 1988), или ßA(25-35) (15 нмоль), растворенный в воде (Maurice et al., 1996), или соответствующий объем растворителя. Модели стрессорных воздействий

1. Раннюю социальную изоляцию у двухдневных цыплят создавали при помощи следующих вариантов:

хроническая полная изоляция осуществлялась в условиях, исключающих какие-либо конспецифические акустические, визуальные или социальные контакты, в течение 2-х постнатальных дней;

хроническая частичная изоляция, при которой сохранены только акустические и обонятельные контакты, но не зрительные и социальные, проводилась в течение 2-х постнатальных дней;

острая частичная изоляция осуществлялась на 2-ой день после рождения в течение 1,5 ч с сохранением зрительных и акустических контактов, но без социальных взаимодействий. В качестве контрольной группы использовали цыплят, выращенных в социальной колонии, состоявшей из 4-6 животных.

2. Раннюю социальную изоляцию создавали, рассаживая 21 -дневных крыс-самцов линии Вистар в пластмассовые непрозрачные клетки. По истечении 6 недель часть животных снова возвращали в группы и содержали в течение 10 нед.

3. Хронический эмоционально-болевой стресс (модель экспериментального невроза). Для этого крыс в течение 14 дней ежедневно на 4-5 ч помещали в специальную установку с индивидуальными ячейками и подвергали действию прерывистого «белого» шума громкостью 65-70 дБ в сочетании с раздражением лап электрическим током силой 1-1,5 мА), который служил неизбегаемым подкреплением условного сигнала - вспышек света. Гибернационный цикл

В работе использовали взрослых сусликов Citellus undulatus обоего пола массой 280-400 г (п=105, животные любезно предоставлены Т.П. Семеновой, ИБК РАН, Пущино). Опыты проведены на 5 группах сусликов, взятых в разные фазы гибернационного цикла: группа 1 - в фазе максимальной активности (середина июня); группа 2 - перед вхождением в спячку (начало сентября); группа 3 - в фазе спячки (в конце ноября); группа 4 - между баутами; группа 5 -после пробуждения (в начале апреля).

Биохимические и молекулярно-биологические методы исследования

Для проведения биохимических исследований экспериментальных животных декапитировали в разные сроки после воздействий или ведения веществ. Подготовку ткани мозга к биохимическому анализу проводили, как описано в работе (Gulyaeva et al., 1996). СМЖ у крыс получали из цереброспинальной цистерны (cisterna magna). Активность NOC определяли ЭПР-спектроскопическим методом, основанным на известной реакции NO с диэтилдитиокарбаматом и двухвалентным железом, в результате которой образуется парамагнитный мононитрозильный комплекс, регистрируемый методом ЭПР-спектроскопии (Gulyaeva et al., 1996) и радиометрическим методом, по скорости образования L-цитруллина из радиоактивно меченного L-аргинина в реакции, катализируемой NOC (Bred, Snyder, 1989). Концентрацию стабильных метаболитов NO нитратов и нитритов (NOx") определяли по интенсивности флюоресценции 2,3-диаминонафтотриазола, продукта реакции 2,3-диаминонафталина и нитрита в кислой среде (Misko et al., 1993) с модификациями (Lei et al., 1999). Активность протеолитических ферментов определяли флюориметрическим методом по

скорости расщепления специфических флюорогенных пептидных субстратов в пробе, содержащей и не содержащей специфический ингибитор. В качестве субстрата каспазы-3 использован Ac-DEVD-AMC, калпаина - Ac-LY-AMC и катепсина - Z-RR-AMC. Влияние СМЖ на активность цистеиновых протеаз определяли с помощью активной рекомбинантной человеческой каспазы-3, активного очищенного человеческого калпаина-1 и активного очищенного бычьего катепсина В. Общую окислительную активность СМЖ определяли с помощью DMPD (Ы,Ы-диметил-р-фенилендиамина), который окисляется алкоксильным и пероксильным радикалом до окрашенного катиона DMPD+ (Verde V., 2002). Определение продуктов свободнорадикального окисления, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБКРП) (базальный уровень и накопление в результате индукции (Fe2+/acKop6aTOM) проводили по методам, предложенным Ohkawa et al., (1972) и Каганом и соавт. (1979). Для оценки потенциальной способности ткани мозга к генерации активных форм кислорода (ГАФК) использовали показатели индуцированной перекисью водорода люминол-зависимой хемилюминесценции (Gulyaeva et al., 1995). Определение белковых и небелковых SH-групп в гомогенатах мозга проводили по классическому методу с использованием дитионитробензойной кислоты (Sedlak and Lindsay., 1968). Выявление уровня Ig в СМЖ больных и мозге и СМЖ крыс, а также связывание нитрованного бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Cayman, USA) производили методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител против Ig человека или крысы и моноклональных антител против нитрованного БСА (Cayman, США). Вестерн-блот анализ осуществляли по стандартному протоколу для денатурирующих условий, а детекцию катепсина В на мембране PVDF проводили с использованием поликлональных антител к катепсину В (FL-339, Santa-Cruz Biotechnology, США). Связывание вторичных антител выявляли с использованием хемилюминесцентной системы ECL (Amersham International, Великобритания). Количественное определение белка проводили по методу Bradford (1976). Гистологические методы исследования

Оценку развития патологических изменений в мозге крыс проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозин-флоксином (Н&Е). Для выявления апоптоза в мозге животных был использован иммуногистохимический подход, основанный на детекции З'ОН-концов ДНК, образующихся при ее фрагментации, с помощью метода TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labeling). Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга крыс на изоформы NOC проводили с использованием поликлональных антител против hNOC (Chemicon, США) или поликлональных антител против uNOC (Chemicon, США). Детекцию иммуноглобулинов в срезах мозга крыс осуществляли с помощью поликлональных антител (Имтек, Россия).

Статистическую обработку полученных в настоящей работе данных осуществляли с использованием методов, реализованных в пакете программ «Statistica for Windows». Различия

между группами определяли с использованием параметрических (t-критерий Стьюдента) или непараметрических (критерий Манна-Уитни) методов анализа. Данные в таблицах и рисунках представлены в виде mean±S.E.M.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Ряд церебральных патологий имеют общие механизмы патогенеза, например, эксайтотоксичность и окислительный стресс являются общими механизмами многих неврологических заболеваний, включая инсульт, травму мозга, инфекции в ЦНС, аутоиммунные патологии, рассеянный склероз, опухоли мозга и большинство нейродегенеративных патологий, таких как БА, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (Lipton and Rosenberg, 1994; Butterfield et al., 2007). В результате активации рецепторов глутамата индуцируется нитрергическая система и в зависимости от степени индукции может изменяться характер сопутствующих или последующих механизмов, среди которых интенсивность окислительного стресса и протеолитических реакций являются ключевыми как для повреждения и гибели клеток, так и для пластических процессов в ЦНС.

Несмотря на то, что инсульт/ишемия мозга является достаточно хорошо изученной патологией и механизмы ее патогенеза в основном известны, в рамках сформулированных задач исследования она позволяет обозначить те экспериментальные направления, которые позволяют подойти к пониманию того, насколько общими или специфическими являются эти механизмы и как они реализуются при других церебральных патологиях. Для этого были использованы такие модели, как эпилепсия (индуцированная PTZ), нейродегенеративные патологии (инъекционные модели БА), различные варианты стресса и модель сезонной пластичности (гибернационный цикл).

1. Нитрергическая система, модуляция цистеиновых протеаз и иммунный ответ в СМЖ больных после инсульта.

В острый период после инсульта в СМЖ больных определяли содержание NOx, активность NOC и активность ЛДГ (Табл. 1). Более чем в 2 раза увеличилось содержание NOx в

Таблица 1.

Активность NOC, содержание NO, и активность ЛДГ в СМЖ больных после инсульта.

Показатель Группа NOx (нмоль/мл) NOC (имп/мин) ЛДГ (нмоль НАДН/мин)

Контроль (п=10) 3,0±0,64 27,3±27,3 5,70±0,60

Ишемический тип (п=11) 7,36±1,71* 478±247* 5,38±1,05

Геморрагический тип (п=13) 2,12±0,39 2137±603** 8,96±0,13*

Примечание: *'** - достоверные отличия от контроля при р<0,05 и р<0,01.

СМЖ больных после ишемического инсульта, тогда как после геморрагического инсульта достоверных отличий от контрольных значений по этому показателю не выявлено. Наиболее

драматические изменения происходили в активности NOC в СМЖ больных, так активность фермента практически на 2-а порядка возросла при геморрагическом типе и в меньшей, но в существенной степени увеличилась почти в 20 раз в СМЖ от больных с ишемическим типом инсульта. Выход в СМЖ фермента, характеризующего гибель клеток, ЛДГ, не отличался от контрольного уровня в случае ишемического инсульта и увеличился достоверно в 1,5 раза при геморрагическом инсульте.

Нами впервые показано увеличение активности NOC в СМЖ после инсульта. Ранее Calabrese et al. (2002) выявили активность iiNOC в СМЖ больных рассеянным склерозом. По-видимому, такая активность может относиться как к секретированной uNOC из активированных астроцитов и/или микроглии, так и к другим изоформам NOC из разрушенных клеток. В пользу последнего предположения свидетельствует повышенная активность ЛДГ в СМЖ больных геморрагическим, но не ишемическим инсультом.

Общая окислительная активность СМЖ достоверно повышалась на ранних сроках после всех исследованных типов инсульта, однако в группе геморрагический инсульт она увеличилась в 2,24 раза по сравнению с контролем и была достоверно выше, чем в группе ишемический инсульт. Известно, что окислительный стресс играет важную роль в патогенезе ишемического (Chopp et al., 1996; Love, 1999) и геморрагического инсульта (Braughler and Hall, 1989). В связи с этим свободнорадикальные механизмы более выражены при внутримозговых геморрагиях, когда железо, образующееся из деградирующего гемоглобина, присутствует в ткани мозга в высоких концентрациях и повреждение клеток мозга может идти более интенсивно (Wu et al., 2003). С другой стороны, локализация и объем гематомы может влиять на уровень NO, поскольку известно, что гемоглобин обладает высоким сродством к NO и может быть его перехватчиком, снижая концентрацию метаболитов NO в мозге (Sampei et al., 2005).

Избыточная продукция NO при нитрозативном стрессе и его реакция с супероксидным анионом приводит к образованию сильного окислителя пероксинитрита, нитрующего белки и пептиды, которые могут активировать иммунную систему и продукцию иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин (Ischiropoulos, 2009). В СМЖ больных обоими типами инсультов выявлено повышенное содержание Ig G, Ig М и Ig А, причем более выраженным это увеличение наблюдалось в группе геморрагический инсульт. Связывание нитротирозин-БСА исходно присутствовало в контрольной группе, достоверно увеличилось в СМЖ после ишемического инсульта и достоверно превышало значения в группах контроль и ишемический инсульт в СМЖ больных геморрагическим инсультом (Рис. 1). Возможно, что повышение связывания нитротирозин-БСА СМЖ происходило благодаря увеличению продукции Ig и, по-видимому, свидетельствует о выработке аутоантител к нитрованным белкам, которые образовались в результате нитрозативного стресса, индуцированного инсультом.

■ 20000 о

Рис. 1. Связывание нитротирозин-БСА СМЖ больных после инсульта.

*р < 0.05; **р < 0.01; отличия от контроля, # р < 0.01; различия между группами ишемический -геморрагический инсульт.

Контроль

Ишшкческнн Геморрапмескин ннсульт инсульт

Известно, что в ликворе циркулируют вещества, секретируемые клетками ЦНС, и продукты, образовавшиеся в результате их гибели (Thompson and Freedman, 2006). Соотношение протеаз и их ингибиторов или активаторов в ликворе, по-видимому, отражает реальное состояние протеолитических систем в клетках головного мозга при развитии нейродегенеративных патологий. СМЖ пациентов из контрольной группы влиял на активность очищенных протеаз, активирует каспазу-3, ингибирует катепсин В и калпаин 1 (Рис. 2). Степень активации каспазы-3 не отличается от контрольной группы в группе ишемический инсульт, но СМЖ пациентов с геморрагическим инсультом активирует протеазу достоверно ниже контрольной группы и группы с ишемическим инсультом. Активация каспазы-3 обратно коррелирует с неврологическим дефицитом в группе геморрагический инсульт (г=-1,0, р<0,05), где он достоверно выше, чем после ишемического инсульта, тогда как в группе ишемический

D Чистый фермент Р Контроль

И Ишемический инсульт Q Геморрагический инсульт

Рис. 2. Влияние СМЖ пациентов после инсульта на активность цистеиновых протеаз. По оси ординат - активность протеаз в % от активности чистого фермента. ** -достоверные отличия от контроля при р<0.01; # - достоверные отличия между типами инсульта при р<0.05.

инсульт такая корреляция отсутствует. Способность ингибировать активность калпаина 1 достоверно ниже контрольной группы у СМЖ пациентов с обоими типами инсульта. Статистически значимое ингибирование активности катепсина В происходило при использовании СМЖ пациентов с геморрагическим инсультом, но не с ишемическим. Выявлены отрицательные корреляции между ингибированием катепсина В и активностью ЫО-синтазы (г=-0,65; р<0.05) в СМЖ пациентов с геморрагическим инсультом и между активностью ЫО-синтазы и активацией каспазы-3 (г=-0,62; р<0.05) и ингибированием калпаина (г=-0,71; р<0.05) в СМЖ пациентов с ишемическим инсультом, что, по-видимому, характеризует взаимодействие протеолитической и нитрергической систем как важное звено в механизмах постинсультной патологии.

Таким образом, снижение ингибирующей активности СМЖ по отношению к калпаину после обоих типов инсульта, повышение ингибирующего действия СМЖ на активность

каспазы-3 и катепсина В после геморрагического инсульта может свидетельствовать о дисбалансе в регуляции протеолитических систем в острый постинсультный период.

В результате исследования СМЖ больных выявлены существенные изменения в состоянии нитрергической системы, интенсивности окислительного стресса, активации/ингибировании цистеиновых протеаз и реакции иммунной системы на ранних сроках после инсульта и эти изменения зависели от типа инсульта. Полученные результаты в какой-то мере отражают патологические процессы, происходящие в ткани мозга после инсульта. Для подтверждения этого предположения были поставлены эксперименты по моделированию инсульта на экспериментальных животных.

2. Нитрергическая система, иммунный ответ и активность нейропротеаз после фокальной ишемии мозга у крыс.

В результате экспериментального инсульта в коре левого ишемического полушария крыс через 24ч происходило достоверное снижение общей активности 1ЧОС в 1,89 раза по сравнению с корой правого контрольного полушария (рис. ЗА), однако содержание ЫОх в коре левого

С **

А

Í »

* -

Контроль

Контроль

Коотроль

Рис. 3. Активность NOC(A), содержание NOx в коре больших полушарий (Б) и СМЖ крыс (С) через 24ч после фокальной ишемии мозга. *р < 0.05; **р < 0.01 - отличия от контроля.

ишемического полушария достоверно превышало таковое в контралатеральном полушарии в 1,26 раза (рис. ЗВ). Выход метаболитов N0 в СМЖ крыс через 24 ч реперфузии достоверно увеличился в 1,5 раза по сравнению с ложнооперированными животными (рис. ЗС).

В срезах мозга крыс через 24 ч после ОЛСМА, окрашенных антителами к нГЧОС, в неокортексе ипсилатерального полушария нМОС-содержащие нейроны практически полностью утрачивали отростки, а также уменьшался их размер и интенсивность окраски.

Таким образом, на ранних сроках после ОЛСМА выявлено снижение активности и, по-видимому, экспрессии ЫОС и увеличение уровня метаболитов N0 в коре ишемического полушария, а также СМЖ крыс.

В СМЖ крыс после ОЛСМА выявлено 2-х-кратное повышение содержания ^ через 24 ч реперфузии, причем антитела, при помощи которых проводили детекцию ^ реагируют со всеми классами крысы, т.е. ^ б, М и А (Рис. 4А). Связывание ликвором нитротирозин-БСА исходно присутствовало в группе ложнооперированных животных, но достоверно увеличилось в 1,53 раза в СМЖ после ОЛСМА (Рис. 4Б). Прямая корреляция между содержанием 1$ в СМЖ

и связыванием нитротирозин-БСА (г=0,80, р<0,05) свидетельствует в пользу выработки аутоантител, специфически распознающих нитрованные белки.

** Т

Контроль

150000 - Б

Контроль

Рис. 4. Содержание ^ (А) и связывание нитротирозин-БСА (Б) в СМЖ крыс через 24ч ОЛСМА. *р < 0.05; **р < 0.01; отличия от контроля.

Иммунохимическое окрашивание срезов мозга антителами к иммуноглобулинам крысы выявило присутствие этих белков в ткани мозга через 24 ч после ОЛСМА. Окраска была локализована в области ишемического очага и профили иммунохимического окрашивания практически полностью совпадали с областью повреждения, выявляемой на соседних срезах, окрашенных Н&Е. Иммунореактивность к иммуноглобулинам крысы полностью отсутствовала в контралатеральном полушарии.

Через 24 ч после ОЛСМА разные классы биомолекул подвергались окислительному стрессу в различной степени. Так интенсивность свободнорадикального окисления липидов по накоплению ТБКРП (Рис. 5А) в коре ишемического полушария была достоверно ниже по сравнению с контралатеральным полушарием, по-видимому, в связи с истощением пула неокисленных липидов на данной стадии реперфузии. Тем не менее окисление БН-групп

. . О Контроль га Ишемия

Контроль Ишемия Белковые тиолы Небелковые тиолы

Рис. 5. Уровень ТБКРП (А), белковых и небелковых тиолов (Б) в коре больших полушарий крыс через 24ч после ОЛСМА. *,** - достоверные отличия от контроля при р<0.05 и р<0.01.

белков на этой временной точке усиливалось и их содержание достоверно уменьшилось в 1,20 раза в коре ишемического полушария. Уровень неферментативных антиоксидантов, к которым относятся низкомолекулярные БН-содержащие соединения, в частности, глутатион, вне- и внутриклеточная концентрация которого в головном мозге достаточно высока, достоверно

понизился в коре ишемического полушария в 1,87 раза по сравнению с корой контрольного полушария (Рис. 5Б).

Результаты исследования активности 3-х цистеиновых протеаз свидетельствуют о достоверном снижении активности калпаина и катепсина В и отсутствии изменений в активности каспазы-3 в коре ишемического полушария через 24 ч после фокальной ишемии (Рис. 6). Показано, что каспазо-зависимый и каспазо-независимый пути апоптоза наблюдаются при ишемическом инсульте (Zhan et al., 2001; Ferrer et al, 2003; Ferrer and Planas, 2003). Растет число исследований, в которых выявлена синергичная активация калпаина и каспазы-3 (Blomgren et al., 2001; Zhang et al., 2002; Pike et al., 2004). Повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ способствует активации калпаина и его иммуногистохимической детекции на разных сроках реперфузии после фокальной ишемии мозга (Liebetrau et al., 1999; Lipton, 1999; Neumar et al, 2001). Активированный калпаин нарушает целостность

лизосомальной

Рис. 6. Активность каспазы-3, калпаина и катепсина В в коре больших полушарий крыс через 24ч после OJ1CMA. * - достоверные отличия от контроля при р<0.05.

мембраны, обеспечивая высвобождение Каспаза-3 Калпаш Катепсшг В ЛИЗОСОМЭЛЬНЫХ ПрОТеаЗ, В ТОМ ЧИСЛе И

катепсина В (Yamashima et al., 1998; Yamashima, 2004). Seyfried и соавт. (2001) продемонстрировали повышение экспрессии и активацию катепсина В в мозге крыс в течение 2-х часов реперфузии после ОСМА, а интрацеребровентрикулярное введение стефина А, ингибитора катепсина В, способствовало существенному снижению площади инфаркта. По-видимому, в нашем исследовании снижение расщепляющей активности протеаз в условиях интенсивной гибели клеток мозга и усиления окислительных процессов является отражением того этапа реперфузии, когда функциональная роль исследуемых протеаз незначительна, поскольку их активация и расщепление соответствующих субстратов состоялись на более ранних стадиях ишемии. 3. Продукция оксида азота и гибель клеток при моделировании ишемии на нейроглиальных и органотипических культурах.

В 3-х сериях экспериментов с использованием нейроглиальных культур мозжечка КГД приводила к достоверному увеличению содержания нитритов в солевом растворе в 3,6 раза во время ишемии (Рис. 7). Через 2 ч реоксигенации накопление нитритов снижалось вдвое, хотя оставалось достоверно (в 1,9 раза) выше контрольного уровня, а через 4 ч реоксигенации уже не отличалось от такового.

□ Контроль SS Ишемия

Рис. 7. Содержание нитритов в солевом растворе при ишемии и реоксигенации нейроглиальных культур мозжечка. По оси ординат - содержание нитритов в %. ** р<0.01 - достоверные отличия от соответствующего контроля; # - достоверные отличия от группы ишемия 120 мин ( р<0.01); а -достоверные отличия от группы реоксигенация 120 мин (р<0.01).

При микроскопии живых культур сразу после ишемического воздействия наблюдалось резкое набухание клеток-зерен мозжечка. В дальнейшем в большинстве нейронов нарастали выраженные деструктивные изменения, которые к концу 4-го часа реоксигенации становились необратимыми, о чем свидетельствовали пикноз ядер, лизис цитоплазмы и дезинтеграция отростков. Развитие морфологических изменений происходило на фоне высокой концентрации нитритов в солевом растворе и может свидетельствовать о значительном вкладе NO в постишемическое повреждение нейронов, подтверждая нейротоксическую роль N0 при ишемии (Dawson, Dawson, 1996).В тоже время контрольные культуры в течение всего периода эксперимента (6 ч) оставались интактными. К концу периода реоксигенации концентрация нитритов снижалась до контрольного уровня, что, по-видимому, обусловлено нормализацией уровня кальция в клетках и/или нарушением синтеза N0 в связи с необратимой деструкцией клеток, сопровождающейся деградацией ферментных систем внутриклеточного метаболизма, в том числе и N0C.

В результате ишемии эксплантатов гиппокампа происходило достоверное снижение накопления нитритов в солевом растворе на 33% (Рис. 8). В дальнейшем через 30 мин реоксигенации продукция нитритов достоверно возрастала на 20% и снижалась до контрольных

значений через 5 и 20 ч реоксигенации.

Рис. 8. Содержание нитритов в солевом растворе при ишемии и реоксигенации эксплантатов гиппокампа. По оси ординат -содержание нитритов в %.*,** - достоверные отличия от соответствующего контроля при р<0.05 и р<0.01.

В эксплантатах гиппокампа как через 6 ч, так и через 24-26 ч после ишемии наблюдалась деструкция нейронов пирамидного слоя преимущественно в поле CAI, что согласуется с данными других авторов (Kirino et al., 1984; Pringle et al., 1997; Laake et al., 1999), указывавшими на подобную селективность ишемического эффекта в гиппокампе in vivo и in vitro. Подобные

450 400 350 300 -250

# **

□ контроль &КГД

150 100 -50

2ч ишемия

2 ч 4 ч

реоксигенация

морфологические изменения нейронов в поле CAI, где, по мнению некоторых исследователей, находится большая часть NOC-содержащих нейронов гиппокампа (Cho et al., 1999), а также увеличение продукции нитритов на ранних стадиях реоксигенации свидетельствуют в пользу нейротоксической функции N0. Полученные результаты свидетельствуют о снижении генерации N0 в эксплантатах гиппокампа во время ишемического воздействия и последующем усилении в ранний период реоксигенации, но не смотря на разнонаправленные изменения генерации N0 в нейроглиальных культурах мозжечка и эксплантатах гиппокампа, гибель нейронов при КГД наблюдается в обоих типах культур.

Таким образом, в зависимости от типа культуры эффект КГД проявлялся в разнонаправленных изменениях продукции NO во время ишемии и в период реоксигенации, но суммировался в гибели клеток в нейрональных культурах мозжечка и эксплантатах гиппокампа.

4. Активность синтазы оксида азота и интенсивность окислительного стресса в мозге крыс после ГИМ, введения холинотоксина и фрагмента (25-35) Р-амилоидного пептида.

Окислительные модификации белков чаще всего связаны с потерей их функциональной активности и с этой точки зрения изменение ферментативной продукции N0, который может быть как предшественником сильных окислителей, так и перехватчиком свободных радикалов, играет важную роль в механизмах повреждения мозга. В связи с тем, что активность NOC и продукция NOx изменялись при фокальной ишемии на фоне усиления окислительных процессов, а и при КГД выход метаболитов NO предшествовал гибели клеток, в дальнейших экспериментах исследовали активность NOC в условиях различной интенсивности окислительного стресса в мозге.

Активность NOC и ГАФК определяли в мозге беспородных крыс через 1 ч и 15-20 дней после ГИМ, которую создавали 15-минутной остановкой системного кровообращения.

14012» Ив ® 80 6« 4» ! 20

1ч 15 дней

ВМКВГАФК

Б

1ч 15 дней

ВШСНГАФК

14« -120 100

Я-40 200 -

15 дней

Рис. 9. Активность N00 и ГАФК в отделах мозга крыс после ГИМ. По оси ординат -активность N00 и ГАФК в %. А - кора больших полушарий; Б - мозжечок; С - подкорковые структуры. * , ** - достоверные отличия от соответствующего контроля при р<0.05 и р<0.01; # - отличия от контроля при р<0.1.

Как показано на рис. 9, достоверное повышение ГАФК наблюдалось во всех исследованных отделах мозга крыс через 1 час после реанимации, в то время как активность NOC в это время снижалась достоверно в мозжечке и подкорковых структурах и в виде тенденции в коре больших полушарий. Через 15-20 дней после реанимации ГАФК оставалась высокой в коре больших полушарий и подкорковых структурах и достоверно повысилась на 37% в мозжечке по сравнению с контрольной группой, а активность NOC была достоверно ниже контрольных значений в коре больших полушарий и подкорковых структурах.

Важно отметить, что отрицательные корреляции между активностью NOC и ГАФК были обнаружены во всех исследованных отделах мозга, но статистически значимыми они были в коре больших полушарий контрольной группы (г=-0,93, р<0,01), в коре больших полушарий через 1 час после реанимации (г=-0,97, р<0,01), в мозжечке (г=-0,93, р<0,05) и в коре больших полушарий через 15-20 дней после реанимации (г=-0,94, р<0,01).

Этилхолин азиридиний (AF64A), токсический аналог холина, разрушает систему активного транспорта холина и вызывает продолжительную холинергическую гипофункцию (Hortnagl et al., 1989). Интрацеребровентрикулярное введение AF64A крысам специфически снижает активность холинацетилтрансферазы в гиппокампе, не влияет на уровни дофамина, серотонина, норадреналина и их метаболитов в структурах мозга, существенно снижает число холинергических нейронов в медиальном септуме (Chrobak et al., 1988; Lorens et al., 1991; Walsh and Opello, 1994).

Через два дня после введения холинотоксина активность NOC практически не отличалась от контроля, но через 3 и 4 дня после введения холинотоксина она достоверно понизилась в сравнении на 48 и 42% соответственно, тогда как к 7-му дню не отличалась от

контрольного уровня (Рис. 10).

Рис. 10. Влияние AF64A на активность NOC в гиппокампе крыс. По оси ординат - активность NOC в % от значений соответствующей контрольной группы. * - р<0.05, достоверность различий между группами AF64A и контроль.

Снижение активности фермента совпадало по времени с развитием окислительного стресса (по показателям ТБКРП) (Рис. 11) и максимальным, необратимым снижением активности холинацетилтрансферазы в гиппокампе (Walsh and Opello, 1994). Тем не менее, временный характер снижения активности NOC может свидетельствовать о том, что снижение активности фермента не связано с потерей холинергических нейронов. По-видимому, септо-гипокампальная дегенерация, вызванная

холинотоксином АР64А, опосредована окислительным стрессом и может быть связана с подавлением синтеза N0 в нейронах вероятно из-за того, что активность нейрональной N00

дни после операции ;пш после операции

Рис. 11. Влияние AF64A на базальный (А) и индуцированный железом/аскорбатом (Б) уровни ТБКРП в гиппокампе крыс. По оси ординат - уровень ТБКРП в % от величин соответствующего контроля. *, ** - достоверные отличия от контроля при р<0.05 и р<0.01.

in vivo чувствительна к окислительному стрессу. Для того чтобы проверить гипотезу о возможности ингибирования активности NOC в мозге в условиях окислительного стресса была проведена специальная серия экспериментов, в которой образцы гомогенатов мозга крыс инкубировали в присутствии сильных окислителей in vitro. Инкубация образцов мозга с перекисью водорода и гипохлоридом натрия приводила к дозозависимому снижению активности NOC, происходившему параллельно с усилением ГАФК. Снижение активности NOC до 40-45% от контрольного уровня наблюдалось при концентрации пероксида 20 мМ и гипохлорита 0,38 мМ.

Таким образом, активность NOC в мозге чувствительна к избытку окисляющих агентов. Сравнение результатов, полученных in vivo и in vitro, позволяет предполагать, что ингибирование NOC при глобальной ишемии мозга и под действием AF64A может быть следствием вызываемого этими воздействиями окислительного стресса в ткани мозга.

Известно, что N0 может играть роль в формировании отложений А(3 и парных спиральных филаментов - основных маркеров болезни Альцгеймера (БА). N0 активирует белок p2iras (Lander et al., 1995; Yun et al., 1998; Luth et al., 2000), что ведет к формированию депозитов АР и нейрофибриллярных клубков в мозге больных БА. Инъекция А(3(25-35) в базальные ядра мозга крыс вызывала активацию NOC в коре, через 1 неделю после введения (O'Mahony, 1998). Такой эффект был опосредован NMDA рецепторами, поскольку хроническая аппликация ифенпродила блокировала NMDA рецепторы, эффективно восстанавливая активность NOC и предотвращая нейротоксичность АР(25-35). Под влиянием Ар и увеличения внутриклеточного содержания Са2+ образуется избыток NO, что ведет к усилению окислительного стресса и повреждению клеток. Введение Ар(25-35) вызывало в гиппокампе кратковременное достоверное снижение активности NOC на 1 -ый день на 40% по сравнению с

контрольной группой (р<0.05) (Рис. 12А). Активность NOC в гиппокампе постпенно восстанавливалась до уровня контрольной группы, а через 30 дней после операции увеличивалась на 43% по отношению к уровню контрольных животных, однако это увеличение

Дни после операции

3 5

Дни после операции

Рис. 12. Влияние интрацеребровентрикулярного введения А|3(25-35) на активность N00 в гиппокампе (А) и неокортексе (Б). Данные выражены как % от уровня активности N00 у интактных крыс. * - р<0.05 по сравнению с контрольной группой, получавшей инъекцию воды.

не было достоверным. В новой коре существенное снижение активности N00 наблюдалось на 3-й день после введения пептида Ар(25-35) (на 38% посравнению с контролем; р<0.03) (Рис. 12Б). На 5-й день после введения Ар(25-35) в этом отделе мозга было обнаружено достоверное увеличение активности N00 на 66% по сравнению с контролем.

■ Контроль а Aß(25-35)

Т

гаи

3 5

Дни после операции

3 5

Дни после операции

Рис. 13. Влияние интрацеребровентрикулярного введения А|3(25-35) на уровни ТБКРП в гиппокампе (А) и неокортексе (Б). Данные выражены как % от уровня ТБКРП у интактных крыс. * - р<0.05 по сравнению с контрольной группой, получавшей инъекцию воды.

Введение 15 нмоль агрегированного А(5(25-35) в боковые желудочки мозга крыс вызывало накопление ТБКРП в церебральных структурах. Увеличение содержания ТБКРП было отмечено в гиппокампе крыс, получавших А|3(25-35), начиная с 3 дня после введения. Уровни ТБКРП оставались в среднем на 35-37% выше, чем в группе контрольных крыс на всех исследованных сроках (рис. 13А). В новой коре накопление ТБКРП начиналось с 5-го дня после операции и достигало максимального уровня к 30-му дню (рис. 13Б).

Следует отметить, что уменьшение активности N00 в течение первых дней после операции в неокортексе и гиппокампе предшествовало накоплению ТБКРП на 5 и 3 дни

соответственно, но не совпадало с их накоплением. Более того, снижение активности NOC в гиппокампе на 1 день после операции сопровождалось не усилением радикалообразования, а напротив снижением ГАФК. Таким образом, снижение активности NOC не всегда связано с усилением окислительного стресса и, по-видимому, зависит от его интенсивности. 5. Исследование соотношения активности NOC и каспазы-3 при эпилепсии.

На ранних сроках после инсульта выявлены корреляции между модулирующим действием СМЖ на протеазы и активностью NOC. Отрицательные корреляции обнаружены между ингибированием катепсина В и активностью NOC (г=-0,65; р<0.05) в СМЖ пациентов с геморрагическим инсультом и между активностью NOC и активацией каспазы-3 (г=-0,62; р<0.05) и ингибированием калпаина (г=-0,71; р<0.05) в СМЖ пациентов с ишемическим инсультом. На модели фокальной ишемии получены положительные корреляции между уровнем NOx в ишемическом полушарии и активностью каспазы-3 (г=0,72; р<0.05) и калпаина (г=0,72; р<0.05) в ишемическом полушарии у крыс. При КГД нейрональных и органотипических культур изменения в продукции N0 предшествовали деструкции и гибели клеток. Таким образом, взаимодействие нитрергической и протеолитической систем является важным звеном в развитии постинсультной патологии и, возможно, в других патологиях мозга, у которых есть общие с инсультом патогенетические механизмы.

PTZ является селективным блокатором хлорного канала ГАМКд рецептора, что приводит к гиперполяризации нейрона и при отсутствии постсинаптического торможения к судорогам (Olsen, 1981). При остром введении PTZ, а также при киндлинге происходят нарушения, в определенной степени аналогичные таковым при эпилепсии височной доли у человека (McNamara, 1985). Известно, что развитию киндлинга способствует, как увеличение нейротрансмиссии опосредуемой NMDA рецепторами, так и снижение эффективности ГАМК-эргической передачи (Corda et al., 1992). На этой модели эпилепсии неоднозначное действие оказывают ингибиторы NOC, с одной стороны, неселективный ингибитор NOC L-NAME оказывает антиэпилептическое действие, указывая на проконвульсивные эффекты NO (Osonoe et al., 1994; Jelenkovic et al., 2002), с другой стороны, специфический ингибитор hNOC 7-нитроиндазол блокирует образование NOx, но не снижает интенсивность судорог при однократном введении PTZ, однако блокирует развитие киндлинга (Han et al., 2000). Участие каспазы-3 в повреждении нейронов при судорогах, индуцированных PTZ, описано в пренатальных культурах гиппокампа и крысином мозге (Naseer et al., 2009; Naseer et al., 2011).

Активность NOC и активность каспазы-3 определяли в отделах мозга крыс линии Вистар при моделировании судорожной активности с помощью инъекции PTZ. В коре больших полушарий активность NOC изменилась только в группе киндлированных животных, но не в группах «острый PTZ» и была достоверно выше, чем в контрольной группе крыс. Также

активность N00 в гиппокампе киндлированных животных была выше, чем в группах животных с тоническими и клоническими судорогами. (Табл. 2, 3).

Таблица 2.

Влияние РТ2 на активность N00 (пмоль Ь-цитруллина/мин/мг белка) в отделах мозга крыс.

Отдел мозга

Группа

Кора больших полушарий

Гиппокамп

Мозжечок

Контроль, п=7

38,2±5,0

45,9±9,3

175,8±19,5

Острый PTZ (клонус) п=

41,1±6,4

45,1±4,б

172,7±15,3

Острый PTZ (тонус) n=l 1

40,2±8,9

43,8*7,4 50,8±5,9Х'#

181,0±16,2

Киндлинг, п=8

47,8±8,7*

183,6±14,б

Примечания: * - достоверные отличия от контрольной группы при р<0,05; * - от группы тонус при р<0,05;#-тенденция к отличию от группы клонус прир<0,1.

Таблица 3.

Отдел мозга Кора больших Гиппокамп Мозжечок

Группа полушарий

Контроль, п=7 29,9±7,2 43,1±4,7 29,4±3,5

Острый РТг(клонус) п=8 28,9±7,0 44,4±9,4 31,3±4,0

Острый РТг (тонус) п=11 32,9±9,3 43,2±5,9 29,7±6,0

Киндлинг, п=8 31,3±4,3 40,8±6,1 31,2±5,6

Активность каспазы-3 не изменялась существенно во время острого и хронического введения PTZ. В контрольной группе была обнаружена прямая корреляция активностей NOC и каспазы-3 в гиппокампе (г=0,94, р<0,005), которая исчезала при остром введении PTZ и сохранялась при хроническом введении PTZ (киндлинг) (г=0,93, р<0,005).

Однократная инъекция PTZ в высокой дозе приводит к «разобщению» активностей NOC и каспазы-3, при этом степень выраженности эффекта PTZ по судорожной активности (тонус или клонус) роли не играют. Хроническое введение PTZ, напротив, не изменяет корреляционных отношений, характерных для нормального мозга. По-видимому, киндлирование не вносит изменений во взаимосвязь NO и каспазы-3 за счет использования подпороговой дозы PTZ. С другой стороны, восстановление связей может быть свидетельством адаптации мозга к действию PTZ после хронического введения меньшей дозы препарата. 6. Влияние различных типов стресса на состояние нитрергической и протеолитической систем мозга.

Механизмы развития ишемического повреждения мозга и реакции на стресс имеют много общих звеньев, среди которых эксайтотокснчность глутамата является важным элементом в модулировании нитрергической и протеолитической систем in vivo. Метаболическое стрессирование культур клеток мозга влияет ни только на их выживание, но и на продукцию различных белков во внеклеточное пространство. 6.1. Стресс ранней социальной изоляции.

Для анализа вовлеченности системы оксида азота в эмоциональный стресс, особенно в период раннего онтогенеза, мы использовали модель социальной изоляции двухдневных домашних цыплят (Gallus Gallus Domesticus) (Nelson and Panksepp, 1998).

По соотношению активности NOC между отделами мозга максимальный уровень активности фермента наблюдался в мозжечке цыплят из всех исследованных групп, и он оказался самым чувствительным к различной степени социальной изоляции (Рис. 14). По сравнению с контрольной группой из всех видов изоляции только хроническая частичная изоляция приводила к максимальной активации NOC. В этой группе достоверное повышение активности NOC зафиксировано во всех исследованных областях мозга цыплят. В мозжечке и подкорковых структурах возрастание активности NOC достоверно преобладало в группе хроническая частичная изоляция по сравнению с хронической полной изоляцией. Активность NOC была статистически выше в мозжечке цыплят после острой частичной изоляции по сравнению с хронической полной изоляцией и контролем, а в подкорковых структурах и левом и правом отделах переднего мозга этой группы различий не обнаружено. Хроническая полная изоляция не индуцировала статистически значимых изменений в активности NOC во всех исследованных отделах мозга по сравнению с контрольной группой.

Рис. 14. Влияние ранней социальной изоляции на активность NOC в отделах мозга цыплят Gallus Gallus Domesticus. По оси ординат - активность NOC в пмоль L-цитрулдина/мин/мг белка. * - достоверные различия между группами при р<0.05.

В различных отделах мозга повышение активности NOC в ответ на изоляционный стресс происходило в различной степени и зависело от интенсивности стрессорного воздействия. Эмоциональный стресс вероятно был более интенсивным при хронической частичной изоляции, когда аккустические контакты между цыплятами были возможны, но физическое взаимодействие было недоступно. Только в этой группе существенное повышение активности NOC происходило во всех отделах мозга. Хроническая полная изоляция, по-видимому, не индуцировала выраженный эмоциональный стресс, поскольку цыплята рождались в условиях, исключающих какое-либо взаимодействие со своими соседями, и пребывание в этих условиях не сопровождалось значимым изменением активности NOC в исследованных отделах мозга. Из 3-х вариантов изоляции цыплят хроническая частичная изоляция вызвала существенное увеличение активности NOC во всех исследованных структурах мозга. Мозжечок цыплят оказался реактивной структурой, в которой

□ Контроль

В Острая частичная изоляция

■ Хроническая полная изоляция 0 Хроническая частичная изоляция

Левая часть Правая часть Мозжечок Подкорковые переднего переднего структуры

мозга мозга

повышение активности NOC происходило как после хронической частичной, так и после острой частичной изоляции, что, по-видимому, связано с выявленными раннее морфологическими изменениями в мозжечке в ответ на изменения в социальном и физическом окружении (Floeter and Greenough, 1979).

Ранней социальной изоляции подвергали крыс-самцов в возрасте 21 день и на разных сроках после окончания изоляции оценивали уровень тревожности животных и определяли общую активность NOC в отделах мозга животных (Рис. 15). Изоляция крыс в течение 6 нед вызывала существенное возрастание уровня тревожности животных по сравнению с

□ Контроль И Изоляция 80 с п Контроль И Изоляция

Неокортекс Гилпокамп Стриат>л| Мозжечок Нсокортекс Гипнокамп Стриагум Мозжечок

Рис. 15. Влияние социальной изоляции на активность NOC в отделах мозга крыс сразу (А) и через 10 нед после окончания изоляции (Б). По оси ординат - активность NOC в пмоль L-цитруллина/мин/мг белка. * - достоверные отличия от контроля при р<0.05.

поведением неизолированных сверстников. Так уровень тревожности крыс, содержавшихся в условиях группы (п = 4) составлял 5,5±1,0 баллов, тогда как у изолированных животных (п = 6) - 11,3±1,1 балла (р<0,03). Через 10 мес после возвращения крыс в нормальные условия тревожность изолированных животных сохранялась на более высоком уровне (11,9±1,5 балла; п = 9), но отличалась от контрольной группы (8,8±0,7 балла; п = 9) на уровне тенденции (р=0,09).

Хроническая частичная изоляция индуцировала активность NOC в гиппокампе, где она достоверно возросла на 56% у изолированных животных сразу после изоляции по сравнению с контрольной группой и сохранялась на достоверно высоком уровне (161%) даже через 10 недель пребывания крыс в группе. Аналогичный эффект наблюдали и в коре больших полушарий, где активность NOC у крыс опытной группы была на 105% достоверно выше, чем у контрольных животных. В то же время в двух других исследованных структурах мозга -стриатуме и мозжечке - существенных изменений активности NOC не наблюдалось.

Сведения о роли NO в возникновении тревожности достаточно противоречивы. Интрагиппокампальное введение неселективных ингибиторов NOC №-нитро-Т-аргинина метилового эфира (LNAME) and №-нитро-Ь-аргинина (LNOARG) оказывает анксиогенный эффект (Monzon et al., 2001; Roohbakhsh et al., 2007), однако в других исследованиях ингибиторы NOC подавляли тревожность (Volke et al. 1997; Dunn et al. 1998; Yildiz et al. 2000). В основе указанных нарушений поведения лежат изменения в системах нейротрансмиттеров и

модулирующих эффектах NO на их высвобождение. Перфузия гиппокампа раствором NMDA, стимулирующего образование N0, приводила к существенному снижению уровня серотонина и дофамина (Whitton et al„ 1994; Тао and Auerbach, 1996), участвующих в механизмах тревожности (Wrighte et а!., 1990; Chiavegatto et al., 2001).

Таким образом, полученные результаты по влиянию стресса социальной изоляции на активность N00 в структурах мозга 2-х видов животных, цыплят и крыс, свидетельствуют о повышении активности NOC в регионах мозга, чувствительных к стрессу у этих видов животных, и оно зависит от длительности и интенсивности стрессорного воздействия. 6.2. Хронический эмоционально-болевой стресс.

Хронический эмоционально-болевой стресс (модель экспериментального невроза) приводил к достоверному повышению уровня метаболитов N0 в коре больших полушарий на 18% и гиппокампе на 63% по сравнению с контрольной группой (Рис. 16А). Общая активность

' □ контроль G стресс

Я 80

ti 7(1

60

£ 50

40

.10

с 20

10

Кора больших Гнппокамп полушарий

Кора больших Гиппокамп полушарий

Рис. 16. Влияние хронического стресса на содержание №)х (А) и активность N00 (Б) в отделах мозга крыс. Примечания: *р<0,05; **р<0,01 - достоверные отличия от контрольной группы.

N00 понизилась достоверно почти на 25% только в коре больших полушарий, в гиппокампе подобное снижение не было статистически значимым, а в мозжечке активность N0C практически не отличалась от контроля (Рис. 16Б).

Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга на наличие hNOC у невротизированных животных, не выявило присутствие этой изоформы NOC в коре мозга и гиппокампе. Более того, в коре мозга и гиппокампе невротизированных животных выявлено достоверное снижение числа hNOC-позитивиых клеток (рис. 17А). В связи с этим снижение активности NOC в исследованных отделах мозга, по-видимому, связано с уменьшением числа HNOC-содержащих нейронов. Более того, в поле CAI гиппокампа отмечено достоверное снижение общего числа нейронов и увеличение числа нейронов с патологическими изменениями (Рис. 17Б). Снижение общей активности NOC в этих структурах после эмоционально-болевого стресса может быть обусловлено эффектами глюкокортикоидов, которые, как было показано раннее, подавляют экспрессию hNOC в отделах мозга крыс (Weber et al., 1994; Lopez-Figueroa et al., 1998; Reagan et al., 1999) и клеточных культурах (Schwarz et al.,

1998). Уменьшение количества н>ЮС-позитивных клеток в коре мозга и гиппокампе согласуется со снижением общей активности N00. Тем не менее, повышенное содержание

О Контроль Ш Стресс

25 1

__W

Ji

XTDbl

Корд больших полушарии гиппокампа гиппокампа cai саз

Рис. 17. Влияние хронического стресса на число hNOC-позитивиых нейронов в отделах мозга крыс (А) и на плотность клеток в поле CAI гиппокампа (Б). А. По оси ординат - число hNOC-позитивных клеток на площади 1 мм2. Б. По оси ординат - число клеток на площади 0,01 мм2. По оси абсцисс: 1 - общее число нейронов; 2 - число нейронов с патологическими изменениями; 3 - общая плотность глиальных клеток. *,** - достоверные отличия от контроля при р<0.05 и р<0.01.

метаболитов оксида азота в коре мозга и гиппокампе свидетельствует об усилении биосинтеза NO на ранних стадиях стресса и/или нарушении его метаболизма.

Активность каспазы-3 после стресса достоверно понизилась в коре больших полушарий и гиппокампе на 17% и 15% соответственно (Рис. 18А). Активность калпаина практически не отличалась от контрольных значений в коре больших полушарий и мозжечке, но достоверно понизилась на 26% после стресса в гиппокампе (Рис. 18Б). Активность катепсина В после невротизации возросла в гиппокампе и мозжечке на уровне тенденции, а в коре мозга была достоверно выше контроля на 50% (Рис. 18В).

□ контроль S стресс

□ контроль 0 стресс

□ контроль В стресс

Корабольшх Гнплоками Мозжечок полушарий

Кора большой; Гшпкжачл полушарии

Кораболышп Гнлпокамп Мозжечок полушарий

Рис. 18. Влияние хронического стресса на активность каспазы-3 (А), калпаина (Б) и катепсина В (В) в отделах мозга крыс. Примечания: *р<0,05; **р<0,01 - достоверные отличия от контрольной группы, # - тенденция к отличию от контроля при р<0,1.

Причиной функциональных нарушений в ЦНС в результате хронического стресса может быть гибель нейронов или их значительные структурные изменения. Так, атрофия гиппокампа

обнаружена у людей при заболеваниях, связанных с повторяющейся депрессией, и при посттравматическом стресс-синдроме (McEwen et ab, 1997). Повреждение и гибель пирамидных нейронов гиппокампа были обнаружены и при сильном продолжительном экспериментальном стрессорном воздействии или хроническом введении кортикостерона у крыс и обезьян (Mizoguchi et al., 1992; Arbel et al., 1994). Однако в представленном эксперименте хронический стресс не только не вызывал какого-либо заметного увеличения, но приводил к достоверному снижению активности каспазы-3 в коре больших полушарий и гиппокампе. По-видимому, обнаруженные изменения в активности каспазы-3 в отделах мозга крыс после невротизации имеют, скорее, отношение к изменению структуры и функции клеток нервной системы у невротизированных животных, для которых характерно снижение способности к адаптивным, нейропластическим изменениям, чем к клеточной гибели как таковой. Более того, иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга не выявило апоптотической гибели клеток в неокортексе и гиппокампе после хронического стресса. Однако в результате гистологического анализа были зафиксированы два вида изменений нейронов: классические гипоксические и отечные, причем гипоксические нейроны с перицеллюлярными отеками встречались во всех полях гиппокампа и в неокортексе. Вероятно, активация катепсина В в этих структурах предполагает участие лизосомальных протеаз в вышеперечисленных морфологических и иммуногистохимических изменениях в мозге после хронического стресса. Тем более что в немногочисленных исследованиях показано, что структурно-функциональные изменения лизосомального аппарата вовлечены в адаптивные метаболические изменения и модификацию клеточных ультраструктур в головном мозге в ответ на хронический стресс (Chemaya et al., 1999).

Таким образом, хронический эмоционально-болевой стресс приводит к таким изменениям в нитрергической системе, как дисбаланс в ферментативной продукции N0 и образовании его метаболитов, уменьшение числа hNOC-позитивиых нейронов, которые похожи на последствия ишемии мозга. Снижение общего числа нейронов и увеличение количества нейронов с патологическими изменениями свидетельствуют о гибели клеток и усилении деструктивных процессов, не связанных с апоптозом, но сопровождающихся активацией лизосомальной протеазы катепсина В.

6.3. Метаболический стресс и секреция катепсина В первичными культурами мозжечка крысы.

Депривацию сыворотки рассматривают как метаболическое стрессирование клеток, которое моделирует условия, возникающие при нарушении мозгового кровотока при ишемии/реоксигенации (Boriongan et al., 2000), и широко используют для исследования механизмов гибели клеток, защитного действия лекарственных препаратов, а также для исследования физиологических функции клеток, в том числе и секреторной функции. Показано,

что в условиях депривации сыворотки астроциты типпокампа увеличивают секрецию белка S 100В по сравнению с условиями культуральной среды (Gonialves et al., 2002). Активированные клетки микроглии могут секретировать катепсин В, оптимум расщепляющей активности которого находится при кислых значениях рН (Ryan et al., 1995; Kingham and Pocock, 2001). Однако неизвестно обладают ли способностью секретировать катепсин В астроциты и нейроны. Тем более, что секреторные везикулы нейронов содержат катепсины В и L, которые принимают участие в процессинге нейропептидов и (3-амилоида (Hook, 2006).

В первичных нейроглиальных и глиальных культурах мозжечка крыс культуральную среду заменяли солевым раствором, в котором определяли расщепляющую активность по отношению к синтетическим субстратам каспазы-3 и катепсина В при разных значениях рН. Динамика Ac-DEVD-расщепляющей активности при разных значениях рН была исследована при инкубации нейроглиальных и глиальных культур в солевом растворе (Рис. 19.) Расщепление Ac-DEVD-AMC при рН 7,4 солевым раствором от нейроглиальных культур

1 3,0 ] | | 2,5 -

^ И20

1 I 1,0 "

I 0,5 " 0,0 * ' '

О 5 10

Время, ч

Рис. 19. Ас-ОЕ\Т)-расщепляющая активность в солевом растворе от нейроглиальных (А) и глиальных (Б) культур при рН 7,4 (кривая 1), при рН 4,5 (кривая 2) и активность лактатдегидрогеназы (кривая 3).

увеличивалось с длительностью инкубации монослоя клеток (Рис. 19А(1)). При рН 4,5 расщепление субстрата проходило более интенсивно и осуществлялось практически с одинаковой скоростью начиная с 1ч инкубации культур в солевом растворе (Рис. 19А(2)). При этом гибель клеток, которая характеризовалась выходом лактатдегидрогеназы в солевой раствор, в интервале 0,5ч - 5ч была в пределах 2% от потенциально возможной при лизисе клеток 1% нонидетом и усиливалась к 10ч инкубации (Рис. 19А(3)). Интенсивность расщепления Ас-ОЕУБ-АМС при рН 7,4 в солевом растворе от глиальных культур была максимальной через 1ч и Зч инкубации в нем клеток (Рис. 19В(1)). Более интенсивное расщепление субстрата при рН 4,5 имело такой же характер изменения во времени (Рис. 19В(2)). Выход лактатдегидрогеназы в солевой раствор в течение 10ч инкубации оставался одинаковым (Рис. 19В(3)). Внутриклеточная Ас-ОЕ\Т)-расщепляющая активность нейроглиальных и глиальных культур достоверно не изменялась в течение 10ч инкубации в солевом растворе.

Сравнение ОЕУО-расщепляющей активности через 1 ч инкубации нейроглиальных культур после замены культуральной среды на солевой раствор выявило достоверное превышение удельной активности при рН 4,5 в солевом растворе по сравнению с лизатом клеток (Рис. 20А) и одинаковую по уровню удельную вне- и внутриклеточную активность в случае глиальных культур (Рис. 20Б).

i.o -

0,8 :

0,6 \

0,4 i

0,2 -J

0,0

1,0

Ь

i 0,8 | М J 0,4

I 0,2 -j 0,0 -

BSS лизат рН 7,4

BSS лизат рН 4,5

BSS лизат рН 7,4

BSS лизат рН 4,5

Рис. 20. Расщепление Ас-ОЕУО-АМС солевым раствором (ВЭЗ) и лизатами от нейроглиальных (А) и глиальных (Б) культур через 1ч инкубации в солевом растворе. (* - различия между лизатом и ВББ при р<0,05).

Эффекты ингибиторов исследуемых протеаз на расщепление специфических субстратов выявили следующее: ингибитор каспазы-3 Ас-ОЕУО-СНО одинаково эффективно блокировал расщепление Ас-ОЕУО-АМС солевым раствором от глиальных культур при рН 7,4 и 4,5, а ингибитор катепсина В СА074 достоверно препятствовал расщеплению этого субстрата только при рН 4,5 (Рис. 21А). Расщепление субстрата катепсина В 2-1Ш-АМС происходило более 1,5 ] А

s 1,0

S

< i £ 0,5

Н Ac-DEVD-AMC И Ai-DEVD-AMC+Ac-DEVD-CHO В Ac-DEVD-AMC+CA074

Z-RR-AMC

Z-RR-AMC+Ac-DE\T>-CHO Z~R R-AMC+C А074

гЬ

рН 7,4

рН 4,5

рН 7,4

рН 4,5

Рис. 21. Влияние ингибитора каспазы-3 Ac-DEVD-CHO (5 мкМ) или ингибитора катепсина В СА074 (5 мкМ) на расщепление субстрата каспазы-3 Ac-DEVD-AMC (50 мкМ) (А) и субстрата катепсина В Z-RR-AMC (50 мкМ) (Б) солевым раствором от глиальных культур при разных значениях рН. (** - отличие от контроля без ингибиторов при р<0,01).

интенсивно при рН 7,4 по сравнению с рН 4,5 и не зависело от присутствия Ac-DEVD-CHO при рН 7,4, но полностью блокировалось Ac-DEVD-CHO при рН 4,5. СА074 эффективно блокировал расщепление субстрата катепсина В Z-RR-AMC как при рН 7,4, так и при рН 4,5 (Рис. 21 Б).

Интенсивность расщепления субстрата каспазы-3 Ac-DEVD-AMC активной формой катепсина В была практически одинаковой при рН 7,4 и 6,0 (Рис. 22А). Однако снижение рН до значения 4,5 почти в два раза увеличило эту активность. Ингибитор каспазы-3 Ac-DEVD-CHO не влиял на расщепление Ac-DEVD-AMC при рН 7,4 и 6,0, но полностью подавлял его

1 А □ Ac-DEVD-AMC

H Ac-DEVD-AMC+Ac-DEVD-CHO ^ Ac-DE VD-AMC+CA074

5 1

60 40

3 Z-RR-AMC

« Z-RR-AMC+Ac-DEVD-CHO a Z-RR-AMC+CA074

pH 6.0

pH 4.5

pH 7.4

pH 6.0

pH 4.5

Рис. 22. Влияние ингибитора каспазы-3 Ac-DEVD-CHO (5мкМ) или ингибитора катепсина В СА074 (5мкМ) на расщепление субстрата каспазы-3 Ac-DEVD-AMC (50 мкМ) (А) и субстрата катепсина В Z-RR-AMC (50 мкМ) (Б) активной формой катепсина В из селезенки быка при разных значениях рН. (** - отличие от контроля без ингибиторов при р<0,01).

при рН 4,5. Достоверное снижение расщепления Ac-DEVD-AMC в присутствии ингибитора катепсина В СА074 происходило при рН 6,0 и 4,5. Протеолиз субстрата катепсина В Z-RR-AMC очищенным катепсином В при рН 7,4 и 6,0 практически на порядок превышал расщепление Ac-DEVD-AMC (Рис. 22Б) с максимумом при рН 6,0. Эффективность блокирующего действия Ac-DEVD-CHO достоверно усиливалась начиная с рН 6,0, в то время как ингибитор катепсина В СА074 достоверно препятствовал расщеплению субстрата при всех значениях рН. kDa

Рис. 23. Идентификация катепсина В иммуноблотгингом. Линия 1 - лизат глиальных клеток, линия 2 - фракция частиц глиальных клеток, линия 3 - концентрированный солевой раствор после 1ч инкубации глиальных культур. В каждом случае количество белка нанесенного на дорожку составляло 25 мкг.

12 3 В результате вестерн-блот анализа (Рис. 23) в лизате

глиальных клеток (линия 1), фракции частиц глиальных клеток (линия 2) и солевом растворе (линия 3) с помощью антител против катепсина В выявлена полоса в области 40 kDa, которая соответствует прокатепсину В. Полоса на уровне 30 kDa присутствует как в лизате клеток (линия 1), так и в солевом растворе (линия 3) и принадлежит одноцепочечной форме катепсина В (Nishimura et al., 1988). Выявленные в солевом растворе белковые полосы в области 25 kDa (27, 24 и 23 kDa), вероятно являются результатом процессинга одноцепочечной формы катепсина В и могут соответствовать тяжелым цепям двухцепочечной формы катепсина В (Morts, 1998). Кроме того, в лизате клеток выявлена полоса на уровне 21 kDa, которую можно рассматривать как результат миграции тяжелой цепи активной формы катепсина В. 7. Исследование соотношения активности NOC и активности каспазы-3 на модели сезонной пластичности.

Гибернация - эффективный способ реагирования, позволяющий животным выживать в неблагоприятных условиях, является также удобной моделью сезонного изменения

нейропластичности. Стадии гибернационного цикла имеют много общего с ишемическим воздействием, например, снижение мозгового кровотока во время спячки рассматривают как собственно ишемию, а его усиление при пробуждении животных как реперфузию. В ранний период ишемии активность N00 и каспазы-3 участвуют в механизмах повреждения и гибели клеток, однако при гибернации гибели и/или повреждения нейронов не наблюдается. Есть ли специфика в модуляции активности N00 и активности каспазы-3 при гибернации?

В динамике изменения активности N00 на разных стадиях гибернационного цикла существенное активация фермента наблюдалась на стадии пробуждения животных. Так в коре больших полушарий, гиппокампе, стволе мозга и в мозжечке активность фермента достоверно возросла по сравнению с сусликами в активном состоянии на 22%, 26%, 22% (при р<0,1) и 40% соответственно. В стволе мозга достоверное снижение активности N00 на 47% наблюдалось при переходе от стадии вхождения в спячку в состояние спячки (Рис. 24). Активность N00 на стадии пробуждения также достоверно превышала таковую у животных, находящихся между баутами спячки, в гиппокампе (24%) и стволе (29%). В мозжечке повышенная активность N00 в сравнении с активным состоянием была выявлена в виде тенденции у спящих сусликов (р=0,05) и между баутами спячки (р<0,06).

Кора больших полушарий

Гиппокамп

4 -

2 4

о 4 -10

61 4 4 2 Н О

3

Ствол

П Р

Рис. 24. Активность NO-cинтaзы в отделах мозга сусликов СИе11ш ип(1и1аШз на разных стадиях гибернационного цикла. По оси ординат - активность N00 в пмоль [3Н]Ь-цитруллина/мин/мг белка. 1 - активные суслики; 2 - вхождение в спячку; 3 - спячка; 4 - между баутами; 5 -пробуждение. * - достоверные отличия от группы активные суслики при р<0.05.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность N00 не изменяется при вхождении животных в спячку, во время спячки и между баутами спячки в коре больших полушарий, гиппокампе и мозжечке и увеличивается практически во всех исследованных отделах мозга сусликов СНеИш ипс1и}аШ преимущественно на стадии пробуждения после гибернации. Известно, что N0 может играть существенную роль в регуляции цикла сон-

бодрствование. Регистрация N0 с помощью электродов выявила максимальный уровень сигнала во фронтальной коре больших полушарий во время бодрствования и снижение сигнала во время медленноволновой и парадоксальной стадий сна (ВигИ е1 а1.» 1999). Неселективный ингибитор N00 Ь-ИАМЕ повышает продолжительность медленноволновой и парадоксальной стадии сна у крыс (Виг1е1 е! а!., 1999). Увеличение продукции N0 в отделах мозга сусликов при пробуждении может свидетельствовать об усилении центрального нитрергического влияния на восстановление функциональной активности сусликов после спячки.

В отличие от регионального распределения активности N00, а она уменьшалась в ряду мозжечок > кора больших полушарий > гиппокамп > ствол, активность каспазы-3 уменьшалась в ряду кора больших полушарий > гиппокамп > мозжечок > ствол (Рис. 25). Переход животных

121 ,о

16 14 I ,2 10 1

8 1

Кора больших полушарий

Гиппокамп

И

12 10 8 6

4 -

2 -О

Мозжечок

6' гЧ

■щ

Рис. 25. Активность каспазы-3 в отделах мозга сусликов СиеНиэ ипс!и1ат на разных стадиях гибернационного цикла. По оси ординат - активность каспазы-3 в пмоль АМС/мин/мг белка. 1 - активные суслики; 2 - вхождение в спячку; 3 - спячка; 4 - между баутами; 5 - пробуждение. *,** - достоверные отличия от группы активные суслики при р<0.05 и р<0.01.

из одной стадии гибернационного цикла в другую сопровождался существенными, регионспецифическими изменениями активности каспазы-3. В наибольшей степени различия между фазами гибернационного цикла были выражены в стволе мозга. В этой структуре активность фермента достоверно повысилась на 88% при вхождении в спячку и более чем в 2 раза между баутами спячки при сравнении с активными животными. В мозжечке активность фермента была выше на 53% во время спячки, чем в активном периоде. В коре больших полушарий существенных изменений по этому показателю в течение гибернационного цикла не наблюдалось за исключением тенденции к повышению активности между баутами спячки при сравнении с периодом активности. Никаких различий в активности каспазы-3 в гиппокампе между периодами гибернационного цикла обнаружено не было.

Таким образом, изменение активности каспазы-3 при смене периодов гибернационного цикла проявляется наиболее значимо в стволе мозга и мозжечке и практически полностью

отсутствует в гиппокампе. При морфологическом и иммуногистохимическом исследовании мозга сусликов на разных стадиях гибернационного цикла не удалось выявить апоптотических ядер в нейронах, что, по-видимому, указывает на отсутствие связи между активацией каспазы-3 в стволе мозга и мозжечке с апоптозом.

При сравнении с активностью NOC, которая увеличивалась практически во всех исследованных отделах мозга сусликов преимущественно на стадии пробуждения после спячки, активность каспазы-3 на этой стадии достоверно не изменялась. Выраженное увеличение активности каспазы-3 в стволе мозга на стадии вхождения в спячку и между баутами сопровождалось значительным снижением активности NOC во время спячки. В мозжечке по мере развития гибернационного состояния увеличение активности обоих ферментов происходило сходным образом. Показано, что нейроны, локализованные в стволе мозга и принимающие участие в регуляции дыхания, содержат NOC (Ogawa et al., 1995). По-видимому, снижение активности NOC в стволе мозга и, следовательно, уменьшение стимулирующего действия N0 на центральную регуляцию дыхания, а также повышение активности каспазы-3 при вхождении в спячку и во время краткосрочного пробуждения в период спячки необходимо для пластических изменений в мозге во время гибернации.

Таким образом, в отличие от ишемии мозга период усиления мозгового кровотока при пробуждении от спячки сопровождается активацией нитрергической системы, но в той степени, которая не влечет за собой деструктивных процессов и не связана с активацией или ингибированием каспазы-3.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе исследовано состояние нитрергической системы по уровню метаболитов оксида азота и активности/экспрессии NOC и протеолитической системы, представленной ключевыми цистеиновыми протеазами каспазой-3, калпаином и катепсином В и сделана попытка проанализировать взаимодействие этих систем в различных патологических ситуациях в мозге in vivo и на клеточных моделях.

Результаты, полученные на клиническом материале от больных после инсульта, во многом совпадают с результатами, полученными на модели ишемического инсульта на крысах. Накопление NOx в СМЖ больных на ранних стадиях реперфузии выявлено и в СМЖ и в ишемическом полушарии крыс через 24 ч после ОЛСМА. Увеличение содержания метаболитов N0 в СМЖ больных в ранний период после ишемического инсульта соответствует литературным данным по этому показателю как для экспериментальных животных (Kumura et al., 1994; Games et al., 2003; Xu et al., 2007), так и для больных этой патологией (Kossi and Zakhary, 2000; Krupinsky et al., 1998). Видимое противоречие между накоплением NOx в СМЖ и снижением общей активности/экспрессии NOC в коре ишемического полушария крыс, по-видимому, связано с различием в источниках метаболитов NO, среди которых на этой стадии

реперфузии могут быть депонированные формы N0, образовавшиеся в период повышенной ферментативной продукции N0, и/или снижение скорости удаления метаболитов N0 в связи с нарушением мозгового кровообращения в ранний постинсультный период. Высокая интенсивность окислительного стресса в мозге после инсульта находит свое отражение и в повышении общей окислительной активности СМЖ больных, и в исчерпанности молекулярных продуктов окисления липидов, и в окислении SH-групп белков и низкомолекулярных тиолов в мозге крыс через 24ч после ишемии. По-видимому, с значительным изменением редокс условий связана и инактивация цистеинсодержащих протеаз, калпаина и катепсина В.

Модулирующее действие СМЖ на активность ключевых для ишемического повреждения мозга протеаз - каспазы-3, калпаина и катепсина В - отражает состояние регуляции протеолитических систем в мозге в ранний период после инсульта. Немногочисленные исследования в этом направлении свидетельствуют об изменении экспрессии эндогенных ингибиторов протеаз при травмах головного мозга, экспериментальном энцефаломиелите и ишемии мозга (Olson et al., 2004; Pirttila and Pitcanen, 2006). Изменение модуляции каспазы-3, калпаина и катепсина В может говорить о дисбалансе в регуляции протеолитических систем в острый постинсультный период.

Повышенная интенсивность нитрозативного стресса в мозге при инсульте сопровождается пероксинитрит-опосредованным нитрованием остатков тирозина в белках, присутствие которых может стимулировать иммунный ответ и продукцию иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин (Ischiropoulos, 2009). Реакция иммунной системы в виде возросшего уровня Ig в ликворе больных и экспериментальных животных, а также высокой плотности Ig в ишемическом полушарии крыс может быть связана ни только с нарушением ГЭБ, но и с in situ продукцией антител, распознающих модифицированные окислительным/нитрозативным стрессом белки. Появление иммуноглобулинов в поврежденных инсультом регионах мозга, а также усиление связывания нитрованных белков в СМЖ может предопределять как защитные, так и повреждающие последствия нейроиммунных взаимодействий (Ren and Adamus, 2004; Hülse et al., 2008).

Нейроглиальные культуры мозжечка и органотипические эксплантаты гиппокампа крысы проявили различную способность к продукции NO во время КГД - повышение в клетках-зернах и снижение в эксплантатах гиппокампа. Ранее в экспериментах in vivo была выявлена прямая корреляция возрастания уровня NO с накоплением нитритов в ткани мозга при ишемии (Kader et al., 1993; Malinski et al., 1993). Принято считать, что увеличение нитратов и нитритов в клетках-зернах мозжечка in vivo и in vitro является результатом активации NOC (Widdowson et al., 1996). Полученные данные согласуются с данными других исследователей, которые наблюдали снижение продукции NO в поле CAI при инкубации срезов гиппокампа в среде без кислорода и глюкозы, несмотря на значительное увеличение внутриклеточной концентрации

ионов Са2+ (Kojima et al., 2001). В органотипических эксплантатах гиппокампа в какой-то мере сохраняются нейроглиальные взаимодействия, синаптические контакты и анатомическая структура (Gahwiler et al., 1997) в отличие от диссоциированных клеточных культур мозжечка. К тому же клетки-зерна мозжечка более устойчивы к КГД и длительность ишемии составляет не менее 2-х часов, чтобы начались структурные изменения в клетках, тогда как для эксплантатов гиппокампа достаточно 30-40 мин КГД. В дальнейшем, высокий уровень нитритов в период реоксигенации, по-видимому, предопределяет последующие деструктивные изменения и гибель нейронов как в нейроглиальных культурах мозжечка, так и в эксплантатах гиппокампа.

Среди механизмов ишемического повреждения мозга окислительный стресс является общим механизмом в патогенезе различных патологий, в том числе и нейродегенеративных заболеваний. Дисрегуляция продукции АФК и РФА может повлечь за собой модификацию структуры и функций белков, нарушение внутриклеточного сигналлинга, повреждение и гибель клеток (Berlett and Stadtman, 1997; Stadtman and Levine, 2003; Butterfield et al., 2007). Снижение активности NOC в отделах мозга после OJ1CMA, ГИМ и инъекции нейротоксина AF64A совпадало с усилением окислительного стресса в исследованных структурах, а ингибирование активности фермента различными окислителями in vitro свидетельствует об одном из возможных путей воздействия продуктов окислительного стресса на биосинтез NO при церебральных патологиях. Однако в условиях умеренного окислительного стресса, который наблюдался после введения р-амилоидного пептида, снижение активности NOC не совпадало с усилением радикалообразования и накопления молекулярных продуктов окисления липидов.

На ранних сроках после инсульта выявлены отрицательные корреляции между модулирующим действием СМЖ на протеазы и активностью NOC. На модели фокальной ишемии у крыс получены положительные корреляции между уровнем NOx в ишемическом полушарии и активностью каспазы-3 и калпаина в ишемическом полушарии, а при КГД нейрональных и органотипических культур изменения в продукции NO предшествовали деструкции и гибели клеток. Одним из общих механизмов патогенеза церебральных патологий является эксайтотоксичность. Известно, что существенный вклад в глутамат-индуцированную гибель нейронов вносят hNOC и NO (Huang et al., 1994; Dawson et al., 1996). Причем интенсивная гиперстимуляция глутаматных рецепторов приводит к некротической клеточной смерти, в то время как умеренная или хроническая стимуляция может завершаться апоптозом или иной формой клеточной гибели (Ankarcrona et al., 1995; Borifoco et al., 1995; Budd et al., 2000).

Ранние исследования свидетельствуют о том, что при PTZ-индуцированной эпилепсии увеличение высвобождения глутамата приводит к активации hNOC и увеличению продукции NO (Endoh et al., 1994; Garthwaite and Boulton, 1995). Активацию каспазы-3 после острого

введения PTZ выявили недавно только в единичных исследованиях на культурах нейронов и в мозге крыс (Naseer et al., 2009; 2011). В нашем исследовании активность NOC и активность каспазы-3 не изменялись на различных стадиях судорог после острого введения PTZ. По-видимому, временную активацию hNOC, опосредованную глутаматом in vivo, сложно детектировать, определяя активность фермента in vitro в условиях оптимального соотношения субстрата и кофакторов. Тем не менее, активация NOC, но не каспазы-3 происходила только в результате хронического введения подпороговой дозы PTZ при киндлировании животных. Положительные корреляции между активностью NOC и каспазы-3, выявленные в мозге контрольных и киндлированных животных, исчезали в результате острого введения PTZ. Вероятно, длительное введение субконвульсивной дозы PTZ не изменяет или восстанавливает взаимосвязь активности NOC и каспазы-3.

Среди патогенетических механизмов реакции на стресс и ишемии мозга активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и глутаматная эксайтотоксичность являются общими звеньями для этих патологий. Стресс может оказывать различные эффекты в зависимости от частоты и интенсивности стрессорного стимула (Madrigal et al., 2006). В результате различных вариантов ранней социальной изоляции у цыплят и крыс обнаружено повышение активности NOC в регионах мозга, чувствительных к стрессу у этих видов животных, и оно зависело от длительности и интенсивности стрессорного воздействия. Повышение тревожности у крыс сразу после хронической изоляции совпадало с активацией NOC в гиппокампе животных. В основе указанных нарушений поведения лежат изменения в системах нейротрансмиттеров, таких как серотонин, дофамин, ГАМК, глутамат и модулирующих эффектах NO на их высвобождение (Lorrain and Hull, 1993; Strasser et al., 1994; Segovia et al., 1994; Kaehler et al., 1999).

Продолжительные и эмоционально-болевые формы стресса связаны со структурно-функциональными изменениями в ЦНС. Например, хронический стресс индуцирует атрофию дендритов пирамидальных нейронов поля САЗ гиппокампа (Magarinos and McEwen, 1995), подавляет нейрогенез в зубчатой фасции (Fuchs and Flügge, 1998; Gould and Tanapat, 1999) и приводит к уменьшению объема гиппокампа (Czeh et al., 2001; van der Hart et al., 2002). В результате нашего исследования обнаружено снижение числа HNOC-содержащих нейронов, а также снижение общего числа нейронов в неокортексе и гиппокампе, т. е. в регионах с высоким уровнем глюкокортикоидных и минералкортикоидных рецепторов (Sorrels et al., 2009). Уменьшение активности общей NOC согласуется с подобными изменениями, однако повышенный уровень метаболитов NO в этих структурах указывает на дисбаланс между ферментативным биосинтезом NO и его дальнейшим метаболизмом, что подтверждает и отсутствие иммунопозитивных клеток, окрашенных на hNOC. Снижение общего числа нейронов в гиппокампе после стресса, а также отсутствие апоптотических клеток и снижение

активности каспазы-3, свидетельствуют о гибели клеток, но не по пути апоптоза. Известно, что глюкокортикоиды регулируют пролиферацию и выживание клеток (Alonso, 2000; Wong and Herbert, 2004), оказывают про- и анти-апоптотическое действие в ЦНС (Almeida et al., 2000), причем блокирование апоптоза может осуществляться в том числе и за счет ингибирования активности каспазы-3 (Malaeb et al., 2003). Увеличение активности катепсина В, по-видимому, является признаком дестабилизации лизосом, но не по калпаин-зависимому механизму, описанному Yamashima (2004), поскольку активность калпаина понизилась после хронического стресса, а под действием других факторов, в том числе и циркуляторной гипоксии, являющейся одним из ключевых звеньев влияния хронического стресса на мозг (Айрапетянц, 1997). Убыль нейронов в гиппокампе и отсутствие признаков апоптоза не исключает другие варианты гибели клеток с участием катепсина В, такие как некроз и аутофагия.

Метаболическое стрессирование клеток посредством замены культуральной среды на солевой раствор приводило к секреции катепсина В из нейроглиальных и глиальных культур. Раннее показано, что активированные клетки микроглии секретируют катепсин В (Ryan et al., 1995; Kingham and Pocock, 2001), но в настоящем исследовании это продемонстрировано для культур, в которых преобладали нейроны и астроциты. Изменения в мозговом кровотоке при ишемии/реперфузии создают метаболический стресс для клеток мозга, в результате которого секретируемый катепсин В может расщеплять субстраты, находящиеся на внешней стороне плазматической мембраны клеток, а также модифицировать белки внеклеточного матрикса (Buck et al., 1992) и способствовать миграции клеток (Kawada et al., 1997). Ацидоз, который наблюдается при ишемии мозга, может обеспечивать расширение спектра протеолитической активности катепсина В, в том числе и в отношении субстратов каспазы-3. Аминокислотная последовательность синтетического субстрата каспазы-3 Ac-DEVD-AMC соответствует сайту расщепления поли(АДФ-рибозо)полимеразы (PARP) фермента, участвующего в репарации ДНК. Известно, что PARP, локализованная в ядре клетки, подвергается протеолитическому расщеплению каспазой-3 во время апоптоза (Nicholson et al., 1995), но и при некротической гибели также происходит расщепление PARP (Shah et al., 1996; Casiano et al., 1998), причем участие в этом лизосомальных протеаз также показано (Gobeil et al., 2001). Таким образом, катепсин В и каспаза-3 имеют общие физиологические и синтетические субстраты, а изменение вне- и внутриклеточного pH, по-видимому, может изменять специфичность протеолитической активности катепсина В.

Значительные изменения мозгового кровообращения при гибернационном цикле не приводят к повреждению мозга, более того, суслики в активном состоянии проявляют большую устойчивость к ГИМ, по сравнению с крысами (Dave et al., 2006). Морфологические изменения в нейронах, происходящие во время входа и выхода из спячки, свидетельствуют о том, что мозг гибернирующих животных является моделью быстрой и обратимой нейрональной

пластичности (Popov et al., 1992 ; von der Ohe et al., 2006; von der Ohe et al., 2007). Увеличение

активности NOC на стадии пробуждения после гибернации может свидетельствовать об

усилении центрального активирующего нитрергического влияния на восстановление

функциональной активности сусликов после спячки. Снижение активности NOC во время

Нитрергическая Протеолитическая

система система

TINOC ГИБЕРНАЦИОННЫЙ ЦИКЛ | каспаза-3

(гибель клеток отсутствует)

ИШЕМИЯ МОЗГА Нарушение мозгового кровотока Эксайтотоксичность Окислительный стресс

jNOC

-NOC TNOC

|NOC TINOC

{NOCfNOx нд

jNOx |NOC jNOCfNOx

СТРЕСС Изоляционный

I

ЭПИЛЕПСИЯ Судороги Кинд^шнг

НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИЯ АР64А (!-амилоид^(25-35)

СТРЕСС Хронический эмоционально-болевой

Метаболический

К^Д

ГЛОБАЛЬНАЯ ИШЕМИЯ ФОКАЛЬНАЯ ИШЕМИЯ

нд

-каспаза-3 -каспаза-3

нд нд

|каспаза-3 [калпаин Ткатепсин В секреция катепсина В

нд

нд

-каспаза-3 ¿калпаин ¿катепсин В

Рис. 26. Гипотетическая схема распределения церебральных патологий с общими механизмами патогенеза в ряду усиления деструктивных процессов и изменения в нитрергической и протеолитической системах. Примечания: «-» перед показателем - отсутствие его изменений; нд - показатель не детектировали.

спячки в стволе мозга, содержащем №ЭС-позитивные нейроны, которые принимают участие в регуляции дыхания (Ogawa е1 а1., 1995), и активация каспазы-3 в этом отделе при вхождении в спячку и между баутами, по-видимому, являются одним из адаптационных механизмов в условиях гипотермии, гипоксии и супрессии метаболизма, в котором задействованы нитергическая и протеолитическая системы мозга гибернирующих животных.

Суммируя вышеизложенное, можно с очевидностью предположить, что изменения в нитрергической и протеолитической системах происходят при всех исследованных патологиях мозга (Рис. 26), однако степень и характер этих изменений зависят от интенсивности сопутствующих механизмов, например, окислительного стресса, а также локализации в отделах мозга и стадии развития патологии.

ВЫВОДЫ

1. Изменения в нитрергической, протеолитической и иммунной системах мозга в остром периоде после инсульта зависят от типа и тяжести инсульта. Развитие нитрозативного стресса в мозге сопровождается индукцией иммунного ответа, появлением аутоантител к модифицированным нитрованием белкам и изменением соотношения активаторов/ингибиторов цистеиновых протеаз в СМЖ. Спинномозговая жидкость модулирует активность цистеиновых протеаз - калпаина, каспазы-3 и катепсина В, однако степень активации или ингибирования изменяются в острый период после инсульта и отрицательно коррелирует с активностью NOC.

2. В ранний период после фокальной ишемии мозга у крыс снижается активность и экспрессия NOC, повышается содержание метаболитов оксида азота и увеличивается уровень иммуноглобулинов в ишемическом полушарии мозга, а также связывание нитрованного БСА в СМЖ.

3. В зависимости от вида нейроглиальных культур и длительности воздействия продукция метаболитов оксида азота возрастает или снижается в ишемический период, остается на высоком уровне на ранних стадиях реоксигенации и в дальнейшем сопровождается деструктивными морфологическими изменениями в нервных клетках и их гибелью.

4. Окислительный стресс через 24 ч после фокальной ишемии характеризуется снижением интенсивности свободнорадикального окисления липидов и повышением окисленности сульфгидрильных групп, а также снижением активности цистеиновых протеаз, калпаина и катепсина В, в мозге животных.

5. Дисбаланс в продукции N0 при ишемическом воздействии, а также после введения р-амилоидного пептида и холинотоксина AF64A регионспецифичен и обусловлен активацией NOC или ее ингибированием, степень которого предопределяется, в частности, интенсивностью окислительного стресса на разных стадиях развития патологии.

6. Модуляция активности NOC и каспазы-3 в мозге происходит при эпилепсии и сезонной нейропластичности-гибернации. При смене функционального состояния мозга во время гибернации, активация NOC и каспазы-3 разделены регионарно и постадийно, однако в результате киндлинга активируется NOC, но не каспаза-3.

7. Стрессорные воздействия различного типа и интенсивности изменяют состояние нитрергической системы и активность цистеиновых протеаз. При социальном стрессе в отделах мозга разных видов животных происходит активация NOC, тогда как эмоционально-болевой

стресс приводит к ингибированию активности и экспрессии NOC, разобщению генерации и метаболизма NO, ингибированию активности каспазы-3 и калпаина, активации катепсина В, структурно-функциональным изменениям в регионах мозга и гибели клеток.

9. Метаболическое стрессирование нейроглиальных и глиальных культур мозжечка крысы при замене культуральной среды на солевой раствор стимулирует секрецию катепсина В, который при кислых значениях рН способен расщеплять субстрат каспазы-3 более интенсивно, чем каспаза-3, и активность катепсина В блокируется ингибиторами каспазы-3 и катепсина В.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gulyaeva N.V., Lazareva N.A., Libe M.L., Mitrokhina O.S., Onufriev M.V., Stepanichev M.Yu., Chernysevskaya I.A., Walsh T.J. Oxidative stress in the brain following intraventricular administration of ethylcholine aziridinmm (AF64A) // Brain Res. - 1996. - V. 726. - P. 174-180.

2. Gurvitch A.M., Mutuskina E.A., Zarzhetsky Y.V., Trubina I.E., Avruschenko M.S., Pylova S.I., Volkov A.V., Lazareva N.A., Stepanichev M.Y., Onufriev M.V., Gulyaeva N.V. Prophylaxis of encephalopathies and risk factors of atherogenesis development in the postresuscitation period in rats by means of succinic acid // Resuscitation. - 1997. - V. 35. - P. 165-170.

3. Степаничев М.Ю., Онуфриев M.B., Лазарева H.A., Заржецкий Ю.В., Мутускина Е.А., Гурвич A.M., Гуляева Н.В. Влияние системной остановки кровообращения на свободнорадикальное окисление и активность NO-синтазы в структурах мозга крыс с разными типами поведения в тесте эмоционального резонанса // Журнал высшей нервной деятельности. -1998.-Т.48.-С.541-550.

4. Степаничев М.Ю., Онуфриев М.В., Лазарева Н.А., Заржецкий Ю.В., Мутускина Е.А., Гурвич A.M., Гуляева Н.В. Отсроченные эффекты системной остановки кровообращения на свободнорадикальные процессы в структурах мозга крыс с разными типами поведения в тесте эмоционального резонанса // Журнал высшей нервной деятельности. - 1999. - Т. 49. - С. 653663.

5. Онуфриев М.В., Степаничев М.Ю., Митрохина О.С., Моисеева Ю.В., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Влияние окислительного стресса на активность синтазы оксида азота мозга in vivo и in vitro//Российский физиол. журн. - 1999. - Т. 85. -№4. - С. 531-538.

6. Lautenschlager М., Onufriev M.V., Gulyaeva N.V., Harms С., Freyer D., Sehmsdorf U., Ruscher K., Moiseeva Y.V., Arnswald A., Victorov I., Dirnagl U., Weber J.R., Hortnagl H. Role of nitric oxide in the ethylcholine aziridinium model of delayed apoptotic neurodegeneration in vivo and in vitro. Neuroscience. - 2000. - V. 97. - P. 383-393.

7. Хаспеков Л.Г., Онуфриев М.В., Лыжин А.А., Викторов И.В. , Гуляева Н.В. Действие ишемии и реоксигенации на накопление нитритов в культурах клеток-зерен мозжечка крыс И Нейрохимия. - 2000. - Т. 17. - № 4. - С. 267-270.

8. Onufriev M., Stepanichev M., Bock J., Gulyaeva N., Poeggel G., Braun K. Changes of nitric oxide synthase activity in response to different levels of social separation in two day old domestic chicks (Gallus gallus domesticus) // Neuroscience Research Communications. - 2000. - V. 27. - P. 175181.

9. Моисеева Ю.В., Онуфриев M.B., Лазарева H.A., Степаничев М.Ю., Гуляева Н.В. Свободнорадикальные механизмы септо-гиппокампальной нейродегенерации, вызванной холинотоксином AF64A у крыс in vivo // Нейрохимия. - 2001. - Т. 18. - № 4. - С. 287-289.

10. Большаков А.П., Онуфриев М.В., Хоничева Н.М., Степаничев М.Ю., Чабак-Гарбач Р., Айрапетянц М.Г., Гуляева Н.В. Влияние ранней социальной изоляции на активность синтазы оксида азота в отделах мозга крыс. // Нейрохимия. - 2001. - Т. 18. - № 4. - С. 262-266.

11. Яковлев А.А.,Семенова Т.П., Колаева С.Г., Онуфриев М.В., Михалев С.Л., Гуляева Н.В. Изменение активности каспазы-3 в отделах мозга сусликов citellus undulatus в течении гибернационного цикла // Нейрохимия. - 2002. - Т. 19. - № 1. - С. 33-36.

12. Здобнова И.М., Степаничев М.Ю., Яковлев А.А., Онуфриев М.В., Егорова Л.К., Моисеева Ю.В., Лазарева Н.А., Мац В.Н., Гуляева Н.В. Взаимодействие нейротоксического фрагмента бета-амилоидного пептида и фактора некроза опухоли альфа при интрацеребровентрикулярном введении крысам // Нейрохимия. - 2002. - Т. 19. - № 2. - С.112-117.

13. Онуфриев М.В., Семенова Т.П., Колаева С.Г., Моисеева Ю.В., Егорова Л.К., Гуляева Н.В. Активность синтазы оксида азота в отделах мозга сусликов citellus undulatus в разных фазах гибернационного цикла // Нейрохимия. - 2002. - Т. 19. - № 4. - С. 264-268.

14. Хаспеков Л.Г., Онуфриев М.В., Лыжин А.А., Викторов И.В., Гуляева Н.В. Влияние ишемии и реоксигенации на высвобождение нитритов из органотипических эксплантатов мозга крыс // Нейрохимия. - 2003. - Т. 20. - № 1. - С. 83-85.

15. Stepanichev M., Zdobnova I., Yakovlev A., Onufriev M., Lazareva N., Zarubenko I., Gulyaeva N. Effects of tumor necrosis factor-alpha central administration on hippocampal damage in rat induced by amyloid beta-peptide (25-35) //J. Neurosci. Res. - 2003. - V. 71. - P. 110-120.

16. Семенова Т.П., Онуфриев M.B., Аношкина И.А., Моисеева Ю.В., Колаева С.Г., Гуляева Н.В., Фесенко Е.Е. Роль моноаминоксидазы а (МАО А) и NO-синтазы в механизмах пробуждения от спячки у сусликов Citellus undulates//Докл. РАН. - 2004. - Т. 398. - С. 571-573.

17. Stepanichev M.Yu., Kudryashova I.V., Yakovlev A.A., Onufriev M.V., Khaspekov L.G., Lyzhin A.A., Lazareva N.A., Gulyaeva N.V. Central administration of a caspase inhibitor impairs shuttle-box performance in rats //Neuroscience. - 2005. - V. 136. - P. 579-591.

18. Айрапетянц М.Г., Яковлев A.A., Левшина И.П., Воронцова О.Н., Степаничев М.Ю., Онуфриев М.В., Лазарева H.A., Гуляева Н.В. Исследование механизмов, опосредующих гибель нейронов, при хроническом стрессе у крыс // Нейрохимия. - 2006. - Т. 23. - № 2. - С. 136-142.

19. Степаничев М.Ю., Онуфриев М.В., Моисеева Ю.В., Яковлев A.A., Лазарева H.A., Гуляева Н.В. Влияние фактора некроза опухоли-альфа и бета-амилоидного пептида (25-35) на показатели свободнорадикального окисления и активность каспазы-3 в мозге крыс // Нейрохимия. - 2006. - Т. 23. - № 3. - С. 217-222.

20. Яковлев A.A., Гороховатский А.Ю.,Онуфриев М.В., Белецкий И.П., Гуляева Н.В. Катепсин мозга способен расщеплять субстрат каспазы-3 // Биохимия. - 2008. - Т. 73. - № 3. - С. 408-413.

21. Stepanichev M.Y., Onufriev M.V., Yakovlev A.A., Khrenov A.I., Peregud D.I., Vorontsova O.N., Lazareva N.A., Gulyaeva N.V. Amyloid-beta (25-35) increases activity of neuronal NO-synthase in rat brain // Neurochem. Int. - 2008. - V. 52. - № 6. - P. 1114-1124.

22. Онуфриев M.B., Яковлев A.A., Лыжин A.A., Степаничев М.Ю., Хаспеков Л.Г., Гуляева Н.В. Секретируемая каспаза-3-подобная активность при кислых значениях pH принадлежит катепсину В: исследование на первичных клеточных культурах мозга // Биохимия. - 2009. - Т. 74. -№ 3. - С. 346-354.

23. Брылев Л.В., Нелькина E.H., Яковлев A.A., Онуфриев М.В., Шабапина A.A., Костырева М.В., Захарова М.Н., Завалишин И.А., Гуляева Н.В. Модуляторы активности цистеиновых протеаз и маркеры клеточной гибели в спинномозговой жидкости пациентов с боковым амиотрофическим склерозом // Нейрохимия. - 2009. - Т. 26. - №2. - С. 143-148.

24. Онуфриев М.В. Нитрозативный стресс в мозге: аутоантитела к нитротирозину в ликворе как потенциальный маркер // Нейрохимия. - 2010. - Т. 27. - № 3. - С. 257-263.

25. Онуфриев М.В., Степаничев М.Ю., Лазарева H.A., Катковская И.Н., Тишкина А.О., Мойсеенок А.Г., Гуляева Н.В. Нейропротекторные свойства пантенола: исследование на модели окклюзии среднемозговой артерии у крысы // Нейрохимия. - 2010. - Т. 27. - № 2. - С. 170-175.

26. Онуфриев М. В., Савоськина И. В., Каймовский И. Л., Лебедева А. В., Гусев Е. И., Гехт А. Б., Гуляева Н. В. Показатели нитрозативного стресса и иммунного ответа в ликворе больных на ранней стадии инсульта // Нейрохимия. - 2011. - Т. 28. - № 1. - С. 83-86.

Onufriev Mikhail Valerievych

Neurochemical mechanisms of cerebral pathologies: nitrergic and proteolytic systems

The aim of present investigation was to study nitrergic system and cysteine proteases system in experimental and clinical cerebral pathologies. In the acute phase after stroke changes in brain nitrergic and proteolytic systems depended on the type and severity of stroke and manifested in the CSF of patients. Increased activity of the NOS and level of NOx in CSF was accompanied by induction of immune response, appearance of antibodies to nitrated proteins and change in the ratio activators/inhibitors of caspase-3, calpain and cathepsin B. Similar changes occurred in the early period after experimental stroke in rats: NOS activity decreased, NOx and immunoglobulin levels increased in the ischemic cortex, the binding of nitrated BSA and NOx level in CSF increased. During this period, in the ischemic cortex oxidation of the SH-groups increased while activities of cysteine proteases calpain and cathepsin B decreased. Depending on the type of neuroglial cultures, NOx production increased or decreased during ischemia, increased at early stages of reoxygenation and subsequently induced neuronal cell death. Imbalance in the production of NO in ischemia, as well as after administration of P-amyloid peptide or AF64A depended on region of brain and was induced by activation or inhibition of NOS; in particular, NOS depression depended on the intensity of oxidative stress at different stages of disease. PTZ-induced kindling activated NOS in the rat brain, but did not affect caspase-3. During hybernation cycle activation of NOS and caspase-3 occurred in different regions of brain and in various stages. Stress of different type and strength differently affected nitrergic system and cysteine protease activity. Social isolation stress activated NOS in the brain, while chronic emotional-painful stress resulted in inhibition of NOS activity and expression, uncoupling of NO generation and metabolism, inhibition of caspase-3 and calpain, activation of cathepsin B, structural and functional changes in brain regions, and cell death. Metabolic stress of neuroglial and glial rat cerebellar cultures induced by replacing the culture medium for balanced salt solution stimulated the secretion of cathepsin B, which, at acidic pH, was able to cleave caspase-3 substrate, this activity being blocked by inhibitors of both caspase-3 and cathepsin B. Thus, changes in nitrergic and proteolytic systems occur in human brain pathologies and animal models and reflect the involvement of these systems in the pathogenesis and adaptive response of the brain.

Заказ № 137-П/02/2012 Подписано в печать 24.02.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.2,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН:info@cfr.ru

Актуальность проблемы

Исследование механизмов церебральных патологий продолжает оставаться актуальной задачей, без решения которой невозможно патогенетическое обоснование лечебных мероприятий. К важнейшим системам, нарушения которых играют существенную роль в патогенезе практически всех церебральных патологий, относятся система оксида азота (N0) и протеолитические системы. Несмотря на различия в функциях, обе системы принимают участие как в нормальной пластичности мозга, обеспечивая динамическое равновесие сигнальных и модифицирующих белки стимулов, так и в механизмах патологических изменений в ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях и других патологиях мозга.

Функционирование нитрергической системы в мозге при физиологических условиях обеспечивают две Са2+/кальмодулин-зависимые изоформы NO-синтазы, которые присутствуют в эндотелиальных клетках (эЖ)С, III тип NOC) и нейронах (hNOC, I тип NOC). N0, генерируемый 3N0C, необходим для контроля мозгового кровотока, тогда как NO синтезируемый hNOC функционирует также как нейротрансмиттер, модулирует нейроэндокринные функции, память и поведение (Szabo, 1996; Guix et al., 2005). При различных патологических условиях, включая нейродегенеративные заболевания и ишемию мозга, большие количества NO синтезируются индуцибельной NOC (hNOC, II тип NOC), экспрессия которой повышается в ответ на локальное усиление биосинтеза провоспалительных цитокинов и связана с повреждающим действием N0. Экспрессия hNOC выявлена в инфилырующих мозг фагоцитах, эндотелии сосудов и глиальных клетках - астроцитах, олигодендроцитах и микроглии (Bachschmid et al., 2005; Moneada and Bolanos, 2006).

Среди основных групп протеаз, регулирующих физиологические функции в головном мозге, выделяют группу цистеиновых протеаз, к которой относятся три семейства - каспазы, калпаина и папаина (Chwieralski et al., 2006). Протеазы этой группы присутствуют во всех типах клеток ЦНС, локализуются в различных компартментах клетки и принимают участие в расщеплении разнообразных субстратов при физиологических стимулах и в процессе повреждения и гибели клеток. К важнейшим цистеиновым протеазам из этих семейств относятся каспаза-3, калпаин и катепсин В.

Согласно одной из классификаций, каспазы, расщепляющие пептидную связь у остатка аспартата в белках, подразделяют на активаторные, провоспалительные и эффекторные (Liu et al., 1996; Orth et al., 1996; Muzio et al., 1997; Thornberry et al., 1997). Каспаза-3 относится к эффекторным каспазам и ее считают фактором терминальной стадии апоптотической гибели нервных и глиальных клеток (Nunez, 1998, Yuan, Yankner, 2000, Timmer, Salvesen, 2007). Каспаза-3 синтезируется в виде неактивного профермента (32 kDa), в результате протеолитического расщепления которого образуется активная протеаза (12 kDa и 17 kDa). Наряду с апоптотическими функциями, каспаза-3 может принимать участие и в физиологических событиях, например, в регуляции клеточного цикла, пролиферации, дифференцировке, а также пластических перестройках клеток мозга (Cohen, 1997; Concha and Abdel-Meguid, 2002; Гуляева, 2003).

Калпаин - нейтральная цистеиновая протеаза, которая активируется кальцием. В головном мозге экспрессируется две изоформы калпаина ц-калпаин и m-калпаин, каждая из которых состоит из каталитической субъединицы (80 kDa) и регуляторной субъединицы (28 kDa) (Bevers and Neumar, 2008). Повышение внутриклеточной концентрации свободного Са2+ выше пороговой величины, специфичной для каждой изоформы (~1 цМ для fi-калпаина и ~1 шМ для m-калпаина), приводит к связыванию Са2+, конформационным изменениям, аутолизу обеих субъединиц и активации калпаина (Hosfield et al., 1999). В результате кратковременной активации калпаины принимают участие в физиологических функциях, осуществляя частичный протеолиз субстратов, таких как структурные белки, Са2+-регулируемые и сигнальные белки (Göll et al., 2003). Однако повышенная активация калпаина наблюдается на ранних этапах экзайтотоксического повреждения нейронов (Siman et al., 1989; Faddis et al., 1997) и задействована в реализации апоптотической гибели клеток (Nath et al., 1996; Squier et al., 1999). В процессе апоптоза и гипоксии-ишемии мозга каспаза-3 может расщеплять эндогенный ингибитор калпаина калпастатин (Blomgren et al., 1999; Wang, 2000). Показано, что калпаин расщепляет профермент и активирует каспазу-3 после воздействия майтотоксина и кислородно-глюкозной депривации (КГД) кортикальных культур (McGinnis, 1999; Malagelada, 2005).

Катепсины - кислые эндопептидазы семейства папаиновых протеаз (Turk et al., 1997). Катепсины локализуются преимущественно в лизосомах, где они принимают участие в деградации белков до аминокислот при кислых значениях рН (Kirschke et al., 1980). Катепсины В и L являются основными лизосомальными цистеиновыми протеазами в ЦНС и экспрессируются как в нейронах, так и в глии (Yamashima, 2000). Различные патологические ситуации, в том числе ишемия мозга, приводят к высвобождению катепсинов в цитоплазму клетки, а избыточная активность этих протеаз вызывает повреждение и гибель клеток (Boya et al., 2003). Катепсин В принимает участие в различных видах клеточной смерти, в частности, влияя на активность других цистеиновых протеиназ, в том числе провоспалительных и эффекторных каспаз (Kingham and Pocock, 2001; Benchoua et al., 2004). Калпаин-катепсиновая гипотеза гибели клетки основывается на том факте, что активированный эксайтотоксичным стимулом калпаин повреждает лизосомы и обеспечивает выход в цитозоль клетки лизосомальных протеаз, включая катепсин В, с последующим расщеплением клеточных белков и гибелью клетки по некротическому пути (Yamashima, 1998; Yamashima, 2003).

Взаимодействие нитрергической и протеолитических систем во многом определяется плейотропными эффектами NO и реактивными формами азота (РФА), которые индуцируют как некротическую, так и апоптотическую J * ' 1} * г / J * dw I " гибель клеток в зависимости от интенсивности токсического воздействия (Bonfoco et al., 1995). NO и пероксинитрит могут индуцировать каспазо-зависимую и/или калпаин-опосредованную клеточную гибель с участием различных механизмов (Zhang et al., 2004; Takadera et al., 2004; Moneada and Balanos, 2006; Kawano et al., 2006; Kosuge et al, 2008). Так NO индуцирует каспазо-опосредованную гибель клеток через высвобождение из митохондрий цитохрома С и активацию каспазы-9, повышение экспрессии р53, активацию митоген-активируемых протеинкиназ и изменение экспрессии белков, регулирующих апоптоз, в том числе из семейства Вс1-2 (Choi et al., 2002; Moneada and Balanos, 2006). NO индуцирует также каспазо-независимую гибель посредством активации калпаина, стимуляции высвобождения возбуждающих аминокислот и активных форм кислорода (АФК), повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция и нарушения функционирования митохондрий (Prast and Philippu, 2001; Choi et al., 2002; Moneada and Balanos, 2006). Действие ингибиторов изоформ NOC подтверждает активирующий эффект NO и его производных на калпаин и каспазу-3 (Dingman et al., 2006; Sun et al., 2009).

С другой стороны, присутствие цистеина в активном центре протеаз делает их уязвимыми для NO, поскольку тиолы чувствительны к окислительно-восстановительным модификациям и могут подвергаться S-нитрозилированию. В исследованиях in vivo и in vitro продемонстрирована способность NO нитрозилировать тиолы в активном центре каспаз и ингибировать их протеолитическую активность (Li et al., 1997; Kim et al., 1997, 2000; Rossig et al., 1999; Tôrôk et al., 2002). Также NO ингибирует активность катепсина В, папаина и калпаина через S-нитрозилирование остатков цистеина в активном центре протеаз (Stamler et al., 1992; Venturini et al., 1998; Koh and Tidball, 2000). Считают, что присутствие в клетке Fe-S комплексов является критическим фактором для опосредованного NO S-нитрозилирования in vivo (Kim et al., 1998, 2000). Таким образом, NO может выступать в качестве общей регуляторной молекулы для цистеиновых протеаз.

Воздействие протеаз на нитрергическую систему проявляется в протеолитическом расщеплении изоформ NOC. Известно, что ковалентно модифицированная hNOC подвергается убиквитинилированию и протеосомальной деградации (Bender et al., 2000; Noguchi et al., 2000). Однако и избыточная активация калпаина приводит к расщеплению всех трех изоформ NOC - hNOC, 3NOC и hNOC (Osawa et al., 2003; Копе et al., 2003; Stalker et al., 2005).

Дисрегуляция продукции и/или метаболизма NO и РФА, которая происходит при нитрозативном стрессе, может повлечь за собой модификацию структуры и функций белков, нарушение внутриклеточного сигналлинга, повреждение и гибель клеток. NO реагирует с супероксидным анионом с образованием сильного окислителя пероксинитрита, который участвует в нитровании остатков тирозина в белках (Gow et al., 1996). hNOC и hNOC играют доминирующую роль в образовании нитротирозина в мозге на разных стадиях ишемии и реперфузии (Eliasson et al., 1999; Hirabayashi et al., 2000). Присутствие нитрованных белков и пептидов может активировать иммунную систему и продукцию иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин (Ischiropoulos, 2009). Наряду с нитрозативным стресом происходит интенсификация окислительного стресса, который является общим знаменателем для многих церебральных патологий, в том числе ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний (Sayre et al., 2008).

Наличие стимулов, которые ведут к усиленной продукции NO, может быть причиной повреждений нейронов. Примером этого является глутаматная токсичность (Lipton et al., 1993). Показано, что Р-амилоидный пептид (АР) действует синергично с глутаматом, вызывая повреждение нейронов по NO-зависимому пути (Aksenov et al.; 1995; Le et al., 1995; Noda et al., 1999; Yang et al.,1998) и индуцирует окислительный стресс (Miranda et al., 2000; Varadarajan et al., 2000). Однако изменения NOC при болезни

Альцгеймера (БА) неоднозначны, а имеющиеся на этот счет данные очень противоречивы (Dorheim et al., 1994; Thorns et al., 1998; Tohgi et al., 1998; Tao et al., 1999; Yew et al., 1999; Gargiulo et al., 2000).

Эксайтотоксичность глутамата играет важную роль и в патогенезе эпилепсии. Ранние исследования свидетельствуют о том, что продукция N0 повышается в результате активации hNOC глутаматом после введения пентилентетразола (PTZ) (Endoh et al., 1994; Garthwaite and Boulton, 1995) и инъекции ингибиторов биосинтеза NO снижают чувствительность к индуцированным PTZ судорогам (Kaneko et al., 2002; Itoh et al., 2004). Тем не менее, NO проявляет и антиконвульсантный эффект при судорогах, индуцированных каинатом (Przegalinski et al., 1994), а-гуанидиноглутаровой кислоты (Yokoi et al., 1994) и NMDA (Buisson et al., 1993). На различных моделях судорожной активности было выявлено повышение экспрессии и активности каспазы-3 (Gillardon et al., 1997; Faherty et al., 1999; Ferrer et al., 2000; Henshall et al., 2000), а ингибитор каспазы-3 z-DEVD-fmk снижал индуцированную судорогами гибель нейронов (Henshall et al., 2000; Kondratyev and Gale, 2000). Остается малоизученной проблема взаимодействия нитрергической системы и каспазы-3 в механизмах церебрального повреждения после судорог, индуцированных PTZ.

Механизмы развития стрессорной реакции и ишемического повреждения мозга имеют много общих звеньев. Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, которая задействована в реакции на стресс, является одним из первых физиологических ответов на церебральную ишемию, которая приводит к длительному повышению в крови концентрации глюкокортикоидов (Getz et al., 1981; Olsson, 1990; Fassbender et al., 1994; Johansson et al., 1997). Нейротоксические эффекты стресса связаны также с повышением внеклеточного уровня возбуждающих аминокислот, в первую очередь глутамата, модуляцией активности и экспрессией изоформ NOC (Moghaddam, 1993; Olivenza et al., 2000). В научной литературе практически отсутствуют данные о роли цистеиновых протеаз, таких как калпаин, катепсин В и каспаза-3, в нейродегенерации, вызванной хроническим стрессом.

Гибернация является уникальной физиологической адаптацией к изменяющимся условиям окружающей среды. Несмотря на то, что мозговое кровообращение кардинально изменяется на стадиях гибернационного цикла, проявляя схожесть с ишемией/реоксигенацией, повреждения мозга не происходит (Lust et al, 1989; Frerichs et al, 1994; Ma et al, 2005). В мозге гибернирующих животных выявлены сезонные изменения эндогенных регуляторов гибернации, таких как серотонин, катехоламины, нейропептиды и гормоны (Popova et al., 1993; Nürnberger, 1995; Gui et al., 1996), однако исследования роли нитрергической системы в таком природном механизме адаптации практически отсутствуют. Существенное снижение температуры тела, кровообращения в мозге и нейрональной активности во время спячки сопровождается изменениями в микроструктуре нейронов (Popov et al., 1992; von der Ohe et al., 2006). Причем вхождение в спячку сопровождается 50-65% потерей синапсов, не связанной с деградацией синаптических белков, а, как предполагают авторы исследования, связанной с их диссоциацией из синапса в аксон, тело нейрона или дендрит во время вхождения в спячку, их пребыванием там во время спячки и быстрым реструктурированием синапсов во время выхода из спячки (von der Ohe et al., 2007). Однако нейроны, подверженные апоптотической гибели, проявляют ретракцию дендритов похожую, как и у нейронов, гибернирующих животных. В подобные структурные и функциональные изменения как правило вовлечены протеолитические ферменты, а роль каспазы-3 участвующей как в апоптозе, так и в реализации нейрональной пластичности, остается практически не изученной при гибернации.

Таким образом, сравнительное исследование нитрергической и протеолитической систем с использованием моделей церебральных патологий способствует комплексному пониманию механизмов этих патологий на примере взаимодействия ключевых систем, обеспечивающих нейрональную пластичность и ответственных за повреждение и гибель клеток.

Цель работы и основные задачи исследования

Основной целью данной работы явилось исследование состояния нитрергической системы и системы цистеиновых протеаз при экспериментальных и клинических церебральных патологиях. Для сравнения была использована модель гибернации как модель естественного (сезонного) изменения нейропластичности.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать показатели нитрергической системы, иммунный ответ и модуляцию активности цистеиновых протеаз в спинномозговой жидкости (СМЖ) больных в острый период инсульта.

2. Исследовать показатели нитрергической системы, иммунный ответ и активность цистеиновых протеаз в мозге и СМЖ на модели фокальной ишемии мозга у крыс.

3. Исследовать продукцию метаболитов NO и интенсивность гибели клеток в нейроглиальных культурах и переживающих срезах мозга крыс на модели кислородно-глюкозной депривации (ишемия/реоксигенация).

4. Исследовать влияние окислительного стресса на активность NOC на модели фокальной или глобальной ишемии мозга, после введения нейротоксина AF64A, после введения Р-амилоидного пептида (25-35), а также при непосредственном действии окислителей in vitro.

5. Исследовать соотношение активности NOC и активности каспазы-3 при физиологических состояниях (гибернационный цикл) и патологических воздействиях (PTZ-индуцированные судороги).

6. Исследовать состояние нитрергической и протеолитической систем на различных моделях стресса.

Научная новизна

В работе впервые проведено систематическое исследование биохимических показателей, характеризующих состояние нитрергической и протеолитической систем мозга при моделировании различных патологических процессов, а также с использованием клинического материала.

У больных впервые выявлено появление активности NOC в СМЖ в острый период после ишемического и геморрагического типов инсульта, а также увеличение иммунной реакции на нитрованные белки в этот период.

Впервые показана способность СМЖ контрольной группы пациентов модулировать активность цистеиновых протеаз - калпаина, каспазы-3 и катепсина В, тогда как для СМЖ больных после инсульта выявлены существенные изменения в степени активации или ингибирования протеаз.

На моделях постреанимационной патологии и болезни Альцгеймера (введение холинотоксина AF64A) впервые продемонстрировано, что усиление окислительного стресса сопровождается снижением активности NOC, а в экспериментах in vitro впервые установлено, что окислители вызывают дозозависимое ингибирование активности NOC в гомогенатах коры больших полушарий.

Установлено, что разные типы стресса оказывают разнонаправленное влияние на активность NOC. Более интенсивный стресс, хронический эмоционально-болевой стресс, способствует снижению активности NOC в коре больших полушарий и мозжечке крыс, тогда как умеренный вариант, такой как ранняя социальная изоляция, приводит к активации NOC в отделах мозга цыплят и в коре мозга и гиппокампе крыс.

Впервые обнаружена активация катепсина В и ингибирование активности калпаина и каспазы-3 в коре мозга и гиппокампе крыс в результате хронического эмоционально-болевого стресса.

Впервые удалось выявить секрецию катепсина В нейроглиальными и глиальными культурами мозжечка крысы при метаболическом стрессе, индуцированном заменой культуральной среды на солевой раствор.

Впервые установлено, что при кислых значениях рН катепсин В проявляет способность расщеплять субстрат каспазы-3.

При различных функциональных состояниях мозга в гибернационном цикле сусликов впервые обнаружена активация N00 и каспазы-3 на разных стадиях цикла, а именно на стадии пробуждения и на стадии спячки соответственно.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные в настоящей работе результаты расширяют представление о возможной связи между генерацией оксида азота и свободнорадикальными механизмами развития постреанимационной патологии и холинергической нейродегенерации, вызванной введением холинотоксина АР64А или РА(25-35).

Ингибирование активности N00 активными формами кислорода и/или продуктами свободнорадикального окисления обусловливает непреходящую актуальность применения антиоксидантной терапии для предотвращения повреждающего действия свободнорадикального окисления и создания дефицита N0 в мозге.

Появление иммуноглобулинов в поврежденных ишемией участках мозга, а также наличие иммунной реакции на продукты нитрозативного стресса, индуцированного инсультом, расширяют представление о системах организма, задействованных в механизмах этой патологии, а также ставят вопрос о способах терапевтического воздействия, которые включают в том числе и коррекцию иммуного ответа.

Выявленные в настоящем исследовании перекрестные эффекты ингибиторов цистеиновых протеаз, играющих ключевую роль в развитии церебральных патологий, характеризуют применение ингибиторов в клинической области достаточно проблематичным и предопределяют, наряду с получением более специфических ингибиторов, масштабную проверку их селективности.

Положения выносимые на защиту

1. Изменения состояния нитрергической и протеолитической систем при церебральных патологиях и их моделировании на животных отражают участие этих систем в патогенезе (в т.ч. нейродегенерации) и адаптивном ответе мозга. Регион-специфичная и постадийная модуляция продукции N0, активности NOC и цистеиновых протеаз в мозге происходит при нейродегенерации, вызванной ишемией, судорожной активностью, введением холинотоксина AF64A, Р-амилоидного пептида, а также при стрессорных воздействия различного типа и интенсивности, сезонной нейропластичности - гибернации.

2. Степень деструктивных последствий в острый период инсульта определяется типом инсульта, участием и взаимодействием нитрергической, протеолитической и иммунной систем. Развитие нитрозативного стресса в мозге сопровождается индукцией иммунного ответа, появлением аутоантител к нитрованным белкам и изменением соотношения активаторов/ингибиторов цистеиновых протеаз в ликворе.

3. Ацидоз (в частности, при ишемии) приводит к расширению субстратной специфичности катепсина В мозга (появлению способности расщеплять субстраты каспазы-3), а метаболический стресс стимулирует секрецию катепсина В из нейронов и глии.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на 1-м региональном конгрессе FAONS (Патайя, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), XXXIII Международном конгрессе физиологических обществ (Санкт-Петербург, 1997), 12-м съезде Европейского нейрохимического общества (Санкт-Петербург, 1998), конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), XXX

Всероссийском Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), 15, 17 Съездах Европейского нейрохимического общества «Достижения в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Варшава, 2003; Саламанка, 2007), Х1Х-ХХ1 Съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Екатеринбург, 2004; Москва, 2007; Калуга, 2010), I Съезде РНО «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), 20 Съезде Международного нейрохимического общества (Инсбрук, 2005), 6 и 7 Европейских Форумах по нейронаукам (Женева, 2008; Амстердам, 2010) и апробированы на межлабораторной конференции ИВНДиНФ РАН.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 26 статей, из них 7 в международных изданиях.

17

184 ВЫВОДЫ

1. Изменения в нитрергической, протеолитической и иммунной системах мозга в остром периоде после инсульта зависят от типа и тяжести инсульта. Развитие нитрозативного стресса в мозге сопровождается индукцией иммунного ответа, появлением аутоантител к модифицированным нитрованием белкам и изменением соотношения активаторов/ингибиторов цистеиновых протеаз в СМЖ. Спинномозговая жидкость модулирует активность цистеиновых протеаз - калпаина, каспазы-3 и катепсина В, однако степень активации или ингибирования изменяются в острый период после инсульта и отрицательно коррелирует с активностью N00.

2. В ранний период после фокальной ишемии мозга у крыс снижается активность и экспрессия N00, повышается содержание метаболитов оксида азота и увеличивается уровень иммуноглобулинов в ишемическом полушарии мозга, а также связывание нитрованного БСА в СМЖ.

3. В зависимости от вида нейроглиальных культур и длительности воздействия продукция метаболитов оксида азота возрастает или снижается в ишемический период, остается на высоком уровне на ранних стадиях реоксигенации и в дальнейшем сопровождается деструктивными морфологическими изменениями в нервных клетках и их гибелью.

4. Окислительный стресс через 24 ч после фокальной ишемии характеризуется снижением интенсивности свободнорадикального окисления липидов и повышением окисленности сульфгидрильных групп, а также снижением активности цистеиновых протеаз, калпаина и катепсина В, в мозге животных.

5. Дисбаланс в продукции N0 при ишемическом воздействии, а также после введения Р-амилоидного пептида и холинотоксина АБ64А регионспецифичен и обусловлен активацией N00 или ее ингибированием, степень которого предопределяется, в частности, интенсивностью окислительного стресса на разных стадиях развития патологии.

6. Модуляция активности NOC и каспазы-3 в мозге происходит при эпилепсии и сезонной нейропластичности-гибернации. При смене функционального состояния мозга во время гибернации, активация NOC и каспазы-3 разделены регионарно и постадийно, однако в результате киндлинга активируется NOC, но не каспаза-3.

7. Стрессорные воздействия различного типа и интенсивности изменяют состояние нитрергической системы и активность цистеиновых протеаз. При социальном стрессе в отделах мозга разных видов животных происходит активация NOC, тогда как эмоционально-болевой стресс приводит к ингибированию активности и экспрессии NOC, разобщению генерации и метаболизма N0, ингибированию активности каспазы-3 и калпаина, активации катепсина В, структурно-функциональным изменениям в регионах мозга и гибели клеток.

9. Метаболическое стрессирование нейроглиальных и глиальных культур мозжечка крысы при замене культуральной среды на солевой раствор стимулирует секрецию катепсина В, который при кислых значениях рН способен расщеплять субстрат каспазы-3 более интенсивно, чем каспаза-3, и активность катепсина В блокируется ингибиторами каспазы-3 и катепсина В.

186

Заключение

В работе исследовано состояние нитрергической системы по уровню метаболитов оксида азота и активности/экспрессии NOC и протеолитической системы, представленной ключевыми цистеиновыми протеазами каспазой-3, калпаином и катепсином В и сделана попытка проанализировать взаимодействие этих систем в различных патологических ситуациях в мозге in vivo и на клеточных моделях.

Результаты, полученные на клиническом материале от больных после инсульта, во многом совпадают с результатами, полученными на модели ишемического инсульта на крысах. Накопление NOx в СМЖ больных на ранних стадиях реперфузии выявлено и в СМЖ и в ишемическом полушарии крыс через 24 ч после OJICMA. Увеличение содержания метаболитов N0 в СМЖ больных в ранний период после ишемического инсульта соответствует литературным данным по этому показателю как для экспериментальных животных (Kumura et al., 1994; Games et al., 2003; Xu et al., 2007), так и для больных этой патологией (Kossi and Zakhary, 2000; Krupinsky et al., 1998). Видимое противоречие между накоплением NOx в СМЖ и снижением общей активности/экспрессии NOC в коре ишемического полушария крыс, по-видимому, связано с различием в источниках метаболитов NO, среди которых на этой стадии реперфузии могут быть депонированные формы NO, образовавшиеся в период повышенной ферментативной продукции NO, и/или снижение скорости удаления метаболитов NO в связи с нарушением мозгового кровообращения в ранний постинсультный период. Высокая интенсивность окислительного стресса в мозге после инсульта находит свое отражение и в повышении общей окислительной активности СМЖ больных, и в исчерпанности молекулярных продуктов окисления липидов, и в окислении SH-групп белков и низкомолекулярных тиолов в мозге крыс через 24ч после ишемии. По-видимому, с значительным изменением редокс условий связана и инактивация цистеинсодержащих протеаз, калпаина и катепсина В.

Модулирующее действие СМЖ на активность ключевых для ишемического повреждения мозга протеаз - каспазы-3, калпаина и катепсина В - отражает состояние регуляции протеолитических систем в мозге в ранний период после инсульта. Немногочисленные исследования в этом направлении свидетельствуют об изменении экспрессии эндогенных ингибиторов протеаз при травмах головного мозга, экспериментальном энцефаломиелите и ишемии мозга (Olson et al., 2004; Pirttila and Pitcanen, 2006). Изменение модуляции каспазы-3, калпаина и катепсина В может говорить о дисбалансе в регуляции протеолитических систем в острый постинсультный период.

Повышенная интенсивность нитрозативного стресса в мозге при инсульте сопровождается пероксинитрит-опосредованным нитрованием остатков тирозина в белках, присутствие которых может стимулировать иммунный ответ и продукцию иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин (Ischiropoulos, 2009). Реакция иммунной системы в виде возросшего уровня Ig в ликворе больных и экспериментальных животных, а также высокой плотности Ig в ишемическом полушарии крыс может быть связана ни только с нарушением ГЭБ, но и с in situ продукцией антител, распознающих модифицированные окислительным/нитрозативным стрессом белки. Появление иммуноглобулинов в поврежденных инсультом регионах мозга, а также усиление связывания нитрованных белков в СМЖ может предопределять как защитные, так и повреждающие последствия нейроиммунных взаимодействий (Ren and Adamus, 2004; Hülse et al., 2008).

Нейроглиальные культуры мозжечка и органотипические эксплантаты гиппокампа крысы проявили различную способность к продукции NO во время КГД - повышение в клетках-зернах и снижение в эксплантатах гиппокампа. Ранее в экспериментах in vivo была выявлена прямая корреляция возрастания уровня NO с накоплением нитритов в ткани мозга при ишемии (Kader et al., 1993; Malinski et al., 1993). Принято считать, что увеличение нитратов и нитритов в клетках-зернах мозжечка in vivo и in vitro является результатом активации NOC (Widdowson et al., 1996). Полученные данные согласуются с данными других исследователей, которые наблюдали снижение продукции N0 в поле CAI при инкубации срезов гиппокампа в среде без кислорода и глюкозы, несмотря на значительное увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са (Kojima et al., 2001). В органотипических эксплантатах гиппокампа в какой-то мере сохраняются нейроглиальные взаимодействия, синаптические контакты и анатомическая структура (Gahwiler et al., 1997) в отличие от диссоциированных клеточных культур мозжечка. К тому же клетки-зерна мозжечка более устойчивы к КГД и длительность ишемии составляет не менее 2-х часов, чтобы начались структурные изменения в клетках, тогда как для эксплантатов гиппокампа достаточно 30-40 мин КГД. В дальнейшем, высокий уровень нитритов в период реоксигенации, по-видимому, предопределяет последующие деструктивные изменения и гибель нейронов как в нейроглиальных культурах мозжечка, так и в эксплантатах гиппокампа.

Среди механизмов ишемического повреждения мозга окислительный стресс является общим механизмом в патогенезе различных патологий, в том числе и нейродегенеративных заболеваний. Дисрегуляция продукции АФК и РФА может повлечь за собой модификацию структуры и функций белков, нарушение внутриклеточного сигналлинга, повреждение и гибель клеток (Berlett and Stadtman, 1997; Stadtman and Levine, 2003; Butterfield et al., 2007). Снижение активности NOC в отделах мозга после OJICMA, ГИМ и инъекции нейротоксина AF64A совпадало с усилением окислительного стресса в исследованных структурах, а ингибирование активности фермента различными окислителями in vitro свидетельствует об одном из возможных путей воздействия продуктов окислительного стресса на биосинтез NO при церебральных патологиях. Однако в условиях умеренного окислительного стресса, который наблюдался после введения Р-амилоидного пептида, снижение активности NOC не совпадало с усилением радикалообразования и накопления молекулярных продуктов окисления липидов.

На ранних сроках после инсульта выявлены отрицательные корреляции между модулирующим действием СМЖ на протеазы и активностью NOC. На модели фокальной ишемии у крыс получены положительные корреляции между уровнем NOx в ишемическом полушарии и активностью каспазы-3 и калпаина в ишемическом полушарии, а при КГД нейрональных и органотипических культур изменения в продукции N0 предшествовали деструкции и гибели клеток. Одним из общих механизмов патогенеза церебральных патологий является эксайтотоксичность. Известно, что существенный вклад в глутамат-индуцированную гибель нейронов вносят hNOC и NO (Huang et al., 1994; Dawson et al., 1996). Причем интенсивная гиперстимуляция глутаматных рецепторов приводит к некротической клеточной смерти, в то время как умеренная или хроническая стимуляция может завершаться апоптозом или иной формой клеточной гибели (Ankarcrona et al., 1995; Bonfoco et al., 1995; Budd et al., 2000).

Ранние исследования свидетельствуют о том, что при PTZ-индуцированной эпилепсии увеличение высвобождения глутамата приводит к активации hNOC и увеличению продукции NO (Endoh et al., 1994; Garthwaite and Boulton, 1995). Активацию каспазы-3 после острого введения PTZ выявили недавно только в единичных исследованиях на культурах нейронов и в мозге крыс (Naseer et al., 2009; 2011). В нашем исследовании активность NOC и активность каспазы-3 не изменялись на различных стадиях судорог после острого введения PTZ. По-видимому, временную активацию hNOC, опосредованную глутаматом in vivo, сложно детектировать, определяя активность фермента in vitro в условиях оптимального соотношения субстрата и кофакторов. Тем не менее, активация NOC, но не каспазы-3 происходила только в результате хронического введения подпороговой дозы PTZ при киндлировании животных. Положительные корреляции между активностью NOC' и каспазы-3, выявленные в мозге контрольных и кнндлнрованных животных, исчезали в результате острого введения PTZ. Вероятно, длительное введение субконвульсивной дозы PTZ не изменяет или восстанавливает взаимосвязь активности NOC и каспазы-3.

Среди патогенетических механизмов реакции на стресс и ишемии мозга активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и глутаматная эксайтотоксичность являются общими звеньями для этих патологий. Стресс может оказывать различные эффекты в зависимости от частоты и интенсивности стрессорного стимула (Madrigal et al., 2006). В результате различных вариантов ранней социальной изоляции у цыплят и крыс обнаружено повышение активности NOC в регионах мозга, чувствительных к стрессу у этих видов животных, и оно зависело от длительности и интенсивности стрессорного воздействия. Повышение тревожности у крыс сразу после хронической изоляции совпадало с активацией NOC в гиппокампе животных. В основе указанных нарушений поведения лежат изменения в системах нейротрансмиттеров, таких как серотонин, дофамин, ГАМК, глутамат и модулирующих эффектах N0 на их высвобождение (Lorrain and Hull, 1993; Strasser et al., 1994; Segovia et al., 1994; Kaehler et al., 1999).

Продолжительные и эмоционально-болевые формы стресса связаны со структурно-функциональными изменениями в ЦНС. Например, хронический стресс индуцирует атрофию дендритов пирамидальных нейронов поля САЗ гиппокампа (Magarinos and McEwen, 1995), подавляет нейрогенез в зубчатой фасции (Fuchs and Flügge, 1998; Gould and Tanapat, 1999) и приводит к уменьшению объема гиппокампа (Czeh et al., 2001; van der Hart et al., 2002). В результате нашего исследования обнаружено снижение числа hNOC-содержащих нейронов, а также снижение общего числа нейронов в неокортексе и гиппокампе, т. е. в регионах с высоким уровнем глюкокортикоидных и минералкортикоидных рецепторов (Sorrels et al., 2009). Уменьшение активности общей NOC согласуется с подобными изменениями, однако повышенный уровень метаболитов NO в этих структурах указывает на дисбаланс между ферментативным биосинтезом N0 и его дальнейшим метаболизмом, что подтверждает и отсутствие иммунопозитивных клеток, окрашенных на hNOC. Снижение общего числа нейронов в гиппокампе после стресса, а также отсутствие апоптотических клеток и снижение активности каспазы-3, свидетельствуют о гибели клеток, но не по пути апоптоза. Известно, что глюкокортикоиды регулируют пролиферацию и выживание клеток (Alonso, 2000; Wong and Herbert, 2004), оказывают про- и анти-апоптотическое действие в ЦНС (Almeida et al., 2000), причем блокирование апоптоза может осуществляться в том числе и за счет ингибирования активности каспазы-3 (Malaeb et al., 2003). Увеличение активности катепсина В, по-видимому, является признаком дестабилизации лизосом, но не по калпаин-зависимому механизму, описанному Yamashima (2004), поскольку активность калпаина понизилась после хронического стресса, а под действием других факторов, в том числе и циркуляторной гипоксии, являющейся одним из ключевых звеньев влияния хронического стресса на мозг (Айрапетянц, 1997). Убыль нейронов в гиппокампе и отсутствие признаков апоптоза не исключает другие варианты гибели клеток с участием катепсина В, такие как некроз и аутофагия.

Метаболическое стрессирование клеток посредством замены культуральной среды на солевой раствор приводило к секреции катепсина В из нейроглиальных и глиальных культур. Раннее показано, что активированные клетки микроглии секретируют катепсин В (Ryan et al., 1995; Kingham and Pocock, 2001), но в настоящем исследовании это продемонстрировано для культур, в которых преобладали нейроны и астроциты. Изменения в мозговом кровотоке при ишемии/реперфузии создают метаболический стресс для клеток мозга, в результате которого секретируемый катепсин В может расщеплять субстраты, находящиеся на внешней стороне плазматической мембраны клеток, а также модифицировать белки внеклеточного матрикса (Buck et al., 1992) и способствовать миграции клеток (Kawada et al., 1997). Ацидоз, который наблюдается при ишемии мозга, может обеспечивать расширение спектра протеолитической активности катепсина В, в том числе и в отношении субстратов каспазы-3. Аминокислотная последовательность синтетического субстрата каспазы-3 Ac-DEVD-AMC соответствует сайту расщепления поли(АДФ-рибозо)полимеразы (PARP) фермента, участвующего в репарации ДНК. Известно, что PARP, локализованная в ядре клетки, подвергается протеолитическому расщеплению каспазой-3 во время апоптоза (Nicholson et al., 1995), но и при некротической гибели также происходит расщепление PARP (Shah et al., 1996; Casiano et al., 1998), причем участие в этом лизосомальных протеаз также показано (Gobeil et al., 2001). Таким образом, катепсин В и каспаза-3 имеют общие физиологические и синтетические субстраты, а изменение вне- и внутриклеточного pH, по-видимому, может изменять специфичность протеолитической активности катепсина В.

Значительные изменения мозгового кровообращения при гибернационном цикле не приводят к повреждению мозга, более того, суслики в активном состоянии проявляют большую устойчивость к ГИМ, по сравнению с крысами (Dave et al., 2006). Морфологические изменения в нейронах, происходящие во время входа и выхода из спячки, свидетельствуют о том, что мозг гибернирующих животных является моделью быстрой и обратимой нейрональной пластичности (Popov et al., 1992 ; von der Ohe et al., 2006; von der Ohe et al., 2007). Увеличение активности NOC на стадии пробуждения после гибернации может свидетельствовать об усилении центрального активирующего нитрергического влияния на восстановление функциональной активности сусликов после спячки. Снижение активности NOC во время спячки в стволе мозга, содержащем NOC-позитивные нейроны, которые принимают участие в регуляции дыхания (Ogawa et al., 1995), и активация каспазы-3 в этом отделе при вхождении в спячку и между баутами, по-видимому, являются одним из адаптационных механизмов в супрессии метаболизма, в котором задействованы нитергическая и протеолитическая системы мозга гибернирующих животных.

Суммируя вышеизложенное, можно с очевидностью предположить, что изменения в нитрергической и протеолитической системах происходят при всех исследованных патологиях мозга (Рис. 42), однако степень и характер этих изменений зависят от интенсивности сопутствующих механизмов, например, окислительного стресса, а также локализации в отделах мозга и стадии развития патологии.

Нитрергическая Протеолитическая система система

Ц,ШС ГИБЕРНАЦИОННЫЙ ЦИКЛ |каспаза-3 гибель клеток отсутствует)

ИШЕМИЯ МОЗГА Нарушение мозгового кровотока Эксайтотоксичность Окислительный стресс

Ж)С

-N00

Т|ШС

Ж)СТЖ)х нд

Ж)х |Ж>С ¿ШСТИох

СТРЕСС Изоляционный I

ЭПИЛЕПСИЯ Судороги КИНД^ИНГ

НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИЯ АЕ64А Р-амилоид^(25-35)

СТРЕСС Хронический эмоционально-болевой

Метаболический куд

ГЛОБАЛЬНАЯ ИШЕМИЯ ФОКАЛЬНАЯ ИШЕМИЯ нд

-каспаза-3 -каспаза-3 нд нд каспаза-3 |калпаин Ткатепсин В секреция катепсина В нд нд

-каспаза-3 ¿калпаин ¿катепсин В

Рнс. 42. Гипотетическая схема распределения церебральных патологий с общими механизмами патогенеза в ряду усиления деструктивных процессов и изменения в нитрергической и протеолитической системах. Примечания: «-» перед показателем - отсутствие его изменений; нд -показатель не детектировали.