Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в патогенезе злокачественных опухолей

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НОВОСИБИРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правахрукописи

ПОТЕРЯЕВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

РОЛЬ ЭНДОГЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

14.00.16- патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосиби рск-2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физиологии СО РАМН, Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Антонов Александр Рудольфович Короленко Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Цырендоржиев Дондок Дамдинович

доктор медицинских наук,

профессор Шарапов Виктор Иванович

доктор медицинских наук Душкин Михаил Иванович

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет МЗ РФ (г. Томск).

Защита состоится г. в_час на засе-

дании Диссертационного совета Д 208.062.04 при Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект 52.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ

Автореферат разослан " / " — ,2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Зубахин А. А.

А////"

2005-4 12642

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активация протеолитической системы является универсальным звеном в развитии опухолевого процесса (Локшина Л. А., 1991: Оглоблина О. Г. и Арефьева Т. И., 1994; Lah Т. and Kos J., 1998; Ferreras M. et al., 2000: DeClercke Y. et al., 2004). С повышенной способностью синтезировать и секретировать цистеиновые, сериновые и аспартильные протеиназы опухолевыми клетками связывают инвазивный рост (Keppler D. et al., 1994; Kirchke H. et al., 1997; Levicar N. et al., 2003), ангиогенез и метастазирование злокачественных опухолей (Werle В., 1997; Korolenko Т. A. et al., 1998; Turk В. et al., 2002; Sloane В. F. et al., 2003). Высокая активность цистеиновых протеиназ характерна для мембранных фракций опухолевых клеток (Okamoto I. et al., 1999, Verle В. et al., 2003). В тканях многих опухолей показано повышение экспрессия мРНК цистеиновых протеиназ, увеличение активности и содержания ка-тепсинов В, L и Н (Kirschke H. et al., 1995; Korolenko Т. A. et al., 1998; Lah T. et al., 2003), обнаружено нарушение гликозилирования катепсинов, увеличение их предшественников (Moin К. et al., 1998; Короленко Т. А. и др., 2004). Лизосо-мальные цистеиновые протеиназы расщепляют многие белки внеклеточного матрикса, что приводит к деструкции ткани, лизису базальной мембраны и способствует инвазии опухолей. Протеиназы могут ослаблять антигенные свойства раковых клеток путем расщепления определенных участков, ответственных за иммуноспецифичность, модифицировать иммуноглобулины таким образом, что последние теряют свою защитную функцию против раковых клеток (Веремеенко К. Н., 2000).

Функции цистеиновых протеиназ регулируются эндогенными ингибиторами — цистатинами, стефинами и кининогенами (Hibbetts К. et al., 1999; Grubb А., 2000). Предполагают, что внутриклеточные ингибиторы лимитируют активность протеолитических ферментов, тем самым сдерживают инвазию и мета-стазирование опухолей (Turk В et al., 2002; Sever N et al., 2003). Снижение количества ингибиторов цистеиновых протеиназ при трансформации доброкачественной папилломы в карциному у мышей (Hawley-Nelson P. et al., 1998), низкая концентрация ингибиторов в опухолевой линии эмбриональных фибробла-стов крыс по сравнению с нормальными клетками (Sloane В. F. et al., 1999) приводят к неконтролируемому росту опухоли. Проведение исследований, связанных с изучением эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ при различных патологических состояниях, в том числе и канцерогенезе, затруднено тем, что количество ингибиторов в биологических жидкостях и тканях измеряется в нано- и пикомолях и становится возможным с развитием иммуноферментных технологий. До настоящего времени роль внутриклеточных ингибиторов, лимитирующих действие протеиназ при опухолевом росте, изучено недостаточно.

Перспективным в этом отношении является поиск факторов, влияющих на повышение содержания эндогенных ингибиторов в организме, что может стать новым подходом к терапии злокачественных опухолей. Например, применение синтетических ингибиторов цистеиновых протеиназ Е-64 или флюорометилке-тона in vivo приводит к стойкому и полному подавлению некоторых экспериментальных опухолей (Coulibaly S et al., 1999, Van Noorden С. J. et al., 2000). Введение гена цистатина С в клетки карциномы мыши сопровождается снижением инвазивной способности опухоли (Huh С. J. et al., 1999).

На современном этапе развития онкологии все большее внимание уделяется изысканию средств, патогенетически влияющих на опухолевый процесс и усиливающих эффективность химиотерапии. Для клинической медицины наиболее перспективны водорастворимые полисахариды, такие как карбоксимети-лированный и сульфоэтилированный -гликаны, обладающие способ-

ностью стимулировать секрецию цитолитических /цитостатических факторов макрофагов. Обнаружено противоопухолевое и антиметастатическое действие (1—»3)-р-0-гликанов на моделях опухолей мышей с химически индуцированной саркомой печени, меланомой и при клиническом использовании у человека (Czop J., Kay J, 1991; Kasai S et al., 1991; Kogan G., 2003). Однако, до настоящего времени остается не исследованным влияние цитостатиков и водорастворимых полисахаридов со структурой -гликанов на содержание эндогенных ингибиторов в тканях опухоли. Неизвестно, связан ли механизм их действия со способностью изменять уровень эндогенных ингибиторов в организме. Остается неизученным, могут ли исследуемые гликаны стимулировать синтез и секрецию ингибиторов протеиназ в макрофагах, подобно синтезу ФНО- а. Представляет интерес изучение Украина (Ukrain, Nowicky Pharma, Австрия) - нового полусинтетического средства, приготовленного на основе растительного сырья (производное алкалоидов Чистотела большого, Chelidonium majus L), известного как иммуностимулирующий препарат с антинеопластическим действием (Liepins A. et al., 1996; Nowicky J., 1996)).

В последнее время обсуждается иммуномодулирующая роль липопротеи-нов, известных ранее только как средство транспортировки триглицеридов, холестерина и других липидов в организме. Сегодня липопротеины привлекают внимание в связи с выполнением ими функций, не связанных с обменом липи-дов: влияние на стероидогенез (Поляков Л. М., Панин Л. Е., 2000), сердечнососудистую (Parhami F et al., 2002) и иммунную системы (Desanctis J. В. et al., 1995; Доценко Э. А. и др., 2001), защита организма от инфекции (Burger D., Dayer J., 2002). В современной литературе имеются лишь единичные сообщения о стимулирующем влиянии липопротеинов и их белковых компонентов на экспрессию отдельных генов и синтез некоторых белков (Ashby D. Т. et al., 1998; Zerbinatti С, Dyer С, 1999). Липопротеины могут изменять функциональ-

ную активность макрофагов (Бапй С. й а1., 2002; 8а10Ш0Ш80п Ь. й а1., 2003). Полагают, что с активацией макрофагов сопряжена их противоопухолевая активность (Литвяков Н. И. и др., 2001; ИегЬеиуа11-РЬ. й а1., 2003). Остается не исследованным влияние липопротеинов на синтез и секрецию ингибиторов цистеиновых протеиназ в макрофагах в норме и в условиях опухолевого роста.

Цель исследования. Выявить роль эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ как факторов, сдерживающих инвазию и метастазирование злокачественных опухолей и изучить механизмы их регуляции под влиянием противоопухолевых препаратов.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание цистатина С и стефина А в тканях и биологических жидкостях человека и мыши в норме.

2. Исследовать содержание цистатина С и стефина А в опухолевой ткани и органах, не вовлеченных в опухолевый процесс (печень, селезенка, сыворотка крови) при развитии экспериментальных мышиных опухолей: лимфосаркомы Ь8, НА-1 гепатомы и аденокарциномы легких Льюис ЬЬА.

3. Исследовать взаимосвязь между противоопухолевым эффектом цикло-фосфана, водорастворимых (1—*3)-Р-0-гликанов, Украина и содержанием ингибиторов цистеиновых протеиназ в тканях и сыворотке крови при изолированном и совместном введении препаратов на моделях лимфосаркомы Ь8 и аденокарциномы легких Льюис ЬЬА.

4. Исследовать взаимосвязь между противоопухолевым эффектом Украина, карбоксиметилированного (1—>3)-Р-П-гликана и содержанием ингибиторов цистеиновых протеиназ в тканях и в сыворотке крови при изолированном введении препаратов на модели НА~1 гепатомы.

5. Исследовать содержание цистатина С в сыворотке крови при развитии и лечении лимфосаркомы БЬ8, резистентной к противоопухолевой химиотерапии.

6. Изучить взаимосвязь между весом опухоли и содержанием цистатина С в тканях опухоли и в сыворотке крови мышей с экспериментальными опухолями. Оценить возможность использования количественного определения ингибитора в сыворотке крови, как биологического маркера опухолевого роста и показателя эффективности проводимой химиотерапии.

7. Изучить влияние различных макрофагальных стимуляторов полисаха-ридной природы (ЛПС, КМГ, 8Е-гликана), нативных липопротеинов и их комбинации на секрецию цистатина С и стефина А в культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей и мышей с НА-1 гепатомой.

8. Изучить влияние нативных липопротеинов на синтез и секрецию апо-протеинов А-1 и Е в культуре гепатоцитов и клетках Купфера.

Научная новизна. Показано, что цистатин С и стефин А обнаруживается во многих тканях и сыворотке крови интактных мышей линии СВА, (СВАхС57В1/6) РьА/5п, наибольшее количество ингибитора обнаружено в ткани мозга. В тканях мышей концентрация стефина А больше, чем цистатина С.

Впервые показано, что развитие экспериментальных опухолей с различными гистологическими типами характеризуется низким содержанием циста-тина С и стефина А в опухолевой ткани по сравнению с другими органами. Минимальное количество цистатина С выявлено в опухолевой ткани аденокар-циномы ЬЬА, характеризующейся метастазами в легкие. Рост исследуемых опухолей сопровождается снижением концентрации цистатина С в печени, селезенке и сыворотке крови.

Впервые показано, что циклофосфан, подавляя рост основного опухолевого узла и оказывая антиметастатический эффект, увеличивает содержание основных внутриклеточных ингибиторов в ткани опухоли, печени и селезенки и в сыворотке крови у мышей с лимфосаркомой LS и аденокарциномой ЬЬА.

Впервые выявлено, что карбоксиметилированный и сульфоэтилированный (1-»3)-р-В-гликаны или Украин потенцируют действие циклофосфана, совместное применение одного из стимуляторов макрофагов и противоопухолевого препарата приводит к максимальному увеличению содержания ингибитора в тканях и сыворотке крови.

Впервые показано, что применение нового противоопухолевого препарата Украина у мышей с НА-1 гепатомой увеличивает продолжительность жизни мышей, снижает ежедневный прирост массы опухоли, асцита и массу асцитной жидкости, изменяет клеточный состав асцита, снижая количество опухолевых клеток и увеличивая количество макрофагов. Введение Украина увеличивает содержание цистатина С и стефина А в клетках опухоли и восстанавливает концентрацию ингибиторов в печени и селезенке. Подобный положительный противоопухолевый эффект на примере НА-1 гепатомы продемонстрирован при введении животным карбоксиметилированного -гликана.

Впервые выявлены изменения концентрации цистатина С в сыворотке крови в динамике развития (на 12, 17 и 20 день) аденокарциномы легких Льюис LLA и при введении противоопухолевых препаратов. Установлено что, модификаторы биологического ответа, гликаны, оказывают положительный эффект на содержание цистатина С в сыворотке крови у мышей с LLA в зависимости от массы опухоли: при небольшой массе опухоли (не более 2,7 г) КМГ или $Е-гликан позволяют снизить дозу циклофосфана в 2-5 раз без снижения его противоопухолевого и антиметастатического эффекта. Если вес опухоли достигает более 5,7 г, одного введения циклофосфана недостаточно для достижения по-

ложительного эффекта, КМГ, SE-гликан или Украин усиливают действие цик-лофосфана.

Развитие лимфосаркомы RLS, резистентной к противоопухолевой терапии по сравнению с опухолью LS, отличалось злокачественным течением: более быстрым ростом трансплантатов и ранней гибелью животных, в сыворотке крови содержание цистатина С в 1,5 раза ниже, чем при US. Введение цикло-фосфана в дозе 150 мг/кг веса не изменяет содержание ингибитора в сыворотке крови мышей с RLS.

Впервые изучено влияние различных стимуляторов полисахаридной природы и липопротеинов плазмы крови на секрецию и синтез цистатина С и сте-фина А в культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей. Сульфоэти-лированный и карбоксиметилированный (I—>3)-Р-0-гликаны в 4-5 раз увеличивают секрецию ингибиторов в примированных макрофагах. Липопротеины низкой и высокой плотности увеличивают секрецию цистатина С и стефина А, их стимулирующий эффект более выражен по сравнению с изученными полисахаридами. При совместном воздействии липопротеинов и (l-»3)-P-D гликанов наблюдается многократное увеличение секреции ингибиторов. Действие ЛПВП почти в два раза больше, чем ЛПНП, а через два часа более выражено (в 4,6 раза) по сравнению с 30-минутным сроком.

Впервые показано, что перитонеальные макрофаги мышей с экспериментальной НА-1 гепатомой секретируют больше цистатина С, чем интактные клетки. Липопротеины низкой и высокой плотности увеличивают секрецию цистатина С в среду инкубации макрофагов мышей с НА-1 гепатомой. При совместном действии липопротеинов с КМГ или SE-гликаном этот эффект усиливается.

Установлено, что липопротеины высокой плотности совместно с гидрокортизоном усиливают в несколько раз синтез и секрецию цистатина С макрофагами от мышей с гепатомой НА-1, аполипопротеина Е - в культуре клеток Купфера, аполипопротеина A-I — в культуре гепатоцитов.

Впервые показано изменение содержания цистатина С в сыворотке крови у больных с гемобластозами (острый лейкоз, злокачественная неходжскинская лимфома, лимфогранулематоз, миеломная болезнь) и раком тела матки I и II стадии заболевания.

Практическая значимость. Выявленное антигенное сходство между ингибиторами человека и мыши позволило использовать наборы для определения цистатина С и стефина А человека для исследования содержания эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ у экспериментальных животных, в частности мышей линии A/Sn, CBA, (СВАхС57В1/6) F1.

Увеличение концентрации ингибиторов цистеиновых протеиназ в сыворотке крови при введении противоопухолевых препаратов коррелировало со снижением веса основного опухолевого узла экспериментальной опухоли. Это предполагает использовать определение ингибиторов в сыворотке крови в качестве маркера опухолевого роста и для оценки эффективности проводимой химиотерапии не только у животных, но и в сыворотке крови больных со злокачественными новообразованиями.

Водорастворимые карбоксиметилированный и сульфоэтилированный -гликаны или Украин при совместном введении с циклофосфаном потенцировали его противоопухолевое действие и приводили к максимальному увеличению содержания ингибитора в тканях и сыворотке крови мышей с экспериментальными опухолями, что позволяет снизить дозу основного противоопухолевого препарата. Это открывает новые возможности применения глика-нов или Украина для клинического использования при химиотерапии злокачественных опухолей человека.

Полученные данные по применению иммуностимулятора Украина подтвердили его противоопухолевый эффект, связанный с повышением содержания ингибиторов цистеиновых протеиназ (цистатина С и стефина А) в клетках мышиной НА-1 гепатомы.

Липопротеины и водорастворимые (1->3)-Р-0-гликаны, обладающие иммуностимулирующими свойствами, при совместном введении во много раз увеличивали синтез и секрецию цистатина С и стефина А в макрофагах, что предполагает разработку препарата, усиливающего содержание ингибиторов цистеиновых протеиназ в организме, как нового противоопухолевого средства.

Внедрение результатов исследования. Теоретические и практические аспекты, разрабатываемые в диссертационном исследовании, внедрены в научный и учебный процесс кафедр патологической физиологии и онкологии Новосибирской государственной медицинской академии МЗСР РФ по тематическим разделам «Патология тканевого роста» и «Канцерогенез».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитие мышиных экспериментальных опухолей с различными гистологическими типами характеризуется очень низкой концентрацией эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в опухолевой ткани, а опухоленоситель-ство сопровождается снижением содержания ингибиторов в печени, селезенке и сыворотке крови.

2. Водорастворимые (1—>3)-|3-0-гликаны (КМГ, 8Е-гликан) или Украин повышают эффективность противоопухолевого действия циклофосфана, позволяют снизить дозу цитостатика и значительно увеличивают содержание ингибиторов в тканях опухоли, печени, селезенки и сыворотке крови.

3. Содержание цистатина С в сыворотке крови является прогностическим критерием опухолевого роста и проводимой противоопухолевой терапии.

4. Мышиные перитонеальные макрофаги секретируют внеклеточно ингибиторы цистеиновых протеиназ (цистатин С и стефин А). Макрофагальные стимуляторы полисахаридной природы (КМГ, SE-гликан) и/или нативные ли-попротеины увеличивают секрецию ингибиторов in vitro.

5. Процесс усиления синтеза и секреции белков под влиянием липопротеи-нов универсален и имеет место в различных клетках в норме и при развитии опухоли. Липопротеины усиливают секрецию цистатина С в макрофагах ин-тактных мышей и мышей с экспериментальной гепатомой НА-1, аполипопро-теина Е - в клетках Купфера и повышают содержание аполипопротеина A-I в культуре гепатоцитов.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Здоровье человека в Сибири» (Новосибирск, 1989), X Всесоюзном симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (Гродно, 1990), Ш съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), XII рабочем совещании Европейской группы по исследованию лизосомальных нарушений (Vidago, Португалия, 1999), I Международной конференции и V ежегодном собрании международного общества по химиопрофи-лактике опухоли «Профилактика и генетика опухоли» (St Gallen, Швейцария, 2000), V Всемирном конгрессе: «Травма, шок, воспаление и сепсис» (Munich, Германия, 2000), Рабочем совещании с международным участием «Лизосомные болезни, модели, терапия» (Новосибирск, 2000), Научной сессии к 65-летию НГМА (Новосибирск, 2000), ХШ рабочем совещании ESGLD (Woudschoten, Нидерланды, 2001), П Международном конгрессе по иммунологии (Stockholm, Швеция, 2001), II Международной конференции по биологии экспериментальных опухолей (Bovec, Словения, 2002), X Братиславском симпозиуме по саха-ридам (Smolenice, Словакия, 2002), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: функциональные и клинические аспекты» (Новосибирск, 2002), второй научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М. Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), IV съезде физиологов (Новосибирск, 2002), П Международной конференции «Профилактика и генетика опухоли» (St. Gallen, Швейцария, 2002), Ш Международной конференции «Противоречия в профилактике и генетике опухоли» (St. Gallen, Швейцария, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 53 работы, из них 30 статей - в рецензируемых отечественных (18) и - иностранных журналах (12) Получено авторское свидетельство на изобретение: А/с №1737340 «Способ определения апопротеина A-I в сыворотке крови» от 1 февраля 1992 г.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 241 странице машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список используемой литературы. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 29 рисунками. Список цитируемой литературы включает 384 источника, в том числе 72 отечественных и 312 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы 2-3-х месячные мыши-самцы линии A/Sn, массой 16-18 г (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск), 3-х месячные мыши-самцы СВА, массой 20-23 г (Институт физиологии СО РАМН, Новосибирск), а также 3-4-х месячные мыши-самцы (СВАхС57В1/6) F1, массой 26-30 г. (НИИ фармакологии Томского научного центра, сертификат 159-87).

В работе использовали перевиваемые опухоли мышей, разработанные ст. н. с. Калединым В. И. (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск): 1) лимфосаркому LS, индуцированную введением мышам СВА N-метилнитрозомочевины в дозе 60 мг/кг однократно, внутривенно (Каледин В. И. и др., 2000). Клетки опухоли криоконсервировали; после размораживания опухоль адаптировали на животных в течение одного пассажа в асцитной форме, а затем перевивали мышам в мышцы правого бедра по 1 х 106 клеток на мышь; 2) лимфосаркому RLS, резистентную к воздействию циклофосфана; 3) гепатому НА-1, первично индуцированную введением мышам линии A/Sn орто-аминоазотолуола подкожно по 10 мг на мышь в течение 8 месяцев (Каледин В. И., и др., 1972). Опухолевые клетки перевивали по 1,25x10е клеток на мышь внут-рибрюшинно; 4) карциному легких Льюис LLA, клетки опухоли вводили по 5х10б мышам линии C57B1/6J в мышцу правого бедра.

В работе использовали циклофосфан (ЦФ, АО Биохимик, Саранск, Россия) в дозах 25, 50, 100, 150 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно; карбоксиметили-рованный и сульфоэтилированный (1->3)-р-В-гликаны (КМГ и SE-гликан, Институт химии Словацкой Академии Наук, Братислава, Словакия) в дозе 25 мг/кг однократно, внутрибрюшинно; Украин (Ukrain, Nowicky Pharma, Австрия) по 0,5 мг/20 г массы животного однократно или в той же дозе пятикратно, внутри-брюшинно. Все препараты вводили изолированно или одновременно в комбинации с ЦФ на 7-10 сутки после трансплантации опухоли.

Эффективность препаратов оценивали по проценту торможения роста опухоли в динамике ее развития - по объему первичного узла, в конце эксперимен-та—по массе опухоли. Антиметастатическое действие препаратов исследовали на модели LLA по проценту животных с метастазами в легкие, среднему числу метастазов на одно животное. Вес асцита определяли как разницу между весом мыши до и после вскрытия брюшной полости и удаления асцита. Масса асцит-

ных клеток определяли после центрифугирования асцита при 3000 об/мин в течении 20 мин.

Макрофаги получали от мышей линии C57BL/6J, примированных in vivo 4%-раствором крахмала за 3-5 дней до взятия материала. Макрофаги выделяли из перитонеального экссудата мышей путем промывания брюшной полости раствором RPMI-1640 с последующей адгезией на пластике (Клаус Д., 1990). Перитонеальный экссудат 3-4 мышей объединяли и по 2 мл помещали в куль-туральные чашки Петри диаметром 35 мм (1,5-2x106 клеток на чашку). Для стимулирования макрофагов in vitro использовали полисахариды бактериального (ЛПС, Sigma, США) или дрожжевого (КМГ и SE-гликан) происхождения в концентрации 10 мкг/мл среды и ЛПНП и ЛПВП - в концентрации 1 мг белка на 1 мл среды. Инкубацию проводили при 37° в течение 2 ч.

Для биохимических исследований использовали сыворотку крови, гомоге-наты опухолевой ткани, печени и селезенки мышей. Гомогенаты тканей готовили (De Duve С. et.al, 1963) с дополнительной обработкой 0,1% раствором Тритона Х-100 для лучшего выявления антигенных детерминант для цистатина С и стефина А. Содержание белка (Lowry О. Н. е. а., 1951) проводили с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (Serva, ФРГ).

В работе использовали следующие биохимические методы:

1) количественное определение ингибиторов и цистеиновых протеиназ в тканях и сыворотке крови: цистатина С, стефина А, катепсина В с использованием наборов для иммуноферментного анализа (KRKA, Словения); 2) спектро-фотометрическое определение al -протеиназного ингибитора (Яровая Г. А. и др., 1982); 3) твердофазный иммуноферментный анализ апопротеинов в культуре гепатоцитов, клетках Купфера и сыворотке крови (Lin R., 1986); 4) выделение липопротеинов сыворотки крови методом препаративного ультрацентрифугирования (Hatch F., Lees R., 1968); 5) хроматографические методы очистки аполипопротеинов, которые проводились совместно с заведующим лабораторией медицинской биотехнологии Института биохимии, д. м. н., профессором Поляковым Л. М.; 6) электрофорез аполипопротеинов в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (Laemmli U. К., 1970); 7) получение антисывороток к отдельным апопротеинам путем подкожной иммунизации кроликов с последующим выделение IgG фракции из сыворотки крови осаждением сульфатом аммония (Фримель Г., 1987); 8) двойная радиальная иммунодиффузия (Ouchterlony О., 1958); 9) иммуноблоттинг (Tovey E., 1987); 10) метод получения гепатоцитов (Seglen, 1973) с изолированием клеток Купфера по модифицированному методу (Усынин И. Ф., 1999) выполнялся ведущим научным сотрудником лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий Института биохимии д. м. н. Усынипым И. Ф.; 11) выделение ядерных структур из гепатоцитов и клеток других тканей крыс (Gottesfield J. е. а., 1976).

Весь материал получен, обработан и проанализирован лично автором.

Статистическую обработку результатов проводили с вычислением среднего арифметического (М) и ошибки среднего арифметического (т), используя стандартный пакет программ Statistica, применяя t-критерий Стьюдента, многофакторный регрессионный анализ с пошаговым отбором вариант и вычислением коэффициента корреляции (г).

Работа частично поддержана грантом Интас 2001-0592.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Концентрацию ингибиторов цистеиновых протеиназ, цистатина С (ЦС) и стефина А (СА), исследовали в гомогенатах опухолевых тканей, печени, селезенке, легких, асцитных клетках и асцитической жидкости, в сыворотке крови интактных мышей и мышей с экспериментальными опухолями. У людей содержание ингибиторов изучали в сыворотке крови, моче, спинномозговой и синовиальной жидкостях, слюне. Для увеличения иммунохимической выявляемо-сти антигенных детерминант ингибиторов использовали дополнительную обработку тканей 0,1% раствором Тритона Х-100. Показано увеличение экстинции образца в среднем в 2-3 раза во всех исследуемых тканях.

Нами выявлено, что в сыворотке крови здорового человека концентрация ингибитора составляла 68 ±11 нмоль/л, что аналогично литературным данным (Kos J. et al., 2000), ниже содержание ЦС в слюне - 2,4 ± 0,8 нмоль/л и моче -2,6 ± 0,5 нмоль/л. Наибольшее содержание цистатина С обнаружено в синовиальной жидкости больных при различных артритах: при реактивном — 485 ± 76,4 нмоль/л, при ревматоидном артрите - 902 ± 76,4 нмоль/л. Спинномозговая жидкость больных при менингитах содержит большое количество цистатина С (484 ± 77 нмоль/л).

У интактных животных наибольшее содержание цистатина С обнаружено в сыворотке крови>моче; в тканях - мозг>печень>селезенка>тимус. В тканях печени и селезенке интактных мышей и мышей с экспериментальными опухолями содержание стефина А выше, чем цистатина С. Цистатин С (в отличие от стефинов) имеет в своей структуре сигнальный пептид, который позволяет этим белкам функционировать вне клетки, что объясняет обнаружение ингибитора во многих жидкостях организма (Calkins С. et al., 1998).

Содержание ЦС исследовали в сыворотке крови больных гемобластозами из Новосибирского гематологического центра. У больных с острым лейкозом количество ЦС в сыворотке крови снижалось (59,9 ± 6,47 нмоль/л). Однако после успешной химиотерапии и достижения клинико-гематологической ремиссии концентрация ингибитора увеличивалась на 42% и превосходила этот показатель у здоровых лиц (85,0 ± 4,33 нмоль/л). Одновременно в сыворотке крови у больных на 56% повышалось содержание а1-протеиназного ингибитора, что

рассматривается нами как благоприятный фактор в лечении больных. У больных с неходжкинской лимфомой до начало лечения происходит повышение концентрации цистатина С на 48,4% в сравнении со здоровыми донорами, при этом наиболее выраженные изменения наблюдаются у пациентов с агрессивными лимфомами, Т-клеточным подвариантом, IV стадией заболевания и неблагоприятным прогнозом заболевания. У пациентов с лимфогранулематозом в дебюте заболевания концентрация ЦС в сыворотке крови возрастала на 58,6%, особенно у больных с III, IV стадией процесса и при смешанно-клеточном варианте заболевания. Содержание ЦС в сыворотке крови при миеломной болезни увеличивалось почти в 2 раза. Проведение курса полихимиотерапии приводило к снижению содержания ингибитора при достижении клинико-гематологической ремиссии.

Развитии экспериментальных опухолей у мышей характеризовалось низким содержанием ингибиторов цистеиновых протеиназ, особенно цистатина С, прежде всего, в тканях опухоли (рис. 1). Минимальное количество цистатина С выявлено в опухолевой ткани аденокарциномы легких Льюис LLA < лимфосар-комы LS < асцитных клетках НА-1 гепатомы, последние содержали в 10 раз больше ингибитора по сравнению с тканью аденокарциномы. Такое соотношение концентрации ингибиторов в опухолевой ткани, вероятно, обусловливает фенотип данных опухолей, их особенности роста и метастазирования. Именно, аденокарцинома LLA характеризовалась высоким инвазивным потенциалом и давала метастазы в легкие. Методами иммуноферментного анализа нами показано увеличение содержания катепсина В в опухолевой ткани и в печени у мышей с аденокарциномой LLA по сравнению с лимфосаркомой. Ранее было обнаружено усиление экспрессии и высокая активность катепсинов В и L при коло-роректальной аденокарциноме человека и экспериментальной мышиной адено-карциноме LLA (Campo E. et al., 1994, Короленко Т. А. и др., 2003). В опухолевой ткани аденокарциномы соотношение катепсин В/цистатин С составляло 3,6, а для лимфосаркомы LS - 1,2. В тканях исследуемых опухолей содержание стефина А также низкое по сравнению с другими органами.

Опухоленосительство на всех моделях опухолей мышей приводило к снижению ингибиторов в печени и селезенке (рис. 1), вероятно, как следствие перестройки тканей в пользу развития опухоли или вследствие токсического действия опухоли [Гершанович М. Л., 1999]. В печени и селезенке мышей с асцитной формой НА-1 гепатомы и при развитии аденокарциномы LLA наблюдали значительное снижение цистатина С в 3-6 раз (рис.1) и стефина А в 2-3 раза по сравнению с органами интактных мышей. Наибольшее снижение (в 9 раз) концентрации цистатина С (рис. 1) и содержания стефина А (в 5,4 раза) наблюдали в печени при опухоленосительстве у мышей с лимфосаркомой LS.

Рис.1. Содержание цистатина С в тканях при развитии экспериментальных опухолей.

""-достоверность различий в сравнении с тканью интактных животных (Р<0,05); ** - достоверность различий в сравнении с тканью интактных животных (Р<0,01).

При сравнении уровней цистатина С и стефина А, оказалось, что содержание последнего в 1,5-1,8 раза выше во всех исследуемых тканях. Его концентрация более стабильна с ростом опухолей, менее подвержена влиянию фармакологических препаратов. Согласно литературным данным сте-фин А - является одним из наиболее сильных опухолевых супрессоров (Calkins С, Sloane В. F., 1995).

Одновременно с ростом всех исследуемых опухолей мышей происходило снижение концентрации цистатина С (в 2-3 раза) в сыворотке крови, что не согласуется с данными, полученным при исследовании ЦС в сыворотке крови у больных с гемобластозами. Возможно, увеличение сывороточного цистатина С у больных с гемобластозами носит компенсаторный характер в ответ на повышение активности цистеиновых протеиназ [Поспелова Т. И. и др., 1998]. Содержание ингибиторов в сыворотке крови, вероятно, связано с продолжительностью заболевания: при острых лейкозах с быстрым нарастанием основных клинических симптомов мы не наблюдали увеличение ингибитора, наоборот оно снижалось. Максимальное развитие экспериментальный опухолей у мышей наблюдали уже на 7-11 день после трансплантации опухолевых клеток, а средняя продолжительность жизни таких животнвгх не более 20 дней. Кроме того, исследуемые опухоли животных обладали высоким инвазивным ростом и достигали значительных размеров (до 6 г) при среднем весе мыши 20-24 г.

Полученные данные свидетельствуют о резком снижении уровня ингибиторов цистеиновых протеиназ в клетках многих тканей при развитии экспериментальных опухолей у мышей. Изменение баланса цистеиновые про-теиназы/эндогенные ингибиторы приводит к относительному увеличению активности цистеиновых протеиназ. При этом усиливаются деструктивные процессы в тканях, изменяются антигенные и адгезивные характеристики клеток, нарушаются межклеточные контакты, возникает резистентность ра-коввк клеток по отношению к защитным системам организма-хозяина (Кушлинский Н. Е., 1999; Kirschke H. et al., 2003). Дальнейшее изучение ингибиторов цистеиновых протеиназ было направлено на исследование возможности повышения их содержания в организме под влиянием противоопухолевых препаратов (циклофосфана) и стимуляторов макрофагов моди-фицированнвгх (1-»3)-|}-0-гликанов и Украина. Мы полагали, что ЦФ, влияя на опухолевые клетки, устраняет факторы (например, фактор ингиби-рующий миграцию макрофагов), с помощью которых опухоль подавляет активность макрофагов и снижает секрецию ими ингибиторов цистеиновых протеиназ [Losi F. et al., 1996].

Перевитая внутримышечно лимфосаркома LS, определялась пальпа-торно на пятые сутки после имплантации опухолевых клеток. Когда размер

узла лимфосаркомы Ь8 достигал в объеме 2-3 см3 (7 сут), мышам вводили ЦФ. Изолированное введение ЦФ в дозе 25 мг/кг почти не влияло на массу опухоли; при повышении дозы ЦФ до 50 мг/кг вес опухоли снижался почти в 5 раз, торможение опухоли составило 80% (табл.1). Изолированное введение Украина снижало массу опухоли в 1,7 раза Совместное введение ЦФ+Украин дополнительно снижало массу опухоли еще на 26% (табл.1). Удачной оказалась схема совместного введения ЦФ и КМГ. Масса опухоли снизилась дополнительно 1,6 раза (на 39%) по сравнению с животными, получавшими один ЦФ и в 8 раз по сравнению с контрольными мышами. При торможению роста опухоли ЦФ происходило увеличение концентрации цистатина С в опухолевой ткани в 7 раз, а также почти в 2 раза в сыворотке крови (табл.1). Изолированное введение Украина в 5 раз увеличивало содержание цистатина С в опухолевой ткани (табл.1) и в 4 раза - в тканях печени. При совместном введение ЦФ+КМГ или ЦФ+Украин повышалось содержание ингибитора в ткани селезенки.

Таблица 1

Влияние ЦФ, КМГ или Украина на вес лимфосаркомы и содержание цистатина С в опухолевой ткани и сыворотке крови (М±т)

Группы животных Масса опухоли, г Торможение роста опухоли, % ЦС в ткани опухоли # ЦС в сыворотке крови #

Контрольные 6,9 ±1,24 0 36,4 ±1,24 10,4 ±1ДО

ЦФ 25 мг/кг 5,7 ± 0,96 16 - -

Украин 4,0 ±0,76* 42 186,7 ±14,5* 11,5 ±1,22

ЦФ 50 мг/кг 1,4 + 0,96* 80 238,2+43,4* 19.4 ±1,91*

ЦФ+Украин 1,03 ±0,12* 85 267,7 ± 36,6* 21,2±2,11*

ЦФ+КМГ 0,86 ±0,09* 87 301,9+28,2* 18,4 ±2,22*

ЦФ100 мг/кг 0,53 ±0,05* 92 - -

Интактные 25,0±2,18

Примечание: количество животных в группе 10. * - достоверность различий в сравнении с контрольными мышами (Р<0,05).

# Содержание цистатина С в тканях выражено в нмоль/г белка х10-3, в сыворотке

крови - нмоль'л.

Подобные цистатину С результаты получены при исследовании концентрации стефина А. Под действием ЦФ или ЦФ+Украин содержание сте-фина А увеличивалось в опухолевой ткани в 2,2 и 2,4 раза, соответственно.

В печени концентрация СА повышалась в обоих случаях в 1,7 и 1,8 раза, соответственно.

Развитие лимфосаркомы, резистентной к терапии ЦФ (RLS) отличалось злокачественным ростом: быстрым ростом трансплантатов и ранней гибелью животных. К 13 сут после трансплантации объем опухоли RLS достигал 5 см3, за это время объем LS увеличился до 3,9 см3. Содержание ЦС исследовали на 3"и и 7'ж сут после введения циклофосфана. Показано, что содержание ингибитора в сыворотке крови мышей с RLS в 1,5 раза ниже, чем у животных с LS. Введение ЦФ приводило к повышению содержания ингибитора в сыворотке крови у мышей с LS (чувствительной к терапии ЦФ), у мышей с RLS концентрация ингибитора не изменялась, несмотря на то, что доза препарата была увеличена до 150 мг/кг веса. Показано, что ЦФ вызывает индукцию апоптоза в опухолевых клетках LS, тогда как при лечении RLS отмечено развитие некрозов (Каледин В. И. и др., 2002). У мышей с лимфосаркомой LS комбинированное введение SE-гликана и ЦФ не приводило к аддитивному эффекту, но впоследствии позволило снизить дозу ЦФ с 50 до 25 мг/кг и даже до 10 мг/кг, при этом противоопухолевый эффект ЦФ не снижался. Таким образом, открывается возможность снижения дозы основного противоопухолевого препарата (циклофосфана) при комбинированной схеме введения стимуляторов макрофагов и цитостатика.

При аденокарциноме легких Льюис LLA (17-ые сут после трансплантации опухолевых клеток) животным вводили ЦФ в дозе 150 мг/кг. Для усиления противоопухолевого эффекта ЦФ, препарат применяли совместно с гликанами (КМГ, SE-гликан, хитин-гликан). Один ЦФ вдвое снижал рост опухолевого узла. Метастазы в легкие были отмечены у 70% животных (в контроле 100%), при этом количество метастазов на одну мышь снизилось до 40%. Изолированное введение КМГ не влияло на рост опухоли, но в 3,6 раза снижало количество метастазов в легкие. Наиболее успешным оказалось одновременное применение ЦФ и КМГ (табл. 2). Происходило торможение роста опухоли на 90% (табл. 2), метастазы возникали лишь у 10% животных, а количество метастазов на 1 мышь сократилось до 8% (в контроле 100%). Украин не подавлял роста основного опухолевого узла, но снижал (в 3 раза) количество метастазов в легкие (табл. 2).

Снижая массу опухоли и оказывая антиметастатический эффект у мышей с аднокарциномой I1A ЦФ, ЦФ+КМГ или ЦФ+Украин увеличивали концентрацию цистатина С и стефина А в опухолевой ткани и печени. ЦФ и ЦФ+КМГ увеличивали содержание ЦС и СА в ткани опухоли (табл.3). В печени концентрация цистатина С возросла в 1,5 раза под влиянием ЦФ. при введение ЦФ+КМГ - максимально, почти в 2 раза и в 1,5 раза для сте-фина А. Одновременно нами был отмечен положительный эффект Украина,

повышающий содержание цистатина С и стефина А в печени (табл.3). Ранее обнаружено гепатопротекгорное действие Украина у больных с хроническим гепатитом С (УсксЬек I. е. а., 2000). В настоящей работе показано, что при снижении веса опухоли ЬЬА под влиянием изученных препаратов происходило увеличение концентрации цистатина С в сыворотке крови (табл.2).

Таблица 2

Влияние ЦФ, КМГ или Украина на вес аденокарциномы легких Льюис ЬЬА и содержание цистатина С сыворотке крови (М±т) _

Группы Масса опу- ТРО, % КМ на ЦС в сыворотке

животных холи, г 1 мышь крови, нмоль/л

Контрольные 5,3 ±0,31 0 17,3 ±2,67 13,6 ±1,98

Украин 5,3 ± 0,27 0 6,0+1,58* 12,0 ±1,09

КМГ 4,3 ±0,21 16 4,8 ±1,36* 15,2 ±1,65

ЦФ 150мг/кг 2,2 ±0,11* 58 7,1 ±1,19* 16,4 ±1,21

ЦФ + чере 3 сут КМГх1 1,3 + 0,11* 75 1,0 ± 0,29** 17.7+2,57

ЦФ + КМГ, од- 0,54+0,11* 90 1,3 ± 0,08** 22,1 ±2,50*

новременно

ЦФ+Украин 2,4 ± 0,09* 45 3,3± 2,10** 24,2 ±0,93*

Интактные 24,1 ±1,53

Примечание: ТРО - торможение роста опухоли; КМ - количество метастазов на 1 мышь; количество животных в группе 10. * - достоверность различий в сравнении с контрольными мышами (Р<0,01); ** - достоверность различий в сравнении с действием ЦФ(Р0,01)

Таблица 3

Влияние ЦФ, КМГ и/или Украина на содержание стефина А в опухолевой ткани ЫА и печени

Группы животных Опухолевая ткань Печень

Контрольные 234,3 ± 23,23 264,3 ±61,21

(без лечения)

КМГ 163,5 ± 34,42 251,8 ±23,45

Украин 204,8 ± 62,56 412,7 ±51,32*

ЦФ 285,4 ±43,34 271,2 ±31,41

ЦФ+КМГ 454,9 ±30.23* 403,8 ± 42,22 *

Примечание: количество животных в группе 10. * - достоверность различий в сравнении с контрольными мышами (Р<0,05).

Содержание стефина А в тканях выражено в нмоль/г белка х 10'3.

Увеличение ЦС в сыворотке крови под влиянием ЦФ зависело от исходного веса опухоли. Когда вес опухоли значителен (5,3 г) действие однократной дозы ЦФ менее эффективно на содержание цистатина С в сыворотке крови (табл.2). Совместное применение ЦФ с Украином или КМГ увеличивало количество ингибитора (табл.2).

В другой серии экспериментов вес опухоли НА на 17й день после трансплантации опухоли составил только 2,7 г. В этом случае однократная доза ЦФ значительно снижала вес опухоли и максимально увеличивала содержание цистатина С в сыворотке крови (табл.4).

В динамике развития опухоли (12, 17, 20 сут после трансплантации опухоли LLA) обнаружено, что на 17ыесут у контрольных животных сывороточная концентрация цистатина С повышена (то, что мы наблюдали у больных). Однако этот период продолжался недолго, к 20ыесут содержание ингибитора вновь снижалось. Наблюдения за содержанием ингибитора в сыворотке крови позволило с помощью корреляционного анализа выявить достоверную обратную зависимость между содержанием ингибитора в сыворотке крови, в опухолевой ткани и массой опухоли.

Таблица 4

Влияние ЦФ и различных гликанов на вес аденокарциномы легких Льюис LLA и содержание цистатина С сыворотке крови (М±т)_

Группы ЖИВОТНЫХ Масса опухоли, г Торможение роста опухоли, % ЦС в сыворотке крови, нмоль/л

Контрольные 2,7 ±0,31 0 12,2 ±0,82

ЦФ 150мг/кг 1,7 + 0,29* 37 16,9 ± 1,30*

ЦФ+КМГ 1,3 ±0,24* 52 18,6 ±2,30*

ЦФ+БЕ-гликан 1,1 ±0,32* 59 19,4 ±2,48*

ЦФ + 8Е-хитин-гликан 2,2 + 0,16* 19 11,9 ±3,21

Интактные - - 23,7 ±0,92

Примечание: количество животных в группе 10. * -достоверность различий в

сравнении с контрольными мышами (Р<0,05).

Препараты платины используют для проведения противоопухолевой терапии, в том числе НА-1 гепатомы (Каледин В. И. и др., 1989). Впервые на модели данной опухоли исследовано влияние Украина и КМГ на рост опухоли и содержание ингибиторов. Ранее нами показано, что Украин подавляет рост мышиной НА-1 гепатомы (Короленко Т. А. и др., 1998, 2004). В нашей работе показано, что введение Украина увеличивало продолжительность жизни животных в среднем на 6 сут по сравнению с контрольными мышами, не получавшими препарат; уменьшало объем асцита и количе-

ство асцитных клеток в 2-2,5 раза. При введении КМГ мышам с НА-1 гепа-томой также снижался вес опухоли и объем асцитической жидкости, но количество опухолевых клеток было вдвое выше по сравнению с данными, полученными при использовании Украина.

В динамике развития НА-1 гепатомы мыши (12ые сут) обнаружено снижение концентрации ЦС в опухолевой ткани по сравнению с 10ые сут; введение Украина увеличивало его содержание на12ые сут почти в 3 раза (рис.2). Однократное введение КМГ или Украина увеличивало содержание стефина А в асцитных клетках гепатомы в 3,2 и 3,4 раза, соответственно, и цистатина С - в печени в 1,9 и 2,1 раза. Кроме того, КМГ повышал уровень стефина А в печени и селезенке в 2,8 и 1,8 раза, соответственно 5 — кратное введение Украина в той же дозе увеличивало содержание цистати-на С в асцитных клетках гепатомы в 1,5 раза по сравнению с однократным введением препарата; возросло содержание ингибитора в печени и селезенке. Ранее было показано, что введение Украина не оказывало влияние на активность катепсинов В и L в клетках асцитной гепатомы (Короленко Т. А, и др., 1998), возможно, его противоопухолевый эффект связан с повышением содержания эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ.

Введение Украина значительно увеличивало число макрофагов в общем пуле клеток асцигической жидкости (рис.3). Известно, что макрофаги являются одним из основных компонентов клеточной реакции организма в зоне опухоли (до 90%), с активацией макрофагов сопряжена их противоопухолевая активность (Литвяков Н. И. и др, 2001).

НА-1,10 сут Украии, 10сут НА-1,12сут Украин, 12сут

Рис.2 Содержание цистатина С в асцитных клетках мышей при развитии НА-1 гепатомы и введении Украина

о -достоверность различий в сравнении с 10 днем развития опухоли (Р<0,01), * - достоверность различий в сравнении с показателями без лечения (Р<0,01)

Состав клеток в асцитической жицкости (К) до лечения

Состав клеток в асцитической жидкости (%) после лечения Украином

3 10 асцкгные клетки

памфоцигы

31

Рис.3. Состав клеток в асцитической жидкости мышей с НА-1 гепато-мой до и после введения Украина (0,5 мг/г, однократно, 10 сут после трансплантации опухоли).

Одним из перспективных направлений терапии злокачественных новообразований является разработка терапевтических подходов, при которых предусматривается не только прямое повреждающее действие на опухолевые клетки, но и активизация эндогенных противоопухолевых механизмов (Гершанович М. Л., 2003). Одним из таких механизмов, может быть, увеличение эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в макрофагах.

Целью следующих экспериментов явилось изучение различных стимуляторов макрофагов на синтез и секрецию ингибиторов цистеиновых про-теиназ. Впервые цистатин С обнаружен в среде инкубации альвеолярных макрофагов человека (Warfel A. et al., 1987). В настоящей работе цистатин С и стефин А измеряли в среде инкубации примированных и непримиро-ванных перитонеальных макрофагов мышей. Примирование проводилось внутрибрюшинным введением 4% крахмала in vivo за 3-5 дней до эксперимента. Секрецию наблюдали в течение 30 мин и 2 ч.

Показано, что примированные и непримированныс макрофаги секре-тируют незначительное количество цистатина С и стефина А (30 мин инкубации). За это время в непримированных макрофагах ЛПС не изменял количество ЦС, гликаны увеличивали уровень ингибитора в 3 раза. В примированных макрофагах КМГ и SE-гликан повышали содержание ЦС в 4 и 5 раз (30 мин инкубации) Существенная разница содержания ЦС обнаружена в примированных макрофагах через 2 час по сравнению с непримиро-ванными макрофагами (рис.4). Стимуляторы макрофагов увеличивали секрецию стефина А только в примированных макрофагах (табл.6). Преимуще-

ство использования примированных макрофагов при оценке секреции ингибиторов цистеиновых протеиназ очевидно, поэтому в следующих сериях экспериментов их предварительно стимулировали.

Рис.4. Содержание цистатина С в непримированных и примированных макрофагах интактных мьппей С57 Б1/61 (2 час).

* -достоверность различий в сравнении с нагримированными макрофагами (Р<0,01).

Липопротеины (ЛП) значительно увеличивали секрецию цистатина С (табл.5). Через 30 мин после добавления ЛПНП и ЛПВП содержание ингибитора возросло в 8 раз по сравнению с макрофагами без добавок. Совместное добавление ЛПС и ЛПНП еще больше увеличивало секрецию ингибитора. КМГ и Ж-гликан с ЛПНП повышали содержание цистатина С более чем в 6 раз по отношению к действию одних ЛПНП (табл.4). КМГ+ЛПНП и 8Е-гликан+ЛПНП повышали содержание ЦС в 12,9 и 10,3 раза по отношению к действию одних стимуляторов (табл.5). КМГ+ЛПВП и 8Е-гликан+ЛПВП также увеличивали концентрацию ингибитора. Через 2 часа инкубации макрофагов с ЛПНП и ЛПВП содержание ЦС увеличивалось по сравнению с 30 мин сроком. Совместное использование ЛП и гликанов увеличивало секрецию ингибитора примерно в 2 раза по отношению к действию одних ЛП (табл.5). Под влиянием ЛПВП наблюдали значительный прирост секреции ингибитора по отношению к 30 мин сроку, он увеличивался почти в 4 раза (табл.5) Действие одних ЛПВП или в комбинации с гликанами (через 2 час инкубации) было максимальным и почти в 2 раза выше по сравнению с ЛПНП или ЛПНП+гликаны, что свидетельствует не только о секреции цистатина С в инкубационную среду, но и о синтезе ингибитора (табл 5).

Таблица 5.

Влияние полисахаридов и липопротеинов низкой и высокой плотностей на секрецию цистатина С перитонеальными макрофагами интактных

мышей (М±т)

Препарат Цистатин С, пкмоль/л

30 мин 2ч

Контроль (без добавок) 31 ±3,8 121 ±9,7

ЛПС 54 ± 3,7 147 ±11,6

КМГ 115 ±7,0* 178 ±13,4*

SE-глюкан 148 ±7,9* 213 ±13,6*

ЛПНП 242 ±20,5* 585 ± 53,9*

ЛПС+ЛПНП 304 + 23,6 720 ±71,8

КМГ+ЛПНП 1489 ±116,7** 1425 ±113,4**

SE-глюкан+ЛПНП 1531 ±117,9** 1522 ±123,6**

ЛПВП 245 ±20,5* 1126 ±123,2*

ЛПС+ЛПВП 291 ±33,6 1050 + 171,8

КМГ+ЛПВП 622 ±60,8** 2340 ±198,6**

SE-глюкан+ЛПВП 1437 ±137,4** 2777 ±223,3**

Примечание: * -достоверность различий в сравнении с контролем (Р<0,01);

** - достоверность различий в сравнении с макрофагами в присутствии соответствующих липопротеинов (Р<0,01).

Электрофорез белков секретируемых макрофагами показал значительное увеличение протеинов с низкой молекулярной массой после инкубации макрофагов с ЛПНП совместно с КМГ или SE-гликаном (рис.5). Известно, что активированные макрофаги синтезирует большое количество низкомолекулярных белков, в том числе цитокинов (Suzuki Т. et al., 2000)

Липопротеины увеличивали секрецию стефина А в 5,2 и 6,2 раза по сравнению макрофагами без добавок (табл.6). ЛПС+ЛПНП повышали внеклеточную концентрацию СА, аналогично действовали КМГ+ЛПНП и SE-гликан+ЛПНП по сравнению с действием одних ЛПНП. Добавление

ЛПС не изменяло содержание ингибитора по сравнению с ЛПВП. КМГ+ЛПВП и SE-гликан+ЛПВП одинаково повышали содержание ингибитора в 1,5 раза по отношению к изолированному действию одних ЛПВП (табл.6) Таким образом, инкубация макрофагов с липопротеинами низкой и высокой плотностей приводила к значительному увеличению секреции ингибиторов цистеиновых протеиназ. причем стимулирующий эффект липо-протеинов был более выражен по сравнению со стимуляторами полисаха-

ридной природы Совместное добавление липопротеинов и (1—>3)-Р-0 гликанов существенно усиливало этот эффект, который нельзя объяснить только аддитивным действием компонентов

Рис 5 Стимуляция секреции белков макрофагами при их инкубации в течение 2 ч с липопротеинами и полисахаридами (белки культу-ральной жидкости разделяли электрофорезом в ПААГ 12,5% ЛПНП (1), ЛПНП + ЛПС (2), ЛПНП + КМГ (3), ЛПНП + SE-глюкан (4) Слева -белки с молекулярной массой 34 (апо Е) и 8-12 кДа (апоС)

Нами впервые показано, что перитонеальные макрофаги мышей с НА-1 гепатомой также секретировали в инкубационную среду цистатин С, причем больше, чем интактные клетки Известно, что опухолевый процесс сопровождается, как правило, специфической сенсибилизацией макрофагов (Joseph I et al, 1998) Асцитическая жидкость мышей с НА-1 гепатомой (после центрифугирования и удаления опухолевых клеток и макрофагов) также содержала цистатин С (1580 ±117 пмоль/л), источником которого являются перитонеальные макрофаги Добавление' ЛПС или гликанов не влияло на секрецию ингибитора (табл 6), вероятно, секреторный процесс у этих макрофагов уже истощен Нами показано, что за 2 ч инкубации пери-тонеальных макрофагов мышей с НА-1 гепатомой секреция ингибитора в инкубационной среде снижалась Ряд исследователей (Потапова Г И, Храмцова С Н, 1993, Herbeuval J-Ph et al, 2003) наблюдали снижение ци-тотоксической активности макрофагов в терминальный период роста опухоли

ЛПНП и ЛПВП увеличивали содержание ЦС в инкубационной среде макрофагов с НА-1 гепатомой почти в 2 раза отношению к контрольным макрофагам (табл 7) Добавление ЛПВП+КМГ или ЛПВП+БЕ-гликан повышали секрецию ЦС по сравнению с действием одних ЛП Максимальное

увеличение уровня ЦС (в 2,3 и 2,1 раза по отношению к одним ЛПВП) наблюдали при добавлении ЛПВП с гидрокортизоном (табл.7). Конкретный механизм влияния липопротеинов на синтез и секрецию эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ макрофагов интактных мышей и с НА-1 гепатомой, показанного нами в данной работе, пока неясен. Мы полагаем, что это влияние связано со способностью липопротеинов, усиливать биосинтез белка в макрофагах [Рашп Ь. Е. е! а1., 2002].

Таблица 6.

Влияние полисахаридов и липопротеинов низкой и высокой плотностей на секрецию стефина А перитонеальными макрофагами интактных мышей (М+т)

Препарат Стефин А, пкмоль/л 30 мин

Контроль (без добавок) 104,7 ±11,46

ЛПС 164,7 ± 14л6*

КМГ 150,1 ± 13,43*

8Е-глюкан 147,4 ±12,74*

ЛПНП 550,1 ±48,13*

ЛПНП+ЛПС 759,5 + 68,31**

ЛПНП+КМГ 695,7 ±18,43**

ЛПНП+8Е-гликан 963,8 ± 88,52**

ЛПВП 650,9 ± 41,31

ЛПВП+ЛПС 433,6 ±40,31

ЛПВП+КМГ 971,6 ±9 1,12**

ЛПВП+8Е-гликан 1006,0 ± 87,0**

Примечание: * - достоверность различий в сравнении с контролем (Р<0,001);

** - достоверность различий в сравнении с макрофагами в присутствии соответствующих липопротеинов (Р<0,001).

Процесс усиления синтеза белков под влиянием липопротеинов, очевидно, происходит в различных клетках и имеет общебиологическое значение. В нашей работе показано, что инкубация клеток Купфера с ЛПВП повышала содержание апопротеина Е в инкубационной среде макрофагов, этот эффект увеличивался под влиянием совместного применения ЛПВП и ГК. Секреция апопротеина Е под влиянием ЛПВП+ГК за 1,5 ч инкубации в клетках Купфера возрастала в 3 раза. В культуре гепатоцитов нами обнаружено, что совместное действие ЛПВП+ГК приводило к значительному увеличению (до 265%) продукции апо А-1. Содержание апо А-1 значительно

увеличивалось при добавлении комбинации ЛПВП и ГК к переживающим срезам печени. Стимулирующий эффект ЛПВП и ГК на секрецию апо A-I в культуре клеток НерО2 был показан ранее (Ranganathan S., Kottke В. А., 1990).

Таблица 7

Влияние полисахаридов и липопротеинов низкой и высокой плотностей на секрецию нистатина С перитонеальными макрофагами мыши с ге-патомой НА-1 (М±т)

Препарат Цистатин С, пкмоль/л 30 мин

Контроль (без добавок) 218 ± 20,7**

ЛПС 187 ± 13,6

КМГ 200 ± 20,8

SE-гликан 228+ 21,4

ЛПНП 389 ± 25,7*

ЛПВП 363 ± 35,5*

ЛПВП+КМГ 692 + 22,7»

ЛТШП+ЭЕ-гликан 743 ±32,1»

ЛПНП+ГК 891 ±75,3»

ЛПВП+ПС 757±64>

Примечание: ** - достоверность различий в сравнении с интактными макрофагами (Р<0,001); * - достоверность различий в сравнении с контролем (Р<0,01); • - достоверность различий в сравнении с макрофагами в присутствии соответствующих липопротеинов (Р<0,01).

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты позволяют расширить существующие научные представления о роли эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в патогенезе злокачественных опухолей. Снижение уровня ингибиторов в организме нарушает динамический баланс между цистеиновыми протеиназами и эндогенными ингибиторами, что приводит к увеличению активности цистеиновых протеиназ и способствует злокачественной прогрессии. Увеличение эндогенных ингибиторов в организме является одним из факторов, сдерживающих инвазию и метастазирование опухоли. Под влиянием противоопухолевых препаратов (циклофосфана) и стимуляторов макрофагов модифицированных Б-гликанов и иммуностимулятора Украина происходит увеличение ЦС и СА в тканях опухоли, а также в печени, селезенке и сыворотке крови. Одновременно с увеличением количества ингибиторов в тканях происходит

торможение роста опухоли, уменьшение массы опухоли, снижение количество метастазов, увеличения числа макрофагов.

ВЫВОДЫ

1. При развитии различных гистологических типов опухолей (лимфо-саркомы ЬЗ, гепатомы НА-1, аденокарцшюмы легких Льюис ЬЬА) наблюдается низкая концентрация цистатина С и стефина А в ткани опухоли. В ткани аденокарциномы ЬЬА, рост которой сопровождается метастазами в легкие, выявлено минимальное количество цистатина С. Опухоленосительство вызывает значительное снижение содержания ингибиторов в печени и селезенке. Одновременно с ростом опухоли происходит снижение (в 2-3 раза) концентрации цистатина С в сыворотке крови при всех видах опухоли.

2. Циклофосфан, подавляя рост основного опухолевого узла лимфосар-комы и аденокарциномы легких Льюис и оказывая выраженный антиметастатический эффект, увеличивает содержание цистатина С и стефина А в ткани опухоли, печени и селезенке. Карбоксиметилированный и сульфоэти-лированный (I—>3)-Р"0-гликаны или Украин потенцируют действие цик-лофосфана, совместное применение препаратов приводит к максимальному увеличению содержания исследуемых ингибиторов в тканях и сыворотке крови.

3. Выявлены обратные корреляции между содержанием цистатина С в опухолевой ткани и массой опухоли (для аденокарциномы легких Льюис ЬЬА - г = -0,65, для лимфосаркомы LS - г = -0,71), между содержанием цистатина С в сыворотке крови и массой опухоли (г = -0,87; г = -0,79, соответственно), что позволяет использовать определение ингибитора в сыворотке крови как биологический маркер опухолевого роста и показатель эффективности проводимой химиотерапии у мышей с экспериментальными опухолями.

4. Введение противоопухолевого препарата Украина оказывает эффективное действие на мышей с гепатомой НА-1: увеличивается продолжительность жизни мышей, снижается ежедневный прирост массы опухоли, асцитической жидкости, уменьшается количество опухолевых клеток и увеличивается число макрофагов в асците. Одновременно повышается содержание цистатина С и стефина А в асцитных клетках и восстанавливается концентрация ингибиторов в печени и селезенке.

5. Изолированное введение Украина мышам с аденокарциномой легких Льюис ЬЬА уменьшает количество метастазов в легких, снижает процент животных с метастазами, увеличивает содержание цистатина С в тканях опухоли и печени, повышает концентрацию стефина А в печени.

6. Лимфосаркома RLS, отличающаяся более агрессивным течением и резистентностью к терапии по сравнению с другими экспериментальными опухолями содержит значительно меньше цистатина С в сыворотке крови мышей. Отсутствие противоопухолевого эффекта циклофосфана на модели лимфосаркомы RLS не вызывает существенных изменений содержания цис-татина С в сыворотке крови.

7. На культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей установлено, что клетки сегрегируют в среду инкубации цистатин С и стефин А. Модифицированные (1 —>3)-|Н}-гликаны (КМГ и SE-гликан) увеличивают секрецию ингибиторов цистеиновых протеиназ. Липопротеины низкой и высокой плотности стимулируют секрецию ингибиторов макрофагами, при совместном введении липопротеинов и полисахаридов наблюдается многократное увеличение секреции цистатина С и стефина А.

8. Перитонеальные макрофаги мышей с НА-1 гепатомой секретируют больше цистатина С, чем интактные клетки. Липополисахарид, карбокси-метилированный и сульфоэтилированный -гликаны не изменяют секрецию ингибитора. ЛПВП и ЛПНП увеличивают секрецию, максимальный эффект наблюдается при совместном введении липопротеинов и гидрокортизона.

9. Под влиянием ЛПВП и гидрокортизона увеличивается содержание апопротеина A-I в культуре гепатоцитов. В клетках Купфера усиливается ресекреция аполипопротеина A-I и продукция аполипопротеина Е.

10. Эндогенные ингибиторы цистатин С и стефин А, регулируя функции цистеиновых протеиназ, играют важную роль в защите организма от развития злокачественных опухолей. Противоопухолевый препарат (цик-лофосфан) и стимуляторы макрофагов (1—>-3)-3-0-гликаны и Украин увеличивают содержание ингибиторов, при этом происходит торможение роста опухоли, уменьшение ее массы, снижение количества метастазов. Липопро-теины и -гликаны повышают содержание ингибиторов путем усиления их синтеза и секреции в макрофагах.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Поляков Л. М., Потеряева О. Н., Панин Л. Е., Загребельный С. Н., Феденков В. И. Твердофазный иммуноферментный анализ апопротеина A-I в сыворотке крови человека // Лабораторное дело. - 1990. - №.6. - С. 11 -14.

2. Поляков Л. М, Кузьменко А. П., Потеряева О Н., Скрынь Г. Ш, Панин Л. Е. Апопротеин А-1-иммунореактивность во фракциях хроматина и ядерном матриксе гепатоцитов крыс// Тез. докл. X Всесоюзного симпозиума «Структура и функция клеточного ядра»- Гродно, 1990. - С. 149.

3. Поляков Л. М., Потеряева О. Н., Панин Л. Е. Определение апопро-теина A-I методом иммуноферментного анализа // Вопросы медицинской химии. - 1991. -Т.37. -№.1. -С.89-92.

4. Поляков Л. М., Потеряева О. Н., Панин Л. Е. Определение апопро-теина В методом твердофазного иммуноферментного анализа // Лабораторное дело. - 1991. - №.9. - С.24-26.

5. Панин Л. Е., Поляков Л. М, Усынин И. Ф., Кузьменко А. П., Потеряева О. Н. Иммунохимическая идентификация апопротеина A-I в хроматине ядер гепатоцитов крыс // Биополимеры и клетка. - 1992. - Т.8. - №.2. -С.44-49.

6. Панин Л. Е., Поляков Л. М, Кузьменко А П., Потеряева О. Н., Скрыль Г. Ш. Обнаружение апопротеин А-1-иммунореактивности в хроматине ядер гепатоцитов крыс // Биохимия. -1992. - Т.57. - №.6. - С.826-831.

7. Усынин И. Ф., Харьковский А. В., Максимов В. Ф., Потеряева О. Н. Роль плазменных липопротеинов в нейтрализации токсических свойств бактериальных липополисахаридов // Тез. докладов III съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. - 1997. - С.240.

8. Панин Л. Е., Поляков Л. М., Колосова Н. Г., Русских Г. С, Потеряева О. Н. Распределение токоферола и аполипопротеин-А-1-иммунореактив-ности в хроматине печени крыс // Биологические мембраны. - 1997. — Т. 14 -№5.-С.512-519.

9. Панин Л. Е., Усынин И. Ф., Харьковский А. В., Потеряева О. Н. Влияние липопротеинов высокой плотности и гидрокортизона на продукцию аполипопротеина Е клетками Купфера // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1998. - Т. 126. -№ 7. - С.43-45.

10. Korolenko Т. A, Svechnikova I. G., Poteryaeva О. N., Djanaeva S. Ja., Kaledin V. I, Nowicky J. Lysosomal cysteine proteinase and inhibitor of murine HA-1 hepatoma: role of intralysosomal accumulation of antitumor drag UKRAIN // Abstracts of 12th Workchop of the European stady group on lysosomal diseases. - Vidago, Portugal. - 23-26 Sept., 1999. -P.7.

11. Korolenko T. A., Poteryaeva O. N., Djanaeva S. Ja., Svechnikova I. G., Kaledin V. I., Nowicky J. Malignization and efficacy of antitumor therapy // Abstracts of International Proteolysis Society 1st General meeting, - Mackinac Island, Michigan, USA. - 25-30 Sept., 1999. - P.37.

12. Korolenko T. A, Svechnikova I. G., Poteryaeva O. N.. Djanaeva S. Ja, Nowicky J. Lysosomal proteinases and cysteine proteinase inhibitors role in tumor prevention // Abstracts of 1 st International Conf. «Tumor prevention and genetics» and 5th Annual Meeting of the International Soc. Cancer Chemopre-vention. - St. gallen, Switzerland. - 17-19 Febr., 2000. - P.66.

13. Гончарова И. А., Фаламеева О. В., Левина О. А., Свешникова И. Г. Потеряева О. Н. Влияние препарата Украин на ферменты лизосом и функциональную активность печени при остром токсическом гепатите у крыс // Тез. докл. Рабочего совещания «Лизосомные болезни, модели, терапия». -Новосибирск, 2000. - С.25.

14. Потеряева О. Н., Короленко Т. А., Жанаева Т. А., Фаламеева О. В., Каледин В. И. Иммуноферментный анализ цистатина С и его роль в динамике опухоли // Тез. докл. Рабочего совещания «Лизосомные болезни, модели, терапия». - Новосибирск, 2000. - С.73.

15. Фаламеева О. В., Каледин В. И., Потеряева О. Н., Свечникова И. Г. Цистеиновые протеиназы/ингибиторы цистеиновых протеиназ: их роль в опухолевом росте и влияние цитостатической терапии // Тез. докл. Рабочего совещания «Лизосомные болезни, модели, терапия». - Новосибирск, 2000. — С.97.

16. Потеряева О. Н., Фаламеева О. В., Короленко Т. А., Тетерин А. С. Иммуноферментный анализ цистатина С у женщин с новообразованиями тела матки // Тез. докл. Научной сессии к 65-летию НГМА. - Новосибирск, 2000. - С.42.

17. Korolenko Т. A., Poteryaeva О. N., Svechnikova I. G., Djanaeva S. Ja., Kaledin V. I., Nowicky J., Falameyeva O. V. Role of macrophages stimulation in HA-1 murine hepatoma development // Abstracts of X International Symposium on Cells ofthe Hepatic Sinusoid. - United Kingdom. - 3-7 Sept, 2000. - P.30.

18. Korolenko T. A, Svechnikova I. G., Poteryaeva O. N., Djanaeva S. Ja. Cysteine proteinases in apoptotic model: murine LS lymphoma treated by cyclo-phosphane // Abstracts of 5th World Congress on Trauma, Shock, Inflammation and Sepsis (pathophysiology, immune consequences and therapy). - Munich, Germany. - 29 Febr. - 4 March., 2000. - Supplement to SHOCK. - Vol.13. -Abstract.460.

19. Korolenko T. A., Kaledin V. I., Nikolin V. P. Djanaeva S. Ja., Svechnikova I. G., Poteryaeva O. N, Falameyeva O. V., Nowicky J. Cysteine proteinases in apoptotic model: murine LS lymphoma treated by cyclophosphane and Ukrain effect // 5th World Congress on Trauma, Shock, Inflammation and Sepsis (pathophysiology, immune consequences and therapy). - Munich, Germany 29 Febr. - .4 March., 2000. - Vol.13. - P.875-879.

20. Korolenko T. A, Poteryaeva O. N., Djanaeva S. Ja., Svechnikova I. G., Timofeyeva O. A., Filipenko M. L. Kaledin V. I., Nowicky J. Cystatin С in LS lymphosarcoma and HA-1 hepatoma treated with Ukrain and cyclophosphamide and involvement of apoptosis // Drugs under Experimental and Clinical Research. - 2000. - Vol. XXVI. - № 5/6. - P.285-292.

21. Poteryaeva О. N., Falameyeva О. V., Korolenko Т. A., Kaledin V. I., Djanaeva S. Ja., Nowicky J., Sandula J. Cysteine proteinase inhibitor level in tumor and normal tissues in control and cured mice // Drugs under Experimental and Clinical Research. - 2000. - Vol. XXVI. - № 5/6. - P.301-306.

22. Falameyeva O. V., Djanaeva S. Ja., Kaledin V. I, Poteryaeva O. N.. Korolenko T. A Cyclophosphamide-induced apoptosis in the experimental model of murine lymphosarcoma // Cell Proliferation. - 2001. - V.34. - № 3. -P.172-174.

23. Korolenko T. A., Falameyeva O. V., Poteryaeva O. N., Levina O. A., Svechnikova I. G., Kaledin V. L, Nowicky J. The role of cystatin С and stefin A as markers of tumour growth and efficacy of antitumour therapy // Cell Proliferation. -2001.- Vol.34. -№ 3.-P.179-181,

24. Потеряева О. Н., Фаламеева О. В., Жанаева С. Я., Свечникова И. Г., Короленко Т. А., Каледин В. И. Роль цистатина С и цистеиновых протеиназ в развитии мышиной LS лимфосаркомы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - № 7. - С.77-79.

25. Потеряева О. Н., Фаламеева О. В., Каледин В. И., Жанаева С. Я., Короленко Т. А. Иммуноферментный анализ цистатина С и его роль в динамике развития и лечения опухолей // Бюллетень СО РАМН. - 2001. - № 1. -С.34-37.

26. Панин Л. Е., Костина Н. Е., Потеряева О. Н., Лукашев В. А. Структурное и иммунохимическое соответствие оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 // ДАН. - 2001. - Т.377. - № 2. - С. 266-269.

27. Фаламеева О. В., Потеряева О. Н., Жанаева С. Я., Левина О. А., Филатова Т. Г., Короленко Т. А, Каледин ВИ, Шандула Й., Коган Г. // Увеличение эффективности химиотерапии карциномы Льюис стимулятором макрофагов карбоксиметилированным -глюканом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - № 8. - С.205-208.

28. Falameyeva О. V., Poteryaeva О. N., Korolenko Т. A., Kaledin V. I., Djanaeva S. Ja., Levina О. Inhibitors of lysosomal cysteine proteinases cystatin С and stefin A: regulation of cysteine proteinases activity and role in apoptosis // Abstracts of 13th ESGLD Workshop, Woudschoten, Netherlands. - 20-23 Sept., 2001.-P.109.

29. Korolenko T> A., Falameyeva O. V., Poteryaeva O. N., Kaledin V. I. Cysteine proteinases and inhibitors as markers of malignization and efficacy of antitumour therapy in murine lymphoma //11th International Congress of Immunology. - Stockholm 22-27 Juli, 2001. - Scandinavian J. Immunology. - Vol.54. -Suppl.l.-P.134.

30. Korolenko T. A., Djanaeva S. Ja., Poteryaeva O. N., Falameyeva O. V., Levina O. A., Kaledin V. I, Nowicky J Antimetastatic and antitumor effect of

chemically modified glucans // European J. Cancer. - 2002. - Vol.38. - № 1. — P. 43-45.

31. Korolenko T. A., Falameyeva O. V., Poteryaeva O. N., Djanaeva S. Ja., Levina O. A., Kaledin V. I. Cysteine proteinases and inhibitors in murine tumors during effective treatment by cyclophosphane and macrophage stimulators // Anticancer Res. - 2002. - Vol.22. - P. 4301-4303.

32. Усова Т. А., Потеряева О. H., Короленко Т. А., Жанаева С. Я., Яры-гина Е. С, Каледин В. И. Цистеиновые протеиназы и их ингибиторы в динамике развития и при комбинированной терапии опухолей мышей цикло-фосфаном и стимуляторами макрофагов // Тез. докл. IV съезда физиологов. -Новосибирск, 2002. -С.283.

33. Потеряева О. Н., Фаламеева О. В., Короленко Т. А. Содержание сте-фина А при развитии перевиваемых опухолей у мышей // Тез. докл. Г/ съезда физиологов. - Новосибирск, 2002. -С.227.

34. Усова Т. А., Потеряева О. Н., Поспелова Т. И., Короленко Т. А. Биологическая роль цистатина С и его диагностическая значимость при онкологических заболеваниях человека // Тез. докл. IV съезда физиологов. -Новосибирск, 2002. - С.283.

35. Усова Т. А., Потеряева О. Н., Дымова Е. В., Короленко Т. А., Поспелова Т. И. Ингибитор цистеиновых протеиназ цистатин С как возможный диагностический и прогностический показатель у больных гемобласто-зами // Тез. докл. докладов XII Научно-практической конференции врачей. -Новосибирск, 2002. - С. 160.

36. Потеряева О. Н., Русских Г. С, Зуева Т. В., Панин Л. Е., Поляков Л. М., Короленко Т. А Синтез цистатина С в перитонеальных макрофагах под влиянием липопротеинов различных классов // Тез. докл. Всеросской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: функциональные и клинические аспекты». - Новосибирск, 2002. - С. 82.

37. Korolenko Т. A., Djanaeva S. Ja, Poteryaeva О. N., Falameyeva О. V., Levina О. A. Antitumor and Antimetastatic effects of chemically modified glu-cans // Abstracts of 10th Bratislava Symposium on Saccharides, Smolenice, Slovakia. - 1-6 Sept., 2002. - P.22.

38. Korolenko T. A., Usova Т., Falameyeva O. V., Poteryaeva O. N., Djanaeva S. Ja, Levina O. A., Kaledin V. I. Lysosomal cysteine proteinases and inhibitors in human and murine tumor development // Abstracts of 3th International Conference on Cysteine Proteinases and Their Inhibitors, Portoroz, Slovenia. -14-18 Sept., 2002.-P. 115.

39. Короленко Т. А., Жанаева С. Я.,. Потеряева О. Н., Фаламеева О. В., Левина О. А., Каледин В. И., Шандула Й. Активность и концентрация ка-тепсина В как прогностический фактор при развитии мышиной лимфосар-

комы LS и аденокарциномы легких Льюис // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 135. - № 4. - С. 452-455.

40. Усова Т. А., Потеряева О. Н., Ярыгина Е. С, Короленко Т. А Цис-татин С в динамике развития и при лечении аденокарциномы легких Льюис у мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. -Т.136.-№1.-С.95-98.

41. Kogan G., Sandula J., Korolenko Т. A., Falameyeva О. V., Poteryaeva О. N., Djanaeva S. Ja, Levina O. A., Filatova T. G., Kaledin V. I. Increased efficiency of Lewis lung carcinoma chemotherapy with a macrophage stimulator- -yeast carboxymethyl glucan // Int. Immunopharmacol. - 2002. - Vol. 2. - № 6. -P. 775-781.

42. Короленко Т. А., Потеряева О. Н., Фаламеева О. В., Левина О. А. Ингибитор цистеиновых протеиназ стефин А как показатель эффективности лечения опухолей мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. -Т.136. - № 7. - С.53-57.

43. Потеряева О. Н., Усова Т. А., Левина О. А., Ярыгина Е. С, Короленко Т. А Иммуноферментный анализ цистатина С в сыворотке крови больных гемобластозами // Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. -Ж7-С.35-38.

44. Korolenko Т. A., Poteryaeva О. N., Zhanaeva S. Ya., Falameeva О. V., Usova Т. A., Pospelova Т. I., Kaledin V. I. Cystatins and cysteine proteases in murine and human tumors // Abstracts of 3rd Conference Experemental and Translational Oncology. - Kranjska gora, Slovenia, 18-21 March, 2004. - P.78.

45. Khalikova T. A., Poteryaeva O. N.. Kaledin V. I., Korolenko T. A. Cathepsins B, L and D activity and cystatin С concentration in mice with sensitive and resistant to cyclophosphamide variants of lymphosarcoma LS // Abstracts of 3rd Conference Experemental and Translational Oncology. - Kranjska gora, Slovenia, 18-21 March, 2004. -P.80.

46. Потеряева О. Н., Поляков Л. М, Короленко Т. А, Зуева Т. В., Русских Г. С, Панин Л. Е. Влияние полисахаридов и липопротеинов плазмы крови на секрецию цистатина С перитонеальными макрофагами мыши в норме и в условиях опухолевого роста // Биохимия. - 2004. - №.3-С.367-371.

47. Короленко Т. А, Жанаева С. Я., Потеряева О. Н., Свечникова И. Г., Фаламеева О. В., Халикова Т. А., Ярыгина Е. С, Гончарова И. А. Регуляция активности цистеиновых протеиназ: роль предшественников протеиназ (проферментов) и внутриклеточных ингибиторов // Бюллетень СО РАМН. -2004.-№2.-С.130-135.

48. Потеряева О. Н , Короленко Т. А., Свечникова И. Г., Жанаева С. Я., Фаламеева О. В , Каледин В. И., Новицки Д. В. Цистеиновые протеиназы и

33 РОС НАЦИОНАЛЬНА,.

БИБЛИОТЕКА СПетербург О» 900 кт

их ингибиторы при развитии мышиной НА-1 гепатомы и опухолевой тера-пиии // Вопросы биомедицинской химии. - 2004. - Т.50. - № 2. - С. 172-179.

49. Usova Т. A., Poteryaeva О. N., Falameeva О. V.. Zhanaeva S. Ya., Levina О. A., Yarygina E. S., Korolenko Т. A., Nowicky J. Serum cystatin С in murine tumors treated by combinations of cyclophosphamide with Ukrain or glu-cans // bit J. Immunotherapy. - 2003. - Vol. XIX. - № 2-4. - 22-29.

50. Korolenko T. A, Falameeva O. V., Poteryaeva O. N., Zhanaeva S. Ya., Levina O. A., Nowicky J. Cysteine protease inhibitor stefin A in murine tumors during treatment by Ukrain and/or cyclophosphamide // bit. J. Immunotherapy. -2003. - Vol. XDC. - № 2-4. - 30-37.

51. Usova T. A., Poteryaeva O. N., Pospelova T. I., Korolenko T. A. Serum cystatin С in patients with hemoblastosis // bit. J. Immunotherapy. - 2003. - Vol. XK.-№2-4.-C.62-66.

52. Korolenko T. A., Poteryaeva O. N., Falameeva O. V., Usova T. A., Pospelova T. I. Positive effect of pretreatment by P-l,3-glucans in murine tumors; cystatin С and stefin A as tumor markers // European J. Cancer. — 2004. — Vol.2.-Xol.-P.52.

53. Korolenko T. A., Zhanaeva S. Ya., Poteryaeva O. N., Dergunova M. A., Alexeenko T. V. Role of liver macrophage depression in murine tumor growth and metastazing // Abstracts of 12th International Symposium on Cells of The Hepatic Sinusoid. - Bilbao, Spain, 5-9 Sept., 2004. - P. 17-18.

Подписано в печать 15.09.04 г. Формат 60 х 84 /16 Уел', печ. л. 2.0. Тираж 120 экз. Заказ № 150-п

Отпечатано в типографии издательства «Сибмедиздат» 630091, г. Новосибирск, ул. Красный проспект, 52. Тел.: (383-2) 29-10-83'. E-mail: bibmedisdat@rambler.ru »

Соискатель

О. Н. Потеряева

»17945

РНБ Русский фонд

2005-4 12642

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Данные литературы свидетельствуют о том, что протеолитические ферменты ассоциированы с опухолевым ростом. Эти ферменты не только участвуют в различных этапах канцерогенеза, но и вовлечены в сложную цепь взаимоотношений раковой клетки с нормальными близлежащими тканями, регуляторными и защитными системами организма хозяина [Ferreras et al., 2000; DeClerck et al., 2004]. С повышенной способностью синтезировать и секретировать протеиназы лизосом опухолевыми клетками связывают инвазивный рост [Levicar et al., 2003], ангиогенез и метастазирование злокачественных опухолей [Werle, 1997, Korolenko et al., 2000; Bervar et al., 2003]. Среди протеиназ, связанных со злокачественным ростом, основными считаются цистеиновые протеиназы (катепсины В и L), аспартильная протеиназа катепсин D и металлопротеиназы [Okamoto et al., 1999]. Секреция протеиназ клетками опухоли приводит к деструкции внеклеточного матрикса и лизису базальной мембраны, что является необходимым условием для клеточной инвазии опухоли [Werle et al., 2003].

По данным Roshy, Sloane [2003] в тканях многих опухолей человека показано повышение экспрессия мРНК цистеиновых протеиназ, увеличение активности и содержания катепсина В в 2-5 раз. Обнаружены различия в составе изоформ, нарушения гликозилирования катепсина В в клетках опухоли по сравнению с нормальной тканью (Moin и сотр., 1998). Опухолевая ткань синтезирует протеолитические ферменты в виде незрелых предшественников, их количество увеличивается в 1500-2000 раз (Короленко Т.А., 1998). Данные изменения в структуре катепсинов приводят к нарушению связывания протеаз с их эндогенными ингибиторами, последние лимитируют активность протеаз, тем самым сдерживают инвазию и метастазирование опухоли.

Активность цистеиновых протеиназ регулируется эндогенными ингибиторами - цистатинами, стефинами и кининогенами [Hibbetts et al., 1999; Sokol, Schiemann, 2004]. Патологическая секреция протеиназ при новообразованиях, сопровождается потреблением эндогенных ингибиторов и приводит к нарушению соотношения протеиназы/ингибиторы протеиназ, снижение последних ведет к неконтролируемому росту опухоли [Turk et al., 2002; Strojan et al., 2004]. Показано снижение уровня мРНК стефина А при трансформации доброкачественной папилломы в карциному у мышей [Hawley-Nelson et al., 1998]. В опухолевой линии эмбриональных фибробластов крыс по сравнению с неопухолевыми фибробластами наблюдается значительное снижение (в 4-15 раз) ингибиторов цистеиновых протеиназ [Sloane et al., 1992].

Ранее синтетические аналоги ингибиторов протеиназ, такие как пепстатин, леупептин, Е-64 успешно применялись при лечении заболеваний, развитие которых сопровождается увеличением активности протеаз лизосом: язвенная болезнь желудка, гипертоническая болезнь, инфаркт миокарда, ожоги [Короленко, 1990]. Недавно показано, что применение синтетических ингибиторов цистеиновых протеиназ Е-64 или флюорометилкетона in vivo приводит к стойкому и полному подавлению некоторых опухолей [Coulibaly et al., 1999; Van Noorden et al., 2000]. Введение гена цистатина С в клетки карциномы мыши приводит к снижению инвазивной способности опухоли [Huh et al., 1999].

Проведение исследований, связанных с изучением эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ при различных патологических состояниях, в том числе и канцерогенезе, затруднено тем, что количество ингибиторов в биологических жидкостях и тканях измеряется в нона- и пикомолях и становится возможным только с развитием и применением иммуноферментных технологий. Поэтому, в настоящее время роль внутриклеточных ингибиторов, лимитирующих действие протеаз при опухолевом росте, изучено недостаточно. Перспективным в этом отношении является поиск факторов, влияющих на повышение содержания эндогенных ингибиторов в организме, что может стать новым подходом к терапии злокачественных опухолей.

На современном этапе развития онкологии все большее внимание уделяется изысканию средств, патогенетически влияющих на опухолевый процесс и усиливающих эффективность химиотерапии. Для клинической медицины наиболее перспективны водорастворимые полисахариды, такие как карбоксиметилированный и сульфоэтилированный (1—>3)-P~D-гликаны, обладающие способностью стимулировать секрецию цитолитических/цитостатических факторов макрофагов и запускать синтез ФНО-а. Обнаружено противоопухолевое и антиметастатическое действие (1—>3)-Р-0-гликанов на моделях опухолей мышей с химически индуцированной саркомой печени, меланомой и при клиническом использовании у человека (Czop, Kay, 1991; Kasai et al., 1991; Kogan et al., 2003). Показана низкая токсичность (1—»3)-Р-0-гликанов в отличие от рекомбинантных цитокинов (ИЛ-2 и др.), применяемых системно (Kogan, 2003; Brown et al., 2003). Однако, до настоящего времени остается не исследованным влияние цитостатиков и водорастворимых полисахаридов со структурой (1—»3)-Р-0-гликанов на содержание эндогенных ингибиторов в тканях опухоли. Неизвестно, связан ли механизм их действия со способностью изменять уровень эндогенных ингибиторов в организме. Остается неизученным, могут ли исследуемые гликаны стимулировать синтез и секрецию ингибиторов протеиназ в макрофагах, подобно синтезу ФНО-а. Представляет интерес изучение Украина (Ukrain, Nowicky Pharma, Австрия) - нового полусинтетического средства, приготовленного на основе растительного сырья (производное алкалоидов Чистотела большого, Chelidonium majus L), известного как иммуностимулирующий препарат с антинеопластическим действием [Liepins et al., 1996; Nowicky, 1996].

В последнее время обсуждается иммуномодулирующая роль липопротеинов, известных ранее только как средство транспортировки триглицеридов, холестерина и других липидов в организме. Сегодня липопротеины привлекают внимание в связи с выполнением ими функций, несвязанных с обменом липидов: влияние на стероидогенез [Поляков, Панин, 2000], сердечно-сосудистую [Parhami et al., 2002] и иммунную системы [Desanctis et al., 1995; Доценко и соавт., 2001], защиту организма от инфекции [Burger, Dayer, 2002]. В современной литературе имеются лишь единичные сообщения о стимулирующем влиянии липопротеинов и их белковых компонентов на экспрессию отдельных генов и синтез некоторых белков [Handwerger, 1995; Ashby, 1998; Zerbinatti, Dyer, 1999]. Липопротеины могут изменять функциональную активность макрофагов [Kurose et al., 1996; Banfi et al., 2002; Salomonsson et al., 2003]. Полагают, что макрофаги, синтезируя и секретируя различные цитокины, оказывают влияние на регенераторно-восстановительные и пролиферативные процессы при воспалении, инициации и развитии атеросклероза, в противоопухолевой защите [Herbeuval et al., 2003]. Остается не исследованным влияние липопротеинов на синтез и секрецию ингибиторов цистеиновых протеаз в макрофагах в норме и в условиях опухолевого роста.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - выявить роль эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ как факторов, сдерживающих инвазию и метастазирование злокачественных опухолей и изучить механизмы их регуляции под влиянием противоопухолевых препаратов.

Для решения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание цистатина С и стефина А в тканях и биологических жидкостях человека и мыши в норме.

2. Исследовать содержание цистатина С и стефина А в опухолевой ткани и органах, не вовлеченных в опухолевый процесс (печень, селезенка, сыворотка крови) при развитии экспериментальных мышиных опухолей: лимфосаркомы LS, НА-1 гепатомы и аденокарциномы легких Льюис LLA.

3. Исследовать взаимосвязь между противоопухолевым эффектом циклофосфана, водорастворимых (1—►ЗЭ-р-Э-гликанов, Украина и содержанием ингибиторов цистеиновых протеиназ в тканях и сыворотке крови при изолированном и совместном введении препаратов на моделях лимфосаркомы LS и аденокарциномы легких Льюис LLA.

4. Исследовать взаимосвязь между противоопухолевым эффектом Украина и карбоксиметилированного (1—»3)-(3-0-гликана и содержанием ингибиторов цистеиновых протеиназ в тканях и в сыворотке крови при изолированном введении препаратов на модели мышиной НА-1 гепатомы.

5. Исследовать содержание цистатина С в сыворотке крови при развитии и лечении лимфосаркомы RLS, резистентной к противоопухолевой химиотерапии.

6. Изучить взаимосвязь между весом опухоли и содержанием цистатина С в тканях опухоли и в сыворотке крови мышей с экспериментальными опухолями. Оценить возможность использования количественного определения ингибитора в сыворотке крови, как биологического маркера опухолевого роста и оценки эффективности проводимой химиотерапии.

7. Изучить влияние различных макрофагальных стимуляторов полисахаридной природы (ЛПС, КМГ, SE-гликана), нативных липопротеинов и их комбинации на секрецию цистатина С и стефина А в культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей и мышей с НА-1 гепатомой.

8. Изучить влияние нативных липопротеинов на синтез и секрецию апопротеинов A-I и Е в культуре гепатоцитов и клетках Купфера.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Показано, что содержание цистатина С определяется во многих тканях и сыворотке крови интактных мышей линии СВА, (CBAxC57Bl/6)Fb A/Sn, наибольшее количество ингибитора обнаружено в ткани мозга. Сыворотка крови мышей содержит в 1,5-2 раза меньше цистатина С в сравнении с человеком. В тканях мышей содержание стефина А выше, чем цистатина С.

Впервые исследовалось содержание эндогенных ингибиторов -цистатина С и стефина А в опухолевых тканях на разных моделях опухолевого роста (с метастазами и без) и с различными гистологическими типами опухолей. Показано, что развитие экспериментальных опухолей характеризуется низким содержанием цистатина С и стефина А в опухолевой ткани по сравнению с другими органами. Минимальное количество цистатина С выявлено в опухолевой ткани аденокарциномы легких Льюис LLA, характеризующейся метастазами в легкие. Одновременно с ростом исследуемых опухолей происходит снижение концентрации цистатина С в печени, селезенке и сыворотке крови.

Впервые показано, что циклофосфан, подавляя рост основного опухолевого узла и оказывая антиметастатический эффект, увеличивает содержание основных внутриклеточных ингибиторов в ткани опухоли, печени и селезенки и в сыворотке крови у мышей с лимфосаркомой LS и аденокарциномой LLA.

Впервые выявлено, что карбоксиметилированный и сульфо-этилированный (1—>3)-р-0-гликаны или Украин потенцируют действие циклофосфана, совместное применение одного из стимуляторов макрофагов и противоопухолевого препарата приводит к максимальному увеличению содержания ингибитора в тканях и сыворотке крови.

Впервые показано, что применение нового противоопухолевого препарата Украина у мышей с НА-1 гепатомой увеличивает продолжительность жизни мышей, снижает ежедневный прирост массы опухоли, асцита и массу асцитной жидкости, изменяет клеточный состав асцита, снижая количество опухолевых клеток и увеличивая количество макрофагов. Введение Украина увеличивает содержание цистатина С и стефина А в клетках опухоли и восстанавливает концентрацию ингибиторов в печени и селезенке. Подобный положительный противоопухолевый эффект на примере НА-1 гепатомы продемонстрирован при введении животным карбоксиметилированного (1 ->3)- p-D-гликана.

Впервые выявлены изменения содержания цистатина С в сыворотке крови в ходе (на 12, 17 и 20 день) развития аденокарциномы легких Льюис и при введении противоопухолевых препаратов. Установлено что, модификаторы биологического ответа, гликаны, дают положительный эффект на содержание цистатина С в сыворотке крови у мышей с LLA в зависимости от массы опухоли: при небольшой массе опухоли (не более

2,7 г) КМГ или SE-гликан позволяют снизить дозу циклофосфана в 2-5 раз без снижения его противоопухолевого и антиметастатического эффекта. Если вес опухоли достигает более 5,7 г, одного введения циклофосфана не достаточно для достижения положительного эффекта, КМГ, SE-гликан или Украин усиливают действие циклофосфана.

Развитие лимфосаркомы RLS, резистентной к противоопухолевой терапии по сравнению с опухолью LS отличалось злокачественным течением: более быстрым ростом трансплантатов и ранней гибелью животных; в сыворотке крови содержание цистатина с в 1,5 раза ниже, чем при LS. Введение циклофосфана в дозе 150 мг/кг веса не изменяет содержание ингибитора в сыворотке крови мышей с RLS.

Впервые изучено влияние различных стимуляторов полисахаридной природы и липопротеинов плазмы крови на секрецию и синтез цистатина С и стефина А в культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей. Сульфоэтилированный и карбоксиметилированный (1—>3)-р-0-гликаны в 4-5 раз увеличивают секрецию ингибиторов в примированных макрофагах. Липопротеины низкой и высокой плотности увеличивают секрецию цистатина С и стефина А, их стимулирующий эффект более выражен по сравнению с изученными полисахаридами. При совместном воздействии липопротеинов и (1—»3)-Р-0-гликанов наблюдается многократное увеличение секреции ингибиторов. Действие ЛПВП почти в два раза больше, чем ЛПНП, а через два часа более выражено (в 4,6 раза) по сравнению с 30-минутным сроком.

Впервые показано, что перитонеальные макрофаги мышей с экспериментальной НА-1 гепатомой секретируют больше цистатина С, чем интактные клетки. Липопротеины низкой и высокой плотности увеличивают секрецию цистатина С в среду инкубации макрофагов мышей

НА-1 гепатомой. При совместном действии липопротеинов с КМГ или SE-гликаном этот эффект усиливается.

Установлено, что липопротеины высокой плотности совместно с гидрокортизоном усиливают в несколько раз синтез и секрецию цистатина С макрофагами от мышей с гепатомой НА-1, аполипопротеина Е - в культуре клеток Купфера, аполипопротеина A-I - в культуре гепатоцитов.

Впервые показано изменение содержания цистатина С в сыворотке крови у больных с гемобластозами (острый лейкоз, злокачественная неходжскинская лимфома, лимфогранулематоз, миеломная болезнь) и раком тела матки I и II стадии заболевания.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Выявленное антигенное сходство между ингибиторами человека и мыши позволило использовать наборы для определения цистатина С и стефина А человека для исследования содержания эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ у экспериментальных животных, в частности мышей A/Sn, СВА, (CBAxC57BI/6)Fl.

Увеличение концентрации ингибиторов цистеиновых протеиназ в сыворотке крови при введении противоопухолевых препаратов коррелировало со снижением веса основного опухолевого узла экспериментальной опухоли. Это предполагает использовать определение ингибиторов в сыворотке крови в качестве маркера опухолевого роста и для оценки эффективности проводимой химиотерапии не только у животных, но и в сыворотке крови больных со злокачественными новообразованиями.

Водорастворимые карбоксиметилированный и сульфоэтилированный (1-»3)-р-0-гликаны или Украин при совместном введении с циклофосфаном потенцировали его противоопухолевое и приводили к максимальному увеличению содержания ингибитора в тканях и сыворотке крови мышей с экспериментальными опухолями, что позволяет снизить дозу основного противоопухолевого препарата. Это открывает новые возможности применения гликанов или Украина для клинического использования при химиотерапии злокачественных опухолей человека.

Полученные данные по применению иммуностимулятора Украина подтвердили его противоопухолевый эффект, связанный с повышением содержания ингибиторов цистеиновых протеиназ (цистатина С и стефина А) в клетках мышиной НА-1 гепатомы.

Липопротеины и водорастворимые (1->3)-(3-0-гликаны, обладающие иммуностимулирующими свойствами, при совместном введении во много раз увеличивали синтез и секрецию цистатина С и стефина А в макрофагах, что предполагает разработку препарата, усиливающего содержание ингибиторов цистеиновых протеиназ в организме, как нового противоопухолевого соединения.

Получено авторское свидетельство на изобретение: А/с №1737340 "Способ определения апопротеина A-I в сыворотке крови" от 1 февраля 1992 г.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Развитие мышиных экспериментальных опухолей с различными гистологическими типами и характером метастазирования характеризуется очень низкой концентрацией эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в опухолевой ткани, а опухоленосительство сопровождается снижением содержания ингибиторов в печени, селезенке и сыворотке крови.

2. Водорастворимые (1->3)-Р-0-гликаны (КМГ, SE-гликан) или Украин повышают эффективность противоопухолевого действия циклофосфана, позволяют снизить дозу цитостатика и значительно увеличивают содержание ингибиторов в тканях опухоли, печени, селезенки и сыворотке крови.

3. Содержание цистатина С в сыворотке крови является прогностическим критерием опухолевого роста и проводимой противоопухолевой терапии.

4. Мышиные перитонеальные макрофаги секретируют внеклеточно ингибиторы цистеиновых протеиназ (цистатин С и стефин А). Макрофагальные стимуляторы полисахаридной природы (КМГ, SE-гликан) и/или нативные липопротеины увеличивают секрецию ингибиторов in vitro.

5. Процесс усиления синтеза и секреции белков под влиянием липопротеинов универсален и имеет место в различных клетках в норме и при развитии опухоли. Липопротеины усиливают секрецию цистатина С в макрофагах от интактных мышей и мышей с экспериментальной гепатомой НА-1, аполипопротеина Е - в клетках Купфера и повышают содержание аполипопротеина A-I в культуре гепатоцитов.

Автор выражает глубокую признательность научному консультанту профессору, доктору медицинских наук Короленко Татьяне Александровне за неоценимую консультативную помощь и поддержку на всех этапах работы. Автор благодарит коллектив лаборатории клеточной биохимии и физиологии Института физиологии СО РАМН - к.б.н. Жанаеву С .Я., д.б.н. Усынина И.Ф., к.м.н. Левину О.А., к.м.н. Фаламееву О.В., аспирантку Усову Т.А за помощь в работе, творческую поддержку и дружескую атмосферу. Особую благодарность автор выражает ведущему научному сотруднику Института цитологии и генетики СО РАН Каледину В.И. за предоставление штаммов опухолей, за помощь в работе. Автор благодарит д.м.н. профессора Полякова Л.М., заместителя директора по науке Института биохимии, за методическую помощь при работе с аполипопротеинами и макрофагами.

ВЫВОДЫ

1. При развитии различных гистологических типов опухолей (лимфосаркомы LS, гепатомы НА-1, аденокарциномы легких Льюис LLA) наблюдается низкая концентрация цистатина С и стефина А в ткани опухоли. В ткани аденокарциномы LLA, рост которой сопровождается метастазами в легкие, выявлено минимальное количество цистатина С. Опухоленосительство вызывает значительное снижение содержания ингибиторов в печени и селезенке. Одновременно с ростом опухоли происходит снижение (в 2-3 раза) концентрации цистатина С в сыворотке крови при всех видах опухоли.

2. Циклофосфан, подавляя рост основного опухолевого узла лимфосаркомы и аденокарциномы легких Льюис и оказывая выраженный антиметастатический эффект, увеличивает содержание цистатина С и стефина А в ткани опухоли, печени и селезенке. Карбоксиметилированный и сульфоэтилированный (1—>3)-Р-Б-гликаны или Украин потенцируют действие циклофосфана, совместное применение препаратов приводит к максимальному увеличению содержания исследуемых ингибиторов в тканях и сыворотке крови.

3. Выявлены обратные корреляции между содержанием цистатина С в опухолевой ткани и массой опухоли (для аденокарциномы легких Льюис LLA - г = -0,65, для лимфосаркомы LS - г = -0,71), между содержанием цистатина С в сыворотке крови и массой опухоли (г = -0,87; г = -0,79, соответственно), что позволяет использовать определение ингибитора в сыворотке крови как биологический маркер опухолевого роста и показатель эффективности проводимой химиотерапии у мышей с экспериментальными опухолями.

4. Введение противоопухолевого препарата Украина оказывает эффективное действие на мышей с гепатомой НА-1: увеличивается продолжительность жизни мышей, снижается ежедневный прирост массы опухоли, асцитической жидкости, уменьшается количество опухолевых клеток и увеличивается число макрофагов в асците. Одновременно повышается содержание цистатина С и стефина А в асцитных клетках и восстанавливается концентрация ингибиторов в печени и селезенке.

5. Изолированное введение Украина мышам с аденокарциномой легких Льюис LLA уменьшает количество метастазов в легких, снижает процент животных с метастазами, увеличивает содержание цистатина С в тканях опухоли и печени, повышает концентрацию стефина А в печени.

6. Лимфосаркома RLS, отличающаяся более агрессивным течением и резистентностью к терапии по сравнению с другими экспериментальными опухолями содержит значительно меньше цистатина С в сыворотке крови мышей. Отсутствие противоопухолевого эффекта циклофосфана на модели лимфосаркомы RLS не вызывает существенных изменений содержания цистатина С в сыворотке крови.

7. На культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей установлено, что клетки секретируют в среду инкубации цистатин С и стефин А. Модифицированные (1—>3)-|3-0-гликаны (КМГ и SE-гликан) увеличивают секрецию ингибиторов цистеиновых протеиназ. Липопротеины низкой и высокой плотности стимулируют секрецию ингибиторов макрофагами, при совместном введении липопротеинов и полисахаридов наблюдается многократное увеличение секреции цистатина С и стефина А.

8. Перитонеальные макрофаги от мышей с НА-1 гепатомой секретируют больше цистатина С, чем интактные клетки. Липополисахарид, карбоксиметилированный и сульфоэтилированный (1—>3)-|3-0-гликаны не изменяют секрецию ингибитора. ЛПВП и ЛПНП увеличивают секрецию, максимальный эффект наблюдается при совместном введении липопротеинов и гидрокортизона.

9. Под влиянием ЛПВП и гидрокортизона увеличивается содержание апопротеина A-I в культуре гепатоцитов. В клетках Купфера усиливается ресекреция аполипопротеина A-I и продукция аполипопротеина Е.

10. Эндогенные ингибиторы цистатин С и стефин А, регулируя функции цистеиновых протеиназ, играют важную роль в защите организма от развития злокачественных опухолей. Противоопухолевый препарат (циклофосфан) и стимуляторы макрофагов (1-»3)-Р-0-гликаны и Украин увеличивают содержание ингибиторов, при этом происходит торможение роста опухоли, уменьшение ее массы, снижение количества метастазов. Липопротеины и (1—»3)-(3-0-гликаны повышают содержание ингибиторов путем усиления их синтеза и секреции в макрофагах.