Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль катепсина "В" в развитии опухоли молочной железы у мышей

На правах рукописи

Коровин Матвей Сергеевич

Роль катепсина «В» в развитии опухоли молочной железы у мышей (экспериментальная работа)

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск-2009

2 3 йпЗ 2010

003490681

Работа выполнена в Институте молекулярной медицины и биологии клетки, Фрайбург, Германия и в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Роздрава».

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Консультант: академик РАМН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор медицинских наук, профессор

Васильева Ольга Сергеевна

Новицкий Вячеслав Викторович

Шенин Владимир Анатольевич Семннский Игорь Жаиович

Ведущая организация: ГУ НИИ Онкологии Томского научного центра СО РАМН, г. Томск

Защита состоится «» аРЖ^Х^ф®.009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.001.038.62 при «Учреждение Российской академии медицинских наук научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «Учреждение Российской академии медицинских наук научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан « 2-0 » К^яя^ь^ 2009

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Шолохов Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Инвазия и метастазирование рака являются результатом ряда взаимозависимых процессов, важную роль в регуляции которых играют протеолитические ферменты (Liotta L.A., Kohn Е.С., 2001). В процессе канцерогенеза малигнизированные клетки вырабатывают ряд протеаз, разрушающих клеточные мембраны и внеклеточный матрикс, способствуя тем самым проникновению раковых клеток в окружающие ткани.

Протеолитические ферменты, участвующие в опухолевой прогрессии и метастазировании, принадлежат к четырём основным типам протеаз: матриксные металлопротеиназы, сериновые протеазы, цистеиновые и аспартатные протеазы (Del Rosso M, Fibbi G., Pucci, et al, 2002; Egeblad M., Werb Z., 2002; Turk V., Kos J., Turk В., 2004). Лизосомальные цистеиновые протеазы (катепсины) относятся к семейству папаиноподобных протеолитических ферментов, локализующихся главным образом в эндосомах и лизосомах. Семь цистеиновых протеаз, катепсины В, С (дипептилил пептидаза I), F, H, L, О и X (другие названия: катепсин Z, катепсин Р) экспрессируются всеми типами клеток организма, тогда как остальные папаиноподобные цистеиновые протеазы (катепсины J, К, S, V, и W) экспрессируются только специфическими типами клеток (Deussing J., Kouadio M., Rehman S. et al, 2002, Rawlings N.D., Barret A.J., 2002).

Традиционно считалось, что лизосомальные цистеиновые протеазы выполняют неспецифические функции в лизосомах (Barret A.J., 1992). Тем не менее, на протяжении последних двух десятилетий были получены множественные доказательства специфических функций этих ферментов в ряде физиологических и патологических процессов (Friedrichs В., et al, 2003, Goulet В., et al, 2004). Было показано, что лизосомальные протеазы способны секретироваться внеклеточно, где они были обнаружены в больших

з

количествах при некоторых заболеваниях, включая рак (Sloane B.F., et al, 2005). Повышенная экспрессия катепсина В была выявлена в клетках карциномы молочной железы человека (Poole A.R., et al, 1978). Кроме того, увеличение экспрессии и протеолитической активности лизосомальных протеаз (например, аспартатных протеаз, катепсина D и цистеиновых протеаз, катепсинов В и L) часто связывают с плохим прогнозом для пациентов с различными злокачественными образованиями, в том числе с аденокарциномой молочной железы (Castiglioni Т. et al, 1994, Fröhlich Е. et al, 2001, Staack A. et al, Koenig F. et al, 2002).

Большинство экспериментальных доказательств участия лизосомальных цистеиновых протеаз в образовании опухолей было получено с использованием моделей ex vivo (Couliably S., et al, 1999, Mohanam S. et al, 2001, Premzl A. et al, 2003). Недавнее исследование с использованием ингибитора цистеиновых катепсинов широкого спектра в модели мышей Ripl-Tag2 идентифицировало роль цистеиновых катепсинов в ангиогенезе, росте и инвазивности опухоли поджелудочной железы (Joyce J.A., et al, 2004). Несмотря на то, что полученные данные подтверждают важность этого класса протеаз, они не раскрывают значимости отдельных катепсинов, в частности катепсина В, в отдельных этапах прогрессии in vivo, что является целью планируемого исследования.

Для установления роли катепсина В в развитии рака молочной железы была разработана трансгенная модель мышей с отсутствием катепсина В путём скрещивания катепсин-В-дефицитных мышей (Halang W., et al, 2000) с предрасположенной к раку молочной железы линией мышей [polyoma middle Т antigen (РуМТ)], в которой экспрессия РуМТ индуцируется в эпителиальных клетках молочной железы за счёт использования промотора вируса опухоли молочной железы мышей (mouse mammary tumor virus (MMTV)) (Guy C.T., et al, 2002).

Результаты исследований в этом направлении позволят установить роль катепсина В в возникновении и развитии РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы и её гистопатологической прогрессии. Кроме того, исследования первичной клеточной культуры раковых клеток, полученных от трансгенных мышей, позволят установить роль отдельных катепсинов в патогенезе раковой прогрессии.

Цель исследования:

Установить роль катепсина В в патогенезе РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы.

Задачи исследования

1. Разработать и оценить модель экспериментального длительного исследования формирования, роста и развития опухолей молочной железы у мышей.

2. Оценить влияние катепсина В на формирование и рост РуМТ-индуцированных опухолей.

3. Определить роль катепсина В в процессе гистопатологической прогрессии рака молочной железы.

4. Изучить свойства раковых клеток с разными генотипами катепсина В in vivo.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспериментальная модель карциномы молочной железы, разработанная с использованием РуМТ трансгена у мышей, характеризуется формированием опухолей эпителиального и мезенхимального типа, среди которых аденокарциномы составляют значительную долю. Экспрессия middle Т-антигена в трансгенных линиях животных под контролем промотора MMTV-

LTR (mouse mammary tumor virus promotor) приводит к синхронному появлению мультифокальных опухолей во всех молочных железах, при этом у большинства животных развиваются многочисленные лёгочные метастазы.

2. Лизосомальная цистеиновая протеаза катепсин В способствует возникновению, росту, инвазии и метастазированию РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы в экспериментальной модели PyMT;ctsb+/+ мышей.

3. Сроки развития аденокарциномы у PyMT;ctsb+/+ мышей короче, а скорость прогрессирования достоверно выше по сравнению с PyMT;ctsb-/-генотипом. Объём лёгочных метастазов у PyMT;ctsb+/+ мышей на 45% превышает таковой у PyMT;ctsb+/- и на 60% - у PyMT;ctsb-/- животными.

Научная новизна

Впервые изучена роль катепсина В в процессах формирования, роста и развития опухолей молочной железы в эксперименте. Установлено, что карциномы у PyMT;ctsb-/- мышей развиваются медленнее, чем у PyMT;ctsb+/+ животных.

Обосновано, что катепсин В способствует разрастанию опухолевой ткани и увеличению общей массы опухолей.

Впервые показано также, что катепсин В-зависимые изменения пролиферации могут способствовать развитию небольших опухолей и торможению процессов метастазирования у РуМТ\Ctsb+/- и PyMT;Cte¿>-/-мышей.

Результаты результаты исследования гистопатологической прогрессии РуМТ-опухолей молочной железы позволяют сделать вывод о том, что отсутствие катепсина В снижает количество злокачественных опухолей у нокаутов по сравнению с выходом их у PyMT;ctsb+/+ животных в возрасте 14 недель.

Научно-практическая значимость:

Установлена роль катепсина В как фактора, ускоряющего рост и гистопатологическую прогрессию РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы. При этом обосновано, что РуМТ-индуцированная карцинома развивается раньше и быстрее у РуМТ;й5Ь+/+ генотипа мышей. Данный генотип характеризуется и большим объёмом лёгочных метастазов. Результаты исследования первичной клеточной культуры раковых клеток, полученных из трансгенных мышей, выявляют вклад отдельных катепсинов в патогенезе раковой прогрессии и могут быть использованы при разработке новых патогенетически обоснованных подходов к терапии злокачественных новообразований.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены:

- на 22-й зимней школе по протеиназам и их ингибиторам (Тирс: Италия, 2005г.);

- на 4-м заседании Международного сообщества протеолиза (Квебек: Канада, 2005г.);

- на 23-й зимней школе по протеиназам и их ингибиторам (Тирс: Италия, 2006г.)

- на 4-й конференции экспериментальной онкологии (Краньска Гора: Словения, 2006г.)

- на 5-й международной конференции посвященной цистеиновым протеиназам и их ингибиторам (Порторож: Словения, 2006)

- на 5-й заседании Международного сообщества протеолиза (Патрас: Греция, 2007г.)

- на 5-й конференции экспериментальной онкологии (Краньска Гора: Словения, 2008г.)

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ - 1, в журналах перечня PubMed - 2, в тезисах докладов на съездах и конференциях международного уровня - 8.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», описания собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками. Список литературы состоит из 217 источников, из них 21 отечественный и 196 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на генетически модифицированных мышах. Для уменьшения влияния генетического фона катепсин В дефицитные мыши (Halangk W., et al, 2000) скрещивали с трансгенной линией мышей FVB/N-TgN(MMTVPyVT)634-MuI (РуМТ) (Guy С.Т., et al, 1992), которая была получена в лаборатории Jackson (Bar Harbor, ME). После скрещиваний было получено три генотипа мышей PyMT;ctsb+/+, PyMT;ctsb+/-, и PyMT;ctsb -/-.

Генотипирование животных проводили в возрасте от 10 до 21 дня.

Опухолевый рост регистрировали методом пальпирования три раза в неделю, начиная с возраста 30 дней. После обнаружения опухолей их диаметр измеряли каждые два дня до достижения возраста 98 дней. Пальпирование мышей-самцов проводили два раза в неделю.

Для гистологических исследований использовали препараты опухолей и лёгких мышей. Для изучения гистопатологической прогрессии использовали срезы опухолей толщиной 6 мкм.

Оценку пролиферации опухолевых клеток проводили с помощью маркера KÍ67 - ядерного протеина, экспрессируемого пролиферирующими клетками во всех фазах клеточного цикла (Gl, S, G2 и М-фаза) и отсутствующего в GO клетках. Кл67-антитела позволяют установить количество активно делящихся клеток в неоплазме путём определения количества Ьй67-положительных клеток в общем числе клеток.

Оценку процессов апоптоза в опухолевых клетках проводили при помощи метода TUNEL. Данный метод является одним из способов обнаружения апоптоза с помощью фрагментации ДНК.

Первичную культуру РуМТ-опухолевых клеток выделяли с использованием растворов дезоксирибонуклеазы I, гиалуронидазы и коллагеназы. В качестве клеточной среды использовали смесь растворов DMEM, пенициллин-стрептомицина L-глутамина. Клетки замораживали в среде диметилсульфоксида DMEM при -80°С.

Для разделения протеинов применяли вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле.

Для идентификации протеинов использовали метод иммуноблоттинга.

Для определения объёма лёгочных метастазов использовали метод ПЦР в реальном времени.

При сравнении арифметического среднего между различными группами применяли F теста Фишера, двухстороннего t-тест или метод ANOVA для более, чем двух групп. Нормальность распределения проверяли при помощи теста Шапиро-Вилка. В случае значительных различий или ненормального распределения использовали непараметрический тест Манна-Уитни,

Post hoc тесты и тесты парных сравнений проведены при помощи двухстороннего t-теста и теста Хи-квадрат. Для статистического анализа кривых Каплан-Майера использовали log rank тест. Достоверными считались различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Появление и рост РуМТ опухолей у трансгенных мышей-самок

В настоящее время известно, что наличие РуМТ трансгена у мышей вызывает формирование опухолей эпителиального и мезенхимального типа, среди которых аденокарциномы составляют значительную долю. Для индукции РуМТ опухолей необходим middle Т антиген. (Guy С.Т., et al, 1992).

В нашей работе в результате наблюдения мышей начиная с возраста 5 недель у нетрансгенных контрольных животных в исследуемом возрастном периоде опухоли не были обнаружены. Это подтверждает, что развитие опухоли индуцируется экспрессией РуМТ-онкогена. В группе PyMT;ctsb-/-мышей-самок пальпируемые опухоли молочной железы были обнаружены у всех животных к возрасту 72 дней, что на 16 дней позже, чем в группе контрольных PyMT;ctsb+/+ мышей (рис.1). В группе PyMT;ctsb-/- животных обнаружено значительно больше опухолей с диаметром менее 0,5 см, а также меньше опухолей размером от 0,5 до 1 см и опухолей более 1 см в диаметре по сравнению с PyMT;ctsb+/+ и PyMT;ctsb+/- группами животных (рис.2). В течение 30 дней с момента первого обнаружения опухоли в группе PyMT;ctsb-/-животных развивалось меньше опухолей размером 0,5-1 см и более 1 см по сравнению с PyMT;ctsb+/+ мышами, что указывает на способствование катепсина В опухолевому росту (рис.3).

Возраст мышей самок (дни)

Рис.1. Появление РуМТ-индуцированных опухолей у CTSB дефицитных мышей-самок: PyMT;ctsb+/+ (п =18), PyMT;ctsb+/- (п =20) и PyMT;ctsb-/- (п =22) мышей-самок. Р < 0,001, log-rank тест.

РуМТ: <0.5 cm

ctsb+/+ ■о ctsb+/-ctsb -/-

0.5-1 cm

>1 cm

40 50 60 70 80

Возраст, дни

50 60 70 80

Возраст, дни

50 60 70

Возраст, дни

Рис.2. Кривые роста опухолей у PyMT;ctsb+/+, PyMT;ctsb+/- и PyMT;ctsb-/-мышей. *, р< 0,05; **, р< 0,01, тест Стьюдента.

о4 «

и Ч о X

с

о

о а Ь о

и у

К

ч о И

р<0.01

■ >1 ст

□ 0.5-1 ст

□ <0.5 ст

^вЬ-/-

РуМТ: с!эЬ+/+ с1зЬ+/-

Рис.З. Размер опухолей в соответствии с их диаметром через 30 дней после появления единичной опухоли. Группы составили 80, 100 и 105 опухолей для групп РуМТ;йзЬ+/+ (п=16), РуМТ;с1БЬ+/- (п=20) и РуМТ;с1зЬ-/- (п=21) мышей соответственно.

Масса и размер опухолей

По достижении мышами возраста 100 дней животные эвтанизированы. Опухоли взяты для дальнейших исследований. Выявлено, что в группе РуМТ;йзЬ+/+ вес опухолей составлял в среднем 6,0 г, тогда как в группах РуМТ;с1зЬ+/- и РуМТфэЬ-/- мышей средний вес опухолей оказался на 1,5 г (р<0,05) и 2,1 г (р<0,01) меньше, чем в группе РуМТ;с1зЬ+/+ животных (рис.4).

п

о

X >>

а с я

4 -

0

I

РуМТ;№Ь+/+ РуМТ;С18Ь+/- РуМТ;№Ь-/-

Рис.4. Масса опухолей у мышей-самок в возрасте 14 недель.

Полученные данные показывают, что катепсин В способствует разрастанию опухолевой ткани и увеличению общего веса опухолей.

В нашей работе исследованы три группы мышей-самцов РуМТ;с1зЬ+/+ (п = 15), РуМТ;с1эЬ+/- (п = 16) и РуМТфзЬ-/- (п=22). Развитие опухолей молочной железы в группе РуМТ^зЬ-/- оказалось более замедленным по сравнению с группой РуМТ;с1зЬ+/+ мышей. Несмотря на то, что у половины РуМТ;с1зЬ+/+ и РуМТ;с1$Ь+/- животных развились пальпируемые опухоли в возрасте 15 и 18 недель соответственно, у 11 из 22 мышей в группе РуМТ;йзЬ-/- опухоли появились только через 26 недель (р < 0,001) (рис.5). В отличие от мышей-самок, у которых аденокарцинома развивалась во всех молочных железах, у трансгенных РуМТ-мышей-самцов установлены в среднем две опухоли без значительного различия между экспериментальными группами с разными генотипами по катепсину В.

В группе РуМТ^БЬ-/- животных не выявлено опухолей размером более 1 см в диаметре в течение месяца наблюдений (рис.6). Таким образом, полученные данные выявляют замедление опухолевого роста при отсутствии катепсина В у мышей-самцов.

РуМТ:

¡5 о - 111111111111111111111111111111

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Возраст мышей, недели

Рис.5. Появление РуМТ-индуцированных опухолей у СТБВ дефицитных мышей-самцов: РуМТ;йзЬ+/+ (п =15), РуМТ^Ы-/- (п =16) и РуМТ;^Ь-/- (п =22) мышей-самцов.

ч

о

X >>

100806040-

I

■ >1 cm

□ 0.5-1 cm

□ <0.5 cm

ctsb+/+ ctsb+/- ctsb -/-

Рис.6. Рост опухолей, определяемый их диаметром через 30 дней после обнаружения каждой отдельной опухоли.

Роль катепсина В в механизмах клеточной пролиферации

Хорошо известно, что опухолевая прогрессия является результатом нарушения баланса между пролиферацией клеток и их смертью. Процессы нарушения такого баланса определяют свойства опухоли (Sanchez-Beato et al., 2003).

Присутствие митотических ядер, тубулярных структур, а также плеоморфизм клеток являются основными для дифференцировки опухолевых поражений молочной железы (Elston, Ellis, 1991).

Нами установлено, что индекс пролиферации Ki67 у PyMT;Cis6-/- мышей в возрасте 10 недель на 8% (р < 0,05) и на 12% (Р < 0,05) меньше, чем у PyMT;Cisb+/- и PyMT;Cisè+/+ животных соответственно (рис.8).

Снижение пролиферации в опухолях PyMT;Qsè-/- животных в возрасте 10 недель может давать более полное представление о дифференцировке опухолей, чем собственно эффект отсутствия катепсина В в опухолевых тканях молочной железы.

Приведённые выше данные подтверждают полученные ранее результаты на модели рака поджелудочной железы мышей (Ripl-Tag2), которые показали

значительное уменьшение формирования карцином у катепсин В-дефицитных мышей (ОосЬеуа ег а1., 2006).

РуМТ;С£5Ь+/+ РуМТ ;С(зЬ+/- РуМТ\Ctsb-l-

Рис.7. Визуализация Кл-67-положительных клеток на опухолевых препаратах.

2 о а

20-

X

**

I

I

□ РуМТ;С(зЬ+/+

□ РуМТ;СГ5Ь+/-■ РуМТ;С(5Ь-/-

10 14

Возраст мышей, недели

Рис.8. Типичное распределение Кл67-положительных клеток в опухолях молочной железы у йзЬ+/+ и йвЬ-/- РуМТ животных в возрасте 10 и 14 недель

(40-кратное увеличение). Общее количество полей в группе РуМТ;с1БЬ+/+ 10 недель составляло 30 для шести животных; в группе йзЬ+/- 10 недель 45 полей для девяти животных; в группе РуМТ;йБЬ-/- 10 недель 55 полей для 11 животных; в группе РуМТ;с1зЬ+/+ 14 недель 70 полей для 14 животных; в группе с1бЬ+/- 14 недель 60 полей для 12 животных и в группе РуМТфэЬ-/- 14 недель 55 полей для 11 животных (непарный тест Стьюдента **, р< 0,01).

Гистопатологическая прогрессия первичных опухолей до стадии поздней карциномы

Результаты исследований гистопатологической прогрессии первичных опухолей показали, что отсутствие катепсина В снижает количество злокачественных опухолей у нокаутов по сравнению с РуМТ;й5Ь+/+ группой животных возрасте 14 недель (рис.9).

□ N □ РЦ □ АРН □ ООБ □ ЮС(С1) □ ЮС (И!) ■ ЮС (СШ) _р=0.03___р=0.05

РуМТ;

Возраст

р=0.20

аэь+/+

р=0.14 р=0.13

■

азь+/- спь-/- а$ь+/+

а$ь+/-

р=0.21 р=0.03

Обь-/- аэь+/+

б недель

10 недель

14 недель

Рис.9. Гистопатологическая прогрессия первичных опухолей к поздней карциноме у катепсин В-дефицитных мышей.

Данные представлены в процентном распределении в образцах ткани PyMT;ctsb+/+ (п = 10), PyMT;ctsb+/- (п = 10) и PyMT;ctsb-/- (п = 10) животных. Различия в частоте встречаемости стадии поздней карциномы в группе PyMT;ctsb-/- животных в возрасте 14 недель достоверны по сравнению с PyMT;ctsb+/+ группой (тест Хи-квадрат, р< 0,01). Эти наблюдения показывают влияние катепсина В на дифференцировку клеток и формирование тубулярных протоков в ткани молочной железы.

Развитие метастазов в лёгких у РуМТ-мышей с различными генотипами катепсина В

Характерной особенностью модели MMTV-PyMT аденокарциномы у мышей является развитие многочисленных лёгочных метастазов, которые можно наблюдать макроскопически и микроскопически в возрасте от 3 до 4 месяцев (Chambers A.F., et al, 2002).

Метастазирование опухолевых клеток - это последовательные процессы, в которых опухолевые клетки распространяются и проникают в сосуды, ткани, и создают очаги метастазирования (Chambers A.F., et al, 2002). Экспрессия катепсина В на генном и белковом уровнях связана с метастизированием (Nagai A., et al., 2003, Tzanakakis G.N., et al., 2003), однако недостаточно известно о функции катепсина В в метастатических процессах in vivo. В нашей работе роль катепсина В опухолевых клеток была проанализирована на лёгочных метастазах.

По сравнению с PyMT;ctsb+/+ группой, объём лёгочных метастазов был уменьшен до 45% в PyMT;ctsb+/- группе (Р = 0,01) и до 65% в PyMT;ctsb-/-группе животных в возрасте 14 недель (Рис.10), хотя снижение объёма метастазов в последнем случае не было статистически значимым. Эти данные показывают, что катепсин В способствует метастазированию в РуМТ модели рака молочной железы.

В возрасте 14 недель установлено меньшее количества метастазов в лёгких у РуМТ(р < 0,01) и РуМТ;С^Ь-/- мышей (р < 0,05), при этом самое низкое значение было отмечено в РуМТ;С&6+/- группе животных (рис.11).

£ О

о

3

о

О

РуМТ: с1эЫ-/+ с1эЬ+/-

Рис.Ю. Влияние отсутствия катепсина В на развитие лёгочных метастазов РуМТ опухолей молочной железы. Гистоморфометрическое определение объёма лёгочных метастазов у РуМТ;с1зЬ+/+ (п =36), РуМТ^Ь+Л (п =38) и РуМТ;^!)-/- (п =32) мышей-самок в возрасте 14 недель.

а К р-г

X 5 Н X

а X а.

н

100

10 1 0.1

РуМТ\CtsbW* РуМТ;С(8Ь+/-РуМТ; №(>-/-

Тг =

10 14

Возраст мышей, недели

Рис.11. Развитие лёгочных метастазов у РуМТ мышей-самок с разными генотипами катепсина В. Лёгочные метастазы опухолей молочной железы в группах РуМТ;с1БЬ+/+, РуМТ;йзЬ+/- и РуМТ^Ь-/- животных сравнивали при

помощи экспрессии РуМТ-мРНК в лёгких. Представлены средние значения для пяти животных каждого возраста (тест Манна-Уитни, р< 0,05, п = 22)

Пролиферация опухолевых клеток в лёгочных метастазах

Появляется всё больше доказательств регуляции пролиферации опухолевых клеток стромальными клетками (фибробластами и миелоидными клетками) путём секреции митогенных факторов и факторов роста (van Roozendaal et al., 1996; Loffek et al., 2006).

Определение индекса Ki67 пролиферации в экспериментальных метастазах выявило значительное снижение пролиферации опухолевых клеток в лёгочных колониях, где отсутствовала даже одна аллель катепсина В. Более того, инъекция опухолевых клеток с частичным или полным удалением катепсина В Ctsb-/- реципиентам приводила к понижению индекса пролиферации до 26-27% (р < 0,01). Эти данные показывают специфическую роль катепсина В в регуляции клеточной пролиферации в дополнение к установленной роли в опухолевой инвазии.

Клеточную пролиферацию в лёгочных метастазах определяли при помощи окраски Ki67. Индекс пролиферации Ki67 был статистически ниже в группе PyMT;ctsb-/- животных по сравнению с группой PyMT;ctsb+/+ в возрасте 14 недель (рис.12, рис.13).

PyMT;Cfsb+/+ PyMT;Cfsb+/- PyMT;Cisb-/-

Рис.12. Пролиферация клеток в метастазах лёгких у PyMT;ctsb+/+, PyMT;ctsb+/- и PyMT;ctsb-/- животных (40-кратное увеличение).

РуМТ;С?эЬ+/+ РуМТ;С(яЬ+/- РуМТ;С(гЬ-/-

Рис.13. Индекс пролиферации Кд-67 в лёгочных метастазах (непарный тест Стьюдента Р < 0,05, п=8).

В целом, полученные нами данные подтверждают участие катепсина В в аутокринной и паракринной регуляции пролиферации клеток опухолей молочной железы. Удаление катепсина В приводит к уменьшению признаков малишизированности опухолей молочной железы и к замедлению опухолевого роста. Показано, что катепсин В опухолевых клеток, а также опухолевой среды активно участвует в пролиферации РуМТ опухолевых клеток. Результаты свидетельствуют, что катепсин В, выделенный из опухолевых и стромальных клеток, играет важную роль в процессах метастазирования. Таким образом, фармакологическое ингибирование внеклеточного катепсина В в опухоли и окружающей её среде при помощи ингибиторов, не проникающих через мембрану, может быть важным для эффективного лечения раковых заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная модель, позволяющая изучить роль катепсина В в процессах формирования, роста и метастазирования опухолей молочной железы.

2. Лизсомальная цистеиновая протеаза катепсин В способствует возникновению, росту, инвазии и метастазированию РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы. Появление опухолей наблюдалось у всех животных в группе PyMT;ctsb-/- мышей-самок на 16 дней позже и с более медленным ростом (р<0,01) чем в контрольной PyMT;ctsb+/+ группе .

3. Катепсин В не является критическим фактором для малигнизации отдельных клонов клеток, а принимает участие в процессах инвазивного роста опухоли.

4. Катепсин В усиливает темпы прогрессии РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы за счёт повышения пролиферативной активности клеток (р<0,01), составляющих субстрат опухоли.

5. Катепсин В способствует метастазированию РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы, о чём свидетельствует снижение темпа миграции и инвазии опухолевых клеток у катепсин В-дефицитных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коровин М.С. Роль лизосомальных цистеиновых протеиназ в опухолевой прогрессии / М.С. Коровин, В.В. Новицкий, О.С. Васильева // Бюлл. сиб. мед.-2009.-№6.-С. 85-91.

2. Tumor cell-derived and macrophage-derived cathepsin В promotes progression and lung metastasis of mammary cancer / O. Vasiljeva, A. Papazoglou, A. Kruger et al. // Cancer Res. - 2006. - Vol. 66, N 10. - P. 52425250.

3. Reduced tumour cell proliferation and delayed development of high-grade mammary carcinomas in cathepsin B-deficient mice / O. Vasiljeva, M. Korovin, M. Gajda et al. // Oncogene. - 2008. - Vol. 27, N 30. - P. 4191-4199.

4. Role of cysteine cathepsins in the mechanisms of mammary cancer progression

in the PyMT mouse model with different cathepsin B genotypes / 0. Vasiljeva, A. Papazoglou, M. S. Korovin, et al. // 22st Winter School on Proteinases and their Inhibitors, Recent Developments, - Italy, 2005. - P. 73.

5. Role of tumor cell and and macrophage-derived cathepsin B in a mammary cancer model / C. Peters, O. Vasiljeva, A. Papazoglou, M. Korovin, H. Brodoefel, A. Krüger, T. Reinheckel // 4th General Meeting of the International Proteolysis Society, IPS, associated with the International Conference on Protease Inhibitor, - Canada, 2005. - P. 138.

6. Tumor cell- and macrophage-derived cathepsin B promotes progression and lung metastasis of mammary cancer / O. Vasiljeva, A. Krüger, A. Papazoglou, H. Brodoefel, M. Korovin, C. Peters, T. Reinheckel // 23rd Winter School on Proteinases and their Inhibitors, Recent Developments: in Tiers at the Rosengarten, - Italy, 2006. - P. 73.

7. Tumor cell - and macrophage-derived cathepsin B promotes progression and lung metastatis of mammary cancer / O. Vasiljeva, A. Krüger, A. Papazoglou, H. Brodoefel, M. Korovin, K. Amholt, B. Nielsen, C. Peters, T. Reinheckel // 4th Conference on Experimental and Translational Oncology, - Slovenia, 2006,-P. 25.

8. Tumor cell- and macrophage-derived cathepsin B promotes progression and lung metastasis of mammary cancer / O. Vasiljeva, A. Krüger, A. Papazoglou, H. Brodoefel, M. Korovin, C. Peters, T. Reinheckel // 5th International Conference on Cysteine Proteinases and their Inhibitors: From Structure to Regulation and Biology, - Slovenia, 2006 - P. 52.

9. Delayed histopathological progression and reduced tumour cell proliferation of mammary cancer in cathepsin B deficient mice / O. Vasiljeva, M. Korovin, M. Gajda, H. Brodoefel, L. Bojic, A. Krüger, U. Schurigt, L. Sevenich, B. Turk, C. Peters, T. Reinheckel // 5th General Meeting of the International Proteolysis Society : book of abstract, - Greece, 2007. - P. 243.

10.Cathepsin В promotes histopathological progression and proliferation of mammary cancer / O. Vasiljeva, M. Korovin, M. Gajda, H. Brodoefel, L. Bojic, B. Turk, C. Peters, T. Reinheckel // From single molecules to degradomics : book of abstracts, - Slovenia, 2007. - P. 106.

11.Reduced tumour cell proliferation and delayed development of high-grade mammary carcinomas in cathepsin B-deficient mice / 0. Vasiljeva, M. Korovin, M. Gajda, H. Brodoefel, L. Bojic, A. Krüger, L. Sevenich, U. Schurigt, B. Turk, C. Peters, T. Reinheckel // 5th Conference on Experimental and Translational Oncology, Kranjska gora, Slovenia : book of abstracts / Association of Radiology and Oncology, - Slovenia, 2008. - P. 74.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РуМТ - polyoma middle T антиген

MMTV - mouse mammary tumor virus - вирус опухоли молочной железы

Ру V - Polyoma virus, вирус полиомы

TNF - tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли

VEGF - vascular endothelial growth factor, сосудисто-эндотелиальный фактор роста

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ММП - матриксная металлопротеиназа мРНК'- матричная РНК ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ТСП - тромбоспондин

Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 114.

Тираж отпечатан в типографии ИОА СО РАН. г. Томск 634021, пл. Академика Зуева, 1 Тел. (382-2) 491-093