Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Трехмерная геометрия нейронов и их пространственное расположение в неокортексе мозга человека в норме и патологии (эпилепсия, синдром Ретта)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЗПО-РССПВДОВАТЕЛЬСКНЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

ОД

~~ 5 С£Ц . На правах рукописи

ВЕЛИЧЕНКО ПАВЕЛ ВАСИЛЬЕВИЧ

ТРВХМВРШШ ГЕОМЕТРИЯ НЕЙРОНОВ И ИХ ПРОСТРАНСТВЕННОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ В ПЕОКОРТЕКСВ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ (ЭПИЛЕПСИЯ, СИНДРОМ РЕТТА)

14.00.2 3 - гистология, цитология, эмбриология

Авторе ф е р <| т диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук в бил« научного доклада

Москва - 19 94

Робота выполнена и лаборатории нейронной структуры мо-jra Научно исследовательского института мозга Российской академии медицн л'-к наук и ъ отделении анатомии и клеточной биологин Г'етеборгсм лч Университета, Шиеция

Официальны«» оппоиоатш

Доктор медицинских наук, профессор Д.Д. Орловская Доктор биологических наук H.A. Чернышевская Доктор медицинских наук С. в. Савельев

Ведущей учреждение - Российский университет дружбы народов

Защита состоится__:___ 1994 г. в _ часов на заседали

специализированного Совета по защите докторских диссертаций 0010401 при 1111И морфологии человека РАМН по адресу» 117418, Моокиа ул. Цюрюпы, д. 3

С диссертацией можно ознакомится и библиотеке Института Автореферат разослан

"......."........................ 19 9 4 Г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

к.и.н. И.Н. Еыельлненко _________

X. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Ахтуальность проблемы

Знание нейронного строения мозга человека в норме и иго изменение при неврологических и психических заболеваниях имеет огромное фундаментальное н практическое значение для современной нейробнологни. Данная область нейронауки оказалась настолько значимой для общества, что последние 10 лет XX века были провозглашены "Декадой изучения мозга человека". Так как большая часть информации (до 95%) со стороны других нейронов приходит на дендриты нейрона, представляется чрезвычайно важным исследовать нейроны вместе с их отростками. Для такого нейронного картирования мозга человека (НКМЧ) необходимо морфологическое описание трехмерной структуры отдельных нейронов разных типов с их отростками (дендритами и аксонами) и их точного Местоположения в формациях мозга. Это позволит лучше понять функциональное значение отдельных областей мозга в норме и их изменение в патологии. В литературе существуют немногие работы по нейронному строению неокортекса человека в норме (Cajai, 1909; Lorente de No, 1933; Поляков, 1949-1979; Школьник-Яросс, 1965; Marin-Padilla, 1970-1984; Антонова, 1972-1983; Purpura, 1975; H. Braak, 1976j Scheibel and Scheibel, 1978; E. Braak, 1982; Mrzljak et al., 1988; Kostovic, 1990; Uylings and Van Eden, 1990). Была создана классификация нейронов коры, исследован их пре- и постнатальный онтогенез для части попей неокортекса. Литературные данные относительно патологических изменений нейронов с их отростками при различных неврологических и психических заболеваниях единичны (Hutteiilocher, 1974; Scheibel et al., 1974; Willlama, 197b; Scheibel, 1981; Bondarier et al., 1986; Robain et al., 1089), не систематичны или совсем отсутствуют. В работах по патологии нейронов при различных заболеваниях в основном'- уделялось внимание изменению дендритов пирамидных нейронов И было найдено уменьшение числа дендритных шпиков. Болыяинство работ выполнено методом импрегнации нейронов то Гопьджн в различных его модификациях. Однако, собственный опыт (2-4) и данные литературы (Е. Braak, 19Я2; Mrzljak et al., 1988; <ostovic, 1990; Uylings and Van Eden, 1990) показывают на значительнее ограничения данного метода при изучении мозга человека в норме и ттологии. Так, неконтролируемость импрегнации, слабая выявляемость iKcoHoB, невозможность окраски большого числа нейромои для <орфометрического анализа в каждом случае не позволяют широко 1спользовать данный метод. Последний факт окэзыиается особенно сритчческим при изучении патологии мозга человека. Индивидуальные особенности этиологии, течения и лечения заболевания диктуют 1еобходимость исследования большого количества нейронов в каждом отдельном случае для выяск ;ння морфологической картины заболевания сонкреткого больного.

В данной работе применена оригинальная стратегия трехмерного нейронного картирования коры мозга человека, включающая внутриклеточное кведение . флуоресцентного красителя люциферового желтого (ЛЖ), внутриаксональный транспорт флуоресцентных карбоцианиновых красителей (в основном Dil, DiA, fast Dil) в комбинации с иммунофлуоресцентным методом выявления биологически активных веществ и конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (КЛСМ). Работа включала два раздела» 1) Изучение нормальной нейронной структуры коры мозга человека без неврологических нарушений; 2) Исследование патологии нейронов коры мозга больных детей с диагнозом лекарственно-резнстентной ("геннуинной") эпилепсии (ЛРЭ) и больных с диагнозом синдрома Ретта (CP), при котором эпилептические припадки удается контролировать медикаментозно.

Изучение детской ЛРЭ имеет большое социальное и практическое значение. Как показывает клинический опыт, у эти больных эпилептогенные припадки возникают довольно рано (в возрасте 0-7 лет). Применение различных новоПших антнэпилептическнх препаратов в течении последующих 10-15 лет не дает достаточного эффекта и в возрасте 15-20 нет им производится нейрохирургическая операция по поводу удаления эпилентогенного очага. В многочисленных современных клинических работах показано, что данный вид эпилепсии в большом числе случапв полностью излечивается после подобного нейрохирургического вмешательства или значительно снижается число эпилептических припадков (Carlson, 1994 ; Malmgren and Sullivan, 1994; Uvebrant, 1994). Таким 'образом, получается парадоксальная ситуация, в которую попадает часть больных с ЛРЭ! в 15-20 лет они избавляются от эпилепсии, однако потенциальные способности мозга к обучению и пластичности, присущие детскому возрасту, упущены, так как частые приступы не давали ни возможности нормального занятия д окопе. Действительно, данные (физиологические, психологические, морфологические) по постнатлльному развитию детей показывают, что пластические способности мозга человека наиболее развиты в ранний детский период и претерпевают значительные изменения с возрастом (в сторону их уменьпення;(см. напр. Никитина, 1971; Kostovic, 1990). На этот период жизни ребенка (6-15 пет) приходится и наиболее продуктивное обучение его в иколе. Учитывая вышесказанное, очевидно, хакое важное социальное и практическое значение имеет ранняя диагностика данного вида заболевания для выполнения нейрохирургической операции по удалению эпнлептогеннсго очага. Морфологическое изучение коры мозга человека при эпилепсии ограничены в основном цитоархитектоническими данными (Meencke and Janz,1384; Babb and Brown, 1987; Nordborg, 1987; Palmini et al., 1991), методом Гольджи показано только уменьшение числа дендритных шипиков н наличие варикозностей на дендритах (Demoor, 1898; Scheibel et al., 1974; Scheioel, 1981).

Клинические проявления другого, изученного б данной работе,

>болевания раннего детского возраста - синдрома Ретта (двигательные зтоматизмы, аутизм, утрата речи, умственная отсталость, эпилептогенные /дорожные припадки) указывает на раннюю вовлеченность определенных груктур мозга. Литературные данные изучения морфологических изменения эзга больных с синдромом Ретта единичны (аеИл-пдег et а1., 1988? зз^опд, 1992; 01<3£огз еЪ а!., 1993), а по некоторым отделам мозга эосто отсутствуют, хотя встречаемость этого заболевания в 4 раза чевышает фенилкетонури» (НадЬегд, 1989} Епдег^гот, 1992). В 1СТояцее время существует единичная работа AInstrong (1992) по 1учению нейронов с их отростками методом Гольджи, в которой выявлено «шызеиие числа дендритов, более заметное для базальных чем косых шкалышх дендритов в височной, чем в зрительной коре. С одной гороны, это ограничивает наин знания по этиологии и патогенезу шного заболевания, а с другой стороны, затрудняет разработку фмакологнческпх препаратов, направленных на лечение данного вида кболевания.

Таким образом, актуальность данной работы представляется в >пытке выяснения закономерностей нейронной структуры корковых полей >зга человека в норме и изучения их при двух неврологических [болеваниях раннего детского возраста - лекарственно-резистентной шлепсии и синдроме Ретта.

2. Цела а задача работы

Цепь работы - выявить закономерности трехмерной нейронной •руктуры отдельных полей разных областей коры мозга человека (поле > фронтальной коры, поле 21 височной коры, поле 17 затылочной коры, >ле 7 теменной коры) в норме а ее изменение в патологии (в шлептогенном очаге при лекарственно-резистентной эпилепсии (ЛРЭ), |Ц синдроме Ретта (СР)).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи>

1. Разработать методы избирательной системной окраски нейронов волокон мозга человека на аутопснйном н биопснйноы материале, зволяющне дать оценку трехмерной геометрии нейронов в норме и тологни. Разработать метод одновременного выявления структуры йронов (с их дендритами а аксонами) и иммуногистохимической ентификации биологически активных вецеств. Для данных методов вонть и применить метод получения трехмерного изображения нейронов и поиоци конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ).

2. Изучить трехмерную геометрию нейронов и их пространственное сположение в ряде полей разных областей коры мозга человека в норме оля 10, 21, 17, 7) н выявить морфологические ссобенности, рактерные для каждого из этих полей (аутопсийкай материал).

3. изучить трехмерную геометрию нейронов кори мозгг. человека в илептогенком р емзжних участках горы при лекарственно-резистентной нлепсни (поля 21, ?0, 18, 71 (биопсийныи мсгер:'эп чсслс

нейрохирургических операций).

4. Изучить трехмерную геометрию нейронов хоры мозга людей диагнозом синдром Ретта (поля 10, 21, 4) (аутопсийный материал)

5. На основании проведанного анализа нейронов составить ба: данных, для трехмерного картирования мозга человека в норме и I изменения при лекарственно-резистентной эпилепсии и синдроме Реттс

1.3. Научная новизна результатов

1. Разработана новая стратегия морфологического изучения моз1 человека, позволяющая проводить нейронное картирование мозга челове! на микроуровне в норме и патологии. Создано новое направление изучении трехмерного нейронного строения мозга человека с поыощ конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Данная стратегия осуществляется применением комплекс морфологических методов системного выявления нервных элементов моз! человека на аутопсчйном и биопсийном материале! а) Внутрнклеточнс введение на фиксированном мозге флуоресцентного красителя люцнферово] желтого (метод ЛЖ), позволяющее окравивать больное количест! нейронов ( 100-300) на любом, даже на очень небольвом участке мозгг Метод ПЖ хорошо выявляет весь нейрон! дендриты с випиками варикозностями и аксоны с коллатералями. 6) Аксональный трансго; флуоресцентных кгрбоцианиновых красителей (прежде всего Dil, fai Dil, Di А), позволяющий прослеживать антеро- и ретроградные нейрональш связи в мозге человека, в) Разработана комбинация метода ЛЖ и мето) карбоцианиновых красителей с иммунофлуоресцентным методом, позволяю«, на одном и том же срезе мозга человека изучать трехмерж распределение биологически активных веществ и трехмерную геометр! дендритов и волокон, г) Р&зработан метод регистрации изображен! нейронов и волокон при помощи конфокального лазерного сканируюце! микроскопа (КЛСМ), позволяющий сохранять изображение в 6iitodi формате, проводить двух и трехмерную реконструкцию глеток.

2. Изучена трехмерная геометрия нейронов и их пространствент расположение в коре мозга взрослого человека (поля 10, 21, 1/,

в норме и создана база данных конфокальных изображений пирамндш и непирамидных нейронов этих полей, записанная на лазерных оптичесю дисках.

а) Изучена гетерогенность пирамидных нейронов данных .юле] описаны морфологические особенности как "классических" пирам.цн нейронов, так и их разновидностей! биапикалышх, "динозавр-подобия: и фузиформных. Выявлено, что в слоях II-III соотношение обычт пирамидных клеток с биапикальными составляет 10!1; в слоях V-V соотношение обычных пирамидных клетох с "динозавр-подобными" фузиформными составляет 12i8il. Показано равномерное распределен дендритных шипиков у данных нейронов, л также симметричное распределен космy апикальных дендритов.

б) Выявлены специфические черты геометрии дендритов, присущие фамндным нейронам определенных полей коры мозга человека. Оценка >нентацин дендрнтов пирамидных нейронов показала, что косые шкальные н базальные дендрита II-III слоев поля 10 фронтальной коры «еют горизонтальную ориентацию, в меньшей степени это характерно пп нейронов 7 поля париетальной коры, в то время как нейроны эительной коры 17 поля имеют вертикальную ориентацию, а нейроны 21 зля височной коры не имеют предпочтительной ориентации.

в) Морфометрнческое изучение параметров геометрии дендритов илвило наличие 2 типов нейронов слоя III 17 поля (а- и б-клетки), х колончатое распределение с периодичностью 300-400 мкм. Базальные

косые апикальные дендриты пирамидных нейронов внутри колонки (а-потки) имеют более вертикальную ориентацию, чем дендриты нейронов :жду колонками (б-клетки). Эти два вида нейронов также различаются э обаей площади дендритной территории (S da), площади апикальных 3d ар) и площади базальных (Sd bas) дендрнтов, по общей длине (Ld) длине базальных дендритов (Ld Ьаз), общей плотности ( Nd ) и плотности шкальных дендрнтов (Nd ар).

г) Выявлено подразделение пирамидных нейронов III слоя 7 поля змеиной коры на 2 подслоя, лежащих один над другим, согласно граметрам геометрии дендрнтов. Два вида клеток (а и б) различаются э следующим параметрам! общей площади дендритной территории (S da), Зщей длины (Ld) и длины базальных дендритов (Ldbas), общей плотности Id) и плотности базальных дендритов (Nd bas), числу свободных концов гндритов (Bd), разветвленности клетки (Ас).

д) Для исследованных полей коры мозга взрослых людей показано »личие четких границ между I и II слоями, между белым и серым ;цеством, отсутствие многочисленных нейронов в слое I и белом ;цестве.

Составленная библиотека трехмерных конфокальных изображений Тронов коры мозга человека и их местоположения в норме использована данном исследовании для сравнения с патологией (ЛРЭ н CP), а также зжет быть использована при изучении коры ыозга данных областей при >угих неврологических и психических заболеваниях.

Э. Изучена трехмерная геометрия нейронов коры мозга и их юстранственное расположение в эпилептогенном очаге больных дарственно-резистентной эпилепсией (поля 21, 10, 18, 7). Составлена 1за данных трехмерных конфохальных изображений атипичных нейронов, [рактерных для этого заболевания. Выявлено:

а) наличие 4-х видов непирамидных нейронов в I слое, которые •сутствуют в норме, не найдено клеток Кахала-Ретциуса, характерных 1Я раннего пренатального онтогенеза,

б) 2-4-х кратное увеличение числа биапикальчых пирамидных fipoHOB во II-III слоях, при неизменном количестве всех пирамидных ¡Аронов,

в) отсутствие колончатой организации нейронов во II-III слоях

г) атипичная ориентация косых и/или базальных дендритов пирамидных нейронов в слоях II-VII, заключающаяся в ориентации коси апикальных дендритов к базальному полюсу клетки и базальных дендрнто к апикальному полюсу клетки,

д) региональное отсутствие випиков ("голые" участки дендритов на пирамидных нейронах во II-VII слоях,

е) увеличение числа "динозавр-подобных" и фузиформных нейроно в слоях V-VII, без увеличения общего числа нейронов в этих слоях

ж) наличие многочисленных атипичных пирамидных нейронов в бело веществе.

Вышеперечисленные морфологические данные по нейронному строен» эпилептогенного очага больных ЛРЭ предполагают нарушение мнграцн нейронов коры мозга у данных больных в раннем пренатальном онтогенез и указывают на "критический" период, когда происходит это наруиенн (5 месяцев пренатального онтогенеза) (см. 37). Выявлена положительна корреляция степени нарушения нейронной структуры в эпилептогенно очаге с возрастом появления эпипептогенных припадков.

Составленная библиотека трехмерных конфокальных изображенн атипичного нейронного строения коры мозга человека при ЛРЭ использован в этом исследовании для прогноза течения ценного заболевания конкретных больных. Эти данные также являются клинически значимом при их использовании для профилактики данного видл заболевания здоровых людей "группы риска", а такяе для ранней диагностики ЛР при биопсийном исследовании пациентов.

4. Изучена трехмерная геометрия нейронов коры мозга и и пространственное расположение у людей с диагнозом синдрома Ретт (поля 10, 21, 4), составлена база данных атипичных нейронов при это заболевании. Выявлено!

а) отсутствие различий нейронов, характерное для исследовании полей коры мозга человека в норме (в т.ч. отсутствие горизонтальног распределения базальных и косых апикальных дендритов, характерно! для нормы во фронтальной коре); геометрия нейронов одинакова и фронтальной, височной и теменной коре,

б) уменьшение числа и региональное отсутствие шиппков ("голые участки дендритоз) на пирамидных нейронах во II-VII слоях,

в) уменьшение числа н ассиметрическая потеря косых апикальни дендритов нейронов во II-III слоях,

г) атипичное распределение горизонтальных волокон и признаки н дегенерации по всему поперечнику коры,

д) отсутствие признаков нарушения коркового строении, T.t отсутствие многочисленных нейронов в I слое и белом веществе бпапикальных нейронов во II-III слоях, атипичной ориентации данлритоь

с?) неравномерность поражения различных полей и слоев кори при к ерлпненни между собой! во фронтальной коре (поле 10) пмрлмнпнь

нейроны II-III слоя были более изменены, чем в слоях V-VII, причем изменения касались в большей степени косых апикальных дендритов, чем базальных; в моторной коре (поле 4) нейроны слоев V-VII были более изменены (кроме больших клеток Бэца), чем нейроны II-III слоев; в височной коре (поле 21) атипичное строение нейронов наблюдалось по всем слоям коры,

5. Морфологические данные по нейронному строению коры мозга больных с синдромом Ретта указывают на ее принципиальное отличие от морфологической картины эпилептогенного очага при лекарственно-резистентной эпилепсии. При синдроме Ретта не найдено признаков нарушения миграции нейронов коры мозга в раннем пренатальном онтогенезе, что характерно для ЛРЭ. Анализ этих морфологических и литературных клинических данных (Hagberg, 1989; Engerstromr 1992) предполагает нарушение при синдроме Ретта развития и становления связей нейронов коры со специфичными афферентными системами (калозальные связи, связи с подкорковыми структурами) в раннем постнатальном онтогенезе (развитие мозга останавливается на определенном этапе) . Полученные данные являются клинически значимыми при их использовании для профилактики данного вида заболевания у новорожденных детей от здоровых людей "группы риска", а также при выработке стратегии для поиска и разработки новых специфических фармацевтических препаратов при лечении данных больных.

1.4.'Практическая цоппость полученных результатов

1. Разработанная новая стратегия для трехмерного нейронного картированию мозга человека является чрезвычайно важной для быстрого получения морфологических данных по нейронному строению различных областей мозга человека в норме и их изменении при любых неврологических и психических заболеваниях.

2. Полученные данные об особенностях трехмерной нейронной организации коры мозга человека в норме и при изученных заболеваниях являются приоритетными и открывают новые перспективы в изучении нормы и патологии. Эти данные ийгальзованы для прогноза течения заболевания у конкретных больных и могут быть использованы в диагностических целях при бнопсийном исследовании мозга, для лечения и выработки новых фармацевтических препаратов при эпилепсии и синдроме Ретта.

3. Составленная база данных трехмерных конфокальных изображений геометрии иейронов в норме и наличие патологически измененных нейронов в эпилептогенном очаге при лекарственно-резистентной эпилепсии входит в базу данных международного проекта "Нейронное картирование мозга человека в норме и патологии". Эти данные также используются для клинической диагностики и прогнозе течения заболевания при ЛРЭ и СР, а также для постоперационного прогноза при нейрохирургическом лечении ПРЭ.

4. Видеофильм "Использование КЛСМ для трехмерной реконструкции

и анализа геометрии нейронов мозга человека в норме и при эпилепсии' и полное описание разработанных методик для нейронного картирован!» мозга человека в норме и патологии, изданное в виде кампактногс магнитного диска, используется на лекционных курсах преподаванш нейроморфологии для обучения студентов медицинских институтов.

5. Результаты работы могут быть использованы научными I клиническими учреждениями РАМН (НИИ нейрохирургии, НИИ юэрологни, НИИ психиатрии), Институтом ВНД и нейрофизиологии РАН, и другим! научными учреждениями РФ, проводящими исследование различных структу! мозга человека в норме и патологии.

1.5. Основные положения, вынесенные ка защиту

1. Нейронное картирование мозга человека включает новую стратеги« изучения трехмерной геометрии■нейронов и волокон, заключающуюся !< использовании комплекса методов системного выявления нервных элементов: метод внутриклеточного введения флуоресцентного красителя люциферовогс желтого, метод внутриаксонального транспорта флуоресцентных карбоцианиновых красителей, комбинацию этих методов с иммунофлуоресцентным методом выявления биологически активных вещестг с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2. Создана база данных трехмерных конфокальных нзображеннг нейронов коры мозга человека в норме и их изменение при лекарственио-резистентнои эпилепсии н синдроме Ретта.

3. Описаны морфологические особенности нейронного строения различных полей мозга человека в норме (поля 10, 21, 17, 7) гетерогенность пирамидных нейронов в пределах огного слоя, морфометрические параметры геометрии нейронов зрительной и парнеталыюГ коры. Выявлены количественные соотношения между нормальными пирамидами, биапикальными, "дннозавр-подобнымп" и фузиформнымн.

4. Изменения трехмерной геометрии нейронов в эпилептогеннок очаге у пациентов с лекарственно-резистентной эпилепсией указывают на пренатальное нарушение миграции нейронов, вызывающее в дальнейшее постнатальном развитии изменения электрической активности I формирование эпнлептогенного очага с эпилептическими припадками, т способными купироваться современными антиэпилептнческнми препаратами,

5. Выявленные изменения трехмерной морфологии нейронов у больны) с синдромом Ретта указывают на преимущественное постнаталыкм нарушение нормального развития коры мозга (его дальнейшее развитш остан< ¡т.юется на определенной стадии постнатального онтогенеза), вызывающее невозможность развития, недостаток или утрату приобретении: функций мозга.

1.6. Публикация

По результатам исследования опубликовано 42 научные работы, и: них Ч в центральных отечественных куриалах, 11 в международны:

риалах, 2 в главах международных книг.

7. Апробация работы

Основные положения диссертации были неоднократно доложены и суждены на отечественных и международных симпозиумах и конгрессах, гом числе! на II и III Всемирных конгрессах ИБРО (Будапешт, Венгрия, 07; Монреаль, Канада, 1991), на I Европейском конгрессе по врологин (Прага, Чехословакия, 1988), на Международном симпозиуме ейрональные сети" (Прага, Чехословакия, 1990), на Международном нгрессе по патофизиологии (Москва, Россия, 1991), на Международном мпознуме "Энторинально-гиппокампальные взаимоотношения" (Франкфурт-Майне, Германия, 1992), на 1-м, 2-м и 3-м Российско-шведских мпозиумах "Современные исследования в нейробиологин" (Гетеборг, сция, 1990; Москва, Россия, 1992; Гетеборг, Швеция, 1994), на огодном симпозиуме американской ассоциации нейронаук "Картирование зга человека" (Бостон, США, 1993), на II и III Ежегодном симпозиумах ойродегенеративные заболевания" (Охо Риос, Ямайка, 1993, 1994), 20 Международном конгрессе по эпилепсии (Осло, Норвегия, 1993),

16 Ежегодном европейском конгрессе по нейронаукам (Мадрид, паиия, 1994 ), на 23 Ежегодном американском конгрессе по нейронаукам лшннгтон, США, 1994), на Международной конференции "Конфокальная кроскопия" (Мюнхен, Германия, 1994), на Международной конференции эпилепсии (Упсала, Швеция, 1994), на конференции Скандинавского •1ноло1нческого общества (Гетеборг, Швеция, 1994) , на I Международном нгрессе по клинической нейрофармакологнн (Фрайбург, Германия, 94), неоднократно на конференциях и симпозиумах, проводимых в НИИ зга РАМН.

Э. Благодарности

Автор выражает благодарность ."отрудннкам НИИ мозга РАМН за эгочисленную творческую помощь при проведении данного исследования, эбую благодарность автор выражает сотрудникам лаборатории нейронной эуктуры мозга НИИ мозга РАМН профессору Т.А. Леонтовнч, с.н.с. Ю.К. <нной, М.А. Маханову, A.A. Федорову за творческое обсуждение зультатов работы. Автор также искренне благодарит лаборантов моратории нейронной структуры мозга НИИ мозга РАМН О.Б. Сизову, ■I. Беличенко, H.A. Михальченко и C.B. Стекольникову за техническую «ощь в получении, обработке и окраске гистологических препаратов jra человека.

Автор также искренне благодарит директора Института мозга 1нкфурта-на-майне (Германия), профессора. В. Зингера и директора :титута нейробиологин г. Гетеборгг, профессора А. Дал^стрем за ¡доставленное обосудоза le для вылолнення час а р&бо'.'Ы.

1.9. Список сокращений, используемых в диссертации

КЛСМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; ЛЖ люциферовый желтый; ЛРЭ - лекарственно-резистёнтная эпилепсия; НК1

- нейронное картирование мозга человека; СР - синдром Ретта; ФБ фосфатный буфер.

( ) - порядковый номер цитированной статьи в списке печатных раб< по теме диссертации.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена на б случаях (контроль) мозга человека б< неврологических заболеваний (возраст 43-73 года), 15 случа> биопсийного материала (возраст 1,5-47 лет) больных с диагнозом Л1 и 3 случаях аутопсийного материала (возраст 18-24 года) с диагноз! СР (табл. 1). Пять случаев мозга человека использовано для комбинац методов внутриклеточного введения ЛЖ и внутриаксонального транспорт Dil с иммунофлуоресцентным методом выявления биопогически активы: веществ (синапсин I, синаптофизин, МАО А, МАО В, в-адреносепторн протеин, парвапьбуыин, кальбиндин, кальретинин),

Краткая характеристика материалов и методов исследован представлена в таблицах 1 и 2. Полная клиническая и неврологическ характеристика используемого материала описана ране!е в работах ( 8, 11-13, 17, 34-40). В хонтроле исследовалось поле 10 фронтальн коры (2 случая), поле 21 височной коры, поле 17 зрительной коры случая), поле 7 париетальной коры; при эпилепсии - поле 10 (3 случая поле 17 (1 случай), поле 7 (1 случай), поле 21 (10 случаев); п синдроме Ретта - поля 10 (3 случая), 21 (3 случая), 4 (3 случая Использовался атлас цитоархитектонических полей мозга человек разработанный в Институте мозга РАМН. Мозг резался на серийные сре при помощи вибратома Vibratome Sériés 1000, Balzers Uni (Liechtenstein). В каждом кусочке мозга 100-200 нейронов би окрашено внутриклеточным введением ЛЖ на микроскопе Zeiss Р (Germaпу). Регистрация изображения нейронов проводилась на КГ BioRad MRC-600, смонтированном на флуоресцентном микроскопе Nik FXA с использованием аргон-криптонового лазера. Трехмерное нзображе> нейронов и волокон получалось на компьютерных рабочих станц! Silicone Graphics IRIS и Indigo с использованием програмн: обеспечения VoxelView Vital Images Inc., сохранялось на лазер! оптических дисках фирмы Panasonic. Всего введено и исследов.' неГфонов в норме - 1100, при эпилепсии - 2300, при синдроме Ре:

- 1000. Описание нейронов не будет проводится по отдельным слс (геометрия дендритов нейронов 11,111 и V,VI,VII слоев коры), тьк > на гистологических препаратах, окрашенных методом ЛЖ, тру; различить границу мбжду этими слоями, к тому же дендриты нейрш нижележащих слоев довольно часто поднимаются в вышележащие сл< Параметры геометрии неГфонов вычисляли на их точных зарисовках

'яблица 1. Краткая характеристика использованного аутопсийного и шопснйного материала мозга человека

I случая, Возраст Пол Изученная Клинич. особенности (прич смерти.

1ациент (лет) область нач. заболевания, число приступов) Цорка

1. 43 Ж п 17 Прич. смерти» аневризма аорты

2. 59 Ж п 7 Прич. смерти: сахарный диабет

3. 73 М л 17 Прич. смерти: инфаркт миокарда

4. 65 Ж л 10 Прич. смерти: пневмония

5. 61 Ж л 21 Прич. смерти: карцинома пищевода

6. 65 Н п 10 Прич. смерти: аневризма аорты

Патология

Пэзарствеппо-розастептаая эяппэпспя

1. Е.Н. 18 И л 21 10 лет нач. забол, 10 прист/мес

2. и.м. 28 Н п 21 22 года нач . забол , 4-5 прист/мес

3. С.М. 25 3 л 18 7 лет нач. забол, 3-10 прист/день

4. Н.В. 47 М п 21 19 лет нач. забол, 12-20 прист/мес

5. а.в. 25 И п 21 15 лет нач. забои, 10-20 прист/мес

6. М.Е. 5 я л 7 13 мес нач. забол, 30 прист/мес

7. Т.Б. 1.5 я л 21 3 мес нач. забол, инф. спазм

0. А.К. 4 я л 21 2 мес нач. забол, 3-5 прист/день

9. б.У. 5 н п 21 1 нед нач. забол, 5-6 прист/день

10 . Т.Т. 4 г л 10 2 мес нач. забол, инф. спазм

11 . А.Р. 23 я п 21 14 мес нач. забол, 10-15 прист/день

12 . 7 5 м л 10 ?

13 . 7 5 я п 10 7

14 . ? 19 м п 21 ?

15 . 7 20 я п 21 ?

Я 'Л 10,21,4 13 лес нач. забол, умет отст,потеря речи, апраксня, эпилепсия, сколиоз 8 л 10,21,4 9 «ее нач. забол, умет отст, недор речи, диспраксия, эпилепсия, сколиоз Я л 10,21,4 б мес нач. забол, умет отст, недор речи, апраксия, эпилепсия, сколиоз

Ж '- женский) забои - заболевание; инф - инфантильный; л - левая; К

- мужской} мес - иесяц(ы); нач - начало; под - неделя; -¡одор -недоразвитие; отст - отсталость} п - правая; прис - прчетук; при1,

- причина) унст - умственная; 7 - данные отсутствует.

Сяадром Ратта

1. 3-13 . 24

2. 3-89 16

3. 8-7 20

Т.Д. Пеонтович (1978), проводили анализ ориентации дендритов построение полярограмм нейронов по собственной методике (1) проводили многомерный анализ параметров по специально разработанчо А.А Федоровым н H.A. Махановым программе с вычислением достоверност различий по критерию Колмогорова-Смирнова.

Разработанная новая стратегия нейронного картирования мозг, человека включает комплекс методов системного выявления нервны: элементов при помощи комбинации методов внутриклеточного введенш лж и внутриаксональнсго транспорта Dil с иммунофлуоресцентни) методом выявления биологически активных веществ и представлена i табл. 2.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В ПХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка новых доходов посладохшивя веброввой в волокнисто! структур мозга человека

Анализ строения нейронов с использованием метода оценки трехмерно( геометрии дендритов необходим для развития исследований мозг; человека. Недостатки классических методов (прежде всего, метод; Гольджн и его модификаций) состоят в крайней степьнн нестабильност! окраски, случайности импрегнации нейронов или в отсутствии полнот! выявляемой картины (как правило, импрегнация аксонов крайне низка).

Для мозга человека в настоящее время существует несколькс методических возможностей изучения нейронной организации» мето< внутриклеточного введения люциферового желтого (3-8) и метод с использованием карбоцианиновых красителей (4-5). Эти метод-j обьединжп возможность в каждом случае проводить контролируемую окраску определенных систем нервных элементов. Совокупность имеющихся i настоящее время методических подходов для картирования нейронов i волокон мозга человека представлена на таблице 2.

3.1.1. Метод внутриклеточного введения люциферового желтого (кото; ЛИ)

Разработан метод внутриклеточного введения ЛЖ на аутопенйном i биопсийном материале мозга человека, позволяющий окрашивать Больше» количество нейронов ( 100-300) даже на небольшом участке мозга. Нею) ПЖ хорошо выявляет весь нейрон! дендриты с випиками и варнкозностяш и аксоны с коллатералями. Контролируемая микроэлектродная окраска отдельных нейронов ЛЖ под микроскопом позволяет получать гистологически' препараты срезов мозга человека с нейронами без дендритных переплетений, что значительно облегчает трехмерный анализ и автоматическу» регистрацию их изображения.

отооксвдацвя•

аблица 2. Методические подходы к трехмерному картированию нейронов волокон мозга человека

t

Электронная микроскопия

•тод па

t L

Одвокавальвая КЛСМ

,Ннмунофлуорводаацвя (Тахассквб красный)

I

2-х канальная ГО1С31

утопсхйшй, вопснйныА материал оэга человека

Трехмерная реконструкция, морфометрвя

' Ваза данных

2-х канальная клен

t

Вммукофлуоресцевдад ' (•луоресцевв)

•тод карбоцгандвоьых раежтелей > Од=оканальная КЛСМ

Э1Х, Faat Dil, DiA)

\ .

»тоохсхдацхя >■ Элактроавая мжкроскоажя

ICM - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия ; ЛЯ - люциферовый >лтый

Подробности охраски методом ЛК неоднократно списаны автором (11, !, 17, 18, 35, Эб, 39, 41, 42). Вкратце, основные этапы данного метода

заключаются в следующем«

Секционный материал мозга человека брали через 12-72 часа поел смерти, биопсийный - через 5-20 минут после операции. Кусочки мозг размером 2x1x1 см фиксировали погружением в холодный раствор (4 оС 4% параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере (ФБ), рН 7,4. Чере 1 час удаляли сосудистую оболочку и помещали в свежий фиксируют! раствор на 2-4 часа. Наилучшие результаты получены на слабофиксированно материале при общей продолжительности фиксации мозга не более часов. Серийные срезы толщиной 150-1000 укм получали на вибратом при медленной скорости движения лезвия внбратома и низкой частот вибрации. Срезы мозга хранили в течении 2-3 недель в ФБ пр температуре 4 оС до проведения метода ЛЖ.

Для внутриклеточного введения ЛЖ использовали люнинесцектни микроскоп, трехкоординатный микроманипулятор для точного введен» микроэлектрода в клетку, ионофорезную установку для подачи постоянпог тока силой 1-15 нА. Вибратомный срез мозга помещали в пластмассову камеру, прижимали ко дну камеры фиг.ьтровальний бумагой с отверстием немного меньшим, чем сам срез, залипали сверху ФП. Стеклянны микроэлектрод с 6% водным раствором ЛЖ вводили под внзуалыш контролем микроскопа, используя эпифлюоресценцию, в тело клетки находящееся э 20-50 мкм от поверхность среза. Клетхи под микроскопе были видны благодаря наличию а них гранул липофусцина или благодар предварителтному окрашиванию их тел водным раствором акрндиновог оранжевого. ЛЖ вводили внутрикпеточно отрицательным постоянным токе силой 2-5 нА в течение 5-10 минут.

Надежным хонтролем полноты окраски служило окрашивание конечнь ветвей тонких дендритов и тонких коллатералей аксона. В каждом ере: окрашивали, как правило 40-60 нейронов; использовали 3-6 срезов д) каждого случая. Далее срезы монтировали па предметное стекло заливали в 90% глицерин на 4>Б. Часть соседних срезов окрашивали I методу Ннссля для более точного определения цитоархнтектоши изучаемого участка.

Для анализа гистологических препаратов под пюминесцентш микроскопом производили серию фотоснимков (4-6 кадров) пр» раэнс расстоянии от поверхности среза или регистрировали изображение П| помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Точж зарисовки нейронов делали путем 2-х мерной реконструкции с сер1 негативов при конечном увеличении в 400 раз или 2-х мерной проекф КЛСИ изображения при помощи специальной компьютерной программы.

Гистологические препараты аутопенйнаго и бмапенйного материи, мозга человека, окрашенные методом внутриклеточного введения Г.Ж, I отличались по качеству между собой: нейроны окрашивались дажк чер| 16 суток после взятия материала, причем ухудшения транспорта ЛЖ I дендритам и аксонам, а также выхода красителя за пределы нейрон не наблюдалось (6, 11, 35).

Нейроны охраливались полностью со всеми деталями: шипиками и терминальными ветвлениями дендритов, аксонами с коллатералями, бусинками по ходу и шипикоподобными структурами (5-7, 11). (онтролируемая окраска нейронов внутриклеточным введением ЛЖ шачительно предпочтительнее импрегнации нервной ткани по методу Гольджи ( 2-4 ). Эта методика стабильна, выявляет все отростки нейронов i позволяет на небольших кусочках мозга окрашивать достаточное количество клеток для проведения морфометрического анализа (5, 13, 19, 24 ). К тому же нейроны можно окрашивать на определенном расстоянии qpyr от друга, что исключает наличие дендритных переплетений между несколькими нейронами и способствует автоматическому анализу изображения путем КЛС11 ( 18, 36 ). За счет различного накопления гранул липофусцина в пирамидных и непирамидных нейронах возможна также окраска только одного типа клеток (19, 24). Методом ЛЖ можно также изучать ультраструктуру нервной тканн путем фотооксидацин ЛЖ в эпоктронноплотный продукт (12). Этот метод особенно информативен при изучении микроуровневой (ансамблевой) организации мозга человека.

3.1.2« Катод вяутрзаксеаальвого трап спорта карбоцпатшовых краспталай

Использование карбоцнанинооых красителей (прежде всего Dil, fast Dil, DiA) значительно расширяет возможности изучения волоконных путей мозга человека. Используя в качестве механизма транспорта этих эецеств продольную диффузию d бимолекулярном слое фосфолипидов удается надеяно окравивать афферентные волокна со всеми их терминальными пствлениями и нейроны с дендритами и оипиками, аксонами и коллатералями.

Подробности окраски мозга человека методом внутриаксонального транспорта к&рбоцианнновых красителей неоднократно описаны автором в литературе (8, 12, 36, 39, 40). вкратце, основные этапы данного истода заключаются в следуюцем!

Секционный материал мозга человека брали через 12-72 часа после смерти, бнопсийный - через 5-20 минут после операции. Кусочки мозга размером 3x2x1 см фиксировала погруаением в холодный раствор (4 оС) 4% па реформа льдегида на 0,1 M фосфатном буфере (ФБ), pH 7,4. Через 1 час удаляли сосудистую оболочку u помещали в свежий фиксирующий раствор на 2-4 часа. Следуюцие карбоцианиновые красители фирмы Molecular Probes, Inc. использовали для исследования! Dil (1,1'-iioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanine Perchlorate), fast Dil (l,l-dilinoleyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbccyanine Perchlorate) и DiA (4-(4-dihexadecylaminoatyryl)-N-methylpyridinium Iodide). Небольшой кристалл гтих красителей вводили в белое вещество, в I или III слои коры мозга человека. Кусочки мозга помещали в свежий фиксирующий раствор, оставляли при комнатной температуре в защипанном эт света месте на 2-12 месяцев. Кажцые 2-3 месяца меняли фиксирующий раствор. Серийные срезы толциной 75-150 чкм получали на вибратом«., понтировали Ht» предметное стекло и запивали в 9и% глицо^чн на

Часть соседних срезов окрашивали по методу Ниссля для более точногс определения цнтоархитектоники изучаемого участка.

Анализ гистологических препаратов показал хорошую окраску клето! и афферентных волокон в радиусе 2 см от места введения кристалл; красителя (8). Афферентные волокна разного диаметра вместе с коллатералями и бусинками походу окрашивались благодаря антероградном] транспорту красителя, нейроны с их дендритами и аксонами окраоивалнс) благодаря ретроградному транспорту.

Использование этой методики дает широкие возможности ь изученш конструкции мозга человека в норме и патологии (8, 12, 39, 40). I настоящее время эта методика является, единственной для изученш связей в мозге человека (8, 39). КЛСМ позволяет получать i анализировать трехмерное изображение нейронов и волокон (39). Путе). фотооксидации карбоцианиновых красителей возможно изучение такж( ультраструктуры нервной ткани (12).

3.1.3. Метод одновремодпого вштлввпя uefipocoo п бпологичосы активных веществ (метод шшупофлуоресценцпи)

Разработана комбинация метода ЛЖ и внутриаксонального транспорт; карбоцианиновых красителей с иммунофлуоресцентным методом, позвопяюща> на одном и том же срезе мозга человека изучать трехмерное распределение биологически активных веществ и трехмерную геометрии нейронов и волокон. Подробности применения данных методик неоднократш описывались автором (35, 36, 39, 41, 42). Вкратце, основные этап! данного метода заключаются в следующем!

После окрашивания нескольких нейронов (10-20) методом ПЖ imi окрашивания волокон и нейронов карбоцианиновым красителем Dil, срез! преиикубпровали в 5% растворе нежирного молока на ФБ в течении 3< минут. Для непрямой иммуноинкубации использовали следующие антитела которые предварительно показали хорошие результаты окрашивания мозг; человека: мышиные анти-моноаминооксндаза А (МАО А) моноклональны! антитела; мышиные анти-МАО Б моноклональные антитела; кроличьи антн в-адреносепторного протеина поликлональные антитела; антитела протш синаптнческих везикулярных белковi кроличьи анти-синапсин I и антн синаптофизин (р38) моноклональные антитела; антитела против кальций связывающих белков: кроличьи анти-парвальбумин, антн-кальбиндин i антн-капъретинин моноклональные антитела. Срезы инкубировали i первичными антителами в оптимальной концентрации в течении 12-1 часов при 4 ос, промывали 3 раза в ФБ и инкубировали в течении 1 час при комнатное, температуре с биотинипированными козьими антн кроличьими антителами (для в-адреносепторного протеина, сннапсин I, р38, капьций-связывающих белков) или биотинипированными кроличьим анти-мышиньши антителами (для МАО А и МАО В). После.повторной промывк срезов (3 раза, ФБ), срезы инкубировали со стрептавнпином, связанны с Техасским красным (для метода ЛЖ) или с флюоресцеичом (для метод

il) в течении 1 часа при комнатной температуре. После окончательной ромывки (3 раза, ФБ), срезы монтировали на предметное стекло и аливалии в 90» глицерин на ФБ. Детергент отсутствовал во всех астворах, так как в предварительных экспериментах было показано, то при его добавлении нарушается целостность мембран и происходит нффузия ЛЯ из клеток и Dil из волокон и клеток. В качестве контроля а иеспецифичность связывания антител часть срезов инкубировали с ормальной кроличьей или мнаиной сывороткой вместо инкубации с срвичными антителами. В контрольных срезах иммунофлуоресценция не тблюдалась.

Комбинация метода иммунофлуоресценцин с методом ПЖ и методом :арбоциашшовых красителей легко позволяет изучать одновременное )пспределение биологически активных веществ (медиаторов, ферментов I др.) с геометрией дендритов (35, 39). Эта методиха будет также |розвычайно информативна при выработке и тестировании новых юзгоспецифичиых нонохлснальпых антител п выяснения мест их связывания напр. нейрон или глия), так как в комбинации с методом ПЖ позволяет шстро идентифицировать клетки. В качестве использования данной гетодики для изучения патологии мозга при лекарственно-резистентной >пнлепсии проведено предварительное исследование распределения |ендритных инпиков и синаптических везикулярных протеинов (сннапсина : и р38) в эпилептогенном очаге. Выявлено взаимное региональное 1счезновенне пипнков и синаптических протеинов, говорящее об 1тсутстпии контактов афферентных волокон с определенными участками ;еидритов.

1.1.4. Патод трашюрпоЗ конфокальной лазерной скапнрувцей микроскопии мотод IUI СП) пзучаппя ссйроппоЯ п волокнистой организации мозга

Супественым продвижением в изучении конструкции мозга человека ia клеточном уровне послужила разработка новой стратегии для •рехмерной регистрации и анализа изображения нейронов и волокон при юмоци КПСИ. Принцип работы данного микроскопа полностью отражается I его названии. За рчет использования очень маленькой апертурной |иафрагмы при получении изображения, удается видеть на экране только ■о изображение, которое находится в данный момент в фокусе (отсюда (азваине прибора - "конфокальный" ), избегая всех деталей за пределами юкуса изучаемого толстого среза биологического объекта. Для 1свецения обьекта через такую маленькую диафрагму необходим мощный 1сточннк света. В данном прибрре используется аргон-криптоновый 1азер (отсюда название "лазерный"). Пуч лазера пробегает по [зображению (отсюда термин "сканирует") и изображение записывается оцифровывается) на компьютер при конкретном фокусном расстоянии, атем автоматически изменяется расстояние на предметном столике я :зображение опять зэписыврэтся на компьютер. Основные достоинства ¡анного прибора - возможность прозоцить "оптическую" резку толстых

гистологичеких препаратов вместо физической, получать очеш качественное изображение объекта, которое записывается на магнитно» диске. Данный микроскоп позволяет также осуществлять трехмерну* реконструкцию биологических объектов (в нашем случае нейронов i волокон ).

В данной работе разработаны и освоены методические npueui регистрации изображения нейронов при помощи КЛСМ, позволяющие сохранять изображение на лазерных оптических дисках в виде отдельны» файлов, проводить двух и трехмерную реконструкцию нейронов и волокон. Одноканальная регистрация изображения при помощи КЛГМ проводилась для срезов, окрашенных методами ЛЖ и Dil, двухканальная - для срезог одновременно окрашенных методамин ЛЖ, Dil ti иммунофлуоресценциеи (см. табл. 2). Результаты применения КЛСМ для данных методик неоднократно описывались автором (17, 18, 20-23, 26-28, 30-32, 3447.). Вкратце, основные этапы данного метода заключаются в следующем!

Гистологические срезы, окрашенные одним или двумя флуорохромамн, изучались и сканировались при помощи КЛСМ BioRad MRC-600, смонтированное на флусресцентном микроскопе Nikon FXA. Использовали аргон/криптоновыГ смешанный газовый лазер с возбуждающей длиной волны для ЛЖ г флуоресцеина (488 а) и Техасского красного или Dil (56в а). Оптимальные условия для получения КЛСМ-изображения нейронов быт найдены следующие» 2Ох объектив (Nikon, Fluor п.а. 1.30), оптические срезы получали через интервал в 0.5-2.0 ыкн, увеличение в 2-4 раза, нейтральный фильтр - :1, быстрая скорость сканирования. КаждыГ оптический срез был результатом усреднения 10 сканов при помоц! фильтрации изображения по алгоритму Кальмана с усреднительны» фактором 3, размер изображения - 1/4 часть экрана. Число оптически) срезов варьировало от 25 до 100. Двухмерную реконструкцию нейроно1 проводили с использованием линейной максимальной Z-лроекцш компьютерной программы с серийных оптических срезов. Трехмернук реконструкцию нейронов и их вращение осуществляли с использование» Silicon Graphics IRIS или INDIGO рабочей компьютерной станцпн npi помощи специальной программы Voxel View - GT, разработанной в Vita] Images, Fairfield, Inc.

Гистологические препараты, окрашенные одним флюорокромом, сканировались в режиме одноканапьной КЛСМ (19, 39). Для гистологически) препаратов, окрашенных двуия флюорохромами, проводилось сканирование через весь препарат одного флюорохрома, затеи предметный столш возвращался в начальное положение И такое же число оптически: сканирований проводилось для другого флюорохрома. Нзображениа попучечноо через два канала сканирования, совмещалось при поыош специальной компьютерной программы (35, 39).

Оптические срезы единичных нейронов записывались на лазерньы оптический диск (Panasonic) в веде отдельных файлов, составлялаа база данных для каждого случая исследуемого поля коры мозга человека

[олучаемое изображение имело очень хорошее оптическое разрешение как in уровне целой клетки, так и на уровне ее деталей (дендритных шпиков, коллатералей и варикозностей аксона) (41) . Можно было судить I морфологии единичных дендритных оипиков, причем не только со :тороны наблюдателя, но и за счет их трехмерного изображения и «ращения - с противоположной стороны (39, 41).

.2. Иссладоваппо трехмарпой геометрии нейронов и ах пространственной эргаппзацпв в коре мозга человека в порма

Данные по нормальной структуре нейронов коры мозга человека юлучены при изучении аутопсийного материала неврологически здоровых пюдей (см. табл. 1) и неоднократно описаны (5, 9, 11, 13, 24, 37). 3 отдельных случаях в качестве контроля использовался биопсийный материалI участки коры мозга больных ЛРЭ, смежные с корковым эпилептогенным фокусом (37).

В результате проделанной работы изучена трехмерная геометрия юйронов коры мозга человека (поля 10, 21, 17, 7) в норме и составлена эаза данных пирамидных и непирамидных нейронов этих попей.

1. На навих гистологических препаратах I слой коры мозга человека а норме был беден клеточными элементами. При окраске методом ПЖ клеток этого слоя, содержащих липофусцин пли предварительно окрашенных акридиновым оранжевым, было найдено, что большая их часть являлась глиальными клетками; очень редко окрашивались непирамидные и [щрамидоподобные нейроны. Такая же картина наблюдалась при исследовании подкоркового белого вещества. На гистологических препаратах, окрашенных по методу Ниссля, также четко прослеживалась граница между белым и ?ерым веществом коры мозга.

2. При исследовании II-III слоев коры изучена трехмерная эрганизация и пространственное расположение главного типа нейронов коры мозга человека - пирамидных нейронов. Описана также их особая разновидность - биапикальные.

Во II-III слоях коры большинство пирамидных нейронов имело "классическую" морфологию - с одним апикальным дендритом, симметричным распределением базал'ьных и косых апикальных дендритов. Часто нейроны верхней части II слоя были крупнее нейронов нижней части III слоя. Биапикальные нейроны имели два идентичных апикальных дендрита, которые отходили непосредственно от тела клетки или от главного ствола апикального дендрита на небольшом расстоянии ( 50 мкм от тела), или в сторону I слоя. Соотношение обычных пирамидных клеток с биапикальными составляет в этих слоях 10:1 и, по всей видимости, является постоянным для разных полей неокортекса.

Анализ ориентации дендритов показал, что они имеют более цертикальную направленность в зрительной коре, в то время как в париетальной коре они ориентированы горизонтально, в основном за счет

Рис. X. Суммарная полярограмма нейронов зрительной (сплошная линия) и париетальной (прерывистая линия) коры мозга человеха в норме.

базальных дендрнтов (рис.1).

Применение Q-факторного анализа показало наличие в III слое зрительной коры 17 поля двух подтипов пирамидных нейронов (а- и б-клетки) (рис. 2, 3), которые располагались в виде колонок с периодичностью 300-400 мкм. Базальные а косые дендриты нейроноз внутри колонки (а-клетки) имели более вертикальную ориентацию. Чем дендриты нейронов, лежацнх между колонхами (б-клеткн). Они также достоверно различались по параметрам S da, Sd ар, Sd bas, Ld, Ld bas, Nd, Nd ар (рис. 4 A).

Нейроны III слоя 7 поля теменной коры можно разделить на 2 подслоя, составленых двумя разными видами клеток (а и б) (рис. 2,

. Согласно морфометрической оценке геометрии дендритов, эти клетки элнчались по параметрам! Sda, Ld, Ld bas, Bd, Ас, Nd, Nd bas (рис. Bi-

-И 1 ч ч — - ••Г ** - N

'т 1 ъ т Ч ч ч - --- лл ч ч ■e«i / ✓ •1

' - 1-Ч ? • 'И 1 ■И

■ ч '

-М, '.к * w .г,А* 1

✓ • 1 1 •• -К И' V Ч ч .1» ^ **» / ✓ X / -1

ne. 2. Пирамидные нейроны зрительной (слева) и париетальной (справа) оры, представленные в факторных координатах. Пунктирной линией тмечены различные группы пирамидных нейронов (а- и б-клетки), рабской цифрой отмечен индивидуальный номер пирамидного нейрона.

3. Другие разновидности пирамидных нейронов - "динозавр-одобные" и фузнформкые - характерны для нейронов нижележащих слоев никогда не встречалась в слоях II-III. "Динозавр-подобные" ираиндныа нейроны имеют пошшо обычного одного апикального дендрита, цо один апцкальио-подобиый деидрит,- который отходит от базальной асти тела клетка и направляется в нижележащие слои (37). Эти два еидрита имеет одинаковую иорфодогию, угол между ними варьирует от О до 150 градусов. Как правило, обьемистое тело клетки, косо асполояенное между этими двуия дендритами, было свободно от азпльных дендритов, которые отходили с противоположной стороны ела. Для краткости описания, а также в нахождении аналогии и схожести энный тип нейронов о дальнейшем будет называться "динозавр-одобные" нейроны. Третья разновидность пирамидных, нейронов - это узиформные биполярные нейроны. Эти нейроны имеют один аьикальный ендрит п один апикально-педобный дендрит, который отходит от ротивоположной базальной части тепа клетки л направляется в ижележащие слои. По сравнению с "динозавр-подобными" нейронами, эти ейроны имеют более узкое и вытянутое тело клетка (по размеру в 2 аза мельче) н многочисленные тонкие баэальные дендриты, отходяпиа

Рис 3. Точные зарисовки нейронов, окрашенных люциферовым желтым, II. слоя зрительной (верх) и париетальной (низ) коры мозга человека Слева представлена »-клетка, справе - в-клетка. Шкала - 400 мкм.

.П.

i-Lj я

Г*1

n

h

(1

гее

в

rtr

л

tJ-

sa< Sd«r SJtxs U Uap Ulm W nd Лс tu №)ар Мкм

л

в

ri

ri

4ВИ

2M

h ■

Г*1

U U<p U<wn

Mi Hbf.

>nc. 4. Морфометрические параметры геометрии дендритов пирамидных leflpoHoa III слоя зрительной (А) (попе 17) и париетальной (В) (поле Г) коры мозга человека.

i-клеткн (светлые столбики) я б-клеткв (зантрихованные столбики) шрамндных нейронов. * - достоверное отличие параметров. >da - общая площадь дендритного поля (х 1000 мхм2), Sdap - площадь юля апикальных дендритов, Sdbaa - площадь поля базалышх пчнлрнтов.

2ЧЖ

м

ы

Ы - общая длина дендритов (мкм), Ыар - длина апикальных дендритов, 1,сЗЬав -длина базальных дендритов, В<3 - число свободных концов дендритов, Ас1 - разветвленность дендритов, Ас - общая разветвленность клетки, N(1 - относительная плотность дендритов (мкм/0,001 мкмЗ) , Шар - относительная плотность апикальных дендритов, ЫдЬав - относительная плотность базальных дендритов.

горизонтально в обе стороны от тела клетки. "Динозавр-подобные" и фузнформные виды пирамидных нейронов найдены нами только в V—VII слоях, причем они более многочисленны в нижележащих слоях. Эти нейроны не составляли группы, а были рассеяны равномерно среди обычных пирамидных нейронов. В этих слоях соотношение обычных пирамидных клеток с "динозавр-подобными" и фузнформными составляло 1218>1.

4. Распределение шипиков было равномерным по длине апикальных, косых апикальных и базальных дендритов пирамид. Как правило, на начальных сегментах этих дендритов (50-75 мкм) оипики отсутствовали или были очень редки, на средних сегментах дендритов плотность □ипиков непрерывно росла, а на терминальных ветвях снова уменьшалась.

5. Распределение волокон при введении карбоцианинового красителя сШ в белое вещество носило характерный вертикальный паттерн, наиболее выраженный для 17 поля зрительной коры. Косо идущих волокон было мало, диаметр их был постоянен.

3.3. Исследование трехмерной нейронной организации оинлептогениого очага у пациентов а локарственно-резистептиой эпилепсией (ЛРЭ)

Исследование больных ЛРЭ имеет большое клиническое и социальное значение. Как уже говорилось ранее, изучение и выработка диагностических морфологических критериев нарушения корковой нейронной организации в эпилептогенном очаге у пациентов с диагнозом ЛРЭ, позволит проводить раннюю морфологическую диагностику данного заболевания при изучении биопсий мозга.

Изучены участки неокортекса, полученные после нейрохирургического лечения пациентов с ЛРЭ. Пациенты были оперированы в нейрохирургическом отделении Гетеборгского университета (Овеция). Основными критериями

5. Нейронное картирование мозга людей с диагнозом ЛРЭ. А1 Реконструкция нейронов левой височной коры (поле 21) у пациента 1. Стрелками отмечены участки нарушения пространственной организации \-'-УН слоев коры, содержащие только "дннозаЕр-подобные" нейроны. В! Реконструкция нейронов пьвой височной коры (поле 21) у пациента 7, Многочисленные непграмидные нейроны в I слое и пирамидные, "днноз .вр-подобные" и фузафорчные клетки в белом веществе (ИМ) .

выбора данной группы больных было отсутствие грубых структуры! аномалий мозга на компьютерной томографии и магнитном резонансна изображении. Как правило, они имели сильные припадки, не поддающнес лечению современными антиэпилептическими препаратами на протяжен! многих лет, хотя некоторые из таких больных употребляли до препаратов в течении 12 лет (таб. 1). Точное определение эпилептогениог очага проводилось путем электрокортикографии во время операции поверхности мозга.

Изучена трехмерная геометрия нейронов и их пространственна организация в эпилептогенном очаге коры мозга людей при ЛРЭ методе ЛЖ и конфокальной микроскопией. Основные результаты работы неоднократ) опубликованы автором ранее (17, 20, 21, 28-30, 33, 34, 37, 38). Быг обнаружено различие нейронной организации зпилептогекного очага смежных с ним участков мозга! часть пирамидных нейронов бы; представлена клетками с атипичной дендритной геометрией, ч". наблюдалось во всех слоях коры, в то

время как смежные области коры были представлены пирамидными клетка» с "нормальной" морфологией (рис. 5 А). У разных больных обласч нарушения геометрии дендритов была различна (Рис. 5). В основном ог затрагивала I слой и нижние слои вместе с белым веществом (рис. В), у другой части пациентов наибольшая патология дендритов бы; найдена во II-III слоях. Не было обнаружено уменьшения обще] количества клеток во всех слоях. Составлена база данных атипичш нейронов, характерных для эпилептогенного очага при этом заболеваш (рис. 8). В эпилептогенном очаге выявлено«

1. Значительное увеличение числа нейронов в I слое, осносш часть которых была представлена непирамидными нейронами (рис. 5 В Выделено 4-е типа непирамидных нейронов в I слое, которые отсутству! в норме» а) мелкие (диаметр тела менее 20 мхм) вертикальные биполярш нейроны с многочисленными варикозностямн и несколькими шнпвкамн i дендритах. Эти клетки имели кисточко-подобные пучхи коротю дендритов, направляющиеся к поверхности мозга и несколько длиши

Рис. 6. Микрофотография атипичных пираипдных нейронов, окраеенп: люциферовым желтым, в различных слоях эпилептогенного очага в височной (A-D, F-H), теменной (Е) и зрительной (I) коры у различи

пациентов с диагнозом ЛРЭ. -$

A-.-i пирамидные нейроны III слоя с двумя апикальными дендрита! (отмечены стрелхами) и тремя апикальными дендрнтами (стрелки). G, пирамидные нейроны V слоя с толстым дополнительным апикальн подобным дендритом (стрелхи) ("динозавр-подобные" нейроны), фузнформный биполярный нейрон с дополнительным апнкально-подобн дендритом. Шкала - 100 мкм.

дендритов, идущих в нижележащий II слой, б) вертикальные биполярнь клетки среднего размера (20-40 мкм в диаметре). Их дендритные пуч! имели биполярную ориентацию, покрыты редкими пипиками и многочисленны» варикозностями. в) среднего размера (30-40 ыкы) вертикалью биполярные нейроны, верхняя часть дендритов направлялась сперва первому спою, а затем распространялась параллельно поверхносп мозга, нижняя же часть дендритов вироко распределялась во II слое Клетки имели многочисленные варикозности и несколько шипнков i дендритах. г) среднего размера (30-40 мкм) мультиполярные клетки варикозностями и редкими оипиками на дендритах. Они имели 4-первичных дендритов одинаковой толщины, идущих в разные стороны бс определенной ориентации. Очень редко были найдены также среднег размера шипиковые мультиполярные нейроны, однако клеток Кахапс Ретциуса не обнаружено.

2. Во II-III слоях, было ьайдено 2-4-х кратное увеличение г сравнению с нормой числа биапикальиых пирамидных нейронов иг нейронов с одним апикальным дендритом, который раздваивается на оче> коротком расстоянии от тела клетки (20-50 мкм) (рис. 6). Колончатг организация нейронов в этих слоях отсутствовала, иаблюдалас атипичная ориентации косых и/или базалышх дендритов у пиргшиднь нейронов (рис. 7). Так, довольно часто базальиые дендриты направлялис к апикальной части клетки и/или косые апикальные дендриты направлялис к базальной части клетки.

3. В слоях V-VII было найдено значительное (в 3-5 раз) увеличен! числа "динозавр-подобных" и фузиформных нейронов, без увеличен! общего количества клеток (рис. 5-7). Эти атипичные клетки досолы часто пространственно были объединены в колонки (рис. 5 А). Друге особенность нейронов в этих слоях (так же как и в слоях II-III) наличие атипичной ориентации косых и/или базалышх дендритов пирамидных нейронов (рис. 7).

4. Характерной особенностью эпилептогеиного очага било налич1 атипичных клеток в подкорковом белом веществе (рис. 5 В, 7). Больно их часть была представлена пирамидными, "динозаср-подобнишГ1 фузнформнымн нейронами, было такав найдено несколько иепирамидш нейронов. Выявлено два типа пирамидных нейронов в белом вецествс

Рис. 7. Конфокальное лазерное сканирующее изображение атипичш пирамидных клеток эпилептогеиного очага во фронтальной (А, Е, F) височной (B-D, G-I) коре различных пациентов с диагнозом ЛРЭ. А-( пирамидные нейроны с атипичной ориентацией базальных дендрите (стрелки). D-F: "динозавр-подобные" нейроны V слоя с дополнительш апикально-подобным дендритом (стрелхи). Gt фузиформный нейрон дополнительным апикально-подобным дендритом, Н, Ii пирамидш нейронг, находящиеся в белом веществе. Окала - 50 мкм.

один тип имел вертикальную ориентацию' апикальных дендритов, пло! развитые косые апикальные дендриты с многочисленными варикозностяя (рис. 7). Некоторые базальные и косые апикальные дендриты на параллельно волокнам белого вещества. Другой тип пирамидных нейрон« имел горизонтальную ориентацию апикальных, косых апикальных базальных дендритов, идущих между волохнами подкоркового бело] вещества (рис. 5 В).

Таким образом, исследование трехмерной дендритной морфологии количественных соотношений разных типов нейронов эпнлептогонно) очага в разных полях коры у больных ЛРЭ выявило определенные нарушен) структуры и соотношения пирамидных и непирамидных нейронов в эт< очаге, в каком бы поле коры он не находился. Можно выделить б аспект« нарушения дендритной геометрии и распределения нейронов в эпилептогенн; очьге по сравнению с нормой (рис. fl)i 1) увеличение количест! непирамидных нейронов в I слов) 2) увеличение количества атипичш пирамидных нейронов с двумя (реже с тремя) апикальными дендрита: во II-III слоях (бнапикал&ные пирамидные нейроны); 3) атипичш ориентация косых апикальных и/ или базальных дендритов пирамиды нейронов в слоях II-VII; 4) увеличение числа и изменение пространствен« микроорганнзации "динозавр-подобных" нейронов в слоях V-VII; увеличение числа фузнформных нейронов в слоях V-VII, 6) налич; атипичных пирамидных, "динозавр-подобных" и фузнформных нейронов белом вещества.

Возможную связь между выявленными нарувешиши дендритной геометр нейронов и клиникой (в данном случае возникновением эпилепси; необходимо изучать в дальнейшем. Интересен вопрос - могут выявленные наруаения дендритной геометрии и пространственно расположения нейронов в элилептогенном очаге составлять морфологическ субстрат эпилептогенной активности? На данном этапе исследован можно выделить 3 возможных фактора провоцирующих эпилепсию (рис. 9

А) Наличие эктопических нейронов в I слое совпадает с наличи атипичных нейронов о белом веществе. Поскольку нейроны в I сл представлены непирамидными клетками, можно предположить их тормози природу - в литературе есть множество данных о той, что ыапеньк непирамидные нейроны кори являются ГАМК-эргическинц. Атипичн нейроны в белом вещество представлены длинноаксонными пирамидным "динозавр-подобными" а фузиформнымы клетками и, скорее всег чгляются возбуждающими, поскольку отсутствуют сведения о наличии коре длинноаксонных тормозных нейронов. Можно предположить, ч избыточное число тормозных нейронов в I слое при НРЭ может бы обусловлено задержкой их миграции с поверхности вглубь коры на ранн стадиях пренатального онтогенеза., повлекшего в дальнейшем недостаточное число в более глубоких слоях коры, где ветвят апикальные дендриты нижележащих пирамидных длинноаксонных клетс В результате чего эти длшшоаксонные клетки получают меньше

3i

гэрмозного влияния со стороны непираыидных нейронов и становятся ипервозбужленнымн. Таким образом, ьнутрикорковый тормозно-ээбуждаюцнй баланс между нейронам» является пространственно нарушенным может способствовать развитию эпилептогенной активности (рис. 9 А).

В) В многочисленных теоретических и экспериментальных работах по эучению электроанатомии клеток было показано, что электрические DoftcTBa апикальных денлрнтов значительно отличаются от таковых аэальных дендритов (см. напр. Rail et al., 1992). Наличие большого тела бнапикальных, "динозавр-подобных" и фузиформных нейронов (т.е. :лоток с "дополнительным'* апикальным дендритом) у пациентов с ЛРЭ южет значительно изменить электротонические и интегративные свойства | этой зоне (рис. 9 В). Такие локалкные нарушения

Рис. 8. Схематическое представление морфологических особенностей нейронного строения и пространственной организации неокортекса людей а норме (слева) и в зпилептогенном очаге больных лекарственно-резистентной эпилепсией (справа) на примере строения 21 поля височной <оры.

пространственной организации хоры могут быть причиной эпилептнческо активности.

С) Как было' показано ранее, апикальные дендриты пирамидны нпйронов коры образуют своеобразные пучки по 10-15 дендрито (Scheibel et al., 1974) Scheibel and Scheibel, 1978). Это являете важной особенность» строения коры человека и, возможно, играет важну| роль в синхронизации ЭЭГ (Hetsche et al., 1975). Увеличенное числе биапикальных нейронов в слоях II-ITI у больных ЛРЭ может эначителык нарушать "электроанатомив" данной области по сравнении с нормальны) представительством дендритных пучков. Так как разные апикальные дендриты биапикапькой клетки могут находиться в разных дендритны» пучках, это может способствовать усилению синхронизации ЭЭГ, то ест1 эпилептогенной активности (рис. 9 С).

Рпс. 9. Схематическое изображение зависимости выявленных аномалий нейронной организации неокортекса в эпалептогенном очаге больных ЛРЭ с возможным нарушением нейрофизиологии данного участха (см. объяснение в тексте).

Изучение зависимости степени морфологических изменений нейронов эпилептогенном очаге с клиническими данными о начале заболевания пациентов показало наличие положительной корреляции: чем раньше >являются эпилептические припадки, тем более значительные аномалии •ндритной геометрии были обнаружены (рис. 10). Эти нарушения кронной геометрии могут быть этиологическим фактором в случаях с ||Ш!:м проявлением эпилепсии и предрасполагающий в случаях с поздним юявлением эпилепсии (29, 33, 37).

Увеличенное число атипичных клеток в эпилептогенном очаге может юретически быть обусловлено лечением антиэпилептическими препаратами.

гв

15 10 5 8

0

<э

1 д

о

-1-1-1-Г......I-1-

0 200 400 600 000 1000 1200

с. 10. График зависимости степени нарушения нейронной организации окортекса в эпнлептогенном очаге (ось X представлена в относительных нницах) от времени начала эпилептогенных припадков (ось У едставлена в годах) у разных пациентов (отдельные черные точки), ачения параметра по оси X расчитывались с использованием б рфологнчесхих критериев нарушения геометрии дендритов (см. рис. н объяснение в тексте) (29, 33) при 4 градациях значений этих итериев - "норма", слабые, средние и сильные изменения. У пациентов значительными нарушениями морфологии коры (на икале X значения льгае 100) эпилепсия проявлялась в более раннем детском возрасте качения на шкале У меньше 5 лет).

Однако не было найдено корреляции между типом пекарст продолжительностью лечения и морфологией нейронов в очаге.

Как уже говорилось ранее, на основании проведенного нсследова! все морфологические особенности строения коры у пациентов лекарственно-резистентной эпилепсией были разбиты на 6 критер* (рис. 8). Полученные критерии по трехмерной геометрии нейронов и пространственного расположения были использованы для прогноза дальнейшем течении заболевания, а также могут быть использованы j ранней диагностики ЛРЭ при биопсийном исследовании пациентов клинике.

3.4. Наследование rpoxuepaoä вейроипай организации ыозга нацией? о диагнозеи спадрсл Ferra (СР)

Нами исследованы 3 случая аутопсийного материала мозга люде] диагнозом СР (Таблица 1). Изучена трехмерная геометрия нейроне волокон и их пространственная организация в коре мозга (поля 10, ; 4) этих больных методами ПК, карбоцнаниновых красителей с коифокаль: микроскопией. Основные результаты работы опубликованы автором pai (26, 40, 41).

Клиническое описание этого заболевания детей впервые б, проведено немецким неврологом Реттом в 1966 году и впоследст получило его название. Синдром Ретта это неврологическое заболева неизвестной этнологии. До настоящего времени это. заболева выявлено н описано только у девочек. Оно характеризуется, по нормального пре- и постнатального развития до 6-1В месяцев, внезап появлением двигательных автоматизмов, главный из которых являе симптом "мытья рук", атаксией и опраксней, умственной отсталост сколиозом, гнпервентшигцией легких пра дыхании, наличием эпилептогеи судорожных припадков, которые часто поддаются медикаыеитози лечению йнтнэпилептичоскииц препаратами (Hagberg, 1989; Engerstr 1992).

Такие клинические проявления СР, как умственная отсталое аутпстическое поведение, потеря речи а нарушение движения говс о явном вовлечении корговых структур. Hau интерес к этому заболева был также вызван клиническими дашшми о наличии у этих бот эпилептических припадков, которые поддастся медикаментозному лече! в отличие от пациентов с лекарственно-резистентной эпилепсией.

Выявлены особенности трехмерной геюметрни нейронов коры ис детей с диагнозом СР, составлена база данных атипичных нейронов атом заболевании (рве. 11)..

1. При сравнения геометрии дендритов пирамидных клето различных полях коры было обнаружено отсутствие различий iioitpoi характерное для исследочаннмх полой коры человека в нэрм'л геоме. jenpoiUB ФрстальноД, внсочноЛ и течениеfl коры была сходна. Так

ыло обнаружено характерного горизонтального распределения базальнкх косых апикальных дендритов пирамидных нейронов во фронтальной коре, аблюдаемое в норме. Некоторые базальные и косые апикальные дендриты мели очень большую длину (до 700 мкм).

2. Широкий спектр изменения дендритов был найден во II-III слоях. ;ольшинство пирамидных нейронов было представлено "классическим" •ипом - с одним апикальным дендритом и многочисленными базальными t косыми апикальными дендритами, однако у части таких нейронов ¡мелась ассиметрня косых апикальных дендритов, в то время как в норме эти нейроны имели симметричное распределение дендритов.

3. Общее число дендритных шипиков было уменьшено на апикальных, сосых апикальных и базальных дендритах пирамидных нейронов в слоях [I-III и V-VII. Постоянной особенностью было региональное отсутствие аппиков на определенных частях дендрита ( "голые" участки дендритов) . Эти участки занимали 10-20 мкм в длину, в то время как остальная часть ;ендрита была покрыта шипиками.

Рис. 11. Схематическое представление морфологических особенностей нейронного строения п пространственной организации неокортекса люпеГ: в норме (слева) и с синдромом Ретта (справа) на примере строения 10 поля фронтальной коры.

4. В моторной коре (поле 4) изучение морфологии волокон использованием карбоцианинового красителя dil показало отсутствн характерного компактного вертикального распределения аксональни волокон. Было выявлено также атипичное распределение горизонтальны волокон и признаки их дегенерации по всему поперечнику коры.

5. Во фронтальной коре (поле 10) пирамидные нейроны II-III ело] были более изменены, чем подобные нейроны слоев V-VII, приче! изменения касались в большей степени косых апикальных дендритов, sei базальных. В моторной коре (поле 4), наоборот, нейроны слоев V-VI были более изменены (кроме больших клеток Бзца), чем нейроны II-II слоев. В височной коре (поле 21) атипичные нейроны были видн: приблизительно равномерно без особой привязки к слоям коры.

6. В I слое коры и подкорковом белом веществе не были найден: атипичные нейроны наподобие тех, которые присутствовали в эпилептогенно; очаге больных ЛРЭ (ср. рис. 8 (справа) и рис. 11 (справа)). отсутствт таких атипичных нейронов при синдроме Ретта говорит о том, чт< миграция нейронов в пренатальном онтогенезе не нарушена у эти; больных. Этим фактом также можно объяснить возможность леченш эпилептических припадков при синдроме Ретта.

На основании проведенного исследования морфологические особенност! нейронного строения коры у пациентов с синдромом Ретта был! представлены на схеме (рис. 11). Полученные данные по трехмерно! геометрии нейронов н их пространственном расположении могут бит) использованы для ранней морфологической диагностики синдрома Ретт; при биопсийном исследовании пациентов в клинике, а также для прогноз, дальнейшего течения этого заболевания.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение разработанных методов изучения нейронной и волоконной организации мозга человека значительно расширяет и открывай': перспективу к изучению теоретических и клинических проблем конструкцш нервной ткани, позволяет решать проблемы ее функциональной организацш в норме и при различных неврологических и психических заболеваниях

Исследование трехмерной геометрии нейронов и их пространственное расположения выявило конкретные особенности строения фронтальной височной, зрительной и парнетальной коры мозга человека в норме Создана база данных трехмерных конфокальных изображений пирамидны: и ..епирамидных нейронов.

Изучение нейронной структуры коры мозга человека в норме и npi двух заболеваниях детского возраста - лекарственно-резистентно! эпилепсии и синдроме Ретта - позволило выявить конкретные особенност! изменения пространственного расположения и геометрии дендритов npi этих заболеваниях. Показана также принципиальная разннца i

>фологнческой картине строения коры, говорящая о пренатальном >ушении структуры мозга в эпилептогенном очаге при ЛРЭ и :тнатальном нарушении структуры мозга при синдроме Ретта.

зоды

1. Разработаны и применены оригинальные методы системного 1вления клеточных элементов мозга человека используемые для :тмрования мозга» метод внутриклеточного введения люциферового iToro, метод внутриаксонального транспорта карбоцианиновых »сителей и их комбинация с нммунофлуоресцентным методом выявления логически активных веществ. Разработан метод регистрации изображения 1ронов и волокон при помощи конфокальной лазерной сканирующей сроскопнн, позволяющий сохранять изображение на лазерных оптических :клх, проводить двух и трехмерную реконструкцию клеток.

2. Изучена этими методами трехмерная геометрия нейронов и их эстранственное расположение в коре мозга человека (поля 10, 21,

, '/) в норме и составлена база данных пирамидных и непирамндных фонов этих полей. Выявлена гетерогенность геометрии и распределения замидных нейронов различных областей коры мозга человека, шючающаяся в различной ориентации косых апикальных и базальных

! ДрИТОВ•

а) Выявлено колончатое распределение нейронов слоя III 17 поля триоднчностыо 300-400 мКм. Базальные и косые дендриты нейронов 'три колонки (a-клетки) имеют более вертикальную ориентацию, чем шрнты нейронов, лежащих между колонками (б-клетки). Эти клетки :же различаются по общей площади (S da), площади апикальных (Sc)

1 и базальных дендритных полей (Sd bas), по общей длине дендритов I) и длине базальных дендритов (Ld bas), плотности дендритов в щритной территории (lid) и плотности апикальных дендритов (N<J ар).

б) Выявлено подразделение нейронов III слоя 7 поля теменной коры

2 подслоя, согласно морфометрнческой оценке геометрии дендритов.

i вида клеток (а и б) различаются по общей площади (S da), общей me (Ld) и общей плотности дендритов в дендритной территории < Nd ), числу свободных концов (Bd), разветвленностн клетки (Ас), а также длине (Ld bas) н плотности базальных дендритов (Nd bas).

в) Выявлено, что в слоях II-III всех изученных полей соотношение 1чных пирамидных клеток с биапикалышми составляет 10« 1; в слоях 'II соотношение обычных пирамидных клеток с "динозавр-подобными" )узнфоркными составляет 12:8! 1.

г) Не найдены многочисленные нейроны в I слое коры и подкорковом юм веществе.

3. Изучена трехмерная геометрия нейронов и их пространственное :положенне в эпилептогенном очаге при лекарственно-резистентной шепсин. Выделено й аспектов морфологических изменений, характерных i такого очага. Составлена база данных атнпнч ых нейронов

эпилептогенного очага. Особенности нейронной организа) эпилептогенного очага, отличающие его от нормальной коры, заключаю в следующем:

а) наличии 4-х видов непирамидных нейронов в I слое, кото отсутствуют в норне,

б) в 2-4-х кратном увеличении числа бнапикальных нейронов во III слоях и отсутствии колончатой организации нейронов в этих ело

в) атипичной ориентации косых и/или базальных дендрнтов пирамидных нейронов в слоях II-VII,

г) увеличении числа и изменении пространственной микроорганиза! "динозавр-подобных" нейронов в слоях V-VII,

д) увеличении числа фузиформных нейронов в слоях V-VII,

е) наличии атипичных пирамидных, "динозавр-подобных" и фузиформ нейронов в подкорковом белом веществе.

4. Морфологические данные указывают на пренатальный харак нарушения нейронной структуры в эпилептогенном очаге. Выявл положительная корреляция степени морфологических нарушений геомет дендритов в эпилептогенном очаге с возрастом начала эпилепсии.

Полученные данные использованы для прогнозирования дальнейш течения заболевания, а также могут быть использованы для ран диагностики, прогнозирования лечения и постоперационном прогнозирова ПРЭ прч биопсийном исследовании пациентов в клинике.

5. Выявлены особенности трехмерной геометрии нейронов и воло коры мозга людей с диагнозом синдром Ретта, составлена база дан морфологических изменений мозга при этом заболевании. Дани которые могут быть классифицированы по следующим признакам:

а) отсутствие различий в геометрии пирамидных нейронов, характер для исследованных полей коры человека в норме (в т.ч. отсутст горизонтального распределения базальных и косых апикальных дендри во фронтальной коре; сходство нейронов фронтальной, височно! моторной коры,

б) ассиметрия косых апикальных дендритов нейронов во II-слоях; региональное отсутствие шипиков ("голые" участки дендрш на пирамидных нейрона:: во II-VII слоях,

в) атипичное распределение горизонтальных аксональных волою признахн их дегенерации по всему поперечнику коры,

г) отсутствие многочисленных нейронов в I слое коры и подкорке белом веществе, а также бнапикальных нейронов во II-III слоях * мозга, что характерно для эпилептогенного очага.

6. Морфологические данные указывают на постнатапьный хара» нарушения нейронной структуры в неокортексе у больных с синдрс Реттг. Оли могут быть использованы для ранней морфологиче< диагностики синдрома Ретта при биопсийном исследовании пациент« клинике, а также для прогноза в дальнейшем течении этого заболева1

7. Выявлено принципиальное отличие морфологических пзмеш

>метрни дендритов нейронов при лекарственно-резистентной эпилепсии изменений, найденных при синдроме Ретта, возможно указывающих на эффективность антиэпилептических препаратов при ЛРЭ и их помощь I эпилепсии у больных с синдромом Ретта.

псок пузкшсациЗ оснозгаа равот по результатам исследований

Валпчонко а.О. (1906) Разработка метода анализа ориентации идритов нейронов. В ки. i Современные тенденции развития медицинского нборостроения. М., 1986, стр. 188.

Dolichcnho p.v. (1988) Postnatal development of the neurons of R in the human brainstem. Abstract I European Congress of Neurology, -22 April, 1988, Prague, Czechoslovakia, p. 458.

Ванячавко п.в. (1988) Морфологические особенности интегративно-сковых нейронов гигантоклеточиого ретикулярного ядра ствола мозга повека. В сб. научи, тр. НИИ мозга, М., 1988, N17, стр. 8-9.

Волвчевко П.П. ;1989) Особенности структурных перестроек нейронов гикулярной формации ствола мозга человека при впзофренин. Ж. вропатол. и Психиатр., 7, стр. 59-61.

Balichanko p.V. and Schlote W. (1989) Morphometric analysis f pyramidal neurons in the human occipital and parietal cortex. Lin. Neuropathology, S, p. 220.

Balichenko p.v. (1990) New morphological methods (Lucifer Yellow 1 carbccyanine dyes for study of neuronal structure in autopsy human terial. Abstract Swedish-Soviet Symposium on "Nevr research in jrobiology", 6-8 November, 1990, p. 16.

Ввлвчовко П.З. (1990) Современные морфологические методы эирательного системного выявления нервных элементов мозга человека . :6.i Махро- и микроуровни организации мозга. М., N19, стр. 9-10.

□elichanko p.v. (1990) Using fluorescent carbocyanine dyes з study pathway organization in autopsy

jterial of the human brain. Bulletin Experimental Biology and idicine, 5t500-501 (transl.).

Makhanov M.A., FedorovA.A., Bollchenko p.v. (1990) Morphometrica). jdy of microlevel organization of pyramidal neurons of layer III human visual and parietal cortex. Proceeding Intern. Symposium ;uronet-1990", 10-14 September, 1990, Prague, Czechoslovakia, p. )-23 3.

10. Balichenko P.V. (1991) Structural changes of neurons of the nucleus reticularis gigantocellularis in human brain stem in normal brain and pathology. Abstract of congress of Intern. Fociety for Pathophysiology, Moscow, 28 May - 1 June 1991, p. 3

11. Беличенко П.В. (1991) Метод внутриклеточного введения люциферово желтого для изучения мозга человеха на аутопсийном материале. Apxi АГЭ, 101(7), стр. 81-84.

12. Balichenko P.V. (1991) Photooxidation of fluorescent preparations of human brain autopsy material for use in light at electron microscopy. Bulletin Experimental Biology and Medicine 9, p. 323-325; or 112/9, p. 1355-1358 (transl.)

13. Balichenko P.V. (1991) The structure of layer III in human visual, frontal, and parietal cortex. Abstract of Third IBRO World Congress of Neuroscience, Montreal, Canada, 4-9 August,

1991, p. 400.

14. Цайнер Б, Орлова Е.И., Веляченхо П.В. (1991) К биохимическ! аспектам патогенеза вегетативных и эмоциональных' парупений щ дисфункции дофаминовой системы. Ж. Нейропатол. и Психиатр., 91, (12] стр. 39-43.

15. Fedorov A.A., Makhanov М.А., Beliohanko P.V. (1992) Compute] analysis of neuronal structure. Abstract of 2nd Russian Swedisl Symposium "New Research in Neurobiology", Moscow, 19-21 May 199; p. 11-12.

16. Беличенко П.В. (1992) Методические подходы к нейронно! картированию мозга человека. В сб.» Макро- и микроуровни организащ мозга. М., 1992, стр. 26.

17. Balichenko P.V., Dahlstrom A., von Essen С., Lindstrom S., Nordborg C. and Sourander P. (1992) Atypical pyramidal cells ii epileptic human cortexi CLSM and 3-0 reconstructions. J.

NeuroReport, 3, p. 765-768.

18. Balichenko P.V., Dahlstrom A. and Sourander P. (1993) Application of confocal microscopy for the study of neuronal organization in human cortical areas after microinjection of Lucifer Yellow. Ini Biotechnology Applications of Microinjectioi Microscopic Imaging and Fluorescence, (Bach P.H., Reynolds C.H,

Clark J.M., Poole P.L, Mottley J., eds.), London, UK, Plenum Scientific Press, p. 29-35.

19. Беличенко П.В. (1993) Морфоыетрическая характеристика непирамидн! нейронов поля СА1 гиппокампа мозга человека. Морфология, 1-2, ст{ 33-40.

20. Balichenko?."., Dahlstrom А., Sourander P. (1992)

orphological findings in therapy resistent epilepsy (TRE) btained by neuronal Lucifer Yellow (LY) microinjection and onfocal scanning laser microscopy (CSLM) study. Abstract Int. onference, Irkutsk, Russia, September 1992, p. 18-19. . Balichenko P.V., Dahlstrotn A., Nordborg C., Sourander P., n Esser. C., Rydenhag B., Malmgren C., Lindstrom S., Hedstrom k., Uvebrant P. (1993) Morphological findings in therapy esistant partial epilepsy« Intracellular Lucifer Yellow licroinjection and confocal scanning laser microscopy study, ibstract 20th International Epilepsy Congress, Oslo, Norway, 3-8 ruly 1993, Epilepsia, 34(Suppl. 2), p. 113.

!. Balichanko P.V., Dahlstrom A. (1993) Human Brain Mappings single cell level obtained by neuronal Lucifer Yellow licroinjection and confocal laser scanning microscopy. Abstract , Sth Annual Meeting of the ENA, Madrid, Spain, 18-21 September .993, p. 73.

I. Balichenko P.V., Dahlstrom A. (1993) Mapping of the human train. The single cell level employing Lucifer Yellow licroinjection, immunohistochemistry, and confocal laser scanning dcroscopy. Abstract 23rd annual meeting society for euroscience, Washington, D.C., USA, 7-12 November 1993, p. 1113. I. Balichenko P.V. (1993) Neuronal cell types in entorhinal :ortex and hippocampal formation of man and ether mammaliai An nterspecies comparison. Hippocampus, 3, p. 3-10. i. Insausti R., Balichanko P.V., Frotscher M., Matus A., Monyer I., Palm G., Steinhauser C. (1993) Plasticity in the entorhinal lippocantpal system. Hippocampus, 3, p. 289-292.

i. Balichanko P.V., Dahlstrom A. (1994) The Rett syndrome <R5): -D dendritic morphology in different cortical areas studied with ronfocal laser scannint microscopy (CLSM). Abstract Int. lymposium "Neurodegenerative

isorder3, Common Molecular Mechanisms", Ocho Rios, Jamaica, April 1-15, 1994, p.3.

'. Balichanko P.V., Dahlstrom A. (1994) Contribution of confocal i3er scanning microscopy (CLSM) to the study of 3-D leuronal structure in normal and pathological human brain, ¿stract Int. Conf. "Confocal and Near-field Microscopy", Munich, lermany, April 25-28, 1994, p. 10.

I. Balichenko P.V., Nordborg C., Malmgren C., Rydenhag B., tdstrom A., Uvebrant P., Dahlstrom A. (1994) Human epileptogenic :ortexj Confocal microscopy study of 3-D immunofluorescence and endritic morphology. Abstract Int. Epilepsy Conference, Uppsala,

Sweden, April 22-23, 1994, EEG and Clin. Keurophys., 1994, p. \

29. Hedstrom A., Malmgren C., Nordborg C., Rydenhag B., Uvebrar P., Belichenko P.V. (1994) Cortical micrody.sgenesis can be an etiological factor in early onset and a predisposing factor ir late onset intractable partial epilepsy. Abstract Int. Epilepc Conference, Uppsala, Sweden, April 22-23, 1994, EEG and Cli

Neurophys., 1994, p. 23.

30. Belichenko P.V., Nordborg C., Malmgren C., Rydenhag B., -Hedstrom A., Uvebrant P., DahlStrom A. (1994) Confocal microsco

study of 3-D immunofluorescence and dendritic morphology in hum epileptogenic cortex. Abstract 1st European Congress of Clinic Neuropharmacology, Freiburg, Germany, 12-14 May, 1994, p. 4. 31 Maxwell D., Dolk S., Jankowska E., Dahlstrom A., Belichenko P.V. (1994) Confocal microscopic analysis of contacts between serotoninergic nerve fibers and dorsal horn spino-cerebellar tract neurones. Abstr. Scandinavian Physiol. Society Meeting, Goteborg, 6-8 May, 1994, p. 2.

32. Belichenko P.V., Dahlstrom A. (1994) Mapping of the human bra at the single cell leveli past, present and future. Abstr. 3rd

Swedish-Russian Symposium on "New Research in Neurobiology", Goteborg, Sweden, 6-8 June, 1994, p. 50.

33. Rydenhag B., Hedstrom A., Malmgren C., Nordborg C., Uvebran P., Belichenko P.V. (1994) Cortical microdysgenesis can be an etiological factor in early onset and a predisposing factor in late onset intractable partial epilepsy. Abstr. 3rd Swedish-Russian Symposium on "New Research in Neurobiology", Goteborg, Sweden, 6-8 June, 1994, p. 43.

34. Belichenko P.V., Sourander P., Dahlstrom A. (1994) Morphological aberrations in therapy-resistent partial epileps; (TRPE)i Confocal laser scanning and 3-D reconstructions of

' Lucifer Yellow injected atypical pyramidal neurons in epileptii human cortex. Mol. Neurobiol., 9(1-3), p. , in press.

35. Belichenko P.V., Dahlstrom A. (1994) Dual channel confocal last scanning

microscopy of Lucifer Yellow-microinjected human brain eel! cc^ibined with Texas Red

immunofluorescence, J. Neurosci. Method, in press. 30. Belichenko P.V., Dahlstrom A. (1994) Micromapping of the human braint Three-dimensional imaging of immunofluorescence ai dendritic

morphology using dual-channel confocal laser scanning microscopy Hruun Brr.iri Mapping, in press. .f7.s«Jich«o<a P.V., SourarJer f., .iulmgren C., KortiDorg c., voj

in С., Rydenhag В., Lindstrom S., Hedatrom A., Uvebrant P., Iilstrom A. (1994) Dendritic morphology in

Lleptogenic cortex from TRPE patients, revealed by intracellular ifer "/ellow

croinjection and confocal laser scanning microscopy. Epilepsy s., in press.

Balichnnko P.V., Dahlstrom A. (1994) Mild cortical aplaeiat three-dimensional study of the dendritic morphology, i Dysplasias of Cerebral Cortex and Epilepsy (R. Guerrini, F. ermann, R. Canapicchi, J. P.oger, P. Pfanner, eds.), Raven ess, New York, in press.

Belichenko P.V., Dahlstrom A. (1994) Mapping of the Human ain in normal and pathological situations> The single cell and or level,

ploying Lucifer Yellow microinjection, carbocyanine dyes acing, immunofluorescence, and 3-D confocal laser scanning construction. Neurosci. Prot,, 1994, in press. Belichenko P.V., Oldfors A., Hagberg В., Dahlstrom A. (1994) itt syndrome» 3-D confocal microscopy of cortical pyramidal drites and afferents, J. NeuroReport, in press.

Belioha:&o P.V., Dahlstrom A. (1994) Studies on the three-enaional architecture of dendritic spines and varicosities in man cortex by confocal laser scanning microscopy and Lucifer low

croinjections. J. Neurosci. Heth., in press..

Belichenko P.V., Dahlstrom A. (1994) Contribution of nfocal laser scanning microscopy (CLSM) to the study of 3-D uronal structure in normal and pathological human brain. J. crosc., 1994, in press, го страниц - 45

скатель

П.В. Беличенхо