Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Транспорт Са2+ саркоплазматическим ретикулумом скелетных мышц и миокарда крыс при вывешивании с функциональной разгрузкой задних конечностей

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

ИНСТИТУТ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ

На правах рукописи

СТЕПАНОВА Виктория Викторовна

ТРАНСПОРТ Са2+ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКИМ РЕТИКУЛУМОМ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ И МИОКАРДА КРЫС ПРИ ВЫВЕШИВАНИИ С ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РАЗГРУЗКОЙ ЗАДНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

14.00.32. - Авиационная, космическая и морская медицина 14.00.16 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Институте медико-биологических проблем Министерства здравоохранения России.

Научные руководители: - доктор биологических наук

Ю.В.Архипенко

кандидат биологических наук И.А.Попова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е.В.Никушкин доюор биологических наук М.Г.Таирбеков

Ведущее учреждение:

Биологический факультет Московского Государственного Университета ни. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится "_"_1993 г. в

"_" часов на заседании Специализированного совета К 074.31.01

по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте медико-биологических проблем МЗ России (123007, Москва, Хорошевское шоссе, 76А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан _1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук И.П.Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие космонавтики, увеличение продолжительности космических экспедиций, расширение и усложнение задач человека з условиях полетов требует изучения фундаментальных биохимических и биофизических процессов, обеспечивающих адаптацию человека к экстремальным условиям. В полетах на организм человека действует комплекс таких факторов как невесомость, гипокинезия, стрессорные нагрузки, радиация, в связи с чем оценка и прогнозирование состояния здоровья космонавтов приобретает первостепенное значение (Газенко, Туровский, 1986; Симонов, Касьян, 1983). Известно, что в условиях невесомости, так же как и при гипокинезии, происходит деминерализация костной ткани с выходом кальция из его основного депо (Какурин, 1967; Коваленко, 1974, 1980). Таким образом, происходит изменение электролитного баланса и, в частности, изменение гомеостаза кальция, который является одним из важнейших медиаторов биохимических процессов в организме. Кроме того, в невесомости или при ограничении двигательной активности происходит атрофия мишц <Ilyina-Kakueva, Portugalov, 1976; Oganov et al, 1980).

Обследование людей, находившихся в условиях невесомости, хотя и дает чрезвычайно ценную информацию о ходе адаптации к экстремальным условиям и обратимости изменений в организме, чаще всего не позволяет достаточно полно оценить собственно тканевой метаболизм. Это затрудняет понимание механизмов изменения обмена веществ, электролитного и энергетического баланса, происходящих в организме человека в условиях космического полета. Больший объем данных о состоянии тканевого обмена мохно получить в экспериментах на животных. Биологические эксперименты с животными в условиях космического полета дали уникальные результаты, но их количество ограничено, а выполнение требует значительных материальных затрат. В связи с этим, моделирование некоторых физиологических эффектов невесомости в наземных экспериментах получило , широкое распространение. Среди многочисленных экспериментальных моделей в последнее время часто используется метод вывешивания крыс за хвост с целью разгрузки задних конечностей (Ильин, Новиков 1980, Могеу-Holton, Wronski, 1981). Показано, что эта модельная система вызывает изменения в костной ткани, мышцах, аналогичные наблюдаемым в условиях микрогравитации (Husacchia, Steffen, Deavers, 1983; Morey, 1979; Ильина-Какуева, Новиков, 1985). .Поскольку в условиях

выверивания, так. же как и в невесомости, значительным изменения: подвержена скелетная мускулатура, важная информация о механизма: происходящих сдвигов может быть получена при изучении ферментны: систем, участвующих в цикле сокращения-расслабления мышечны: волокон. Одной из таких систем является саркоплазматическш ретикулум (СПР), который непосредственно вовлечен в процео сопряжения возбуждения и сокращения мышц, освобождая ионы кальци для сокращения и депонируя их для расслабления мышечных волокон. .' литературе имеются немногочисленные данные о влиянии весово разгрузки конечностей на состояние системы транспорта Са2^ СП мышечных тканей разных типов (Stevens, Mounier, 1992).

Исследование состояния системы Са-транспорта СПР при длительно весовой разгрузке конечностей необходимо для получения важно информации об изменениях сократительных свойств мышц пр гипокинезии-гиподинамии и обратимости атрофических процессов мышечных волокнах, а также оценки возможных способов предупрехдени этих изменений.

Цель и талдчн исс.тр.юплния . Цель работы состояла в выяснени зависимости характеристик Са-насоса СПР от функциональной активност мышц.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить динамику изменений скорости транспорта Са2-* СП скелетных мышц разных типов и сердца крыс с 1-х по 40-е сутк вывешивания.

2. Изучить изменения конформационной стабильности Са-насоса СП при вывешивании различной продолжительности.

3. Определить степень и временные характеристики восстановлени свойств системы транспорта Са2-* СПР скелетных мышц и сердца пр возвращении крыс в нормальное положение после длительного период вывешивания.

4. Выяснить, как реагирует система транспорта Са2+ СПР мышц различным соотношением быстрых и медленных волокон на снятие возобновление опорной нагрузки.

5. Исследовать возможность фармакологической коррекци изменений эффективности Са-транспорта СПР мышц и миокарда, вызванны условиями отсутствия опорной нагрузки.

Научная новична работы. Б результате проведенной работ установлено, что при снятии опорной нагрузки на задние конечное? крыс при вывешивании за хвост происходит увеличение скорост транспорта Са^* СПР скелетных мышц. Впервые исследована динамик

активности Са-насоса СПР скелетных мышц и миокарда крыс при снятии опорной нагрузки в период с 1-х по 40-е сутки, причем в первые две недели ..вывешивания исследована ежедневная динамика изменений скорости транспорта Ca2-1-'. ' Степень и . сроки проявления воздействия весовой разгрузки наСа-насос СПР зависят от состава мышц по типам волокон. Са-транспортирующая способность СПР мыиц с преимущественно медленным типом волокон (m.soleus) значительно увеличивается- -. с первых дней снятия опорной нагрузки. Скорость транспорта Са2+ СПР смешанной мышцы (п. gastrocnemius lateralis) в первые 2 недели достоверно не отличается от контрольных значений, а увеличение скорости транспорта Ca2-*- проявляется к более поздним срокам вывешивания - к 25-м и 40-м суткам.

После 25 и 4 0 сут. разгрузки задних конечностей отмечено повышение конформационной стабильности Са-насоса СПР -в. gastrocnemius lateralis, что выразилось в большей его устойчивости к повышенной температуре.

Показана' различная реакция . Са-насоса СПР скелетных мышц медленного (з. soleus) и смешанного (ti. gastrocnemius lateralis и п. vastus medialis) типов на возобновление нагрузки после длительного периода весовой разгрузки. А именно, выявлено резкое снижение скорости транспорта Ca2* СПР мышц смешанного типа уже через 4 часа после возобновления нагрузки, тогда как в медленной мышце значительных изменений скорости транспорта Ca2*- СПР в этот же период не происходит. Впервые исследована ежедневная динамика активности Са-насоса СПР.скелетных мышц в ходе 2х-недельной реадаптации после длительной весовой, разгрузки конечностей. .Для смешанных .. мышц .(п. gastrocnemius lateralis и п. vastus medialis) характерно резкое снижение .транспортной активности в .период 1-й недели реадаптации с последующим "всплеском" в течение 2-й недели с максимумом на 10-12-е сутки реадаптации. В мышце с преимущественно медленным типом волокон (m. soleus) происходит постепенное снижение скорости транспорта в течение 2-х недель реадаптации до уровня контрольных значений. .

При вывешивании крыс наблюдается достоверное снижение скорости транспорта Ca2-* СПР миокарда только к 40-м суткам.эксперимента,"а на более ранних сроках . достоверных изменений активности ..Са-насоса не происходит. Чувствительность .Са-насоса к повышенной ..температуре одинакова для опытной и контрольной групп на .25-е и 40-е сутки вывешивания. . Через .4 часа после .возвращения крыс в "■ нормальное положение после 40 сут. вывешивания отмечено увеличение скорости транспорта Са2+ СПР миокарда по сравнению со значениями, полученными

в группе животных, находившихся в вывешенном состоянии в течение 4( сут, хотя величина скорости транспорта после 4 часов возобновлена опорной нагрузки остается нихе контрольных - значений. ] восстановительный период после 40 сут. вывешивания транспортна! активность СПР миокарда быстро возвращается к контрольному уровню т.е. изменения скорости транспорта Са2^ СПР при вывешиваний'нося: обратимый характер.

Впервые показан коррегирующий эффект .препарата Лодронат относящегося к группе дифосфонатов, применяемых для леченш заболеваний, сопровождающихся нарупениями обмена кальция 1 резорбцией костной ткани, на состояние системы транспорта Са2"1- СП! миокарда и скелетных мыиц при 40-сугочном вывешивании крыс.

Практическая и научная значимость работы. При оценк! экспериментальных 'данных с использованием моделей . гипокинезш следует учитывать, что даже кратковременное снятие опорной нагрузк1 на мыицц приводит к увеличению скорости транспорта Са2^ СПР мышц, 1 состав которых входят волокна медленного типа. Полученные данны< свидетельствую? о выраженной -модификации Са-насоса в периб; длительной весовой разгрузки. Исследование' ежедневной "динамик! скорости транспорта Са2^ СПР скелетных мышц и миокарда мегодо! скользящих средних с использованием.минимального количества животны: позволило установить начальные сроки и. особенности- проявлена эффектов вывешивания для разных мыпц, что дает основание' 1 •дальнейшем проводить прицельное изучение параметра на необходимо! количестве'животных в предварительно выявленные ключевые сроки;

Резкое изменение скорости . транспорта Са2"*. . СПР миокарда I скелетных мышц происходит через 4 часа.'.тюсле• возобновления'опорно] нагрузки. ' Отсюда следует, что Са-насос ■ СПР - лабильная' система активность которой необходимо регистрировать, непосредственно поел« окончания длительного периода гипокинезии-гиподинамии.

Полученный коррегирующий эффект препарата Лодронат из групш дифосфонатов на состояние системы транспорта Са2"* при'гипокинезии гиподинамии позволяет 'осуществлять направленный -' ' подбо! фармакологических средств, оказывающих .влияние на гомеостаз кальция для'предупреждения последствий ограничения двигательной активности..

. Основные положения, прелставлярмыя к защите:. .' . . " • 1. Состояния с различным уровнем функциональной .активност: ■скелетной мускулатуры (весовая разгрузка, конечностей, возобновлена опорной нагрузки после длительной гипокинезии-гиподинамии сопровождаются изменениями интенсивности - работы мембранного Са

-mcoca СПР скелетных мыиц.При этом снятие опорной нагрузки вызывает активацию транспорта Са2^ СПР, а при возобновлении нагрузки эффективность ' мембранного , транспорта Са2 + восстанавливается до' уровня контрольных величин. ' .

2. Изменение положения тела по отношению к направлению вектора гравитации и функциональная разгрузка задних конечностей при . вывешивании крыс в период с 1-х •по 25-е ' сутки воздействия не вызывают значительных сдвигов в работе Са-насоса СПР миокарда. Снижение активности мембранного транспорта Са2-1- наблюдается только к • 40-м суткам вывешивания, причем изменения носят обратимый характер.

3. Применение, препарата " Лодронаг из -группы .дифоссонатов, регулирующих метаболизм кальция в организме, предотвращает изменения активности транспорта Са2^ СПР скелетных . .мышц и " миокарда, индуцированные условиями гипокинезии-гиподинамии.

заседании секции Ученого Совета ИМБП МЗ России.

По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы. -Структура и об-ьрм ттисорртапин.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания . материалов и методов исследований, четырех глав . собственных исследований с обсуждением полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. ■ Библиографический указатель включает 237 источников литературы. Работа изложена на 151 странице машинописного текста , содержит 24 ■ . рисунка и 3 таблицы. г

: УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ. ИССЛЕДОВАНИЙ, МАТЕРИАЛЫ И. МЕТОДЫ. ■■'..-.

Объем, структура и условия исследований представлены в .таблице; ■

'Эксперименты ' проводились на крысах-самц-ах Вистар-.- Выверивание ' крмс за хвост в антиоргостатическом положении' (-30°). проводили по нет.оду,' предложенному Ильиным ' и Новиковым (1980),. .в модификации . rtorey'-Holton S'Htonski (1981), Крыс забивали способом декапитации. Скелетные мышцы и. сердце выделяли и быстро' замораживали в жидком. ...• азоте ' • ;'••'•':_.:••■•'. .

"'. 'Ткань измельчали в 'ножевом гомогенизаторе. Ultra-Turrax. Определение скорости транспорта Caz+ ' СПР регистрировали . в '-.• гомогенатах тканей в присутствии оксалата На-*:-: с_ использованием иономера с Са-селективным электродом по методу . (Hadeira, 1975, . ■ rteerson, ' Sazontova, Arkhiperiko, 1991). Для изучения конформационной

стабильности Са-насоса СПР проводили его термоинактивацию путе) прогрева сомогекатсв мышечных тканей при температуре 44-45°С Максимальную •■ емкость СПР для Са2+ определяли- после окончани: процесса транспорта Са2-1" внутрь СПР по разности между начальны] уровнем кальция в реакционной среде и уровнем концентрации кальция : среде после реакции транспорта.

Таблица 1. Объем, структура и условия исследований.

Условия воздействия Количество Объем

животных исследований

1. Вывешивание крыс в Контрольная Измерение

течение различных группа - 40 крыс скорости

временных периодов. Экспериментальные транспорта

Объекты исследования: группы: Са2+ СПР -

скелетные мьшцы: вывешивание 1-14 936 анализов

m. gastrocnenius lateralis; сут - 14 крыс; Измерение

ш, vastus medialis; вывешивание 25 максимальной

в. soleus; сут - 6 крыс; емкости

сердечная мыица. вывешивание 40 везикул СПР .

сут - 6 крыс; для Са2-*- -

реадаптация 4 234 ан.

часа - 6 крыс; Термоинакти-

реадаптация 1-14 вация Са-

сут - 14 крыс. насоса СПР

936 ан.

2. Вывешивание крыс ß течение Контрольные Измерение

40 сут при введении препарата группы: скорости -

Лодронат. контроль-10 крыс; транспорта

Объекты исследований: кокгроль+Лодронат Са2+ СПР

скелетная мышца - - 10 крыс. 240 ан."

ю. gastrocnemius lateralis; Экспериментальные

сердечная"мышца. . ' группы:

вывешивание 40 •

сут - 10 крыс;

вывешивание +

Лодронат-10 крыс .

ИТОГО: 126 крыс 2346 анализов

•' " . Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистик с использованием критерия'- 1 Стьюдента. - С 1-х по 14-е сутк вывешивания и - в течение 2х-недельного периода-' реадаптаци •1 • эксперимент' проводили по методу динамических'- рядов- наблюдени (Павлов, Гансбургскйй, . Запрягаев, 1986), полученные "данны -' обрабатывали способом скользящих средних- и достоверность различи определяли, используя непараметрический критерий различия Вилкоксон ' : для "сопряженных пар (Урбах, .1964). Результаты в контрольной групп ''•'•животных обрабатывали с помощью регрессионного анализа.

6 • .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. транспорт са-* саркоплазматическим ретнг/лумом скелетных мышц крыс при функциональной разгрузке задних конечностей.

Разгрузка задних конечностей крыс при вкэешнвэнии за хвост приводит к значительной атрофии скелетных мыиц, причем наибольшие изменения наблюдаются в медленной камбаловидксй мьшце (Ilyina-Kakueva, 1078, Oganov et al,1930, Hiriiarski et al, 19S7). Атрофия обычно характеризуется снижением содержания белка в мышце (Steffen, Mussachia, 1984) с преимущественной потерей мнсхибриллярных белков (Thonacon et al, 1390). Изменяются сократительные свойства мыиц (Stevens et al, 1980), распределение типов волокон (Templeton, 1934), и активность ферментов (Thomason, 1990). Развитие атрофических процессов в мышце при гипокинезии - гиподинамии может оказывать влияние на структуру саркоплазматического ретикулума (СПР), так как последний непосредственно вовлечен в процесс мышечного сокращенна - расслабления. Показано, что свойства мембран СПР значительно изменяются при дистрофических процессах в мышцах (Verjovski-Alaedia, 1979, Takagi, 1984). Для выяснения влияния весовой разгрузки задних конечностей при вывешивании крыс на состояние системы транспорта Ca2* СПР в скелетных мышцах предпринята настоящая работа. Животные .находились в состоянии вывешивания в течение 1-14, 25 и 40 сут.

При исследовании динамики активности транспорта Ca2* СПР камбаловидной мыпцы показано, что в течение 1 -14 сут. вывешивания происходит значительное увеличение скорости транспорта Ca2* (р<0,01), причем нарастание этой величины проявляется с 3-4 дня вывешивания (рис. 1, кривая 2). В данной постановке эксперимента можно оценить достоверность различий данных, полученных в опытной группе (кривая 2) ив контроле (кривая 1), а также выявить тенденцию изменений изучаемого параметра при воздействии. К 25-м суткам эксперимента средняя величина скорости транспорта Ca2* в .группе животных с разгруженными конечностями составляет .1,522*0,12 нмоль Са2*/мин/мг ткани,." что на 48% выше контроля (1,022*0,099) (рис. 1). К 40-м суткам вывепивания величина скорости транспорта Ca2* СПР в опытной группе (1,525*"0,13) на 31% выше контрольных значений (1,161*0,059) -(рис.1).

сутки

Рис. 1. Динамика активности Са-насоса СПР камбаловидной мышць крыс в контроле (кривая 1)'и при вывешивании с 1-х по 40-е сутку (кривая 2). •'*" - р < 0,05.

Изучена максимальная емкость везикул СПР камбаловидной мышщ для Са2-, поскольку эта величина может характеризовать целостносп мембраны, а также слухить для оценки относительного содержания I мышце везикул СПР, способных к депонированию Са, в расчете на 1 мг мышечной ткани. К 25-м суткан вывепивания величина максимально? емкости везикул СПР 'для Са21- в группе животных с разгруженным! конечностями (11,416-0,663 нмоль Са2-/мг ткани) на 242 выше контрольных значений (9,206+0,459) (р<0,05). Однако, на 40-е сут^ вывешивания максимальная емкость везикул СПР для Са2+ в опытно? группе <11,686-0,813) достоверно не отличается от контрольны) значений (10,1-*0,4).

С целью выявления изменений конформационной стабильности Са-

насоса СПР после весовой разгрузки мышц была изучена

чувствительность системы транспорта Са2* СПР к . температурном}

воздействию, которое ведет к разобщению транспортной I

гидролитической функции _ Са-АТФазы (Болдырев и др. 1988). Хот5

скорость аккумуляции Са2+ СПР и. Бо1еи5 после 25 и 40 суп

вывешивания в опытной группе выше по сравнению с контролем,

8

термочу сствнтельность системы транспорта Са2+ одинакова в обеих группах, что отражает тот факт, что при вывешивании не изменяется конформационная стабильность Са-насоса СИР п. soleus.

При исследовании динамики изменений -скорости транспорта Ca2* СПР и. gastrocnemius lateralis показано, что с 1-х по 14-е сутки достоверных различий мехду опытной и контрольной группой нет, хотя видно, что изменения в группе вывешенных животных носят колебательный характер с тенденцией к снижении на 5-э сутки воздействия и к повышению на 12-14-е (рис. 2, кривая 2), что хорошо выявляется при использовании метода скользящих средних. Данные, полученные на контрольных образцах в разные сроки обследования (кривая 2)', били обобщены с использованием 'регрессионного анализа для выявления тенденции изменений скорости транспорта кальция в С? мышц интактных животных по времени (рис.1 2, кривая 3).

нмоль Са2+/мин/мг ткани

Рис. 2. Динамика активности Са-насоса .СПР m. gastrocnemius lateralis в контроле (кривая 1) и при вывешивании крыс в течение 40 сут (кривая 2). Данные контрольных серий обобщены с помощью регрессионного анализа (кривая 3). "*" - р < 0,05.

На рис.3 представлена .зависимость скорости-транспорта ионов кальция в СПР от времени термоинактивации препаратоз путем , .. предварительного прогрева гомогенатов мышц при 45°С в контроле (1) ■

9

и после 25 суток "вывешивания (2). Начальная скорость транспорта Са2-нативных гомогенатов мышц у крыс опытной группы (4,305-0,262 нмоль Са2-/мин/мг ткани) достоверно выше на 412 по сравнены» с контролем (3,052-0, 16). Снижение .скорости.транспорте Са2+ в СП? при .нагревании гомогенатов мыац выведенных животных идет медленнее, чем в контроле, и к 20-й минуте термообработки составляет 30% от первоначальной активности, в то время как в контроле остаточная активность составляет к этому времении только 10% (рис. 3, врезка).

нмоль Са+ + /мин/мг ткани б

б 10 16 20 26 30

мин термоинактиЬации

контроль о | | вывепшвание

о

о

Рис. 3. Зависимость скорости транспорта Ca2- СПР п. .gastrocnemius lateralis от времени инкубации гомогенатов мышечных тканей при 45°С-'в' контроле (1) и на 25-е сутки вывешивания кр'ыс (2). На врезке представлена степень снижения активности Са-насоса к 20-й минуте термоинактивации.

После 40 суток вывешивания начальная . скорость транспорта кальция в СПР мышц животных опытной группы (6,011-0,281) на 582 выше, чем в контроле (3,791-0,242). К этому сроку обследования термостабильность Са-насоса.СПР мышц животных была повышена, как и на 25-е сутки вывешивания - в опытной группе остаточная активность транспорта к 20 минуте инкубации при 45°С составляла 422 по сравнению с.282 в контроле.

Главный' • *из описанных выше -результатов состоит в том, что

весовая разгрузка задних конечностей крыс при выверивании п.-лзодкт к активации Са-транспортнрующей функции СПР как мышц с преимущественно медленным типом еолокон (п. soleus), так и мывц, состс^днх из . быстрых и медленных волокон (п. gastrocnemius lateralis).

Значительное увеличение скорости поглоценпя выброса Гг2**" СПР камбаловидной мызцц после Еженедельной разгрузки задних конечностей или иммобилизации были получены в ряде работ (Kiл, 1981, Patterson et al., 1935, Stevenset al., 1902,). Авторы связывают эти изменения с трансформацией медленных волокон в быстрые при ограничении подвижности. Известно, что при весовой разгрузке задних конечностей в мнацах с преимущественно медленным типом волокон (п. sclsus, а. vastus internedius) увеличивается содержание тяжелых цепей миозина' (myosin heavy chain, .ЧНС), относящихся к быстрому типу !На), и уменьшается содержание ,ЬЛ!С , относящихся к медленному типу (I) (Тепр leton et al., 1S 5-1, Diffee ct al . , 1391). Идснтнф/.цированы така;е различные изофоркы Са-ЛТ'1ази СПР, специфические для Си:трого и медленного типов волокон скелетных мьшц кролика (Leber'er, Pette, 1986). Са-АТЧ'аза быстрих волокон имеет более высокую активность и Са-транспортпруюцун способность по сравнению с медленными г;-.окнами (Ruegs, 1937). Из этого следует, что активация работы Са-ка:оса СПР при весовой разгрузке в медленных (soleus) и смешанных (п. gastrocnemius lateralis) мышцах .может бить связана как с повышением скорости работы самого фермента в связи с изменением его кинетических параметров, так и за счет синтеза в медленных волокнах новой изоформи Са-ЛТ^ази с повышенной. транспортной активность:-:.

При исследовании динамики изменений состояния Са-нассса СПР мышц задних конечностей крыс в течение 40 сут. вывешивания выявлены различия между реакциями системы транспорта Са2* СПР камбале видной и икроножной мыпц на весовую разгрузку. А именно, в камбадовидной мышце увеличение скорости транспорта Са2+ СПР начинает проявляться с 3-4-х суток воздействия и достигает максимальных значений у. 13-14-м суткам, в то время как активация . транспортной функции СПР ¡я. gastrocnemius lateralis становится заметной к 25-м суткам вывепизания и достигает максимальных значений к 40-м. Разная степень проявления изменений активности Са-насоса во время снят;«..-, весовой нагрузки связана, по-зидимому,.с различиями в составе исследованных мышц по типу волокон. Учитывая то, что икроножная мышца евзтоит из быстрых и медленных волокон, а камбаловидная - мипца преимущественно медленного типа, можно понять, почему к 14-м суткам не получено достоверных изменений .состояния Са-гранспортирующей системы СПР .

волокон, трансформированных из типа I (медленные) в тип II (быстрые-) возрастает настолько, что их вклад б обцую активность транспорта становится заметным. Следует отметить, что увеличение общей активности Са-транспорта СПР в мышце при вывешивании может отражать но только количественные изменения в ферментном составе волокон, когда содержание "быстрых" изоформ белков непрерывно возрастает на фоне деградации "медленных" форм ферментов, но и более сложные процессы, когда на разных сроках снятия весовой нагрузки скорости процессов синтеза и деградации мнаечных структур могут иметь отличную друг от друга фазность и продолжительность (Booth, Kirby, 12S2). Это сложное сочетание скоростей синтеза и распада белков можно косвенно проиллюстрировать на примере динамики изменений активности Са-насоса СПР камоаловидной ныпцы. Выверивание в течение 2-х недоль вызывает максимальные сдвиги в функционировании Са-насоса камоаловидной мышцы крыс.

Максимальная емкость везикул СПР для Са2*~, регистрируемая в мышечных гомогенатлх, может характеризовать относительное содержание структур СГ;Р, способных к депонированию ионов кальция., к 25-м суткам вывешивания повышена по сравнению с контрольными значениями. Поскольку атрофические процессы затрагивают в первую очередь сократительные белки, то содер1ание структур СПР в мышце в расчете на мг ткани может увеличиваться к 25-м суткам вывешивания. Кроме того, наблюдаемое в этот период повышение максимальной емкости везикул СПР канбаловидной мышцы для Са2* согласуется по степени проявления с уменьшением относительного веса мышц к этому сроку. К 40-м суткам вывешивания максимальная емкость везикул не отличается достоверно от контрольных значений, хотя скорость транспорта на 317! выше по сравнению с контролем. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что к этому сроку процессы деградации структур затрагивают не только сократительные белки, но и систему СПР, поэтому их количественное соотношение в конечном счете не отличается от контрольных значений. Тот факт, что после 40 суток вывешивания скорость транспорта Са2* значительно выше контроля при отсутствии изменений максимальной емкости везикул, свидетельствует г пользу гипотезы о трансформации медленной формы волокон в быструю.

В .икроножной мыице к 25-к и 40-м суткам вывешивания увеличивается устойчивость Са-насоса СПР. к повышенной температуре, тогда как СПР канбаловидной мышцы к тем же срокам эксперимента в опытной группе и в контроле имеет одинаковую чувствительность к

быстрая H5oíi?K3 Ca-AT-íasM, то усиление устойчивости к »¿грезами» Са-насоса СП? икроножной нышцы мохно объяснить тем, что "быстрая" Са-АТгаса менее лабильна, т.е. для ее инактивациитребуются более жесткие воздействия. Однако в камбаловидной мышце при увеличении скорости транспорта Са-^ после снятия опорной нагрузки не происходит повышения устойчивости Са-насоса к нагреванию. Объяснение расхождения з результатах, полученных для канбаловидной и икронохной мышц по термостабнльносги Са-насоса следует искать как в различием составе этих мышц по типу волокон, и, следовательно, соотношении нзофорн Ca-AT'íaoU СПР, так и в различном микроокруженпи Са-АТФазы в мембране СПГ. Поскольку максимальное увеличение скорости транспорта Са-* СПР п. salens при завешивании крыс наблюдалось к 13-14-м суткам эксперимента, не исключено, что в эти сроки термостабильность Са-насоса СПГ камбаловидной мышцы животных, находившихся в условиях вывешивания, могла би быть повышенной. К 25-м и 40-м суткам выверивания деструктивные процессы в камбаловидной мышце при атрофии могут затрагивать как. сократительные белки, так и мембраны СПР, поэтому эффект повышения териостабнльности Са-насоса не проявляется.

2. ТРАКСПОГГ Са2- САГКОПЛАЗМАТНЧЕСКИМ РЕТИКУЛУМОМ СКЕЛЕТНЫХ мыац В Е0ОСТАНОВКТЕЛЬНЫЙ ПЕРИОД ПОСЛЕ 40 СУТ ВУВЕЙИВАиИЯ.

Изменения метаболизма при ограничении двигательной активности были предметом многочисленных исследований (Коваленко, Туровский, 1980). Особенности обмена вешеств после выведения из состояния сни.тенной двигательной и функциональной активности изучены меньше. Следует, однако, иметь в виду, что именно в этот период может в полной мере проявиться пагубность тех изменений, которые происходили при гипокинезии. Имеются данные об очаговых повреждениях мышечных волокон в период реадаптации, особенно если в это время хивотные подвергаются физической нагрузке (Kasper, White, Maxwell, 1990). Однако, в литературе не содержится данных о состоянии системы Са-транспорта СПР мышц в период реадаптации после гипокинезии-гиподинамии, хотя . функционирование этой системы мохет нарушаться как в период снятия опорной нагрузки .на мышцы, . так и в процессе возобновления мышечной нагрузки.

Для изучения изменений Са-насоса СПР различных скелетных мышц в период .2-х недельной реадаптации после 40-суточного вывешивания скорость транспорта Са2+ измеряли в СПР камбаловидной мышцы (п.

soleun), икроножной мьшци (и. gastrocnertius lateralis), четырехглавой мыацы бедра (п. vastus nedialis) крыс через 4 час; поело возобновления нагрузки, а также каждый день с 1-х по 14-< сутки после 40 сут. выверивания.

Через 4 часа после возобновления нагрузки на задние конечносп скорость транспорта Ca2- СПР и. gastroenemius lateralis (GL. составила 4,335-0,139 нмоль Са2-/мин/мг ткани, что на 27% ниже, че> активность транспорта после 40 сут. вывешивания (6,011-0,281] (р<0,05), и достоверно не отличается от контрольных значени; (3,791-0,242) (рис. 4).

толь Сс+ + /мин/мг гпкаьи

7

6 б 4 3 2 1 О

GL VM SOL

Li.L¿i¡nJ I I

контроль вывешивакие 4 ч реадаптации

Рис. 4. Скорость транспорта Са2- СПР п. gastrocnemius lateralis (GL), п. vastus nedialis (VM), ¡a. soleus (SOL) в контроле, на 40-« сутки вывешивания и через 4 часа после возобновления опорно» нагрузки на задние конечности. "*" - р < 0,05.

В СПР in. vastus nedialis (Vtf) после 4 часов реадаптацш скорость транспорта Са2- (3,931-0,200 нмоль Са2-/мин/мг ткани) нг 312 ниже этого показателя после 40 сут. вывешивания (5.691-0.307] (р<0,05), и достоверно не отличается от контроля (3,730-0,143) .(рис. 4). Скорость транспорта Са2- СПР m. soleus (SOL) после 4 часо] реадаптации (1,241-0,117. нмоль Са2-/мин/мг ткани) достоверно ■ Н£ отличается как от значений в группе крыс, вывешенных в течение 4(

14

отличается как от значений в группе крае, вывешенных в течение 40 сут. <1,525+0,130), так и от контрольных значений (1,151'0,059) (рис. '4). Максимальная емкость везикул СПР ¡п. soleus для Са2- после 4 часов реадаптации (8.176*0.900 нмоль Са2*/мг ткани) на 30% снижена по сравнению с величиной, полученной в группе животных, находившихся в состоянии вывешивания в течение 40 сут. (11.666*0.013) (р<0,05), что может отражать, изменение проницаемости 'менбрани СПР и, тем самым, возможность пассивного выхода Са2* из везикул через 4 часа после возобновления нагрузки на мышцу.'

На рис. 5 представлена динамика "изменений активности Са-насоса СПР m. gastrocnemius lateralis с 1-х по 14-е сутки реадаптации после 40 сут. вывепивания (кривая 2) и в контроле в эти же сроки (кривая 1). Значения, полученные в группе восстановления после выверивания, достоверно отличаются от контроля (р<0.05).

нмоль Са++/мин/мг ткани

Рис. 5. Динамика скорости транспорта Ca2* СПР п. gastrocnemius lateralis в ходе 14-суточного восстановительного периода после 40 сут. вывешивания крыс. Данные контрольной (1) и опытной (2) серий эбработаны по методу скользящих средних для динамических рядов. Символы - индивидуальные значения паранетра в ряду динамики. Кривая 3 - регрессионная кривая для контрольных значений.

Видно, что в первую неделю восстановительного~периода скорость

транспорта Ca2* СПР gastroenenius 'lateralis остается примерно на

15

уровне контроля. В течение второй неделя происходит постепенное увеличение показателя с максимумом в период 6-10 суток реадаптации, и последующее снижение до уровня контрольных значений,. Характер изменений состояния Са-насоса СПР п. vastus nedialis подобен динамике для л. gastrocnemius lateralis -с характерным плато на уровне контрольных значений в период 1-й недели восстановительного периода и noBLiaeiiiiev активности в течение 2-й недели. При этом значения для группы восстановления и контрольной группы достоверно не различаются. Исследование динамики активности транспорта Ca2- СПР п. sulcus показало, что в течение 1-14 сут. реадаптации происходит постс-пенноо снижение показателя от уровня значений в группе выведенных животных до уровня контроля (рис. 6), рричем значения в группе восстановления после вывешивания (кривая 2) достоверно отлнчгнт.ся. от контроля (кривая 1) <p<0;Gl)..

нмоль Са++/мин/мг гпкани

сутки Ьосстанобительного nepuofla

Рис. 6. Динамика .скорости транспорта Са2- СПР т. эо1еи5 в ходе 14-суточного восстановительного периода после 40 сут. вывешивания крыс. Данные контрольной (1) и опытной (2) серий обработаны по методу скользящих- средних для динамических рядов. Символы индивидуальные значения параметра в ряду динамики. Кривая 3 регрессионная кривая для контрольных значений.

возобновление нагрузки после 40 суток вывешивания. В мышцах, состоящих из быстрых и медленных волокон (п. gastrocnemius lateralis, m. vastus nedialis), способность СГТР осуществлять транспорт "Ca2* уже в г.ерЕые часы восстановительного периода существенно снижается по сравнению с таковой в группе животных после 40 сут. вывешивания. В мышце с преимущественно медленным типом волокон в первые 4 часа реадаптации после длительного выверивания скорость транспорта Ca2* СПР достоверно не изменяется (рис. 4), хотя нельзя утверждать, что состояние СПР m. soleus не изменяется в период 4х-часовой реадаптации, так как максимальная емкость везикул для Ca2* после 4-х часов возобновления нагрузки достоверно снижена по сравнению с группой, находившейся 40 сут. в состоянии вывешивания. Уменьшение максимальной емкости везикул СП? для Ca2* может быть связано с активацией процессов естрстве-нного разрушения мембран (ПОЛ, фосфолипазн и др.), в результате чего нарушается целостность мембраны СПР, и Ca2*, депонированный в процессе активного транспорта внутри везикул, возвращается в цитоплазму. Общая максимальная емкость везикул СПР для Ca2* в гомогенате мышечной ткани в этом случае может быть снижена при неизменной активности Са-АТФази.

Существует разница в динамике реадаптации СПР мышц с медленным (SOL) и смешанным (GL и VM) типами волокон. Снижение транспортной активности Са-насоса СПР Gl и VM до уровня контроля в течение 1-й недели реадаптации и отсутствие такового в динамике изменений Са-насоса СПР SOL можно объяснить тем, что в быстрых волокнах, входящих в состав GL и VH, происходит инактивация части молекул■Са-АТФазы СПР, что характерно для ' Са-насоса быстрых скелетных мышц, подвергнутых злектростимуляции или физической, нагрузке (Byrd, Bode, Klug, 1989; Leberer, Hartner, Pette, 1987). Увеличение активности Са-насоса СПР GL и VM в течение 2-й недели реадаптации наблюдается, вероятно, из-за неравенства скоростей синтеза и деградации ферментных структур, поскольку известно, что в период реадаптации после гипокинезии-гиподинамии увеличивается скорость синтеза белка, но она гораздо ниже скорости деградации белковых структур в период самой гипокинезии-гиподинамии (Thomason, Herrick et al., 1987).

При обсуждении изменений состояния мышечных волокон как при снятии опорной нагрузки, так • и при ее возобновлении следует учитывать комплексные процессы' синтеза и деградации белковых структур, которые при наложении могут давать сложную картину явлений, что и .наблюдается в данной серии экспериментов:"

3. ТРАНСПОРТ Са2* САРКОПЛАЗИАТИЧЕСКИМ РЕТИКУЛУМОМ МИОКАРДА КРЫ .ПРИ ВЫВЕШИВАНИИ И Б ПЕРИОД РЕАДАПТАЦИИ

Состояние систем мембранного транспорта чрезвычайно важно дл Функционирования сердца. Нарупения транспорта Са2+ предиествув нарушению дефицита макроэргов в миокардиальной мышце и играют рол начального звена в патогенезе сердечной недостаточности. В связи этим были изучены изменения Са-насоса СПР миокарда при вызепивани крыс с 1-х по 40-е сутки, а также в период г^-недельной реадаптаци после 40 сут. вывешивания.

При исследовании динамики активности Са-насоса СПР миокарда пр выверивании выявлено снижение скорости транспорта Са2*-СВР в опытно группе ( 1,11-0,063 нмоль Са2*/мин/мг ткани-) на 33?; по отношению контролю (1,535*0,182) только к 40-м суткам эксперимента, а на боле ранних сроках достоверных изменений скорости аккумуляции Са2* СПР н наблюдалось (рис.7).

нмоль Са+ + /мин/мг ткани

сутки

Рис. 7. Динамика скорости вывешивании крыс с 1-х по вйсстановитель'ный период после Данные контрольных серий обобЦ' (кривая 1). "*" - р < 0.05.

транспорта Са2* СПР миокарда пг 40-е сутки и в г^-недельнь 40. сут. .-вывешивания (кривая 2] |ы с помощью регрессионного гнали:

Термостабильность системы транспорта Са2+ СПР миокарда в группе животных, подвергавшихся -вывешиванию в течение "40 - сут., -не отличается . от контроля,--что свидетельствует об отсутствии изменений конформационнои устойчивости Са-насоса миокарда - в период вывешивания.

Через 4 часа после возвращения крыс . в нормальное положение ■ скорость транспорта Са2+ СПР миокарда <1,364+0,'050 нмоль Са^/мин/мг ткани) выше на 19% по сравнению с величиной, полученной на 40-е сутки вывешивания ( 1. ПО+О .062) , однако, она остается на 202 нихе контрольных величин (1.637+0.073) (р<0,05).

Ш2Э '-ЕЮ ."■" Етез '.'•

. - •у : контроль вывешивание 4 ч реадаптации

• -'. -Рис.- 8. Скорость транспорта Са2+ СПР миокарда в - контроле,, на 40-е . сутки вывешивания и через 4 часа после возобновления опорной

- нагрузки:'на -задние конечности. - р < ^0,05 по отношению к.группе

- контроля,'-.-"**" - Р < 0,05 по отношению к контролю и к группе крыс на . 40-е сутки выверивания. -

■ "'.:■:;■ В',-востановительный период после' 40:сут. вывешивания скорость.

-"транспорта Са2+ СПР. миокарда .бистро-.возвращается к. контрольному

уровню, обнаруживая обратимый характер -.изменений .. активности Са-

насоса СПР- миокарда, вызванных'условиями,вывешивания <рис. 7). Можно

.предположить,' что снижение "транспортной "активности Са-АТФазы • СПР

миокарда при вывешивании крыс происходит вследствие изменения . - 19

гормонального и электролитного баланса в организме, что на клеточное уровне приводит к таким регуляторным сдвигам в функционировании Са-наcoca СПР, которые могут как ингибироватъ Са-АТФазу посредством сопряженных с ней ферментов, в мембране, так и подавлять синтез само? Са-АТФази. •

4. ВЛИЯНИЕ ЛОДРОНАТА НА Са-ТРАНСПОРТИРУЮЩУ» ФУНКЦИЮ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ И МИОКАРДА КРЫС ПРИ.

ВЫВЕШИВАНИИ В ТЕЧЕНИЕ 40 СУТОК.

При нарушении общего баланса кальция в организме в ходе вывешивания наблюдается дефицит макрозргов, в частности, АТФ, чтс может приводить к изменению эффективности функционирования АТФ-' зависимых ферментов, в том числе и Са-АТФазы.. . Поэтому был; предпринята попытка предупреждения изменений активности Са-насос; СПР скелетных мышц и миокарда, вызванных условиями вывешивания, < помощью введения препарата Лодронат, который эффективен при леченш заболеваний связанных с нарушениями Са-баланса в организме (Fleish. 1'939).

Если после 40 сут вывешивания скорость транспорта Cas* СП: икроножной мышцы (in. gastrocnemius lateralis) (6,011*0,281 нмол Са2*/мин/мг ткани) возрастала на. 562- по сравнению . с контроле: (3,791-0,242), то введение Лодроната снимало этот эффект, и значени скорости транспорта Ca2* в группе вывешенных животных при введени препарата достоверно не отличались от интактного■ контроля и о контроля с'введением Лодроната (рис. 9).-

302-ное " снижение скорости транспорта Ca2* .СПР миокарда на 40-'"'сутки. вывешивания предотвращалось введением . Лодроната.-животным находившимся в'условиях вывешивания (рис. 9). г"-

Таким образом,' Лодронат оказывает коррегирующее действие н ' ' 'систему транспорта Ca2* в СПР скелетных мыиц-и миокарда - введени препарата предотвращает изменения Са-насоса СПР, вызванные■действие "' факторов, возникающих при вывешиваниии животных. Учитывая то, чт ■ дифосфонаты снижают концентрацию кальция в плазме крови -и моче пр различных '• нарушениях .кальциевого метаболизма, ' сопровождающихс гиперкальциемиёй, можно, ■■ по-видимому-, ' полагать, -. что влияни " Лодронатана работу Са-насоса 'СПР мышц и миокарда ■ ■. носи '''опосредованный характер за счет нормализации уровня свободного Ca2 ' в организме. :.-•■_.

v ......

mgastrocnemiu3 lateralis

нмоль Са++/мин/мг ткани

плацебо 'АоОронот

• контроль

миокард нмоль Са++/мин/мг ткани 2

плацебо ЛоЭронат Ч22Х вхгпеттэаннс

Рис. 9. Влияние Лодроната на состояние системы транспорта Ca2* СПР п. gastrocnemius lateralis <Л) и миокарда (Б) при 40-суточном вывешивании крыс. "*" - р < 0.05.

В целом полученные нами данные свидетельствуют о том, что система транспорта Са2+- СПР ' скелетных мышц и миокарда зависит'от уровни двигательной активности,' определяется составом мииечных-волокон- и может служить для оценки сократительных свойств мышечной ткани. Эффективность использования' Лодроната для предупреждения' .вызванных условиями вывешивания изменений транспортной функции- СПР показывает, что уровень кальция в организме в целом И в клетке,.в-частности, оказывает • влияние на состояние ферментных систем, вовлеченных в цикл сокращения-расслабления мышечных волокон, при различных уровнях двигательной активности. '-

■ ' ' выводы -■■'.'• . • " ■ ' .' ■

!' .-' 1. Скорость транспорта Са2+ СПР скелетных мышц и миокарда крыс

зависит от уровня двигательной активности, определяется составом

мышечных волокон и моает служить для оценки сократительных свойств'

мышечной ткани. ■

2. Количественные и временные" проявления- воздействия весовой

разгрузки задних конечностей крыс на'Са-насо'с СПР зависят от состава

21

■даО.;;-;.

мышц по типам волокон. Снятие опорной нагрузки приводит к активац) Са-транспортируюцей функции СПР медленных (m. soleus) и смеиант (п.' • ga.strocnemius lateralis и.т. vastus medialis) мышц. В медленш мьгацах увеличение активности транспорта Ca2* СПР .проявляется .первых дней эксперимента с максимальным повышением к 13-14-м сутк; вывешивания. В смешанных мышцах активация транспортной функции CI проявляется к.25-м суткам и достигает максимальных значений к 40-суткам вывешивания.

3. Увеличение скорости транспорта Ca2* СПР мышц смешанного тш (га. gastrocnenius • lateralis) . ,при вывешивании сопровождает! повышением термоустойчивости Са-насоса, что свидетельствует повышении конформационной стабильности молекулы Са-АТФаз1 Устойчивость к нагреванию Са-насоса СПР мышц- медленного типа (i soleus) не изменяется.

4. Быстрое снижение скорости транспорта Ca2* в первые 4 час возобновления опорной нагрузки после 40 сут. вывешивания происход! в СПР смешанных мышц и не наблюдается в СПР медленных..

5. Восстановление Са-транспортируюиих свойств СПР медленш мышцы в течение 2*-недельного периода реадаптации после 40 су-вывешивания происходит плавно до уровня контрольных значений, тог; как динамика восстановления активности Са-насоса СПР смешанных мыг носит, фазовый характер.

б'. Скорость транспорта Ca2* СПР в миокарде снижается только ,.40гм суткам вывешивания и восстанавливается в течение первой неде. .после возврацения крыс в нормальное положение.

7. Препарат Лодронат, применяемый для коррекции нарушен! обмена кальция,' снимает эффекты, оказанные условиями вывешивания, i .. транспортную функцию Са-АТФазы СПР скелетных мышц и Ниокарда.

. . ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ' ■•

1. Метод определения. скорости транспорта Са:

саркоплазмагическим " ретикулумои ' мьгиечных тканей может бы: использован для оценки функциональных свойств мышц животных человека применительно к космическим .. полетам различие продолжительности и в модельных экспериментах. ■-'-

с: ■■ 2. Регистацию скорости транспорта Ca2* саркоплазматическ! ■ 'ретикулумои мышечных тканей рекомендуется проводить непосредствен] -после окончания периода гипокинезии-гиподинамии.

••• -3. Определение транспортной активности ,Са-насс?'

. саркоплазматического ретикулума —рекомендуется ; использовать д'.

эиенн.и эффективности ьктп чес к их средств. направленны;-: на

снижение неблагоприятного г.гляник факторов космического полета.

4. Рекомендуется применение препарата Лодронат при длительной гипокинезии-гиподинамии для регуляции обмена кальция в организме.

список работ. опубликованных по теме диссертации

1. Транспорт Са2* саркоплазматическим ретикулумом скелетных 1ышц крыс при весовой разгрузке задних конечностей. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1993. - N 9. - С. . (Соавторы: ).В.Архипенко, И.А.Попова, Т.Г.Сазонтова, Ф.3.Меерсон).

2. Влияние Лодроната на кальций-транспортирующую функцию :аркоплазматического ретикулума скелетных мышц и миокарда крыс при швешивании в антиоргостатическом положении. // Космич. биол. .994. - N 2. (в печати). (Соавторы: Ю.В.Архипенко, И.А.Попова, ^В.Моруков) .

3. Транспорт Са2* саркоплазматическим ретикулумом камбаловидной ш!11цы крис при весовой разгрузке задних конечностей. // Космич. иол. - 1934. - N 1. (п печати). (Соавторы: Ю.В.Архипенко,

!.А.Попова).

4. Транспорт Са саркоплазматическим ретикулумом камбаловидной ышцы крыс при весовой разгрузке задних конечностей. // Тез. докл. имп. "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной игнализации". - Москва. 23-29 сентября. 1993. - С. 74-75. Соавторы: Ю .В.Архипенко, Н.А.Попова).