Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Стрессорные повреждения ионных насосов миокарда и их адаптационная защита

Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы

На правах рукописи

0 3' 9 2

АРХИПЕНКО Юрий Владимирович

СТРЕССОРНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ИОННЫХ НАСОСОВ МИОКАРДА И ИХ АДАПТАЦИОННАЯ ЗАЩИТА

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

••?./) О /7 (У

/у; ; /X А

Москва - 1992

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии Российской АМН

Научный консультант - доктор мед.наук, профессор Ф.З.МЕЕРСОН

Официальные оппоненты:

доктор мед.наук, профессор П.Ф.ЛИТВИЦКИЙ

доктор биол. наук, профессор И.И.ИВАНОВ

доктор мед. наук, профессор Е.А.ДЕМУРОВ

Ведущее учреждение -

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится 08 апреля 1992 г. в 15.00 на заседании специализированного совета при Университете дружбы народов им. П. Лумумбы (Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8).

С основными работами, опубликованными по теме диссертации, можно ознакомиться в библиотеке Университета дружбы народов им. П. Лумумбы (ул. Миклухо-Маклая, б).

Автореферат разослан 06 марта 1992 года Ученый секретарь специализированного совета

докт.мед.наук, проф. Г.А.Дроздова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последнее десятилетие при изучении цитологических и биохимических механизмов стрессорного повреждения, а также адаптационной защиты от стресса выяснилось, что активация свободнорадикального окисления составляет реальное звено патогенеза стрессорного повреждения, причем объектом повреждения являются прежде всего мембранные структуры клетки и активность мембранно-связанных ферментов. Эти важные положения, установленные исследованиями Ф.З.Меерсона и его сотрудников на уровне сердца, Г.Н.Крыжановского и его сотрудников на уровне головного мозга весьма важны, но вместе с тем оставляют ряд открытых вопросов.

Так например, до недавнего времени не было ясно, какова динамика перекисного окисления липидоз в клетках сердца и мозга в процессе реакции организма в ответ на стрессорную ситуацию. Всегда ли речь идет только об активации свободнорадикального процесса или бывают периоды его торможения. Во многих отношениях неизученным оставался также вопрос об активности при стрессе таких систем транспорта катионов как ^.К-АТФаза плазматической мембраны и Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума сердца. Наконец, вообще не изучался важный вопрос, зависит ли повышение резистентности мембранных систем клетки при адаптации только от антиоксидантной защиты или в этом играют роль другие, не менее важные механизмы, например, резистентность к аутолитическим факторам, повышенным концентрациям внутриклеточного кальция, температуре. До самого последнего времени отсутствовали исследования, в которых были бы сопоставлены механизмы защиты мембранных катион-транспортирующих ферментов сердца при различных формах адаптации, например, к повторным стрессам и периодической гипоксии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. В соответствии с этим цель настоящего исследования состояла, во-первых, в том, чтобы выяснить динамику процесса перекисного окисления липидов в сердце и головном мозге в процесс; развертывания стресс-реакции, а также механизмы нарушения активности мембранных ферментов во время стресса. Во-вторых, установить, как влияет предварительная адаптация к периодической гипоксии и кратковременным стрессорным воздействиям на стресс-индуцируемые нарушения активности Ка,К-насоса плазматической мембраны и Са-насоса саркоплазматического ретикулума и устойчивость этих транспортных систем к свободнорадикальному окислению,

аутолизу и повышенным температурам.

В рамках этой общей цели экспериментально решались следующие конкретные задачи:

1. Выяснить динамику перекисного окисления липидов во время длительного стрессорного воздействия в сердце, мозге и печени; как при этом меняется активность систем катионного транспорта в мембранных структурах миокарда.

2. Провести изучение состояния при стрессе и адаптации к нему устойчивости Ма,К-насоса сарколеммы и Са-насоса саркоплазматического ретикулума к индукции свободнорадикального окисления и повышению температуры.

3. Оценить роль нарушений липидов микроокружения и самих белковых молекул переносчиков в механизме стрессорной инактивации мембранных катионных насосов.

4. Как влияет адаптация к повторным стрессорным воздействиям на активность мембранных Иа.К- и Са-АТФаз миокарда, резистентность этих ферментов к индукции свободнорадикального окисления, высокой температуре и аутолизу?

5. Как влияет адаптация к периодической гипоксии на активность мембранных К- и Са-АТФаз миокарда, резистентность этих ферментов к индукции свободнорадикального окисления, высокой температуре и аутолизу?

6. В какой мере предварительная адаптация к периодической гипоксии и стрессорным воздействиям предупреждает стрессорную инактивацию катионных насосов?

7. Оценить различия в защитном эффекте адаптации к гипоксии и кратковременным стрессам на активность катионных насосов при аутолизе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате проведенной работы установлено, что в раннем периоде длительного иммобилизационного стресса во внутренних органах наблюдается активация перекисного окисления липидов, а в головном мозгу - существенное снижение интенсивности этого процесса. Стресс подавлял активность Ыа,К-АТФазы сарколеммы миокарда, причем предварительное введение животным антиоксиданта предотвращало это явление, что свидетельствовало об участии в нем свободнорадикальных процессов. В мозгу стресс, напротив, приводил к активации Ыа.К-АТФазы, которая играет важную роль в функционировании мозга. В итоге, как у контрольных животных, так и при стрессе складывались реципрокные отношения между уровнем активности Ка,К-АТФазы в плазматических мембранах и содержанием продуктов перекисного окисления липидов в тканях. Впервые показано, что активация перекисного окисления в организме при стрессорной ситуации сочеталась с увеличением эффективности антиоксидантной защиты мозга. Биологическое значение обнаруженного явления состоит в том, что мозг, как орган управления поведением, способен продолжать выполнять свои функции в экстремальных условиях.

Стресс сопровождался снижением активности Са-насоса саркоплазматического ретикулума миокарда - скорости транспорта кальция и, в меньшей степени, активности Са.Мд-АТФазы. Предварительное введение антиоксиданта ионола снижало выраженность эффектов стресса. Таким образом, ингибирование Са-насоса саркоплазматического ретикулума при стрессе в значительной мере является результатом активации перекисного окисления липидов.

В результате адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям активность Са-насоса саркоплазматического ретикулума возрастала. Эта адаптация повышала устойчивость катионных насосов в мембранах миокарда к аутолизу и высоким температурам, а также предупреждала повреждение мембран и утечку кальция из саркоплазматического ретикулума при длительном стрессе. Таким образом, впервые установлено, что известный кардиопротекторный эффект адаптации к повторным стрессам связан со стабилизацией клеточных мембран и мембранных катионных насосов.

При адаптации к непрерывному действию гипоксии (в условиях среднегорья) наблюдалось падение активности антиоксшантных ферментов каталазы и супероксиддсмутазы сердца, печени и мозга, что является предпосылкой для снижения устойчивости организма к действию стресса, активирующего перекисное окисление липидов. Эта своеобразная атрофия от бездействия сопровождалась снижением резистентности сердца к реперфузионным аритмиям. Адаптация к периодической гипоксии в условиях барокамеры, при которой каждый "подъем" завершается реоксигенацией при "спуске", привела к противоположному. результату, а именно, повысила активность каталазы и суперкосиддисмутазы во внутренних органах и устойчивость сердца к реперфузионным аритмиям. Таким образом, впервые показано, что в зависимости от режима адаптации к гипоксии активность антиоксидантной системы сердца может меняться противоположным образом: адаптация к периодической гипоксии повышает ее, а длительное пребывание в условиях горной гипоксии, напротив - снижает.

Адаптация к периодической гипоксии, в отличие от адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям, не ограничивала аутолитической инактивации Са-насоса и утечки ионов кальция из саркоплазматического ретикулума при хранении гомогената, а наоборот - ускоряла эти процессы. Этот факт сооветствует представлению о том, что защита сердца при адаптации к стрессу осуществляется не только за счет антиоксидантной системы , но и благодаря иным факторам.

Адаптация к повторным стрессорным воздействиям и адаптация к периодической гипоксии являются эффективными способами защиты мембран сердечной мышцы и мембранно-связанных катион-транспортирующих ферментов, которые в перспективе могут быть применены в практике. При адаптации к периодической гипоксии эта защита обеспечивается в основном увеличением активности антиоксидантной системы, а при адаптации к повторным стрессам этот

механизм не играет решающей роли и защита определяется иным, не менее мощным механизмом, действующим на уровне клеток.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ работы определяется тем, что в ней впервые показан разнонаправленный характер изменений перекисного окисления лшшдов в мозгу и внутренних органах, а также установлено, что различные формы адаптации повышают резистентность мембранных структур клетки к аутолизу, повышенным температурам или перекисному окислению липидов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ работы определяется тем, что в ней показан мембранопротекторный эффект адаптации к кратковременным повторным стрессорным воздействиям и периодической гипоксии от стрессорных повреждений и сердца и эндогенныхз повреждающих факторов, что может служить основой для развития новых адаптационных методов лечения и профилактики заболеваний человека.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ПРЕДСТАВЛЯЕМЫЕ К ЗАЩИТЕ:

1. Активация перекисного окисления липидов в миокарде при стрессе сочетается с ингибированием работы основных мембранных катионных насосов кардиомиоцитов. При этом снижение концентрации продуктов перекисного окисления в мозге сопровождается активацией Ма/К-насоса плазматических мембран.

2. Основными механизмами индуцируемого свободнорадикальным окислением нарушения транспорта катионов в мембранах являются увеличение проницаемости саркоплазматического ретикулума для ионов кальция и ингибирование Ка,К-АТФазы сарколеммы.

3. Адаптация к кратковременным стрессам или периодической гипоксии способна предотвратить как активацию перекисного окисления липидов в миокарде, так и нарушение работы мембранных катионных насосов.

4. Защитное действие различных форм адаптации характеризуется развитием устойчивости на уровне мембранных структур к перекисному окислению липидов, повышенным концентрациям внутриклеточного кальция, аутолизу и температуре.

5. В основе мембраностабилизирующего эффекта различных форм адаптации лежат в значительной степени различающиеся механизмы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы были доложены и обсуждены на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Международном симпозиуме "Адаптация сердца к гемодинамической нагрузке, тренировке и стрессу" (Тюбинген, ФРГ, 1982), На 1 Всесоюзном семинаре молодых ученых по проблемам молекулярной и клеточной кардиологии (Минск, 1983), Международном симпозиуме "Свободные радикалы и биостабилизаторы" (София, Болгария, 1987), 4 Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), Международном симпозиуме по основным исследованиям пшертензивного сердца (Париж, Франция, 1989), Международной конференции "Регуляция свободнорадикальных реакций - биомедицинские аспекты"

(Варна, Болгария, 1989), Учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов (Москва, 1991) и др.

ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации опубликованы в 1 монографии и 49 печатных работах в отечественных и зарубежных изданиях.

СТРУКТУРА РАБОТЫ: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 7

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ОБСУЖДЕНИЕ. 8

I. Состояние перекисного окисления липидов в органах 3 крысы при стрессе.

II. Нарушения в системе На,К-насоса сарколеммы миокарда 11 при стрессе.

III. Янгибирование Са-насоса саркоплазматического 16 ретикулума миокарда при стрессе.

IV. Адаптационная защита от стрессорных повреждений 22 катионных насосов миокарда.

ВЫВОДЫ (Conclusions) 34

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ 39

ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на самцах крыс Вистар. Эмоционально-болевой стресс [по Ве$1с1ега1о О. а а1., 1974] или иммобилизашгонный стресс (фиксация за 4 конечности в положении на спине) поддерживался в течение б часов. Адаптацию к стрессу проводили путем иммобилизации в течение 1 часа через день в течение 2 недель. Адаптацию к периодическому действию "высотной" пшокс:ш создавали путем ежедневного в течение 4 недель содержания крыс по 6 часов в барокамере при давлении, соответствующем высоте 5000 м над уровнем моря. Адаптацию к непрерывной гипоксии проводили в горах Кавказа (база Терскол) в течение 4 недель.

Изолированные сердца измельчали в ножевом гомогенизаторе "ШЕга-Типгах", а печень и мозг - в гомогенизаторе тефлон-стекло. Транспорт Са"4" саркоплазматическим ретикулумом регистрировали в гомогенате миокарда или в выделенной дифференциальным ультрацентрифугированием мембранной фракции.

9 !

Активность Са-АТФазы регистрировали рН-метрически, скорость транспорта Са" -иономером с Са-селективным электродом, с использованием или рН-

метрически. Активность Ка,К-АТФазы определяли в грубой фракции сарколеммы спектрофотометрически по разности между общей и уабаин-нечувствительной (Mg-зависимой) АТФазами. Активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатиокпероксидазы контролировали спектрофотометрически по опубликованным процедурам. Уровень @-токоферола определяли флуорометрически.

Аутолиз гомогената проводили при 4 или 37°С при постоянном перемешивании. Концентрацию белка в пробах регистрировали по биуретовой реакции, по Лоури или по 4-й производной УФ-спектра.

Липиды ткани или мембранных фракций экстрагировали хлороформ/метанольной смесью. Концентрацию первичных продуктов ПОЛ -диеновых конъюгатов - определяли по отношению оптических плотностей липидного раствора при 232 и 210 нм, а пщропероксидов - методом полярографии на ртутно-капельном электроде; концентрацию шиффовых оснований - флуорометрически при 420 - 440 нм и возбуждении светом 360 нм. Концентрацию тиобарбитурат-реактивных продуктов - по усовершенствованному методу Ohkawa Н. et al. [1979].

Термоденатурацию мембранных фракций проводили в интервале температур 50 - 60°С. Расчет контанты скорости термоденатурации и проведение термодинамического анализа процесса проводили по Hubbard R. [1958] и Johnson F.H. & Eyring Н. [1974]. ЭПР-сигнал спиновых зондов и меток регистрировали на радиоспектрометре Varían Е-4. Перекисное окисление липидов индуцировали системой аскорбат (0,2 мМ) + Fe~+( 10 нмоль/мг белка).

Для электронной микроскопии суспензию мембран саркоплазматического ретикулума фиксировали 2,5%-ным глутаровым диальдешдом и 1%-ным OsO^. Ультратонкие срезы контрастировали' водными растворами уранилацетата и ацетата свинца. При исследовании методом криофрактографии мембраны быстро замораживали в жидком фреоне-22, охлажденном жидким азотом. Скалывание проводили на установке JEOL (Япония); напыление сколотых поверхностей производили платино-углеродной смесью. Ультратонкие срезы и реплики, очищенные стандартными процедурами, просматривали в электронном микроскопе JEM-7A (Япония).

Обработку экспериментальных кривых и статистический анализ проводили на миникомпьютере М-44 ("Olivetti", Италия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Состояние перекисного окисления липидов в органах крысы при стрессе.

В предварительных исследованиях было убедительно показано, что стрессорное воздействие на организм приводит к снижению электрической стабильности сердца, нарушению расслабления и другим функциональным сдвигам в работе миокарда, а также к структурным повреждениям сердца [Воронцова Е.Я. и др., 1980; Меерсон Ф.З. и др., 1980, 1983]. Картина наблюдаемых нарушений позволяла с высокой степенью достоверности предположить, что в их основе лежит повреждение основных мембранных структур, которые обеспечивают, в частности, ионный гомеостаз и электровозбудимые свойства кардиомиошпов. Было также показано, что одним из

эффективных способов защиты сердца от стрессорных повреждений является предварительное введение в организм веществ, обладающих антиоксидантными свойствами [Меерсон Ф.З. и др., 1979]. Эти данные явились серьезным основанием для предположения о том, что активация свободнорадикального окисления является одним из главных факторов повреждения мембран и нарушения нормальной работы сердца при стрессорных воздействиях. В связи с этим мы попытались прежде всего оценить уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в миокарде, сравнить динамику этого процесса в разных органах в ходе стрессорного воздействия, изучить изменение чувствительности тканей к индукции ПОЛ.

В результате анализа продуктов ПОЛ в липидных экстрактах из гомогената сердца в контроле и после б-часового эмоционально-болевого стресса (через 2 часа после его окончания) было показано, что содержание и первичных (гидропероксиды, диеновые конъюгаты), и конечных (флуоресцирующие основания Шиффа) продуктов ПОЛ после стресса существенно возрастает. Полученные данные не оставляли сомнений в том, что активация ПОЛ при стрессе достаточно высока.

Указанные выше способы анализа отражают концентрации отдельных продуктов ПОЛ, однако существует метод интегральной оценки активации ПОЛ в тканях - спектрофотометрическое определение розового хромогена ( А = 535 нм), появляющегося при реакции альдегидов (типа малонового диальдегида, МДА) с 2-тиобарбитуровой кислотой. Как нами показано, в ходе развития процесса ПОЛ между уровнем первичных продуктов, определяемых полярографически и по оптической плотности при 232 нм, и содержанием МДА в биологических мембранах имеется прямопропорциональная зависимость в области концентраций, наблюдаемых ia vivo, что позволило нам в дальнейшем ограничиться регистрацией лишь продуктов атьдегидной природы.

Развитие стресс-реакции - не монотонный процесс и в течение стрессорного воздействия степень его повреждающего эффекта будет отличаться не только на различных временных интервалах, но и в зависимости от наблюдаемой функции, органа, системы. Из результатов определения МДА в гомогенатах различных тканей крысы на разных сроках иммобилизационного стресса следует, что в сердце и печени при длительности стресса до б часов наблюдается активация ПОЛ. Этот факт парадоксальным образом сочетается со снижением более чем в 2 раза уровня продуктов ПОЛ в головном мозге. Оба явления - повышение содержания МДА в печени и сердце и снижение его в мозге - были наиболее выражены посте одночасового стрессорного воздействия, а в дальнейшем (к 12 ч. иммобилизации) исчезали. Иммобилизация свыше 12 ч. сопровождалась нарастанием концентрации МДА во всех исследованных органах без исключения.

Проведенный анализ стационарного уровня продуктов ПОЛ в ткани не позволяет оценить степень готовности антиоксидантных систем к защите от всплеска свободнорадикальных реакций при стрессе, а также подверженность имеющихся в

клетхах субстратов к ПОЛ. Фактически необходимость определения этих показателей диктуется значимостью чувствительности ткани к ПОЛ, эффективности повреждающего действия этого процесса для функционирования органа или системы в условиях стресса. В определенной мере ответы на эти вопросы могут быть получены путем активации ПОЛ в гомогенатах тканей, взятых на различных стадиях стрессорно-го воздействия, экзогенной системой индухции свободнорадикальных реакций. В качестве последней чаще всего используется комбинация аскорбиновой кислоты и - естественных компонентов живого организма [Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И., 1972].

Инкубация гомогенатов сердца, печени и мозга в присутствии системы аскорбат + позволила выявить различную устойчивость органов к

свободнорадикальному окислению. На рис. 1 представлена динамика изменений начальной скорости накопления продуктов ПОЛ в ходе длительного иммобилизационного стресса. Из этих данных следует, что начальная скорость этого

Immobilization stress duration

Rate of MDA formation in rat organs

Time of immobilization, hours

— Heart —i— |_,'ver —A— Erain

Рис. 1. Влияние иммобилизационного стресса различной длительности на начальную скорость накопления малонового диальдегида при индукции ПОЛ.

о I ^

процесса, индуцируемого системой Fe + аскороат, под влиянием одночасового стресса в сердце и печени возрастала в 2,4 - 3,5 раза, а в мозге стресс, напротив, вызывал снижение этого показателя в 2,2 раза.

Важно, что реципрокные отношения между уровнями продуктов ПОЛ in vivo в мозге и внутренних органах были обнаружены в наших экспериментах не только между группами контрольных и перенесших стресс животных, но и индивидуально внутри контрольной группы. У крыс, имевших наиболее высокое содержание малонового диальдегида в печени, его концентрация в мозге была, как правило, наименьшей (коэффициент корреляции г = -0,515).

Отмеченные посте одночасового стресса отклонения скорости индукции ПОЛ от контрольного уровня сохранились и посте б часов стресса, чего нельзя было сказать о стационарном уровне МДА в тканях, что может свидетельствовать о более высокой чувствительности первого из упомянутых тестов. После 12 ч. иммобилизации скорость индукции ПОЛ в гомогенатах всех исследованных тканей одновременно возвращалась к нормальным значениям. Наконец, продолжение иммобилизации вплоть до 24 ч. приводило к ускорению накопления МДА в гомогенатах всех тканей при индукции ПОЛ in vitro системой аскорбат + Fe^+.

Хотя детальный механизм активации ПОЛ в сердце при стрессе пока не изучен, очевидно, что существенными его участниками должны являться фосфолипиды мембран, а также антиоксидантная система клетки, состоящая из ряда ферментных и неферментных механизмов. В связи с этим мы попытались исследовать состояние этих клеточных компонентов в миокарде крыс, подвергшихся стрессорному воздействию. Отмечено, что изменения содержания липидов отдельных классов в миокарде при стрессе не достоверны. Аналогичный вывод следовал и из данных по анализу жирнокис-лотного состава липидов , миокарда крыс до и посте стрессорного воздействия. При изу-чении состояния основных компонентов антиоксидантной системы кардиомиощгтов бы-ло обнаружено, что наибольшим изменениям при стрессе подверглась активность ката-лазы (величина падения составила 32%). Активности супероксиддисмутазы и глутати-онпероксидазы остались без существенных изменений. Важным, на наш взгляд, пред-ставляется снижение уровня липидного антиоксиданта @-токоферола, который, по-видимому, в первую очередь "выгорает" в ходе активации ПОЛ в миокарде при стрессе.

4.2. Нарушения в системе Na,K-Hacoca сарколеммы миокарда при стрессе.

Одним из основных механизмов поддержания мембранного потенциала кардиомиоцитов и обеспечения возбудимости и сократимости сердца является Na,K-насос сарколеммы. Основной его структурный компонент - Na.K-АТФаза, нарушения активности которой могут играть существенную роль в возникновении наблюдаемого при стрессе у животных и людей снижения электрической стабильности сердца и развития фибрилляции желудочков. В связи с этим нами была поставлена задача

выяснить степень повреждения Ыа.К-АТФазы сердца при стрессе и оценить участие в этом процессе стресс-индуцируемой активации ПОЛ.

Как видно из рис. 2, эмоционально-болевой стресс вызывает снижение активности Ка,К-АТФазы сердца крысы на 28%. Активность Mg-ATФaзы остается при этом практически неизменной. Вызванное стрессорным воздействием падение активности Иа.К-АТФазы предупреждалось путем предварительного введения крысам антиоксиданта ионола в дозе 20 мг/кг веса тела. Как показано на рис. 2, в этом случае падение активности Ш,К-АТФазы оказалось существенно менее выраженным (на 13%), чем при стрессе на фоне безионольной инъекции. Поскольку ионол является специфическим антирадикальным агентом и подавляет активацию ПОЛ при стрессе, можно было полагать, что в основе стрессорного нарушения работы Иа.К-насоса лежат свободнорадикальные процессы. Необходимо помнить, что в сферу этих процессов могут вовлекаться практически все основные компоненты клетки: липиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводные заместители и т.д.. Вместе с тем, инактивация гидролитической активности ИаД-АТФазы свидетельствует скорее всего об изменениях в активном центре фермента, которые, между тем, могут быть как прямыми в результате окисления аминокислотных остатков, так и опосредованными конформационными переходами молекулы белка вследствие нарушения липид-

Rat Heart Na,K-Pump

Effects of stress A BHT

NaK-frTPase У////Л Mg-ATPase

Рис. 2. Активность На,К- и 1^-АТФаз в сарколемме из сердца крыс после стрессорного воздействия. Влияние предварительного введения ионола (ВНТ).

Thermal Sensitivity of Na,K-ATPase

Effect of stress and lipid peroxidation

-3.00

белковых взаимодействий в мембране. С целью выявления существования при стрессе модификаций белковой молекулы Na-Hacoca или ее микроокружения мы использовали анализ кинетики термоденатурации фермента. Этот подход позволяет оценить тонкие конформационные изменения белка, которые in vivo могут сказаться на устойчивости фермента к внешним воздействиям, времени жизни молекулы, кооперативных, регуляторных и других ее свойствах [Johnson. F.H. et al., 1974].

Скорость термоинактивации Na.K-АТФазы во фракции сарколеммы, выделенной из миокарда крысы после стрессорного воздействия, оказалась значительно выше, чем у контрольных животных. Результаты анализа кинетики термоинактивации Ха, К-AT Фазы свидетельствуют о том, что во всех представленных случаях процесс термоденатурации фермента следует кинетике реакции первого порядка. Тангенс угла наклона построенных прямых характеризует величины констант термодентатурации (К^). С повышением температуры инкубации К^ монотонно возрастает, однако, при каждой выбранной температуре она выше при стрессе, чем в контроле.

Расчет термодинамических параметров процесса

термоденатурации Ма,К-АТФазы, проведенный на основе графических данных (рис.3), позволил заключить, что в результате стрессорного • воздействия

существенно уменьшается величина Еа и соответственно снижаются величины AS* и /\Н при практически неизменной величине AF* термоденатурации (табл. 1).

Представленные данные позволяют предположить, что в ингибировании Ма,К-АТФазы

миокарда при стрессе существенную роль играет процесс ПОЛ. Следующая серия опытов проводилась в целях выяснения чувствительности Na.K-АТФазы к ПОЛ, а также расшифровки возможных механизмов свободнорадикальной модификации фермента. В экспериментах использовалась грубая фракция сарколеммы из сердца крысы.

Динамика накопления МДА в суспензии везикул сарколеммы из сердца крыс в присутствии Fe-+ и аскорбата существенно не отличается от аналогичных

-3.50

з. оо

3.04 3.0t Temperatute, 10OO/T

Рис. 3. Температурная зависимость Ктд ИаД-АТФазы сарколеммы миокарда в контроле, после стресса и после действия ПОЛ.

данных, полученных ранее на других мембранных структурах, однако начальная скорость окисления достаточно высока (0,9 нмоль МДА/мг белка за 1 мин.), что можно объяснить большим количеством полиненасыщенных жирнокислотных ацилов в фосфолипидах сарколеммы [Nagatomo Т. е1 а1., 1980].

Таблица 1

Термодинамические параметры термоденатурации Ма,К-АТФазы сарколеммы миокарда в контроле, после перенесенного стресса или индукции ПОЛ ¡л у1гто_

Параметр Контроль Стресс ПОЛ

Еа, ккал/моль 75,6+2,3 60,7+2,0" 59,2+1,9"

АН*, ккал/моль 75,0+2,3 60,1+2,0" 58,6+1,9"

Д.5*, кал/моль/град 156,8+0,6 111,3+3,6"" 104,6+1,2""

Др*. ккал/моль 24,4+1,5 23,7+1,9 23,4+2,1

Примечание. " - Р < 0,05; "" - Р < 0,01.

Синхронно пробам на МДА в ходе этой инкубации отбирались аликвоты для определения активности и Mg-ATФaз. Во всех отобранных образцах процесс

ПОЛ останавливался добавлением 1 мкМ ионола и разведением холодной средой инкубации. Было продемонстрировано, что в ходе развития ПОЛ быстро падает активность ИаД-АТФазы (на 50% за 3 мин.), тогда как активность 1»^-АТФазы снижается значительно медленнее. В присутствии антиоксиданта ионола, добавленного перед индукторами ПОЛ, вместе с блокадой процесса ПОЛ стабилизируется и АТФазная активность в везикулах сарколеммы. Аналогичная картина сохранения постоянного низкого уровня МДА и высокой активности Ка,К-АТФазы наблюдается и при инкубации суспензии мембранных везикул в отсутствие индукторов ПОЛ.

Формы кривых, отражающих динамику развития ПОЛ и ингибирования ^,К-АТФазы близки зеркальному отображению одна другой. В целях проверки существования прямой зависимости между этими процессами полученные данные были отложены в координатах АТФазная активность - концентрация МДА. Экспериментальные точки в этих координатах легли на прямую, что свидетельствует о тесной взаимосвязи ингибирования Ма,К-АТФазы с развитием свободнорадикального окисления.

В дальнейших- экспериментах мы попытались выяснить причины ингибирования Иа,К-АТФазы при ПОЛ. Гидролитический центр фермента может модифицироваться в ходе развития свободнорадикальной атаки благодаря двум основным факторам: а) непосредственное окисление аминокислотных остатков активного центра или определяющих его натнвную конформашпо участков полипептидной цепи фермента; б) опосредованная окислением липидного микроокружения и последующим нарушением липид-белкового взаимодействия

конформационная перестройка активного центра фермента. Возможна также комбинация этих двух причин.

В качестве взаимодействий, активных в отношении гидрофобной зоны мембраны, мы применили два подхода. Во-первых, к мембранной суспензии, подвергшейся ПОЛ и потерявшей вследствие этого половину Na.K-АТФазной активности, посте остановки процесса ионолом был добавлен фосфатидилэтаноламин. Если бы ингибирование Na.K-АТФазы было связано с потерей полиненасыщенных липидов вследствие ПОЛ в микроокружении фермента, то введение дополнительных количеств ненасыщенного фосфатидилэтаноламина хотя бы частично реактивировало ИаД-АТФазу, однако активность не менялась'. Во-вторых, к свежевыделенным мембранам была добавлена гидропероксидная фракция фосфатидилэтаноламина, но даже значительные количества гидроперокспдов, превышающие исходное содержание фосфолипидов в мембране, не оказали существенного влияния на активность фермента.

Как хорошо известно из литературных данных [Bertoni J.M., 1982; Schmitz W. et al., 1982], Ка,К-АТФаза весьма чувствительна к действию различных окислителей, не всегда продуцирующих свободные радикалы и не активирующих ПОЛ. В наших опытах даже кратковременная продувка кистородом суспензии мембран, не сопровождающаяся заметным накоплением продуктов ПОЛ, также приводила к потере гидролитической активности фермента. При этом ионол не оказывал защитного эффекта на Na.K-АТФазу. Все эта данные могут свидетельствать о том, что действие ПОЛ на Ка,К-АТФазу не опосредовано модификацией липидной составляющей мембраны, а является следствием неспецифического окисления одной или нескольких существенных групп полипептидной цепи, определяющей работу активного центра фермента.

Следует отметить, что ПОЛ в устовиях различного конформационного состояния активного центра Ма,К-АТФазы не изменило чувствительности фермента к свободнорадикальной окислительной модификации. Столь же малоэффективной оказалась попытка зашиты сульфгидрильных групп белка дитиотреитолом или блокада участия перекиси водорода в процессе с помощью каталазы. Слабое действие этанола и альбумина может свидетельствовать о том, что в ПОЛ-индуцированном иншбировании особую роль играет радикал НО- и аминокислотные остатки, являющиеся его ловушками (гистидин, ароматические группы).

Продемонстрированная высокая чувствительность активного центра Na,K-АТФазы к окисштельной модификации не исключает того, что в процессе индукции ПОЛ подвергаются окислению другие участки полипептидной цепи фермента или липиды в его микроокружении, определяющие оптимальную конформацию белкового комплекса, необходимую для осуществления функций Na-Hacoca. Одновременно необходимо учитывать, что в устовиях компартментализации внутриклеточных процессов активный центр ИаД-АТФазы может быть защищен антиоксидантными

системами. В этом случае повреждение Иа-насоса будет определяться деструкцией отмеченных выше других участков. С целью выявления этих модификаций, приводящих к конформационной нестабильности Ка,К-АТФазы, мы попытались оценить температурную устойчивость белковой молекулы Ыа-насоса на различных стадиях индукции ПОЛ в мембранах сарколеммы миокарда крыс.

После частичного окисления везикул сарколеммы в присутствии системы Ре~+ + аскорбат в течение 6 мин. процесс был остановлен добавлением антиоксиданта ионола, охлаждением и последующим осаждением и ресуспендированием везикул в среде, не содержащей индукторов ПОЛ. По сравнению с препаратом, обработанным аналогичным образом, но без добавки Ре^+ + аскорбата, в полученной фракции активность Ыа.К-АТФазы оказалась сниженной примерно на 20%, а содержание МДА превышало исходное на 3,5 нмоль /мг белка. Динамика снижения активности фермента в ходе термоинактивации при 55° показывает, что скорость термоиндуцированного падения активности ИаД-АТФазы значительно выше в окисленном препарате, чем в контрольном. При этом величины К^ во всем диапазоне исследованных температур выше в образце, подвергшемся ПОЛ (рис. 3). Это сочетается с уменьшением Еа, и /\Н* при сохранении неизменной величины

ДБ*. Данные позволяют заключить, что окислительная модификация сарколеммы сопровождается облегчением конформационных переходов фермента в денатурированное неактивное состояние, причем свойства фермента при этом весьма близки наблюдаемым посте стрессорного воздействия.

Таким образом, даже если прямого ингибирования активного центра фермента не происходит, модификация других фрагментов молекулы или ее микроокружения способствует снижению конформационной устойчивости Ыа,К-АТФазы.

4.3. Ингибирование Са-насоса саркоплазматического ретикулума миокарда при стрессе.

Поддерживая циклические флуктуации активности внутриклеточного Са^+, саркоплазматический ретикулум с встроенным в него АТФ-зависимым Са-насосом обеспечивает ритмические сокращения сердечной мышцы. Картина наблюдаемых нарушений сократительной функции сердца (в частности, нарушение расслабления миокарда) и очаговые контрактуры миокардиальных клеток [Меерсон Ф.З. и др., 1983] позволяют предположить, что важным элементом патогенеза стрессорных повреждений сердца является повышение стационарной концентрации Са в саркоплазме из-за частичной потери саркоплазматическим ретикулумом своих Са-насосных функций. Было показано, что отмеченные повреждения могут быть предупреждены путем введения в организм животного перед стрессорным воздействием антиоксидантов [Меерсон Ф.З. и др., 1979]. Наличие этих данных послужило предпосылкой для выяснения роли Са-насоса саркоплазматического

ретикулума в стрессорном повреждении миокарда и участия ПОЛ в этом явлении. Изучение кинетики накопления и связывания кальция саркоплазматическим ретикулумом, выделенным из миокарда крыс до и после эмоционально-болевого стресса, показало, что как скорость, так и стационарный уровень связанного мембранами кальция после стресса заметно снижаются. Полученные величины этих параметров представлены на рис. 4, где показано также, что введение ионола крысам перед стрессорным воздействием предупреждает повреждение транспорта кальция. На этом рисунке приведены также значения АТФазных активностей тех же мембранных

Rat Heart SR Ca-Pump Effects of stress & BHT

Control Stress BHT BHT-rStress

* - Р<0.05

Рис. 4. Показатели ферментной системы транспорта ионов кальция в мембранах саркоплазматического ретикулума сердца крысы. Влияние стрессорного воздействия и антиоксиданта ионола (ВНТ).

препаратов. Видно, что активность 1^-АТФазы слабо меняется при стрессе, однако активность "истинной" Са-АТФазы после стресса оказалась пониженной.

Эффективность работы ферментной системы транспорта кальция зависит не только от транспортирующей способности Са-АТФазы. но и от свойства везикул ретикилума удерживать во внутреннем объеме накопленный кальций, т.е. от проницаемости мембраны. Увеличение проницаемости мембраны неизбежно приведет к выходу внутривезикулярного кальция и диссипации его трансмембранного градиента. Для ликвидации этой утечки потребуется дополнительное "включение" Са-АТФазы. Если принять, что сопряженность работы Са-насоса, т.е. отношение скорости

накопления кальция к активности Са-АТФазы (Са/АТФ), остается неизменным, то можно рассчитать вклад увеличения проницаемости в снижение Са-транспортирующей способности ретикулума после стресса. Так, в контроле Са/АТФ = 37,2 : 502 = 0,074. Используя этот коэффициент, получаем, что теоретическое значение для скорости накопления кальция посте стресса составляет 0,074 х (активность Са-АТФазы после стресса 359 нмоль Pj на 1 мг белка за I мин.) = 26,6 нмоль Са~+ на 1 мг белка за X мин. Разницу между этим значением и экспериментально полученным 26,6 - 23,1 = 3,5 нмоль на 1 мг белка за 1 мин. можно считать скоростью утечки Са~+ из везикул, обусловленной увеличением проницаемости мембраны саркоплазматического ретикулума в результате стресса.

Полученные данные о накоплении продуктов ПОЛ при стрессе и одновременном повреждении Са-насоса саркоплазматического ретикулума миокарда позволили предположить, что механизмом нарушения транспорта кальция является активация свободнорадикальных процессов. В связи с этим на следующем этапе работы выяснялась взаимосвязь между этими явлениями в модельных экспериментах.

Одним из наиболее распространенных способов моделирования развития процесса ПОЛ в биомембранах является их инкубация с ионами двухвалентного железа и аскорбата. Эта система генерации свободных радикалов вызывает накопление различных молекулярных продуктов ПОЛ [Козлов Ю.П. и др., 1972]. В наших экспериментах при индукции ПОЛ in vitro в мембранах саркоплазматического ретикулума содержание первичных продуктов ПОЛ - гидропероксидов и диеновых конъюгатов - быстро нарастало на начальной стадии процесса и, достигнув максимума к 30 мин. инкубации, медленно спадало; концентрация карбонильных соединений (МДА), вторичных молекулярных продуктов ПОЛ. неуклонно возрастала в ходе 120-минутной инкубации; уровень более поздних продуктов ПОЛ - флуоресцирующих шиффовых оснований - незначительно изменялся в течение первых 30 мин. инкубации, после которых начинался заметный прирост их концентрации. Ингибиторы свободно-радикального окистения липидов ионол и @-токоферол предотвращали накопление в мембранах саркоплазматического ретикулума продуктов ПОЛ всех типов.

При анализе липидного состава мембран методом тонкослойной хроматографии показано, что два основных компонента бислоя мембраны саркоплазматического ретикулума в разной степени подвергаются ПОЛ: содержание фосфатидилхолина изменяется незначительно, в то время как количество фосфатидилэтаноламина быстро снижается. Одновременно существенно увеличивается пятно полярных и полимерных производных фосфолипидов, остающихся при разделении на старте хроматограммы. Следует отметать, что пятно фосфатидилэтаноламина в ходе процесса ПОЛ все более размывается и образует характерный "хвост" полярных продуктов. Учитывая, что фосфатидилэтаноламин

является наиболее ненасыщенным из фосфолипидов саркоплазматического ретикулума [Магрла 3., 1975], его предпочтительное окисление становится вполне объяснимым.

Жирнокислотный состав мембран саркоплазматического ретикулума при индукции ПОЛ претерпевает естественные изменения: наблюдается потеря полиненасыщенных жирных кислот, в результате которой среднее число двойных связей падает с 1,47 в контроле до 0,97 через 1 час посте начала ПОЛ.

Генерируемые в ходе ПОЛ активные формы кисторода, радикальные интермедиаты, бифункциональные реагенты типа МДА могут взаимодействовать с белковыми компонентами биомембран. Действительно, как показано методом электрофореза, в ходе ПОЛ уменьшается количество мономерных форм полипептидов в мембране: Са-АТФазы (105 кД) и Са-связывающих белков (46 и 55 кД). Одновременно регистрируется появление продуктов их полимеризации. Количество модифицированного белка зависит от времени инкубации и коррелирует с концентрацией МДА.

Одним из следствий нарушения межмолекулярных взаимодействий в мембране является изменение ее структурной организации. Обнаруженные нами изменения липидного и белкового составов мембраны саркоплазматического ретикулума закономерно проявляются на ультраструктурном уровне: при электронной микроскопии суспензии везикул саркоплазматического ретикулума отмечена их фрагментация, в результате чего диаметр мембранных пузырьков уменьшался с 1200 + 160 А в контроле до 540 ± 50 А при накоплении 25 нмоль гидропероксидов/мг липидов. Хотя замкнутость модифицированных везикул сохранялась, трехстойность мембраны становилась менее определенной, происходило увеличение толщины мембраны на 20 - 30%. При изучении мембраны саркоплазматического ретикулума методом криофрактографии обнаружено, что присутствующие на вогнутых поверхностях сколов везикул внутримембранные частицы диаметром около 80 А, соответствующие липопротеидным комплексам Са-АТФазы, практически полностью исчезают посте индукции в мембранах ПОЛ.

Активация ПОЛ в везикулах сархопллзматичесхого ретикулума системой Ре~+ + аскорбат сопровождается значительными нарушениями работы Са-насоса. В частности, заметно снижается эффективность работы Са-насоса (количество переносимых ионов кальция на 1 молекулу затраченного АТФ, Са/АТФ). Степень выявленных нарушений зависит как от времени индукции ПОЛ, так и от концентрации продуктов ПОЛ. Однако, в отличие от Ка,К-АТФазы, концентрационная зависимость повреждения Са-насоса от продуктов ПОЛ является не прямой, а более сложной Б-образной. Полное инпширование транспорта кальция наступает при накоплении в мембранах 10 - 13 нмоль гидропероксидов/мг липидов.

Снижение эффективности работы Са-насоса саркоплазматического ретикулума при ПОЛ имеет в своей основе увеличение проницаемости мембран для ионов Са. Этот вывод может быть сделан на основании экспериментов с мембранными

везикулами после их предварительной "загрузки" кальцием: скорость пассивного выхода кальция из везикул оказалась значительно выше посте индукции ПОЛ в мембранах.

Изучение температурной зависимости эффективности работы Са-насоса показало, что при ПОЛ происходит смещение в низкотемпературную область точек термоиндуцированного резкого снижения величины Са/АТФ (в области 40°С). Можно полагать, что в результате накопления в мембране и, соответственно, в микроокружении Са-АТФазы продуктов ПОЛ происходит модификация и/или нарушение температурной чувствительности фермента. Это сопровождается таким нарушением липид-белковых взаимодействий, в результате которого возрастает проницаемость мембран для кальция.

Причиной увеличения ионной проницаемости мембран может являться модификация сульфгидрильных групп мембранно-связанных белков. Действительно, при титровании мембран саркоплазматического ретикулума с помощью ДТНБ установлено, что накопление продуктов ПОЛ в мембранах сопровождается снижением количества титруемых БН-групп с б до 3 моль в пересчете на 1 моль белка с Мг = 105 кД.

Значительно меньшей чувствительностью к развитию процесса ПОЛ в мембранах саркоплазматического ретикулума по сравнению с Са-транспортирующей способностью обладает гидролитическая активность Са-АТФазы: только через несколько часов инкубации мембран в присутствии генераторов ПОЛ наблюдается падение активности фермента.

Анализ температурных зависимостей активности Са-АТФазы в образцах СР, подвергшихся индукции ПОЛ в различной степени, показал, что на ранних стадиях процесса активность фермента заметно снижается в низкотемпературной области и мало отличается от контроля в области высоких температур (35° - 50°). При этом если при температурах ниже 20° уменьшение активности Са-АТФазы происходит без изменения величины энергии активации (Еа = 25 ккал/моль), то в области температур выше точки излома накопление продуктов ПОЛ приводит к увеличению Еа скорости гидролиза АТФ (от 14 в контроле до 16 и 19 ккал/моль при содержании МДА соответственно 2, 13 и 18 нмоль на 1 мг липидов). На более поздних стадиях ПОЛ даже при относительно высоких температурах активность Са-АТФазы остается существено ниже, чем в контроле. Следствием неравноценности изменений Еа в области высоких и низких температур при индукции ПОЛ является исчезновение точки излома графика Аррениуса активности Са-АТФазы. На поздних стадиях ПОЛ график представляет собой прямую линию с Еа = 23 - 25 ккал/моль.

При анализе температурной зависимости нативного препарата саркоплазматического ретикулума было обнаружено, что в области выше 50° наблюдается быстрое падение активности Са-АТФазы. Это падение сопровождается помутнением суспензии и является необратимым, что позволяет сделать заключение о

термоденатурации фермента. По мере развития процесса ПОЛ точки быстрого падения активности (термоденатурации) Са-АТФазы смещаются в область более низких температур по сравнению с контролем.

Одним из наиболее эффективных подходов к оценке модифицирующих эффектов ПОЛ на молекулярную организацию липидов и белков в биологических мембранах является использование ЭПР-спехтроскопии спиновых зондов и меток. В настоящей работе состояние липидной фазы мембраны саркоплазматического ретикулума оценивали с помощью трех спиновых зондов, локализующихся на разной глубине фосфолипидного бислоя. Анализ ЭПР-спектров 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила (I) в мембранах позволяет рассчитать долю жидкой высокоподвижной гидрофобной фазы в ядре бислоя мембраны. Локализация спиновой метки амидного производного пальмитиновой кислоты (II) в полярной области мембраны представляет возможность выяснить подвижность гидрофильных поверхностных участков фосфолипидных молекул. Наконец, оксазолидиновое производное пальмитиновой кислоты (6:10, III), спиновая группа которой чувствительна к изменению подвижности фосфолипидов на участке их ацильного фрагмента, приближенном к полярной области, позволяет получить данные как о текучести мембраны на периферии гидрофобного слоя, так и о гидрофобно-гидрофильном балансе липидной фазы мембраны.

Величина параметра солюбилизации @ зонда I фактически отражает коэффициент распределения зонда между водным раствором и жидкой частью липидной фазы мембраны. Рост содержания продуктов ПОЛ от 1,6 в контроле до 16,5 нмоль МДА /мг белка сопровождается монотонным снижением способности мембраны саркоплазматического ретикулума включать зонд I в гидрофобную фазу. На начальных стадиях ПОЛ этот эффект особенно отчетливо заметен в низкотемпературной области, а по мере накопления в мембранах свыше 10 нмоль МДА/мг белка солюбилизируюшая зонд I способность саркоплазматического ретикулума снижается во всем исследованном диапазоне температур. Таким образом, происходит снижение температурной зависимости параметра @ при ПОЛ, которое может отражать как уменьшение мембранной текучести, так и увеличение полярности центральной гидрофобной области мембраны. Вместе с тем, смещение точек изломов аррениусовских графиков @ в область низких температур безусловно свидетельствует о том, что в результате ПОЛ наблюдается уменьшение подвижности концевых фрагментов ацильных цепей фосфолипидов.

Существенные изменения при ПОЛ обнаружены и в полярной области мембраны. Анализ времени корреляции зонда III, рассчитываемого по параметрам его ЭПР-спектра, а также температурной зависимости времени корреляции, позволяет заключить, что в результате ПОЛ происходит ограничение подвижности гидрофильных фрагментов в молекулах фосфолипидов мембраны саркоплазматического ретикулума. Снижение параметра упорядоченности (S) зонда II происходит во всем диапазоне

температур. Это свидетельствует, что полученные со всеми тремя спиновыми зондами данные коррелируют друг с другом и в целом отражают уменьшение мембранной текучести по всей толщине липидного бислоя мембраны саркоплазматического ретикулума.

Однако представленные в описанной серии экспериментов со спиновыми зондами данные позволяют оценить лишь некий интегральный показатель молекулярной подвижности в гидрофобной зоне липид-белкового комплекса мембраны саркоплазматического ретикулума. Этот показатель определяется не только степенями свободы различных участков молекул фосфолипидов самих по себе, но и их участием во взаимодействиях с мембранно-связанными белками, которые, как известно, вносят существенный вклад в стабилизацию структуры мембраны. Для вычленения белок-зависимого вклада в мембранную текучесть мы использовали экстракцию мембранных липидов и анализ их подвижности в сформированных в водной среде липосомах. Полученные с использованием зондов I и II параметры мембранной текучести в липосомах в дальнейшем вычитались из интегральных показателей мембраны саркоплазматического ретикулума. Оказалось, что липосомы, сформированные из экстрагированных липидов, обладают существенно большей мембранной текучестью. Эти данные позволяют провести оценку распределения липидов по трем областям мембраны саркоплазматического ретикулума с различной молекулярной подвижностью (жидкие липиды бислоя; упорядоченные липиды бислоя - кластеры; липиды, находящиеся в контакте с Са-АТФазой). Установлено, что по мере накопления МДА в мембране уменьшается количество жидких липидов в бислое и липидов, взаимодействующих с Са-АТФазой, тогда как резко возрастает доля упорядоченных липидов в бислое.

IV. Адаптационная защита от стрессорных повреждений катионных насосов миокарда.

Как было показано ранее, вызванные стрессом нарушения ряда функциональных характеристик сердца могут быть предупреждены путем адаптации организма к неблагоприятным факторам внешней среды [Hearse D.I., 1981; Меерсон и Пшенникова М.Г., 1988]. Одним из таких факторов являются кратковременные стрессорные воздействия.' Важно было установить, участвуют ли в возникновении адаптационной устойчивости миокарда к стрессу мембранные структуры кардиомиоцитов, в частности, их катионные насосы. В соответствии с этим на следующем этапе нашей работы было проведено сравнение изменений активности Na-насоса сарколеммы миокарда при стрессе, адаптации к коротким стрессорным воздействиям и стрессе после адаптации.

Полученные данные свидетельствуют, что адаптация в виде 7 одночасовых эмоционально-болевых воздействий через день сопровождается незначительным снижением Ка,К-АТФазной активности. Вместе с тем, проведенный посте такой адаптации длительный стресс уже не приводит к существенному падению активности фермента, как это имело место при стрессе без предварительной адаптации.

Выше было показано, что стресс-индуцированное изменение активности Ка,К-АТФазы наблюдается одновременно со снижением конформационной стабильности фермента, оцениваемой по кинетике его термоденатурации (см. стр. 13). Результаты анализа термоинактивации Ыа,К-АТФазы в стучае адаптированных животных показывают, что многократные короткие стрессы сами по себе почти не меняют термоустойчивость Ка,К-АТФазы, но предупреждают ее падение, вызванное стрессом большей длительности (рис. 5). Данные термодинамического анализа

Thermal Inactivation of Na,K-ATPase

Effects of stress & adaptation to stress

'5 о

Ъ.

a.

a

£

с 'g

CL —

О £

з ®

a Я Q.

I-<

Рис. 5. Влияние стресса и адаптации к кратковременным стрессам на динамику термоинактивации ИаД-АТФазы в сарколемме миокарда крыс.

процесса термоденатурации фермента в этой серии экспериментов также свидетельствуют о защитном эффекте адаптации на стресс-индуцированное падение конформационной стабильности Ка-насоса сарколеммы миокарда.

Time of incubation, min

Необходимым звеном внутриклеточной адаптации следует считать систему кальциевого гомеостаза клетки. Ее участие в адаптивном ответе миокарда мы исследовали на примере Са-транспортирующей способности саркоплазматического ретикулума. В этой серии опытов активность Са-насоса саркоплазматического ретикулума определялась в гомогенате миокарда крысы. Одновременно регистрировалась исходная концентрация свободного кальция, а также динамика ее роста и падения Са-транспортирующей способности в ходе аутолиза (хранение при 4°С) гомогената. Показано, что концентрация свободного цитоплазматического кальция в гомогенате сердца наибольшая в группе, подвергшейся стрессорному воздействию.

Падение концентрации кальция в среде в ходе инкубации, обусловленное его АТФ-зависимым захватом везикулами саркоплазматического ретикулума, происходит при стрессе значительно медленнее, чем в контроле, тогда как после адаптации - быстрее. При этом важно отметить, что при увеличении концентрации кальция в среде от физиологической к более высокой разница между скоростями транспорта кальция в саркоплазматическом ретикулуме миокарда после стресса и после адаптации не только сохраняется, но и нарастает (рис. б). Это показывает, что адаптированные животные оказываются более устойчивыми к таким повреждающим воздействиям, которые приводят к избыточным концентрациям кальция в саркоплазме. В этом смысле обнаруженный защитный эффект адаптации от последующего острого стресса можно рассматривать лишь как частный отучай защиты миокарда' от повреждающих факторов путем адаптации к коротким стрессорным воздействиям. Как видно, проведение стресса у адаптированных животных существенно не меняло концентрацию свободного кальция и скорость его поглощения саркоплазматическим ретикулумом. Кинетический анализ процесса транспорта кальция в везикулах позволил получить величины Кэд и Vmax, которые свидетельствуют, что основные различия между группами заключаются в изменении сродства фермента к кальцию, а не в скорости работы Са-насоса. Так, К^ при адаптации почти вдвое ниже, чем при стрессе, тогда как Vmax почти не различаются.

Полученный в данной серии экспериментов результат об ингибировании Са-насоса в гомогенате сердца при стрессе сравним с приведенными выше данными, обнаруженными на изолированной фракции саркоплазматического ретикулума миокарда животных, подвергшихся эмоционально-болевому стрессу (рис. 4).

Механизмы стрессорного повреждения Са-насоса миокарда, связанные с активацией ПОЛ в этих мембранных структурах, подробно рассмотрены нами ранее (см. раздел III), поэтому в данной главе обратим внимание на одно из важнейших следствий этого явления - повышение концентрации цитоплазматического кальция при стрессе. Полученные результаты свидетельствуют о том, что содержание кальция в саркоплазме кардиомиоцитов после стресса возросло на 25% по сравнению с контрольным миокардом (напомним, что изолированные сердца замораживались в

Calcium Transport in SR

Dependence upon calcium concentration

30

с '3 о

w

а

а

с

5 20

с 1

0 а а с а

U

1

а О

10

о Control

Strat*

0.00

--------3

0.50

1.00

1.50

2.00

Calcium concentration, jjM

Рис. 6. Зависимость скорости транспорта кальция саркоплазматическим ретикулумом сердца от концентрации СаС12 в среде инкубации после

предварительного стрессам.

стрессорного воздействия и адаптации к коротким

□

жидком азоте в состоянии диастолы). Если учесть, что при физиологическом сокращении концентрация кальция в саркоплазме возрастает на 2 - 3 порядка, то станет ясно, почему при стрессе в первую очередь будет изменяться не столько сила сокращения миокарда, сколько (благодаря появлению дополнительного кальция в диастоле) степень его расслабления, а также скорость расслабления (последнее за счет снижения скорости удаления кальция, индуцирующего систолическое сокращение, системой Са-насоса саркоплазматического ретикулума). Прирост концентрации кальция в саркоплазме может быть связан не только с потерей эффективности Са-насоса саркоплазматического ретикулума - определенный вклад могут вносить выход кальция из митохондрий и вход через сарколемму. Однако, проведенные на стр.18 расчеты о появлении в саркоплазматическом ретикулуме Са-проницаемости после стресса (достигающей 10% от скорости его транспорта внутрь везикул) говорят о значительном вкладе этих мембран в создание избыточной концентрации кальция в саркоплазме.

Существенные различия были выявлены между группами и в ходе хранения гомогената при 4° С. Происходящий при этом аутолиз быстрее всего повреждает образцы миокарда после стресса: в гомогенате нарастает концентрация свободного кальция, а скорость транспорта Са^+ падает. Большей, чем контроль, стабильностью обладают по этим показателям образцы, полученные у адаптированных крыс. Так, если исходно скорость транспорта при стрессе составляет 90% от контрольного значения, то через 3 дня хранения эта величина не превышает 17%, причем к 4-му дню транспорт в стрессорном образце пропадает совсем. В группе адаптации непосредственно после гомогенизирования скорость транспорта составляла 119% от контроля, а к 4-м суткам хранения эта величина возрастала до 290% от контроля . Повышенной стабильностью при хранении отличались и гомогенаты миокарда крыс, подвергшихся стрессу после адаптации.

Итак, вместе со стрессорными повреждениями Са-насоса саркоплазматического ретикулума наблюдается ускорение его инактивации при хранении гомогенагов. Можно полагать, что эта инактивация обусловлена, по крайней мере отчасти, теми же причинами, что и стрессорное ингибирование Са-насоса. Действительно, при стрессе и при аутолизе существенную роль играет активация одних и тех же внутриклеточных факторов разрушения клеточных структур: активация фосфолипаз, ПОЛ, лабилизация лизосом и освобождение протеаз [Меерсон Ф.З., 1983]. Понятно поэтому, что стресс не только приводит к депрессии функции Са-насоса и становится причиной таких прижизненных феноменов, как увеличение содержания кальция в саркоплазме, падение порога фибрилляции сердца и постстрессорной ригидности сердечной мышцы, но также является причиной активации аутолитических процессов в миокарде.

Адаптация не только увеличивает эффективность работы Са-насоса, но и приводит к стабилизации этого мембранного механизма по отношению к эндогенным факторам деградации.

Следует отметить, что ранее защитный эффект адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям был обнаружен при адренергических, ишемических и реперфузионных аритмиях [Меерсон Ф.З. и др., 1988], т.е. на моделях, существенным звеном патогенеза которых является избыток кальция в саркоплазме. Этот защитный эффект также проявляется при перфузии изолированного сердца или папиллярной мышцы гипонатриевым раствором, приводящей к прямой перегрузке кальцием и контрактуре кардиомиоцитов. Естественно, что во всех отмеченных случаях активация механизмов удаления кальция из саркоплазмы окажет антиаритмическое и противоконтрактурное действие. По-видимому, в этом и состоит основной механизм адаптационной защиты миокарда.

Полученные сведения об адаптационном увеличении стабильности Са-насоса саркоплазматического ретикулума по отношению к эндогенным повреждающим факторам также важны для понимания защитного эффекта адаптации. Дело в том, что

причиной адаптационной стабилизации миокарда может быть снижение уровня внутриклеточного свободного кальция за счет активации транспорта в мембранные структуры. Учитывая, что кальций является индуктором практически всех эндогенных повреждающих факторов, снижение его концентрации при адаптации замедлит катаболические процессы. Кроме того, при адаптации возможен биосинтез специальных стабилизирующих молекул или ингибиторов деградирующих ферментов, на роль которых, в частности, могут претендовать белки теплового шока, функция которых в организме млекопитающих пока не ясна. Эти предположения открывают перспективы дальнейшего углубления исследований в области механизмов адаптационной стабилизации внутриклеточных структур.

Одной из основных причин нарушения работы катионных насосов мембранных структур миокарда при стрессе, является активация ПОЛ. Возникает вопрос, проявляет ли адаптация к стрессорным воздействиям свой защитный эффект и на уровне свободиорадикальных реакций? Судя по полученным нами данным, на этот вопрос следует ответить положительно. Действительно, тяжелый эмоционально-болевой стресс приводит к накоплению продуктов ПОЛ и снижению устойчивости ткани к индукторам ПОЛ. Мягкое адаптационное воздействие кратковременных стрессов не изменяет чувствительности миокарда к ПОЛ, вследствие чего скорость накопления продуктов ПОЛ не отличается от контроля. Однако, у адаптированных животных стресс уже не вызывает существенного роста чувствительности к ПОЛ. Следует также заметить, что исходное содержание малонового диальдегида в

Таблица 2

Активность ферментов антиоксидантной защиты и содержание @-токоферола при стрессе, адаптации к коротким стрессорным воздействиям и при стрессе на фоне адаптации._

Показатель Контроль Стресс Адаптация Адаптация +стресс

Активность каталазы, 1.82+0.11 1.47+0.18* 2.52+0.27 * 1.96+0.21

ммоль/НтОт/г ткани за 1 мин.

Активность супероксиддисмутазы, 58.7+2.1 56.1+2.1 67.9+6.5 64.0+2.5

усл.ед./г ткани за 1 мин.

Активность глутатионпероксидазы, 19.2+0.6 18.7+0.4 19.0+0.7 19.4+0.2

мкмоль ХАБРН/г ткани за 1 мин.

Содержание ©-токоферола, 66.7+2.1 63.4+4.3 64.5+2.9 67.8+2.6

мкг/г ткани

Примечание. * - Р < 0,05 по сравнению с контролем.

Antioxidant aniyma» 4 MDA In rat tltaoa« Etttet* ol »o*eution to n/poxi«

• - P<0.08: •• - P<0.01

Рис. 7. Активность антиоксидантных ферментов и уровень малонового диальдегида в тканях сердца, печени и мозга крыс в контроле и после адаптации к непрерывной и периодической гипоксии. SOD - супероксиддисмутаза, MDA малоновый диальдегид.

гомогенате миокарда у адаптированных животных и у животных, подверппих-ся стрессу после адаптации, практически не отличается от контроля.

Как отмечалось выше, существенным фактором, определяющим развитие реакций свободнорадикаль-ного окисления в организме, является активность

антиоксидантных ферментов. В связи с этим естественной явилась оценка участия каталазы,

супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в эффекте повышения

устойчивости к ПОЛ миокарда адаптированных к стрессу крыс. Полученные на этот счет данные приведены в табл. 2. Как видно, наиболее лабильной из исследованных ферментов антиоксидантной защиты оказалась каталаза,

активность которой I результате длительного стресса снизилась на 20%, г после адаптации к короткиг. стрессорным воздействиям ■ повысилась на 35% ш отношению к контролю Соответственно, стресс ; адаптированных животны: не привел к существенны!

сдвигам в активности каталазы. Из другах ферментов лишь супероксиддисмутаза имеет тенденцию к росту активности (на 16%) у крыс, адаптированных к стрессу, тогда как активность глутатионпероксидазы достоверно не менялась во всех сериях опыта.

Одним из чрезвычайно интересных с позиций патофизиологии фактов является эффект так называемой перекрестной адаптации. Это явление заключается в приобретении организмом защитной реакции к повреждающему действию внешнего фактора после адаптации к другому фактору. Конкретным примером может служить отсутствие стресс-индуцированных нарушений работы сердца у крыс, адаптированных к периодическому действию пгаобарической гипоксии [Меерсон Ф.З. и др., 1987]. Если в основе этого эффекта также лежит регуляция свободнорадикальных процессов, то при анализе содержания продуктов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов должны были выявиться изменения, сходные с наблюдаемыми при адаптации к коротким стрессорным воздействиям.

На рис. 7 представлены результаты анализа уровня продуктов ПОЛ и ферментов антиоксидантной защиты в миокарде крыс, адаптированных к прерывистой гипобарической гипоксии. Данные демонстрируют, что после адаптации активности каталазы и супероксиддисмутазы оказались повышенными. Соответственно, содержание продуктов ПОЛ не только не возросло, но оказалось даже ниже значений, отмеченных у неадаптированных животных. Подобное соотношение между концентрацией продуктов ПОЛ и активностью антиоксидантных ферментов обнаружено нами в' миокарде левого и правого желудочков: у менее интенсивно снабжаемого кислородом правого желудочка содержание диеновых конъюгатов и шиффовых оснований оказалось выше, а активность ферментов антиоксидантной защиты. - ниже, чем у левого желудочка, отличающегося повышенным уровнем энергообмена. Итак, как и в случае с адаптацией к коротким стрессорным воздействиям, адаптация к периодической гипоксии привела к активации каталазы, что, по-видимому, является необходимым компонентом повышенной устойчивости миокарда к повреждающему действию последующего стресса. Действительно, стресс у адаптированных к прерывистой гипоксии животных, в отличие от неадаптированных, не приводит к накоплению продуктов ПОЛ, т. е. налицо защитный эффект, обнаруженный ранее на физиологическом уровне.

Вместе с тем, адаптация к периодической гипоксии обладает и существенными отличиями от адаптации к кратковременным стрессам. Это было обнаружено в следующих экспериментах по оценке устойчивости Са-насоса саркоплазматического ретикулума к внутриклеточным повреждающим факторам. На рис. 8А представлены значения скорости транспорта кальция в гомогенатах сердец контрольных и адаптированных животных. Активность Са-насоса посте адаптации к периодической кратковременной гипоксии оказывается на треть выше, чем в контроле. Вместе с тем, содержание кальция в миокарде в обеих сериях не различается.

С помощью кинетического анализа свойств ферментов можно попытаться выяснить причины повышения скорости транспорта кальция при адаптации. В этих целях была проведена оценка скорости транспорта при различных исходных концентрациях кальция в гомогенате, достигаемых путем предварительной добавки в среду инкубации стандартного раствора СаС^- Полученные данные показывают, что во всем диапазоне исследованных концентраций кальция активность Са-насоса после адаптации выше, чем в контроле, однако форма кривой (монотонный рост- активности при увеличении концентрации кальция; значительное падение чувствительности Са-насоса к кальцию при концентрации выше 10 мкМ) в обеих сериях одинакова. После представления этих данных в координатах Лайнуивера-Берка были получены величины K^j и Vmax. Их сравнение показывает, что адаптация приводит к снижению значений К^ и увеличению Vmax , что может быть интерпретировано как рост сродства фермента к кальцию при некотором увеличении числа молекул Са-насоса в мембранах саркоплазматического ретикулума.

Обсуждая вопрос о механизмах увеличения активности Са-насоса в результате адаптации к периодической гипоксии, можно высказать три взаимодополняющих предположения. Одно из них, как указывалось выше, состоит в том, что в результате адаптации к периодической гипоксии увеличивается количество молекул Са-насоса в мембранах саркоплазматического ретикулума. Это согласуется с данными о том, что при большинстве форм адаптации происходит биосинтез функционально активных белков различных метаболических звеньев кардиомиоцита [Явич М.П. и др., 1976; Bastian С., 1978]. Другое предположение касается роста сродства Са-насоса к кальцию. На роль регуляторов, обеспечивающих этот эффект, могут претендовать как известные эндогенные модуляторы Са-АТФазы, так и вновь синтезируемые при адаптации молекулы. Наконец, третье предположение вытекает из факта, что при адаптации к гипоксии повышена эффективность энергообеспечения функции сердца, увеличена концентрация миоглобина, активность креатинкиназы, пируваткиназы, гексокиназы и т.д. [Лукьянова Л.Д., 1984]. Это может положительно влиять на активность Са-насоса, который в процессе своей работы использует АТФ.

На следующем этапе при изучении устойчивости к эндогенным повреждающим факторам была исследована динамика активности Са-насоса при хранении гомогената сердца в различных температурных режимах. На рис. 8А показано изменение активности Са-насоса в ходе хранения гомогената при 4° С. Видно, что падение скорости транспорта кальция в ходе аутолиза происходит быстрее в образцах адаптированных к гипоксии животных, чем контрольных. Более очевидным этот вывод становится после представления результатов в процентах к исходной активности (рис. 8В). Необходимо отметить, что отсутствие различий по содержанию свободного кальция в миокарде сохраняется и при аутолизе, несмотря на существенный рост этого показателя в процессе хранения в обеих сериях (рис. 8А).

Ca-pump activity during autolysis Effect of hypoxic adaptation

0.00

A

2

3

1

о a О

Ca-oump activity deer«»«« 4tn My оt лигЫуи»

Incubation time, days

- P « 0.01

В

t

3

Рис. 3. Влияние адаптации к периодической гипоксии на показатели кальциевого метаболизма в сердце крысы в течение аутолиза.

А - Падение активности Са-насоса саркоплазматического ретикулума и увеличение содержания свободного кальция в ходе хранения гомогената миокарда при 4°С. В - Снижение активности Са-насоса за 4 суток хранения, выраженное в процентах к исходной скорости транспорта

На рис. 9А (сплошные линии) представлены результаты анализа скорости транспорта кальция в ходе проведения аутолиза при 37° С. Сопоставление этих данных с представленными на рис. 8 показывает возможность значительного снижения времени проведения аутолиза путем повышения температуры до 37° С; при этом качественные различия между сериями сохраняются: после адаптации к гипоксии устойчивость Са-насоса к аутолизу падает.

Одним из важных факторов как аутолитической деградации тканей, так и патогенеза стрессорных и ишемических повреждений является перекисное окисление липидов [Козлов Ю.П., 1973; Джафаров А.И., 1981; Кадап У.Е., 1990]. В связи с этим в данном исследовании мы попытались оценить изменения устойчивости Са-насоса саркоплазматического ретикулума сердца к индукторам свободнорадикального окисления при адаптации к гипоксии. Для этого к инкубируемым при 37° образцам гомогенатов добавляли РеБО^ и аскорбат. Кривые на рис. 9А показывают, что в результате активации свободнорадикального процесса скорость транспорта кальция в контроле падает на величину, почти вдвое большую, чем при адаптации (более

демонстративно этот результат представлен на рис. 9В). Иными словами, адаптация к гипоксии повышает устойчивость Са-насоса к индукторам свободнорадикального окисления. Следовательно, потенциирующий эффект адаптации на инактивацию Са-насоса при хранении гомогената предположительно может быть связан с другими повреждающими факторами: протеазами, фосфолипазами и т.д.

Каков возможный механизм, за счет которого возникает обнаруженное в нашей работе адаптационное увеличение резистентности Са-насоса саркоплазматического ретикулума к индукции свободнорадикального окисления? Ответ на этот вопрос вытекает из ранее приведенных данных о влиянии адаптации к периодической гипоксии на активность антиоксидантных ферментов (см. рис. 7). При такой адаптации дефицит кислорода, возникающий при каждом "подъеме" в барокамере, при спуске сменяется умеренной реоксигенацией. 30 - 35 таких реоксигенаций естественным образом приводят к индукции активности

SR Ca-Pump Activity during Incubation Effect of lipid peroxidation

-Blark lncU)at:cn'

-------Incub + LPO

Tim« of InetAetJoa trtn

Щ -rt«nntlwit hypoxia

Ca-pump «en«itivity to LPO

Different Adaptations

I/

• - KO.Ot

в

, -contirucu« hypoxia

Рис. 9. Влияние адаптации к различным формам гипоксии на снижение активности Са-насоса саркоплазматического ретикулума в ходе инкубации гомогената миокарда крысы при 37°С. Сплошные линии -контрольная инкубация; пунктирные - в присутствии системы индукции перекисного окисления липидов.

А - динамика процесса; В - Чувствительность Са-насоса к перекисному окислению липидов, оцененная к двум часам инкубации по данным рис. 9а.

антиоксидантных ферментов. Действительно, в результате адаптации к периодической гипоксии активность супероксиддисмутазы и каталазы в сердце увеличивается на 1012 %, в мозге прирост активностей этих ферментов составляет 38 и 29%, а в печени -47 и 28%, соответственно. Этот сдвиг является наиболее вероятной причиной увеличения резистентности Са-насоса к индукции свободнорадикального окисления.

При сопоставлении результатов, полученных на моделях адаптации к периодической гипоксии и к кратковременным стрессам обращает на себя внимание следующее принципиальное различие: адаптация к гипоксии снижает резистентность Са-насоса к инактивирующему влиянию эндогенных факторов гомогената, а адаптация к повторным относительно мягким стрессорным воздействиям обладает резко выраженным противоположным эффектом - значительно увеличивает устойчивость Са-насоса и ограничивает утечку кальция из элементов саркоплазматического ретикулума. Этот факт согласуется с результатами последних работ, которые свидетельствуют, что при перевязке коронарных артерий адаптация к гипоксии обладает мощным антиишемическим эффектом, а именно, вдзое уменьшает зону первичной ишемии через 5 минут посте окклюзии, но полностью лишена цитопротекторного эффекта, т.е. не уменьшает ту часть зоны ишемии, которая подвергается некрозу. Адаптация к стрессорным воздействиям, наоборот, лишена антиишемического эффекта, но при этом обладает сильным цитопротекторным действием, уменьшая зону некроза на 45 % [Меепоп ¥.Х., 1991]. Таким образом, возможно, что отсутствие в наших опытах защитного эффекта адаптации к гипоксии связано с тем, что ее кардиопротекторное действие является главным образом антиишемическим, т.е. обусловлено ростом коллатералей и в значительно меньшей мере связано с прямой стабилизацией структур.

Адаптация к периодической гипоксии - менее изученное явление, чем адаптация к непрерывной высотной гипоксии. Необходимо также учитывать, что применение в клинике использованной нами модели адаптации к гипоксии в барокамере требует значительных материальных и технических затрат в связи с необходимостью конструирования объемных птобарических барокамер. В связи с этим возник вопрос о сопоставлении эффектов и механизмов адаптивного ответа на этих двух моделях гипоксии. С этой целью крыс перевозили в Приэльбрусье на высоту 2100 м над уровнем моря и содержали их там в течение 30 дней. Контролем служили животные, остающиеся в условиях равнины. Показателями защитного эффекта адаптации служили уровни основных антиоксидантных ферментов в сердце, мозге и печени, а также содержание продуктов перекисного окисления липидов в них. Полученные результаты представлены на рис. 7, из которого видно, что в отличие от прерывистой адаптации, в условиях высокогорья не происходит активации супероксиддисмутазы и каталазы, но наоборот, активности этих ферментов значительно снижаются. Падает также уровень малонового диальдегида по сравнению с контролем во всех исследованных тканях.

Объяснение этих фактов находится в природе снабжения тканей кислородом при двух способах адаптации. Если в условиях прерывистого пребывания в пшоксической атмосфере барокамеры организм периодически попадает в состояние реоксигенации, то в высокогорье создается непрерывный недостаток кислорода. В первом случае эффект реоксигенации и сопровождающая его периодическая активация свободнорадикальных процессов приводит к необходимости индукции систем защиты от перекисного окисления липидов, а во втором - постоянный недостаток кислорода вызывает снижение скорости реакций перекисного окисления и, соответственно, излишняя часть системы антиоксидантной защиты подвергается деградации. Следовательно, механизмы адаптации к двум примененным режимам гипоксии имеют коренные различия. В результате устойчивость тканей к воздействиям, вызывающим активацию свободнорадикальных процессов (например, стрессу), развивается только в случае периодической гипоксии. С другой стороны, повреждающий эффект этих воздействий в условиях непрерывной гипоксии может оказаться значительно более выраженным, чем на равнине.

В целом полученные данные позволяют заключить, что механизмы защитного действия и, в частности, кардиопрогекторного эффекта, при адаптации к факторам окружающей среды могут обладать глубокими различиями. Изучение способов адаптационной стабилизации внутриклеточных структур позволит целенаправленно рекомендовать оптимальные адаптационные воздействия для профилактики и лечения различных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. В раннем периоде длительного иммобилизационного стресса во внутренних органах - сердце и печени - наблюдается значительное увеличение содержания тиобарбитурат-активных продуктов перекисного окисления липидов, а в головном мозгу -напротив, существенное снижение их содержания. При этом в гомогенатах внутренних органов возрастала скорость перекисного окисления липидов, индуцируемого системой Ее^+ + аскорбат, а в головном мозгу скорость этого процесса снижалась более чем вдвое. В целом при стрессорной ситуации общая активация перекисного окисления в организме сочетается с увеличением эффективности антиоксидантной защиты мозга. Биологическое значение обнаруженного явления состоит в том, что мозг, как орган управления-поведением, способен продолжать выполнять свои функции в экстремальных условиях.

2. Стресс более чем на треть ингибирует Иа.К-АТФазу -основной компонент Ма-насоса сарколеммы миокарда. Предварительное введение животным антиоксидантов предотвращает это явление, что свидетельствует об участии в нем свободнорадикальных процессов. В

мозгу стресс, напротив, приводит к активации ИаД-АТФазы, которая играет важную роль в функционировании мозга. В итоге, при стрессе складываются реципрокные отношения между уровнем активности Na,K-АТФазы в плазматических мембранах и содержанием продуктов перекисного окисления липидов в тканях.

3. При анализе молекулярных механизмов ингибирования Иа.К-АТФазы плазматической мембраны миокарда при активации свободнорадикальных реакций in vitro установлено, что главную роль в этом явлении играет окисление ключевых аминокислотных остатков в активном или аллостерических центрах фермента. Эти сдвиги сопровождаются увеличением термочувствительности Na,K-АТФазы и, следовательно, уменьшением конформационной стабильности, которая определяет время жизни фермента в клетке.

4. Стресс сопровождается снижением активности Са-насоса саркоплазматического ретикулума миокарда - скорости транспорта кальция и, в меньшей степени, активности Са-АТФазы. Предварительное введение антиоксиданта ионола снижает выраженность этих эффектов стресса. Таким образом, активация перекисного окисления липидов в мембранах саркоплазматического ретикулума стрессорном сердце является одной из основных причин повреждения ферментной системы транспорта кальция.

5. Молекулярными механизмами ингибирования Са-насоса саркоплазматического ретикулума при перекисном окислении липидов in vitro являются увеличение проницаемости мембраны для ионов кальция за счет формирования гидрофильных трансмембранных каналов пассивной утечки, а также рост вязкости и полярности липидного бислоя мембраны (что способствует ее дальнейшему разрушению факторами аутолиза). Гидролитическая активность Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума более устойчива к повреждающему действию перекисного окисления, чем Са-транспортирующая функция.

6. Активность Са-насоса саркоплазматического ретикулума в результате адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям увеличивается, что выражается в повышении скорости транспорта кальция в 1,4 раза, снижении скорости утечки кальция из мембранных везикул, а также в возрастающей эффективности транспорта в условиях повышения концентрации свободного кальция в саркоплазме. Адаптация к кратковременному стрессу значительно повышает устойчивость как Са-, так и На,К-насоса к аутолизу и к термоденатурации. Таким образом, известный кардиопротекторный эффект адаптации к повторным стрессам, наряду с другими факторами, обусловлен стабилизацией клеточных мембран и мембранно-связанных катионных насосов.

7. Предварительная адаптация к повторным кратковременным стрессорным воздействиям предотвращает активацию перекисного

окисления липидов и увеличение чувствительности к его экзогенным индукторам, наблюдаемые при стрессе. Такая адаптация повышает устойчивость катионных насосов в мембранах миокарда к аутолизу, повышенным концентрациям кальция и высоким температурам, а также предупреждает повреждение мембран и утечку кальция из саркоплазматического ретикулума при длительном стрессе.

8. При адаптации к непрерывному действию гипоксии (в условиях среднегорья) наблюдается падение активности антиоксидантных ферментов каталазы и супероксиддисмутазы сердца, печени и мозга, что является предпосылкой для снижения устойчивости организма к действию стресса, активирующего перекисное окисление липидов. Эта своеобразная атрофия от бездействия сопровождается, как было показано, снижением резистентности сердца к реперфузионным аритмиям. Адаптация к периодической гипоксии в условиях барокамеры, при которой каждый "подъем" завершается реоксигенацией при "спуске" привела к противоположному результату, а именно, повысила активность каталазы и супероксиддисмутазы во внутренних органах и устойчивость сердца к реперфузионным аритмиям. Таким образом, адаптация к периодической гипоксии, в противоположность к непрерывной гипоксии, повышает антиоксидантную защиту организма, способствующую преодолению нарушений работы сердца, которые связаны с активацией свободнорадикального окисления.

9. У адаптированных к периодической гипоксии животных обнаружена повышенная активность Са-насоса саркоплазматического ретикулума и снижение его устойчивости к аутолитическим факторам. Вместе с тем, Са-насос адаптированных животных обладает повышенной резистентностью к индукторам перекисного окисления липидов. Последнее обстоятельство является решающим в проявлении защитного эффекта адаптации к периодической гипоксии от стрессорных повреждений миокарда: адаптация предотвращает активацию перекисного окисления липидов и ингибирование катионных насосов в мембранах миокарда при длительном стрессе.

10. Адаптация к повторным стрессорным воздействиям и адаптация к периодической гипоксии являются мощными факторами защиты мембран сердечной мышцы и мембранно-связанных катион-транспортирующих ферментов, которые в перспективе могут быть применены в практике. При адаптации к периодической гипоксии эта защита обеспечивается в основном увеличением активности антиоксидантной системы, а при адаптации к повторным стрессам этот механизм не играет не столь решающую роль и защита определяется иным, не менее мощным механизмом, действующим на уровне клеток.

"Stressory Damage of Myocardial Cation Pumps and Their Adaptive Protection" Yuri V. ARKHIPENKO

Thesis. Doctor of Biological Sciences CONCLUSIONS

1. At early stages of long-term immobilization stress a considerable increase in thiobarbiturate reactive products of lipid peroxidation in internal organs, heart and liver, is observed; in brain, on the contrary, there is a substantial decrease in these products content. Furthermore the lipid peroxidation rate induced by Fe~+ + ascorbate system, increased in homogenates of internal organs, while in brain this process was decelerated more than twofold. As a whole, in stressful situation the total peroxidation activation in the body is associated with the enhanced efficiency of antioxidant protection of brain. The biological significance of the phenomenon observed is that the brain as an organ of behavior regulation preserves its capacity of functioning in extremal conditions.

2. Stress inhibits Na,K-ATPase, the basic component of myocardial sarcolemma Na-pump, by more than one third. Pretreatment of animals with antioxidants prevents this phenomenon, indicating the involvement of free radical processes. In brain, on the contrary, stress activates Na,K-ATPase which plays an important role in brain functioning. As a result, reciprocal relations between N'a,K-ATPase activity in plasma membrane and lipid peroxidation products content in tissues form in stress.

3. When analyzing molecular mechanisms of myocardial plasma membrane Na,K-ATPase inhibition during activation of free radical process in vitro it was established that oxidation of the essential amino acid residues in enzyme active or allosteric centers plays a dominant role in this phenomenon. These shifts are accompanied by an elevation in Na,K-ATPase thermal sensitivity and, consequently, by a decrease in conformational stability which determines the life-time of cellular enzymes.

4. Stress is accompanied by a decrease in the activity of Ca-pump of myocardial sarcoplasmic reticulum that is the rate of Ca-transport and, to a less degree, of Ca,Mg-ATPase activity. The preliminary administration of antioxidant butylated hydroxvtoluene decreases the pronouncement of stress effects. Thus, the stressed heart shows a decreased activity of sarcoplasmic reticulum Ca-pump and efficiency of ATP utilization by this cation pump due to mainly activation of free radical reactions.

5. The inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca-pump upon activation of lipid peroxidation in vitro is associated with the increased membranous permeability for Ca^+ ions due to the formation of hydrophilic transmembranous channels of passive Ca-leakage. Membrane lipid bilayer becomes more viscous and polar which potentiates its further degradation by factors of autolysis. The sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase hydrolytic activity is more resistant to the damaging effect of peroxidation than the Ca-transport capability.

6. Adaptation to short-term stress exposure increases the sarcoplasmic reticulum Ca-pump activity evidenced by i) 1.4 increase in calcium transport rate, ii) decrease in the rate of Ca^+ leakage from membrane vesicles, iii) growing transport efficiency under the conditions of enhanced free concentration in sarcoplasma. Adaptation to short-term stresses results in a substantial increase in Ca- and Na,K-pumps resistance to autolysis and thermal denaturation. Thus, a well-known cardioprotective effect of adaptation to repeated stress, along with other factors, is due to a stabilization of cellular membranes and membrane-bound cation pumps.

7. Preliminary adaptation to repeated short-term stress exposures prevents the activation of lipid peroxidation and enhancement of sensitivity to its exogenous inducers observed in long-term stress. This adaptation increases the resistance of myocardial membrane cation pumps to autolysis and high temperature, as well as prevents membrane damage and Ca^+ leakage from sarcoplasmic reticulum in long-term stress.

8. In adaptation to continuous hypoxia (under conditions of middle mountains) there is a fall in activity of antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase in heart, brain and liver which is a prerequisite to the reduction in organism resistance to stress exposure. This peculiar "atrophy of disuse" was shown to be accompanied by a reduction in cardiac resistance to «perfusion arrhythmias. Adaptation to intermittent hypoxia in altitude chamber, at which each "elevation" is followed by «oxygenation of "descent", produced an opposite effect that is an enhancement of catalase and superoxide dismutase activities in internal organs and an increase in heart resistance to reperfusion arrhythmias. Thus, adaptation to intermittent hypoxia, in contrast with continuous hypoxia, potentiates antioxidant protection of the body.

9. The animals adapted to intermittent hypoxia showed an increased activity of sarcoplasmic reticulum Ca-pump and its decreased resistance to autolytic factors. At the same time Ca-pump of adapted animals possesses an increased resistance to inducers of lipid peroxidation. Hence, with regard to this cation pump, adaptation to intermittent hypoxia increases the efficiency of antioxidant protection as well. Consistently, preliminary adaptation to intermittent hypoxia prevents both the activation of lipid peroxidation and inhibition of cation pumps in myocardial membranes during long-term stress.

10. Adaptations to repeated stress exposure and adaptation to intermittent hypoxia are strong protective factors for myocardial membranes and membrane-bound cation-transponing enzymes, which in perspective, may be used in practice. In adaptation to intermittent hypoxia, this protection is provided mostly by an increase in antioxidant system activity, and in adaptation to repeated stress this mechanism is less significant .and another, strong enzymatic and non-enzymatic systems are involved in the protective mechanism at the cellular level.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Каган В.Е., Чуракова Т.Д., Карагодин В.П., Архипенко Ю.В., Биленко .В., Козлов Ю.П./ Нарушение ферментной системы транспорта Са"+ в мембранах ркоплазматического ретикулума при действии гидроперекисей липидов и дроперекисей жирных кислот // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1979.- Т.87, п 2.- С. 5 - 149

2. Корчагин В.П., Братковская Л.В., Шведова А.А., Архипенко Ю.В., Каган Е., Шуколкжов С.А./ Олигомеризация интегральных мембранных белков при :рекисном окислении липидов // Биохимия.- 1980,- Т. 45, п 10,- С. 1767 - 1772

3. Меерсон Ф.З., Каган В.Е., Архипенко Ю.В., Белкина Л.М., Рожицкая .И./ Предупреждение активации перекисного окисления липидов и повреждения ¡тиоксидантных систем миокарда при стрессе и экспериментальном инфаркте // 1рдиолоп1Я,- 1981,- Т. 21, п 12.- С. 55 - 60

4. Меерсон Ф.З., Архипенко Ю.В., Рожицкая И.П., Каган В.Е./ овреждение Са-транспортируюшей системы саркоплазматического ретикулума при юционально-болевом стрессе .// Бюлл.эксперим. биол. и мед.- 1981.- Т. 91, п 4,- С. )5 - 406

5. Kagan V.E., Belousova L.V., Tyurin V.A., Shvedova A.A., Schukolukov S.A., dzIov Yu.P./ Effects of products of phospholipid hydrolysis by phospholipases on odopsin thermal stability of photoreceptor membranes // Vision Research.- 1981.- V. 23, 10.- P. 1029 - 1034

6. Каган B.E, Архипенко Ю.В., Писарев В.А., Белоусова Л.В., Козлов ).П./ Повреждение мембран саркоплазматического ретикулума при перекисном сислении липидов и его роль в развитсга мышечных патологий // Биофизика гмбран,- М.- Наука.- 1981.-С. 132-141.

7. Меерсон Ф.З., Каган В.Е., Козлов Ю.П., Белкина Л.М., Архипенко Ю.В./ зль перехисного окисления липидов в патогенезе ишемического повреждения и ггиоксидантная защита сердца // Кардиология.- 1982.- Т. 22, п 2.- С. 81 - 93

8. Меерсон Ф.З., Каган В.Е., Прилипко Л.Л., Сазонтова Т.Г., Архипенко ).В./ Повреждение биомембран при стрессе и их предупреждение антиоксидантами ' 1-й Всесоюзный биофизический съезд.- М.- Наука.- 1982,- С. 182

9. Каган В.Е., Козлов Ю.П., Архипенко Ю.В./ Молекулярные механизмы эвреждения кислородом системы транспорта Са*+ в саркоплазматическом ретикулуме ышц // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии.- М.-аука.-1982,- С. 136 - 148

10. Meerson F.Z., Kagan V.E., Kozlov Yu.P., Belkina L.M., Arkhipenko Yu.V./ he role of lipid peroxidation in pathogenesis of ischemic damage and the antioxidant •otection of the heart // Basic Res. Cardiol.- 1982,- V.7, n 4.- P. 465 - 485

11. Козлов Ю.П., Каган В.Е., Архипенко Ю.В./ Модифицируют действие молекулярного кислорода на систему транспорта Са^+ саркоплазматическом ретикулуме // Иркутск.- Изд-во ИГУ им. A.A. Жданов; 1983. - 186 С.

12. Каган В.Е., Архипенко Ю.В., Козлов Ю.П./ Модификация фермента системы транспорта Са^+ в саркоплазматическом ретикулуме при перекис» окислении липидов. Изменение химического состава и ультраструктурной организац мембран // Биохимия,- 1983.- Т.48, п 1.- С. 158 - 166

13. Каган В.Е., Архипенко Ю.В., Ритов В.Б., Козлов Ю.П./ Модификац ферментной системы транспорта Са^+ в саркоплазматическом ретикулуме п перекисном окислении липидов. Молекулярные механизмы увеличения проницаемое мембраны для кальция// Биохимия.- 1983.- Т. 48, п 2.- С. 320 - 330

14. Архипенко Ю.В., Каган В.Е., Козлов Ю.П./ Модификация ферментн системы транспорта Са?+ в саркоплазматическом ретикулуме при перекист окислении липидов. Молекулярные механизмы изменения активности Са-АТФаз1 Биохимия,- 1983.- Т. 48, п 3.- С. 433 - 441

15. Клаан Н.К., Азизова O.A., Сибельдина Л.А., Архипенко Ю.В., Каг В.Е./ Модификация ферментной системы транспорта Са~+ в саркоплазматическ< ретикулуме при перекисном окислении липидов. Изменение молекулярн организации мембранных липидов/ Биохимия.- 1983.- Т. 48, п 4.- С.626 - 633

16. Азизова O.A., Максина А.Г., Клаан Н.К., Суханов В.А., Архипен Ю.В., Владимиров Ю.А., Козлов Ю.П./ Модификация ферментной систег. транспорта Са-+ в саркоплазматическом ретикулуме при перекисном окислен: липидов. Изменение молекулярной организации липопротеидного комплекса С АТРазы // Биохимия.- 1983,- Т. 48, п 5.- С. 861 - 869

17. Arkhipenko Yu.V., Kagan V.E., Meerson F.Z./ Mechanisms of he; sarcoplasmic reticulrm damage under stress // Cardiac Adaptation to Hemodyn. Overload Stress.- Darmstadt.- FRG.- 1983.- P. 258 - 264

18. Каган B.E., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З., Козлов Ю.П Модификация ферментной системы транспорта Са~+ в саркоплазматическ< ретикулуме при перекисном окислении липидов. Повреждение in vivo при развит] патологических состояний/ Биохимия.- 1983.- Т. 48, п 7.- С. 1141 - 1148

19. Архипенко Ю.В., Писарев В.А., Каган В.Е./ Модификация ферментн:

. o-i.

системы транспорта Ca в саркоплазматическом ретикулуме при перекисш окислении липидов. Системы генерации и регуляции перекисного окисления саркоплазматическом ретикулуме скелетной и сердечной мышц // Биохимия.- 198; Т.48, п 8.- С. 1261 - 1270

20. Каган В.Е., Савов В.М., Диденко В.В., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.Э Кальций и перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий и микрос< сердца // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1983.- Т.95, п 4.- С. 46 - 48

21. Прилипко JI.JI., Каган В.Е., Меерсон Ф.З., Богданова Е.Д., Брусованик ¡.И., Орлов О.Н., Архипенко Ю.В./ Роль липидов в изменении свойств --лренорецепторов мозга при эмоционально-болевом стрессе // Бюлл. эксперим. биол. [ мед.- 1983.- Т. 96, п П.- С. 6 - 8.

22. Меерсон Ф.З., Сазонтова Т.Г., Каган В.Е., Твердохлиб В.П., Архипенко О.В./ Роль перекисного окисления липидов в ингибировании Ма,К-АТФазы сердца [ри стрессе // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1983.- Т. 96, п 12.- С. 42 - 44

23. Дупин A.M., Болдырев А.А., Архипенко Ю.В., Каган В.Е./ Защита :арнозином транспорта Са~+ от повреждений, вызванных перекисным окислением мпидов // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1984.- Т.98, п 8.- С. 186 - 188

24. Arkhipenko Yu.V., Meerson F.Z., Kagan V.E./ The role of lipid peroxidation ti physiological disassembly of cell membrane structures// Internat. Symp. "Membrane lipids

methabolism and organization", Varna,- 1984. - P. 38

25. Сазонтоза Т.Г., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З./ Увеличение активности »а,К-АТФазы мозга крыс при стрессе // Бюлл.эксперим. биол. и мел.- 1984.- Т. 97, п .- С. 556 - 55S

26. Каган В.Е., Савов В.М., Диденко В.В., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З./ "оотношение активности антиоксидантных систем и эндогенного перекисного кисления липидов в миокарде левого и правого желудочков сердца // Бюлл. ксперим. биол. и мед.- 1984,- Т. 97, п 6.- С. 664 - 666

27. Меерсон Ф.З., Ясинский Я.Л., Дюсенов С.С., Сазонтова Т.Г., Козлов О.П./ Нарушение активности мембранных катионных насосов и электрической табильности сердца при стрессе. Механизмы и предупреждение этого явления // ^оматосенсорная и кинестатическая чувствительность в норме и патологии.- 1985.-1ркутск, - С. 28 - 30

2S. Arkhipenko Yu.V., Meerson F.Z., Sazontova T.G., Kagan V.E./ Mode of pid peroxidation induced inhibition of Na,K-ATPase // Acta Physiol.Pharmacol.Bulg.-985.- V. 11,n 1.- P.70-78

29. Меерсон Ф.З., Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., Каган В.Е./ Анализ ермоденатурации Ка,К-АТФазы сарколеммы миокарда крыс при стрессе и возможная оль повреждения этого фермента в патогенезе аритмий // Вопр. мед. химии.- 1986.32, п 5,- С. 67 - 71

30. Джапаридзе Л.М., Устинова Е.Е., Архипенко Ю.В., Спиричев В.Б., 1еерсон Ф.З./ Увеличение скорости накопления продуктов перекисного окисления ипидов и снижение порога фибрилляции сердца при авитаминозе Е // Вопр. итания,- 1986,- п 6.- С. 48 -50

31. Архипенко Ю.В., Диденко В.В., Салтыкова В.А./ Накопление :алонового диальдегида в миокарде при аритмии, вызванной перекисью водорода // [еп. ВИНИТИ.- п 3903-В86 от 02.06.86,- С. 1-9

32. Винер Р.И., Новиков К.Н., Архипенко Ю.В., Скрыпин В.И., Козло! Ю.П., Спиричев В.Б., Каган В.Е./ Неантиоксидантный механизм стабилизации Р-45С @-токоферолом: эффективность при авитаминозе Е // Биохимия.- 1986.- Т. 51, п 9.-С. 1549 - 1554

33. Каган В.Е., Архипенко Ю.В./ Липид-зависимое и липид-независимо( повреждение транспортных АТФаз активными формами кислорода/ Перекисно( окисление липидов в биомембранах.- Международный симпозиум,- София, - 1986.- С 124

34. Белкина Л.М., Архипенко Ю.В., Джапаридзе Л.М., Салтыкова В.А. Меерсон Ф.З./ Влияние недостаточности витамина Е на возникновение сердечны: аритмий при острой ишемии // Бюлл.эксперим. биол. и мед.- 1986,- Т. 102, п 11.- С 530 - 532

35. Архипенко Ю.В., Джапаридзе Л.М., Гуткин Д.В., Рожицкая И.И, Спиричев В.Б./ Сравнительная оценка влияния недостаточности витамина Е н перекисное окисление липидов и транспорт Са"+ в сердечной и скелетных мышцах / Вопр. мед.химии.- 1987.- Т. 33, п 1.- С. 122 - 127

36. Meerson F.Z., Belkina L.M., Sazontova T.G., Saltykova V.A., Arkhipenk Yu.V. /The role of lipid peroxidation in pathogenesis of arrhythmias and prevention с cardiac fibrillation with antioxidants // Basic Res. Cardiol.- 1987.- V. 82, n 2.- P. 123 137

37. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З./ Увеличение активност ферментов антиоксидантной защиты сердца при адаптации крыс к коротки: стрессорным воздействиям // Бюлл.эксперим. биол. и мед.- 1987.- Т. 103, п 10.- С 411 - 413

38. Архипенко Ю.В., Коновалова Г.Г., Джапаридзе Л.М., Ланкин В.В Спиричев В.Б./ Содержание продуктов перекисного окисления липидов и активное! антиоксидантных ферментов в миокарде и печени крыс при различной обеспеченное! витамином Е // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1988.- Т. 104, п 12.- С. 670 - 671

39. Меерсон Ф.З., Архипенко Ю.В., Диденко В.В./ Избирательнс подавление перекисного окисления липидов в головном мозге при стрессе // Б юл. эксперим. биол. и мед.- 1988.- Т. 104, п 11.- С. 542 - 544

40. Архипенко Ю.В., Каган В.Е./ Повреждение ион-транспортных систе кардиомиоцитов при стрессе/ Свободные радикалы и биостабилизаторы.- 1-й Болгар< советский симп.- Варна, -' 1989.- С. 8

41. Архипенко Ю.В., Шимкович М.В./ Участие перекисного окислен! липидов в регрессии гипертрофированного сердца// Бюлл.эксперим.биол.мед.- 1989 Т. 108, п 11 - С. 556 - 558

42. Архипенко Ю.В., Диденко В.В., Сазонтова Т.Г., Меерсон Ф.З Сравнительная оценка влияния иммобилизационного стресса на динамш