Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Мембраностабилизирующий эффект растворимых цитоплазматических факторов в миокарде и скелетных мышцах при стрессе и адаптации к нему

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ

г» и

/ / КОП 1939

ОД

На правах рукописи

МАЦКЕВИЧ Алексей Анатольевич

МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ РАСТВОРИМЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В МИОКАРДЕ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ ПРИ СТРЕССЕ И АДАПТАЦИИ К НЕМУ.

14.00.16- патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1999

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте общей патологу патофизиологии Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Сазонтова Татьяна Геннадьевна доктор биологических наук, профессор Архипенко Юрий Владимиров!

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Глебов Рудольф Николаевич доктор биологических наук Полина Ольга Дмитриевна

Ведущее учреждение:

Российский Университет дружбы народов

Автореферат разослан-^^ентября 1999 года

Защита диссератции состоится «21» октября 1999 года в ^ ч на заседа! Диссертационного совета Д 001.03.01 при Научно-исследовательском инстит общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ;

Д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы

Поиск немедикаментозных методов защиты организма приобретает все большее ачение, являясь важной проблемой теоретической и практической медицины. В следние годы экспериментально показано, что а результате адаптации организма к рессорным и другим повреждающим воздействиям происходят изменения не лько на уровне целого организма [Меерсон, Пшенникова, 1988], изолированных танов и тканей, но и на уровне внутриклеточных мембранных структур [Сазонтова, '98]. Одновременно интенсивно развивается изучение отдельных ¡зкомолекулярных компонентов цитоплазмы клеток и их роли в повреждении и щите клетки. Однако, до сих пор практически отсутствуют данные о механизме 'йствия растворимых цитоплазматических факторов (РЦФ) в мембрано-абилизирующем эффекте адаптации. До настоящего времени не известны способы даже сама возможность репарации нарушенных функций на уровне утрикпеточных структур при стрессорных повреждениях.

Известно, что острое стрессорное воздействие различной природы приводит к рушениям функционирования сердечно-сосудистой системы, снижению ектрической стабильности сердца, нарушению метаболизма в кардиомиоцитах, и в нечном итоге к развитию ишемической болезни, кардиопатий, аритмий и т.д. еерсон, 1986]. В последнее десятилетие показано, что стресс-индуцированное вреждение на внутриклеточном уровне проявляется в значительном снижении эфективности функционирования мембранных ион-транспортирующих систем -),К-АТФазы плазматической мембраны, Са-АТФазы саркоплазматического тикулума (CP), Са-АТФазы плазматической мембраны и митохондрий [Arkhipenko а!.. 1985; Сазонтова Т.Г. и др., 1989; Parnham, Lunec, 1986; Zaidi et al., 1995]. При ом наряду со снижением устойчивости ферментов к действию эндогенных вреждающих факторов, значительно уменьшается также и скорость акционирования этих важнейших систем ферментов поддержания клеточного иного баланса. Степень ингибирования достигает 30-50%, что в отсутствии мпенсации приводит к снижению порога выживаемости. Такое существенное дение активности ферментов, наблюдаемое in vitro в изолированных мембранных эакциях, вызывает закономерный вопрос о совместимости этого явления с ¡наруженным поддержанием некоторых физиологических функций после стресса, от вопрос особенно актуален при изучении Са-транспортирующей системы CP юкарда, ответственной за поддержание Са-гомеостаза в клетке и реализацию кпа сокращение-расслабление. Действительно, показано, что даже длительный юционально-болевой стресс в течение 4-х или 6 часов [Белкина и др., 1983] не бывает достоверного изменения сократительной функции сердца - развиваемое вление и частота сердечных сокращений остаются на контрольном уровне.

Следовательно, е стрессированном сердце резкое падение активности зрментов ионного транспорта должно быть хотя бы частично скомпенсировано, обы поддерживать физиологические функции на прежнем уровне. Поскольку при трых воздействиях компенсация не может быть осуществлена за счет быстрого юсированного синтеза новых молекул ферментов ионного транспорта, можно лагать, что восстановление функции поврежденных при стрессе мембранно-язанных ферментов происходит за счет различных РЦФ, которые, как показано в

последнее время, быстро накапливаются в клетке при стрессе, ишемии, теплово шоке, индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Mulvagh et al. 1987; Graven i al., 1993; Melia et al., 1994; Nanji et al., 1995; Plumier et al., 1996; Bhattacharyya, Sei 1998]. Однако, данные о влиянии на мембранные системы клетки различнь низкомолекулярных соединений разрозненны и зачастую противоречивы, что связан с тем, что роль РЦФ практически не рассматривается в целом, а выделяются изучаются лишь отдельные цитоплазматические компоненты. Поэтому оцет суммарного эффекта РЦФ может являться актуальным информативным тестом.

Еще меньше данных о роли РЦФ при адаптации к различным факторам сред! При этом нужно учитывать, что адаптационные изменения в значительной степей реализуются на уровне самих мембран и связанных с ними ферментов - происход! смена изозимного состава, изменяется чувствительность к субстратам и регулятора и т.д. Однако, так же, как и в ситуации со стрессорными повреждениями, вопрос соотношении вклада в адаптационное изменение работы фермента процессо происходящих на уровне самого мембранно-связанного белка и участия мембранной адаптационной защите других факторов клетки, в частности, РЦ< остается открытым. Кроме того, не ясна возможность существования не толы прямого, но и перекрестного адаптационного защитного эффекта на внутрикпеточнс уровне, и его модулирования с помощью экзогенно добавленнь мембранопротекторов.

В связи с этим цель работы заключалась в том, чтобы оценить прямой перекрестный эффекты цитоплазматических факторов, накопленных в миокарде скелетных мышцах при остром стрессе и адаптации к нему, а также протекторнс действие природного термостабилизатора (а-кристаллина), на активность резистентность Са-транспортирующей системы СР.

В рамках этой цели решались следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить повреждающий эффект острого стресса и протекторное действ! адаптации к стрессу на активность Са-насоса CP миокарда и скелетных мышц и е резистентность к повреждающим факторам - термоденатурации, автолизу, индукщ ПОЛ и др.

2. Провести моделирование стрессорного повреждения Са-насоса С скелетных мышц in vitro с помощью частичного окисления мембран и автолиза присутствии и отсутствии высоких концентраций Са2\

3L Исследовать действие РЦФ на стресс-индуцированные и адаптационнь изменения активности и конформационной стабильности Са-насоса CP, выяви тканеспецифичность проявления эффектов РЦФ в сердце и скелетных мыш Сравнить эффекты стресса и адаптации к нему на Са-насос CP, при определении е активности в гомогенатах сердца и скелетных мышц или в мембранных препарат CP из этих тканей.

4, Оценить перекрестные эффекты РЦФ, а именно: стрессорных РЦФ i мембраны CP миокарда и скелетных мышц от контрольных и адаптированж животных, а также адаптационных РЦФ на контрольные и стресс-поврежденж мембраны CP этих тканей.

5. Исследовать протекторное действие а-кристаллина на мембранную систе! Са-транспорта CP миокарда и скелетных мышц (в гомогенатах и мембранж препаратах) при стрессе и адаптации к нему. Оценить возможность усилен! протекторного действия а-кристаллина с помощью РЦФ. Выяснить возможное

/ществования репарационного эффекта а-кристаллина в отношении Са-насоса Р, поврежденного в результате стрессорного воздействия.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые на нутриклеточном уровне продемонстрировано участие комплекса цитозольных эмпонентов в защитном эффекте на систему транспорта Са2* в CP миокарда энтрольных, стрессорных и адаптированных животных. Этот протекторный эффект азличается по степени выраженности в зависимости от состояния организма in vivo: эм значительнее исходно поврежден транспорт Са2<", тем больше защитный эффект итозольных факторов. Максимален он при стрессе, т.е. в ситуации, при которой эрмоустойчивость Са-насоса CP минимальна и наименее выражен этот эффект при цаптации к стрессу (т.е. при максимальной термоустойчивости). Сопоставление |ункционирования Са-транспортирующей системы CP, активность которой змерялась в гомогенате и в микросомальных препаратах CP в присутствии итоплазматических компонентов, показало аналогичные результаты.

Впервые продемонстрирована тканеспецифичность эффектов РЦФ в скелетных ышцах и миокарде. Показано, что РЦФ в сердце прежде всего увеличивают зрморезистентность мембранно-связанных ферментов, в то время как в скелетных ышцах не изменяя термостабильность Са-насоса CP, РЦФ значительно повышают эрвоначальную активность фермента. Несмотря на выраженную санеспецифичность проявления протекторного эффекта растворимых компонентов в эрдце, и в скелетной мышце стресс-индуцированные нарушения работы ембранных ферментов компенсируются в обеих тканях и поддерживается высокая £фективность их функционирования.

Впервые продемонстрирована возможность наличия перекрестных защитных £>фектов адаптации на внутриклеточном уровне в отличие от существования только эямых эффектов стрессорных цитоплазматических компонентов, которые (азывают защитное действие строго специфично только в отношении стресс-эврежденных Са-насоса миокарда и скелетных мышц и не имеют выраженного эйствия в контроле и при адаптации к стрессу. Цитозольные компоненты от каптированных животных как в сердце, так и скелетных мышцах, напротив, Зладают ярко выраженным перекрестным протекторным эффектом во всех группах, гзависимо от состояния организма.

Впервые показан защитный эффект а-кристаллина, повышающего активность и )нформационную стабильность Са-транспортирующей системы CP как скелетных ышц, так и миокарда, при этом его эффект проявляется только при наличии острых звреждающих воздействий, а именно при стрессе у контрольных или у оптированных животных. Обнаружена тканеспецифичность действия а->исталлина. В мембранных препаратах скелетных мышц а-кристаллин повышает шько начальную активность Са-насоса CP, причем для проявления своего действия i не требует присутствия дополнительных активаторов. В сердце защитный эффект ■кристаллина релизуется только при наличии РЦФ, накопленных при стрессе.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней впервые изучен )ямой и перекрестный эффект цитозольных компонентов сердца и скелетных мышц ' стрессированных и адаптированных животных на функционирование мембранно-шзанного Са-насоса СР. Показана универсальность действия РЦФ, защищающих эмбраны CP от свободно-радикальных, автолитических и тепловых повреждений.

ч

Обнаружен репарационный эффект а- кристаллина, восстанавливающе

активность Са-насоса СР после повреждающего стрессорного воздействия.

Практическое значение работы состоит в том, что в ней на основе изучен; мембранопротекторного действия РЦФ сердца и скелетных мышц показа] возможность использования цитоплазматических компонентов для повышен! эффективности защитного действия адаптации к факторам среды. Применен! одного из РЦФ - неспецифического термостабилизатора а-кристаллина может бы эффективно при комплексной профилактике стрессорных повреждений, включающ* адаптационные воздействия различной природы для снижения «цены» адаптации для проявления максимального защитного эффекта от последующих повреждений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Цитоплазматические компоненты оказывают протекторный эффект ( активность Са-насоса СР скелетных мышц и терморезистентность этого фермента миокарде, причем степень выраженности защиты тем больше, чем значительн( повреждена система транспорта Са2+ в СР.

2. Стрессорные цитоплазматические компоненты оказывают защитное действ1 строго специфично только в отношении стресс-поврежденных мембранно-связаннь ферментов, а цитозольные компоненты от адаптированных животных имеют яр( выраженный перекрестный протекторный эффект, независимо от состояв организма.

3. а-кристаллин в сердце и скелетной мышце оказывает протекторное репарационное действие на систему транспорта Са2* в СР при острых повреждающ! воздействиях, при этом в миокарде его эффекты проявляются только при наличу дополнительных цитоплазматических активаторов, т.е в гомогенатах или пр совместном действии РЦФ и а-кристаллина.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсужден на Первом региональном совещании по медицинским наукам «Роль свободнь радикалов в здоровом состоянии и при болезнях» (Иерусалим, Израиль, 1998 Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождени И.П.Павлова (С.-Петербург, 1999), Всероссийской научной конференции «Свободны радикалы и болезни человека» (Смоленск, 1999), Международной конференции п гипоксии (Москва, 1999).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов методов, 3 глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов выводов. Список литературы содержит 229 источников. Диссертация иллюстрирован 25 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была проведена на 92 крысах-самцах Вистар массой 200-250 г. Кажда экспериментальная группа содержала 7-12 животных. Исследовани предусматривало несколько основных направлений. На первом этапе оценивал повреждающий эффект стрессорного воздействия (иммобилизация 3 часа) протекторное действие адаптации к стрессу (15 сеансов по 1 часу в день) н. эффективность функционирования Са-насоса СР миокарда и скелетных мышц.

Гомогенаты сердца и четырехглавой мышцы бедра получали путем измельчени: тканей этих органов гомогенизатором Шга-Тиггах ТР-18/10 ножом 25Ы-10 при 6501 об/мин в течение 60 сек (2 раза по 30 с интервалом 15 сек) в среде, содержащей 11

b

1 гистидина (pH 7,2 при 4°С) и 100 мМ NaCI при соотношении ткань:среда, вном 1:4.

Для проведения модельных экспериментов в целях изучения вклада РЦФ в цуцированные стрессом или адаптацией изменения активности и резистентности •насоса CP, а также с цепью сравнения двух видов измерения активности Са-:оса - в гомогенате и в микросомальной фракции, выделяли CP миокарда и ¡летных мышц, для чего полученные гомогенаты центрифугировали при 11000 'мин (10000 д) 20 минут на центрифуге "К-24". Осадок отбрасывали, а супернатант льтровали через 4 слоя марли, после чего центрифугировали 60 минут при 27000 мин (105000д) на центрифуге "Beket". Супернатант сохраняли и в дальнейших периментах использовали в качестве фракции, содержащей РЦФ, а осадок :пендировали в растворе, содержащем 0.6 М KCI, 5мМ гистидина (рН 7.0) с лощью гомогенизатора тефлон-стекло. После этого суспензию центрифугировали i 105000д 60 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 2,5 мл ¡ды хранения, содержащей 50 мМ NaCI, 5 мМ имидазола рН 7,0 при 4°С) и 20% церина. Концентрация белка в полученных микросомальных препаратах CP летных мышц составляла 5,6 мг/мл, а в миокарде - 6,3 мг/мл.

Определение скорости транспорта Са2* в CP осуществлялось с помощью Са-1ективного электрода с нелинейной характеристикой Са-ответа (иономер Orion ЕА-I) на основе более ранних разработок [Madeira, 1975; Ритов, Мурзахметова, 1985] методу [Meerson et al., 1990]. Для этого использовали оксалат №*(15мМ), который зывает поступающий в везикулы CP Са2\ что позволяло в течение длительного мени (5 мин и более) регистрировать максимальную скорость транспорта Са2* без ыщения им СР. Скорость транспорта Са2* в CP измеряли в микросомальной акции или в гомогенатах миокарда и скелетной мышцы при 37°С с непрерывной пьютерной обработкой on line. Образцы (30-50 мкл суспензии микросомальной зкции или приготовленного гомогената) помещали в 7 мл среды, содержащей 100 KCI, 20 мМ HEPES (рН 7,0 при 37°С), 4 мМ MgCl2, 5 мМ №N3, 15 мМ оксалат Na. У контрольных, стрессированных и адаптированных животных изучали явность Са-насоса и его резистентность к повреждающим воздействиям -моденатурации, автолизу в присутствии и отсутствии высоких концентраций Са2+, укции ПОЛ.

Для оценки устойчивости Са-транспортирующей системы к свободно-икальному повреждению при наличии и в отсутствии РЦФ в микросомальных паратах CP скелетной мышцы индуцировали ПОЛ in vitro системой, содержащей зрбат (0,25 мМ). Остановку свободно-радикальных процессов осуществляли с сщью ионола в концентрации 10 нмоль на 1 мг белка. При моделировании гссорных повреждений in vitro проводили частичное окисление микросомальной |кции CP при 37°С до потери 30% активности Са-транспорта СР. Для определения резистентности Са-насоса CP к автолизу в отсутствии и :утствии высоких концентраций Са2* и термоденатурации пробы по 50 мкг белка згената или 25 мкг белка микросомальной фракции CP инкубировали в течение 0 мин в термостатируемых ячейках с постоянным перемешиванием при 37°С и 2, соответственно, в среде, содержащей 100 мМ NaCI, 10 мМ гистидина (рН 7,5) концентрации белка - 2-5 мг в 1 мл. Затем через фиксированные временные /ежутки отбирались аликвоты на определение Са-транспорта в стандартных шиях.

На втором этапе было исследовано соотношение вклада в модулящ состояния Са-насоса СР миокарда и скелетных мышц при острых стрессорн! воздействиях и адаптации к ним, изменений на уровне мембран и опосредованнс действия РЦФ. Для этого у контрольных, стрессорных и адаптированных животн! изучали активность и термоустойчивость Са-насоса СР в присутствии РЦ полученных от тех же животных, что позволило оценить прямой эффект РЦФ соответствующие мембранные препараты. Параллельно были оцене! перекрестные эффекты РЦФ, а именно: стрессорных РЦФ на мембраны СР миокар, и скелетных мышц от контрольных и адаптированных животных, а так адаптационных РЦФ на стресс-поврежденные и контрольные мембраны СР эт тканей.

Для изучения влияния РЦФ на Са-транспортирующую систему СР в сре,! содержащую 100 мМ №С1, 10 мМ гистидина (рН 7,5 при 37°С) к микросомальн фракции СР добавляли РЦФ в соотношении, равном 1:3 мг белка микросомальн фракции к мг белка РЦФ для скелетной мышцы и 1:9 для миокарда. Затем в течен 2 мин при 37°С проводилась преинкубация и стандартные пробы отбирались д определения скорости транспорта Са2* в СР. В контроле вместо РЦФ добавля среду, содержащую 100 мМ №С1, 10 мМ гистидина (рН 7,5) в том же объеме. П изучении прямых эффектов РЦФ проводили инкубацию контрольнь стрессированных и адаптированных мембранных препаратов с соответствующи! РЦФ. При изучении перекрестных эффектов РЦФ к каждому из контрольнь стрессированных и адаптированных мембранных препаратов сначала добавля контрольные РЦФ, в другой серии экспериментов - стрессорные РЦФ и в третьей адаптационные РЦФ.

На третьем этапе исследовали возможность существования репарационнс действия одного из важных защитных РЦФ - неспецифического термостабилизато а-кристаллина на мембранную систему Са-транспорта СР миокарда и скелетн! мышц, поврежденных в результате острого стрессорного воздействия и сравнива защитный эффект а-кристаллина на Са-транспортирующую функцию СР п различных состояниях организма. Для этого изучали активность и резистентность С насоса СР контрольных, стрессорных и адаптированных животных в присутств оптимально подобранной концентрации а-кристаллина.

Для оценки действия а-кристаллина к суспензии, содержащей 80 мкг белка С до начала термоинактивации добавляли 0,4 мг а-кристаллина с последующ инкубацией в течение 1 мин. В дальнейшем пробы инкубировались в течение 10-мин в термостатируемых ячейках с постоянным перемешиванием либо при 41°С экспериментах по устойчивости фермента к термоденатурации), либо при 37°С экспериментах по устойчивости к автолизу), откуда через фиксированные времени! промежутки отбирались аликвоты на определение Са-транспорта в стандарта! условиях. Для определения возможности модулирования действия а-кристаллина Са-транспортирующую систему СР с помощью РЦФ, препараты СР миокар, инкубировали в присутствии одновременно добавленных РЦФ и а-кристаллина п описанных ранее соотношениях по белку. В качестве контроля на неспецифическ влияние белка вместо а-кристаллина использовали бычий сывороточный альбумь взятый в тех же, что и и-кристаллин весовых и объемных соотношениях.

Полученные данные выражены в форме М+Б.Е. Статистическая оцен достоверности отличий проведена по критерию I Стьюдента, а для серии влияния кристаллина на Са-транспортирующую систему СР миокарда использова

эпараметрический критерий статистики и (Вилкинсона-Манна-Уитни). Различия ежду группами считались достоверными при Р<0,05.

ЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Повреждающий эффект острых стрессорных воздействий на Са-эанспортирующую систему клетки и защитное действие адаптации к стрессу

Учитывая, что ранее при адаптации к стрессу изменение состояния ^триклеточных процессов в скелетной мышце практически не изучалось, на первом гапе определяли повреждающее действие стресса и эффективность защиты цаптации к нему на уровне мембранных структур в гомогенатах скелетных мышц.

Тест на термоинактивацию позволяет оценить конформационную стабильность олекулы. Как видно из рис. 1а, иммобилизационный стресс приводит к уменьшению зрмостабипьности (при температуре 41 °С) Са-насоса саркоплазматического этикулума (СР) скелетных мышц в 2 раза, по сравнению с контролем. После цаптации к стрессу термоустойчивость фермента значительно выше и через 10 мин зрмоинактивации скорость транспорта Са2* в 4 раза больше, чем в контроле. У ивотных, перенесших стресс на фоне предварительной адаптации не только элностью предупреждено стресс-индуцированное снижение термоустойчивости Са-эсоса скелетной мышцы, но она остается выше, чем в контроле.

Из полученных данных видно, что выбранная модель и длительность курса цаптации к стрессу увеличивает резистентность мембран СР к термоинактивации. В з же время примененная модель острого стресса снижает устойчивость мембранных груктур столь значительно, что даже на фоне курса адаптации он несколько снижает ггойчивость к термоинактивации Са-насоса, хотя и сохраняется на уровне более ысоком, чем в контроле. Таким образом, несмотря на отсутствие прямой нагрузки на селетную мышцу при стрессе, связанном с ограничением подвижности животных, ^триклеточные структуры скелетной мышцы повреждаются не меньше, а по ряду зраметров даже в большей степени, чем в миокарде.

Подобные закономерности были выявлены также при изучении устойчивости Са-эсоса сердца и скелетных мышц к другому повреждающему фактору - автолизу, эзволяющему оценить устойчивость молекулы к действию протеолитических |ерментов. На рис. 16 видно, что после адаптации значительно увеличена эзистентность Са-АТФазы к автолитическому повреждению - активность Са-насоса зеле адаптации в 2-3 раза выше, чем в контроле и при стрессе при всех временах зздействия. Это подтверждается данными по автолитическому повреждению в эисутствии высокой концентрации Са2+ при нейтральных рН, т.е в условиях, эобходимых для дополнительной активации протеолитической кальпаиновой «темы. На рис. 2 видно, что добавление 1мМ Са2* (1мМ) модулирует динамику нактивации Са-насоса СР в различных экспериментальных группах: при стрессе входная активность фермента практически не изменяется, но через 10 мин автолиза эдает на 34%. Можно предполагать, что это связано с активацией рН-нейтральной а-активируемой системой протеаз - кальпаиновой системы, которая реализует свое ействие при увеличении времени автолитического воздействия. У адаптированных ивотных добавление Са2* вызывает небольшое первоначальное снижение ктивности транспорта Са2*" в СР, которое в процессе автолиза нивелируется и ктивность Са-насоса СР восстанавливается практически до контрольного уровня. В эзультате по абсолютному значению скорость транспорта Са2* в СР скелетных ышц адаптированных животных даже после 10 мин автолитического воздействия в

„а

присутствии высокого уровня Са намного выше, чем в контроле и п| стрессе - в 1,5 и 2,7 раза, соответственно. Таким образом, высокая адаптационн; информационная устойчивость Са-насоса СР скелетных мышц, выявленная экспериментах по термоденатурации, сопровождается значительн( резистентностью фермента к действию протеаз. При изучении действия автолиза 1 мембранные структуры сердца зарегистрирована значительно более высок; резистентность Са-насоса СР миокарда по сравнению со скелетными мышцам Действительно, скорость автолитического повреждения Са-насоса СР миокарда и контрольных, и у стрессорных животных оказалась в 2 раза ниже, чем в скелетнс мышце. Скорость транспорта Са2* в СР миокарда стрессированных животных к \ глин составляет 19% от исходного уровня, что в 1,6 раза ниже аналогично! показателя в контроле, а в скелетных мышцах после стресса уже к 10 мин автопи; активность фермента в 2,1 раза ниже, чем в контроле. Таким образом, анал! полученных данных выявил повреждающий эффект стрессорного воздействия протекторный эффект адаптации на эффективность функционирования Са-насос СР и миокарда, и скелетных мышц при действии повреждающих факторов термоденатурации и автолиза в гомогенатах этих тканей.

Стресс-индуцированное снижение исходной скорости транспорта Са2* в СР н зарегистрировано как в цельных гомогенатах, так и микросомальных препаратах С миокарда (т.е. в отсутствии РЦФ). Однако, несмотря на то, что в гомогенатг скелетных мышц отсутствует стрессорное снижение скорости транспорта Са2* в СР, микросомальных препаратах СР скелетных мышц (рис. 4а,б) начальная активное! Са-насоса СР при стрессе уменьшается более, чем в 1,7 раза по сравнению контролем. Следовательно, в мышечных клетках должны содержатьс дополнительные протекторные механизмы, позволяющие поддерживат эффективность функционирования Са-транслортирующей системы СР. Поэтому дл оценки вклада РЦФ в изменение состояния мембранных ферментов при стрессе адаптации мы изучили их действие на Са-насос в выделенных мембранны препаратах СР.

Влияние РЦФ на активность и резистентность Са-транспортирующей систем! СР миокарда

Начальная скорость транспорта Са2* в СР в выделенных микросомальны грепаратах миокарда во всех группах в присутствии и в отсутствии РЦФ н вменяется, однако, термоустойчивость Са-насоса значительно различается.

Как видно из рис. 3 в контроле добавление РЦФ не изменило достоверн! начальную скорость транспорта Са2* в СР, однако термоустойчивость это! мембранно-связанной системы увеличилась на 15-20%. При стрессе, гд< термоустойчивость самой мембраны значительно снижена, добавление растворимы: компонентов приводит к настолько значительному повышению термостабильносп Са-насоса, что исходная активность полностью сохраняется в течение первых 1( мин, и даже к 20 мин термоинактивации активность транспорта Са2* составляет 42% что в 1,2 раза выше, чем в соответствующей точке контрольной группы и в 2 раз; Еыше, чем при стрессе без РЦФ. При адаптации к стрессу, где устойчивость самоь мембраны уже значительно повышена, добавление растворимых компонента! значительно меньше активирует Са-насос: скорость транспорта Са2* в СР увеличивается к первым 5 мин, сохраняется практически на исходном уровне к 1С мин

100 90

2яо

о

§70

X

Х60

н

о

5" 50 а

¿40

га

О

¿30 и

■¡20 н

10

А

й

-В

П контроль Пстресс

□ адаптация

□ стресс+адатация

**

**

а

5

5 10 15

время инкубации, мин

Рис. 1 Резистентность Са-насоса СР скелетных мышц, измеренного в гомогенатах к термоденатурации (41°С) (А) и автолизу (Б) в контроле, при стрессе, адаптации к стрессу и при стрессе на фоне предварительной адаптации. Указана достоверность отличий от контрольных значений: '-р<0,05, " - р<0,02.

70

60

х

с о 2

: 50

40

, 30

о

Й20

10

контроль

ы,

□ без Са Ос Са

А

0 10 время, мин

О 10

время, мин

70

60

и

1бо

2

^

о 40 г

Л зо

та О

| 20 та

10

адаптация

й

□ без Са Пс Са

В

о

ю

время, мин

Рис. 2 Влияние высокого уровня Са2+ на активность и резистентность транспорта Са к авпюлитическому повреждению в гомогенатах скелетных мышц в контроле (А), при стрессе (Б) и адаптации к нему (В).

\

О

Рис. 3 Влияние РЦФ на активность и терморезистентность Са-насоса выделенной фракции СР миокарда в контроле (А), при стрессе (Б), адаптации к стрессу (В) и при стрессе на фоне предварительной адаптации (Г). Указана достоверность отличий от контрольных значений: ' - р<0,05, " - р<0,02.

5 10 15 время инкубации, мин

5 10 15

время инкубации, мин

адаптация

—•—без РЦФ -О—с РЦФ

5 10 15 время инкубации, мин

Рис. 4 Влияние РЦФ на активность и тврморозистентность Са-насоса выделенной фракции СР скелетных мышц в контроле (А), при стрессе (Б), адаптации к стрессу (В) и при стрессе на фоне предварительной адаптации (Г). Указана достоверность отличий от контрольных значений: ' - р<0,05, " - р<0,02.

700

600

¡200

100

700

600

«N300

100

в

—беэРЦФ -в—РЦФ(С) -РЦФ(А) -РЦФ(К)

5 10 15 время инкубации, мин

20

адаптация

—♦—без РЦФ

—«3—РЦФ(С)

—Л—РЦФ(А) .............'I'1'.............

5 10 15 время инкубации, мин

700

Рис. 5 Перекрестный эффект РЦа при действии на активность и тер морезистентность Са-насоса выдв ленной фракции СР миокарда в кон тропе, при стрессе и адаптации I нему. Указана достоверность отли чий от контрольных значений: • -р<0,05, ** -р<0,02.

Рис. 6 Перекрестный эффект РЦ при действии на активность и те, морезистентность Са-насоса выд ленной фракции СР скелетных мыи. в контроле, при стрессе и адапт. ции к нему. Указана достоверносп отличий от контрольных значений: * - р<0,05, ** - р<0,02.

2,5

2 2 х х 2

§1.5 *

5

Я 1

с и

I4

с; о 2

*3 +

сч л О

52

X га

в

контроль

------ Я V,

щ

А л

И без крист И с крист

гЬ

м

О 10 20

время инкубации, мин

стресс

□ без крист В с крист

□ с бса

а

О 10 20

время инкубации, мин

2.5

О с

¡0,5

2

"2

1«

с о

13

адаптация

ЕЭ без крист В с крист

т

>

<

;

>?

гМ

0 10 20 время инкубации, мин

I

■"Зг:

стресс+адаптация

И без крист В с крист

Ос бса

Л

йЬ

П

и

N

п.

О 10 20

время инкубации, мин

2

51.5

Рис. 7 Влияние а-кристаллина на скорость и термоустойчивость Са-насоса в выделенных мембранных препаратах СР скелетных мышц в контроле (А), при стрессе (В), адаптации к стрессу (Б) и после стресса на фоне адаптации (Г). Указана достоверность отличий от значений без а-кристаллина: * - р<0,05.

Рис. В. Зависимость степв/м активации Са-насоса СР (мкмопь/мин/мг белка) скелетных мышц от увеличения дозы а-кристаллина (мг на 0,1 из белка) .

16

14

12

£ 10 о 2

= 8 +"

сч

™ о

О 6 С

< А

адаит+стресс

гВ

^ СЗ без крист ^ 0 с крист

XI

О 10

время инкубации, мин

О 10

время инкубации, мин

Рис. 9 Влияние а-кристаллина на скорость и термоустойчивость Са-насоса в микросомалыюй фракции СР в гомогенатах скелетных мышц (А) и миокарда (Б) в группе стресса на фоне адаптации.

600

,.500

1 г

2 400

л с; о

|зоо +

м

(П

О

с 200 и X та

е-ь 100

контроль

й

«

И

Р Ш

$ К*

О.

¥ $

□ контроль Ирцф

□ рцф+крист

3*1

О 10 20

время инкубации, мии

600

^.500 х

I400

с о 2

1300 +"

N

га О

с 200

и

г

Ь100

адаптация

яЬ

□ адаптация Прцф

□ рцф+крист

лъ

ж

О 10 20

время инкубации, мин

600

!_500 |

х

2400

л С О 2

= 300 +"

м

то О

¿200

100

В

1?

£

стресс

г!

т

0 стресс Ирцф □ рцф+крист

5

** й

&

ш

О 10 20

время инкубации, мин

600

О 10 20

время инкубации, мин

у

>

Рис. 10 Сопоставление прямого действия РЦФ и совместного добавления а-кристаллина и собственных РЦФ на активность и термоустойчивость Са-насоса СР скелетных мышц в контроле (А), при стрессе (В), адаптации к стрессу (Б) и после стресса на фоне адаптации (Г). Указана достоверность отличий от значений без РЦФ и а-кристаллина: * - р<0,05. " - р<0,02.

(93%) и в дальнейшем снижается к 20 мин до уровня, в 1,5 раза более ысокого, чем в контроле. Важно, что при стрессе на фоне адаптации ермоустойчивость как в присутствии, так и в отсутствии РЦФ остается на уровне даптированных мембран, т.е. полностью предупреждаются стресс-индуцированные овреждения Са-насоса, в то же время активирующий эффект РЦФ не оказывает начительного протекторного действия.

В результате, во всех группах цитоплазматические компоненты оказывают эщитный эффект на систему транспорта Са2* в CP миокарда, который различается о степени выраженности в зависимости от состояния организма in vivo: чем начительнее исходно поврежден транспорт Са2*" в CP, тем больше защитный ффект РЦФ. Максимален он при стрессе, т.е. в ситуации, при которой зрмоустойчивость Са-насоса была минимальной и наименее выражен этот эффект эи адаптации к стрессу (т.е. при максимальной термоустойчивости), а контроль знимает промежуточное положение. Такой значительный защитный эффект при грессе может быть связан с накоплением в цитозоле белков срочного ответа, синтез ггорых характерен для острых воздействий, например, продуктов протоонкогенов с-s, c-myc [Das et al., 1993], специфических белков-стабилизаторов [Bhattacharyya, эп, 1998], неспецифических белков семейства Hsp, антиоксидантов [Graven et al., 593; Plumier et al., 1996], различных шаперонинов группы GroL [Hook, Harding, 1997] термостабилизаторсв, в частности, а-кристаллина [Longoni et al., 1990].

Влияние РЦФ на активность и резистентность Са-транспортирующей системы Р скелетных мышц.

Мембранные препараты саркоплазматического ретикулума скелетных мышц леют значительно меньшую термоустойчивость, чем в миокарде, что аналогично юнице в терморезистентности этих ферментов в гомогенатах при измерении их в могенатах. По-видимому, это может быть связано с большей защитой миокарда от ислительных повреждений [Архипенко и др., 1997; Голанцова, Сазонтова, 1998]. >бавление РЦФ к мембранным препаратам CP скелетных мышц имеет отекторный эффект, однако, в отличие от сердца он реализуется не в отношении рмоустойчивости, а лишь исходной скорости транспорта Ca2t в СР. На рис. 4 видно, э в контроле, при стрессе и адаптации к нему, добавление РЦФ активирует анспорт Са2* в 1,5, 2,6 и 1,35 раза, соответственно. В скелетных мышцах также ализуется закономерность, обнаруженная нами в отношении сердца, а именно: ксимальный восстанавливающий эффект реализуется при стрессе, который иводит и к наибольшему (1,7-х кратному) снижению исходной активности ;рмента, минимален защитный эффект при адаптации, а контроль занимает эмежуточное положение. В результате, в присутствии РЦФ исходная активность -насоса CP при самых различных состояниях организма - в контроле, при стрессе и аптации - поддерживается на одном и том же уровне, что в отсутствии полнительных повреждающих воздействий позволяет мембранным структурам глетных мышц и после стресса функционировать на контрольном уровне, однако, змоустойчивость системы транспорта Са2* в CP ни в контроле, ни после стресса и зптации к стрессу в присутствии РЦФ не увеличивается.

Таким образом, завершая все выше сказанное, можно констатировать, что мбраннопротекторное действие адаптации на Са-насос CP формируется не только уровне самого мембранно-связанного фермента, но и может модулироваться с ющью РЦФ клетки. При этом РЦФ в значительной степени восстанавливают ивность и резистентность Са-транспортирующей системы CP мышечных клеток.

1В

Несмотря на выраженную тканеспецифичность проявления это;

эффекта, и в сердце, и в скелетной мышце стресс-индуцированные нарушеж работы мембранных ферментов компенсируются и поддерживается необходим; эффективность их функционирования.

Перекрестный эффект РЦФ на мембранно-связанный Са-насос С скелетных мышц и миокарда

Выше были описаны прямые эффекты РЦФ на транспорт Са2* в СР миокарда скелетных мышц контрольных, перенесших стресс и адаптированных к нег животных. Эксперименты с растворенными компонентами цитоплазмы разноименнь экспериментальных групп показали, что РЦФ могут иметь значительнь перекрестный эффект и модулировать транспортную активность Са-насоса С миокарда и скелетных мышц.

Перекрестные эффекты РЦФ на Са-насос СР миокарда

На рис. 5 показан перекрестный эффект стрессорных (РЦФс) и адаптационнь (РЦФА) компонентов цитоплазмы на мембраны СР сердец контрольнь стрессированных и адаптированных животных. Видно, что РЦФС oблaдa^ Еыраженным термостабилизирующим эффектом строго специфично только отношение стресс-поврежденных мембранно-связанных ферментов, при действии > на контрольные препараты СР не проявляют протекторного действия, а адаптированных даже снижают исходную активность Са-насоса СР (на 25%). другой стороны, РЦФд показали максимальный активирующий эффект и в контроле при стрессе, и при адаптации к нему, вызывая нехарактерное для прямых эффект собственных РЦФ увеличение исходной активности Са-насоса СР. Кроме Т01 наблюдается максимальное повышение конформационной стабильности Са-насо С.Р, который в контроле в наибольшей степени выражен на начальных этап термовоздействия, а при стрессе - на поздних (10-20 мин) этапах термовоздейств!* При этом у стрессированных животных речь идет не просто о восстановлен термоустойчивости Са-насоса до контрольного уровня, но и о дополнительн стабилизации этой ферментативной системы в результате действия РЦФд.

Таким образом, адаптация к иммобилизационному стрессу приводит, преж, всего, к повышению резистентности самого мембранно-связанного Са-насоса С Присутствие же РЦФ от адаптированных животных еще больше повыша термоустойчивость Са-насоса в СР миокарда животных всех экспериментальн! групп, увеличивая также исходную скорость транспорта. При этом исследован перекрестного эффекта РЦФА также показало зависимость действия РЦФ разн экспериментальных групп от состояния мембран СР. Так, максимальн выраженность эффекта РЦФА зарегистрирована при стрессе на поздних сроках ( мин) термовоздействия. Аналогично, влияние стресса сказывается в значительн степени на уровне мембранных структур СР, причем не столько на начальн скорости транспорта Са2* в СР, сколько на снижении его устойчивости термоинактивации, и на РЦФс, которые имеют повреждающее действие; и толькс препаратах СР стрессорной группы добавление РЦФС оказывает ярко-выраженн защитный эффект на Са-насос.

Аналогичные закономерности наблюдаются при перекрестном действ цитозольных факторов в скелетной мышце (рис.6). Так, РЦФс обладают выраженж активирующим эффектом только при действии на микросомальные мембраны свс же стрессорной группы, при действии же на контрольные и адаптированн

ipenapaTbi CP не проявляют протекторного действия. Добавление >ЦФ от адаптированных животных приводят к значительному повышению начальной скорости транспорта Са2* (в 1,5 - 2,5 раза) в контроле, при стрессе и адаптации к 1ему, в результате чего активность Са-насоса CP во всех группах не отличаются друг it друга в РЦФд. Кроме того, РЦФд увеличивают термостабильность мембран CP и от онтрольных (на 20%), и от стрессорных (на 70%) животных по сравнению с ¡ктивирующим эффектом их собственных РЦФ.

На наш взгляд, механизм действия РЦФд для контрольных и стрессированных сивотных может реализоваться через несколько возможных направлений. Во-первых, даптация повышает эффективность антиоксидантной системы, многие компоненты оторой являются растворимыми и участвуют в поддержании устойчивости от .ействия повреждающих, в частности, окислительных факторов [Сазонтова, 1987; iuckman et al, 1993; Lopez-Torres et al., 1993], что косвенно может стимулировать Са-асос СР. Во-вторых, показано, что различные виды адаптации сопряжены с интезом низкомолекулярных шаперонных структур, которые имеют как пецифические, так и неспецифические эффекты. К первым относятся белки, пособные специфически модулировать активность Са-насоса CP [Bhattacharyya, en, 1998], ко вторым - Hsp 23, 25, 27 и другие низкомолекулярные белки-эрмостабилизаторы и мембранопротекторы как, например, недавно обнаруженный в келетных мышцах «-кристаллин [Longoni et al., 1990; Hook, Harding, 1997].

Таким образом, активирующее действие РЦФд на мембранные клеточные /ютемы является универсальным свойством цитоплазмы клеток как миокарда, так и <елетных мышц, при этом эффект РЦФд распространяется на мембранные эепараты всех экспериментальных групп. Важно отметить, что в скелетных мышцах элее заметна «цена адаптации», выражающаяся в увеличении чувствительности ембранных препаратов CP скелетных мышц адаптированных животных к нгибирующему действию РЦФ повреждающей природы. Возможно, это связано с :м, что сердце как один из самых жизненноважных органов обладает механизмами, Зеспечивающими его максимальную защиту как при физиологических, так и при атофизиологических условиях [Архипенко и др., 1987; Каган, 1989; >ланцова.Сазонтова, 1998]. Кроме того, длительная адаптация приводит к переходу г синтеза белков срочного ответа на синтез белков «долгосрочного» ответа, которые леют преимущественный эффект на повышение стабильности мембранно-¡язанных ферментов, как это ярко видно на примере сердца.

Цитоплазматические факторы от стрессированных животных, в отличие от РЦФд : оказывают дополнительного активирующего действия на Са-насос CP в контроле при адаптации к стрессу, что совпадает с ситуацией в миокарде. При зделирование стрессорного повреждения Са-насоса CP скелетных мышц с >мощью частичного окисления контрольных мембранных препаратов при индукции ЭЛ in vitro мы не обнаружили защитный эффект РЦФС. что подтверждает 1ецифичность их действия, проявляющегося только при наличии комплекса >вреждений, реализующихся в стрессорных ситуациях in vivo.

Итак, РЦФс обладают специфическим защитным эффектом только на Са-насос D стрессорных животных, при этом следует отметить, что РЦФС скелетных мышц )ладают меньшей эффективностью поддержания термоустойчивости Са-насоса CP, i сравнению с РЦФс сердца. Отсутствие ярко выраженных защитных перекрестных эфектов РЦФс, по-видимому, связано с тем, что, во-первых, при остром

стрессорном воздействии не только накапливаются протекторные белк срочного ответа, но и меняется восприимчивость к ним мембранно-связанны ферментов (возможно, изменяется их конформационное и олигомерное состояние, также регуляция с помощью фосфоламбана, кальмодуллина и др.) [Pengarkul et al 1977; Cory et al., 1994] Во-вторых, наряду с синтезом протекторных соединение стресс неизбежно сопровождается накоплением в цитоплазме клеток фактороЕ снижающих устойчивость Са-насоса к повреждающим воздействиям. Возможно, эт связано с тем, что стресс приводит к увеличению содержания свободного Са2 которое ведет к прямому ингибиторному действию на Са-насос CP, а также може способствовать процессу олигомеризации молекул Са-АТФазы и таким образо! создавать новые пути истечения Са2* из везикул CP [Geimonen et al., 1994]. Кром того, повышенный уровень Са2* приводит к активации Са-зависимых нейтральны протеаз (кальпаинов). Кальпаины могут участвовать в протеолитической деградаци молекул Са-АТФазы (как в оптимальных, так и большей степени, в условия) сопровождающихся перегрузкой внутриклеточного Са2*), а также разобщат синхронизацию процессов гидролиза АТФ и транслокации Са2* [Falchetto, Vorher 1992].

Таким образом, эндогенные цитозольные факторы обладают как прямым, так перекрестным действием на мембранно-связанные ферменты при различно состоянии мембран. В третьей части работы была изучена возможность реализаци защитного действия одного из цитозольных компонентов - а-кристаллина.

Проявление шапероновой активности а-кристалпина на Са-насос CP пр стрессе и адаптации к нему.

Действие а-кристаллина на Са-насос CP скелетных мышц при стрессе адаптации к нему.

а-Кристаллин, составляющий до 30 % всех растворимых белков хрусталик глаза и до 5% всех растворимых цитоплазматических белков миокарда [Longoni et.al 1990], имеет ярко выраженную шапероновую активность по отношению к широком спектру белковых структур (антиоксидантные ферменты, структурные белю ферменты энергетического обмена и т.д.) [Hook, Harding, 1997; van der Klundertet. al 1998; Lee et al., 1998]. Важно, что защитное действие а-кристаллина реализуете только в отношении белков с нарушенной структурой в результате термовоздействи! снижения рН, окислительных модификаций и др. [Conconi et.al., 1998; Lee et.al., 199! Rajaraman et.al., 1998].

Перед оценкой действия а-кристаллина на мембранную систему транспорта Са' в CP скелетных мышц контрольных, стрессированных и адаптированных животнь была проведена калибровка доза-эффект. Оказалось (рис. 8), что достижени максимального эффекта а-кристаллина при увеличении его количества происходит узком концентрационном интервале 4,4 - 5,6 мг а-кристаллина на 1 мг белка | среднем 5:1) и не увеличивается при дальнейшем повышении соотношения с кристаллин/белок до 7-10 к 1. Эти данные вполне согласуются с оптимальны соотношением а-кристаллин/белок, при котором проявляется максимальны защитный эффект на растворимые и цитоскелетные белки [Hook, Harding, 199' Longoni et al., 1990].

Как видно из рис. 7 в скелетной мышце ни в контроле, ни после адаптации < кристаллин (при добавлении в соотношении 5 мг на 1 мг белка) не оказывае дополнительного активирующего действия, что связано либо с отсутствие

цогенных активаторов а-кристаллина (в контроле), либо уже достаточно вышенной термоустойчивостью мембран CP (при адаптации). В то же время, йствие а-кристаллина на фоне острого стресса показывает совершенно другую зтину. Во-первых, в присутствии а-кристаллина полностью предупреждается )есс-индуцированное падение активности Са-насоса CP и восстанавливается тгрольный уровень этого параметра, хотя восстановления термоустойчивости рмента при этом не происходит. Во-вторых, в группе стресс на фоне адаптации а-1сталлин проявляет ярко выраженный (3-х кратный) активирующий эффект на содную активность Са-насоса CP, не изменяя термоустойчивость фермента, жно предположить, что острое стрессорное воздействие приводит к накоплению 5Комолекулярных шапероновых белков различной природы, часть из которых жет являться активаторами а-кристаллина [Ito et al., 1997; Mehlen et al., 1995]. При мелировании стресса (автолиз контрольных мембран in vitro) а-кристаплин теряет >ю активирующую способность в отличие от активирующего действия а-юталлина на начальную скорость транспорта Са2+ в CP в экспериментальных ппах, подвергавшихся повреждающему воздействию (стрессу) in vivo. ^ствительно, после 20 мин автолиза при 37°С скорость транспорта Ca2* в CP 1жена в 2 раза т.е. в той же степени, что и при стрессе. Однако, и в ситуации in vitro цитный эффект а-кристаллина также может проявляться, если его добавлять честно с РЦФ, как например, в контрольной группе, где значительно (в 1,4 раза) ¡ышается устойчивость Са-насоса CP к автолитическому воздействию.

Таким образом, из полученных результатов видно, что шаперонная активность эисталлина в отношении Са-транспортирующей системы CP скелетных мышц бенно ярко проявляется при наличии острого стресса у контрольных и штированных животных, т.е. в тех случаях, которые могут сопровождаться реждениями структуры этого ферментативного комплекса и его мембранных /ляторов (при стрессе у контрольных животных) или же накоплением активаторов эисталлина (при стрессе у адаптированных животных). Возможность активации а-сталлина с помощью РЦФ подтверждается в экспериментах с гомогенатами ппа стресс на фоне адаптации), т.е в условиях когда а-кристаллин может. имодействозать с эндогенными цитозольными факторами, при котором также аружен выраженный защитный эффект а-кристаппина (рис. 9а). Хотя активация насоса в гомогенате в присутствии а-кристаллина слабее, чем в мембранной жции, но она сопровождается повышением терморезистентности фермента {на >), чего не наблюдается в мембранных препаратах, т.е., по-видимому, действие а-зталлина в гомогенатах наиболее приближено к нативному состоянию, чего не пюдается в изолированных мембранных препаратах.

Протекторный эффект а-кристаллина на Са-транспортирующую систему CP карда

Защитное действие а-кристаллина обнаружено и в гомогенатах миокарда, где лоустойчивость Са-насоса CP (группа стресс на фоне адаптации) в присутствии а-:таллина повышена в 2 раза (рис. 76). Однако, на мембранные препараты карда а-кристаллин не оказывает защитного действия, что может объясняться птацией мембранных структур к а-кристаллину в связи с высоким содержанием аналога в сердце [Zhang, 1999]. При комплексном действии а-кристаллина и згенных цитозольных факторов проявляется стабилизирующий эффект на .юустойчивость Са-насос микросомальных препаратов CP миокарда в группах :сса и стресса на фоне адаптации (рис.10). Действительно, при стрессе в

присутствии только РЦФ и а-кристаллина к 20 мин термовоздействия активное транспорта Ca2* составляет 75% от исходной, что в 1,7 раза выше, чем при стреса присутствии РЦФ и в 3,3 раза выше, чем при стрессе без РЦФ. Сходный резулы зарегистрирован и в группе стресса на фоне предварительной адаптации, одна выраженность стабилизирующего эффекта с/.-кристаллина в присутствии РЦФ зде несколько ниже, возможно, в связи с уже увеличенной в результате адапта:-термоустойчивостью Са-насоса: к 20 мин термоинактивации сохраняется 64% первоначальной скорости транспорта Ca2* в CP, что на 27% выше, чем без РЦФ i 1,7 раза выше, чем в присутствии только РЦФ.

Таким образом, в миокарде защитное действие а-кристаллина реализует только при наличии ряда условий. Во-первых, протекторный эффект а-кристаллу регистрируется только в отношении стресс-поврежденных мембран CP, при этом э-эффект тем выше, чем сильнее нарушена Са-транспортирующая система СР. С подтверждается и тем, что максимальный защитное действие а-кристалг проявляет на самых поздних стадиях термоинактивации, когда конформационь устойчивость Са-АТФазы значительно нарушается. Во-вторых, для активации кристаллина необходимо наличие РЦФ, причем в их состав должны входить только те компоненты, которые характерны для контрольных животных, но дополнительные низкомолекулярные соединения, синтез которых активируется г острых повреждающих воздействиях. По-видимому, это связано с тем, что РЦФ стрессированных животных содержат защитные белки срочного ответа, обладают активирующим действием на молекулы а-кристаллина. Например, это недас показано в отношении'молекул семейства hsp (25, 27) [van de Klundert et al., 19 Hermes-Lima, Storey, 1993; Siems et al., 1993; Spasic et al., 1993], а так шаперонинов группы GroEl [Hook, Harding, 1997). Эти белки могут способствов; фосфорилированию а-кристаллина, либо переводу его в мембранно-связанн форму, что в обоих случаях приводит к его активации. Кроме того, вполне вероят участие высокого уровня восстановленных SH-rpynn в повышении защити! действия а-кристаллина [Pal et al., 1998].

В группе адаптации отсутствие дополнительного активирующего эффекта кристаллина можно объяснить несколькими факторами. Во-первых, адаптация у приводит к значительному увеличению терморезистентности Са-насоса CP, при эт скорость транспорта Ca2* в CP сохраняется на очень высоком уровне, что позвол! говорить о достаточно малом «резерве» увеличения эффективт функционирования этой системы. Во-вторых, в экспериментах по прямому влиян РЦФ показано, что адаптация реализуется скорее на мембранном уровне, нежели уровне РЦФ, в частности, при адаптации не нарабатываются прямые активаторы кристаллина. В-третьих, следует отметить, что РЦФ адаптированных животн обладает перекрестным защитным действием на препараты CP контрольных стрессированных животных. Мы полагаем, что этот эффект связан с накоплени белков «долгосрочного» ответа, которые, по-видимому, не обладают активируюш дйствием на молекулы а-кристаллина, а реализуют свое действие на мембранн уровне.

Таким образом, применение а-кристаллина может быть особенно эффектиЕ при комппексной профилактике стрессорных повреждений, включаюи адаптационные воздействия различной природы для снижения «цены» адаптации проявления максимального защитного эффекта от последующих повреждений

Выводы

1. Острый стресс приводит к уменьшению резистентности Са-насоса CP в логенатах и в мембранных препаратах из миокарда и скелетных мышц к вреждающим воздействиям: автолизу, термоденатурации, высокому уровню Са2*. рессорные повреждения на мембранном уровне более выражены в скелетных |шцах по сравнению с миокардом. Адаптация к стрессу значительно повышает гивность и резистентность Са-насоса CP в обеих тканях и предупреждает стресс-цуцированное нарушение работы этого фермента.

2. Цитоплазматические компоненты оказывают протекторное действие на фективность функционирования Са-насоса мембранных препаратов CP миокарда скелетных мышц в контроле, при стрессе и адаптации к нему. Степень раженности защиты тем больше, чем значительнее повреждена система жспорта Са2+ в CP - максимальное увеличение активности фермента (в скелетных шцах - в 2,6 раза) и максимальное повышение термостабильности (в миокарде - в

раза) зарегистрировано при стрессе.

3. РЦФ обладают не только прямым, но и перекрестным защитным эффектом, i этом стрессорные цитоплазматические компоненты оказывают защитное 1ствие строго специфично только в отношении стресс-поврежденных мембранно-1занных ферментов, а цитозольные компоненты от адаптированных животных эют ярко выраженный протекторный эффект в контроле, при стрессе и адаптации к лу. В миокарде он проявляется в значительном увеличении информационной ойчивости Са-насоса, а в скелетной мышце - в повышении исходной скорости [нспорта Ca2t в CP (в1,5 - 2,5 раза) во всех группах.

4. а-Кристаллин оказывает протекторное действие на эффективность нкционирования системы транспорта Са2* в CP миокарда и скелетных f/ышц. В ¿бранных препаратах CP скелетных мышц в группе стресс на фоне адаптации а-стаппин повышает исходную активность Са-насоса CP, а в гомогенатах, кроме э, увеличивает терморезистентность этого фермента. В миокарде эффекты а-сталлина проявляются только при наличии дополнительных цитоплазматических иваторов (синтез которых наблюдается при стрессе), т.е. реализуются в огенатах или при совместном действии РЦФ и а-кристаллина, повышая (в 2 - 3 а) в обоих случаях терморезистентность Са-насоса СР.

5. Обнаружен репарационный эффект а-кристаллина на Са-насос CP в петной мышцы, который выражается в восстановлении активности и истентности этого фермента, сниженных в результате окислительной (ификации in vitro или стрессорного воздействия in vivo.

Список раЬот, опубликованных по теме диссертации

1. Vitamin Е as a modifier of Са2+ transport in sarcoplasmic reticulum of the heart ar skeletal muscles: effect on purified microsomal fraction and homogenates. // Abstr. Tt F-'irst regional meeting of medical sciences: The roles of free radicals in health ar disease.-Jerusalem, Israel, 1998.-P.15. (соавт. Сазонтова Т.Г., Голанцова H.E Архипенко Ю.В.)

2.Роль цитоплазматических факторов в стабилизации Са2*-транспортирующЕ функции саркоплазматического ретикулума миокарда крысы при адаптации к стресс I! Бюл. эксперим. биол. мед.-1999.-Т.127.-Ы2.-С.155-159. (соавт. Сазонтова Т.Г.)

3.Шаперонная активность а-кристаллина в отношении Са-насо< саркоплазматического ретикулума скелетных мышц при стрессе и адаптации. II Бю оксперим. биол. Mefl.-1999.-T.120.-N5.-C.156-159. (соавт. Сазонтова Т.Г., Архипен! Ю.В., Бабижаев М.А.)

4.Calpains: physiological and pathophysiological significance. II Pathophysiology 1999.-N3.-P.91-102. (соавт. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В.)

5.Перекрестные эффекты защитных цитоплазматических факторов клетки п[ адаптации животных к стрессорным воздействиям. II Всероссийская научн; конференция, посвященная 150-летию со дня рождения И.П.Павлова. Тез.-С Петербург, 1999.-С.82. (соавт. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В.)

6.Мембранная адаптация при действии факторов внешней среды. Е!сероссийская научная конференция, посвященная 150-летию со дня рожден! И.П.Павлова. Тез.-С.-Петербург, 1999.-С.57. (соавт. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В.;

7.Тканеспецифичность шапероновых эффектов а-кристаллина на стрес поврежденный Са-насос саркоплазматического ретикулума миокарда и скелетнь мышц. И Свободные радикалы и болезни человека. Тез. конф.-Смоленск, 1999.-С.6 (соавт. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В.)

8.Эндогенная защита мембранно-связанных ферментов от свободн радикальных повреждений, индуцированных стрессом. II Свободные радикалы болезни человека. Тез. конф.-Смоленск, 1999.-С.41. (соавт. Сазонтова T.I Архипенко Ю.В.)

Э.Мембранопротекторное действие адаптации к гипоксии и стрессу. II Втор; всероссийская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». Те юнф.-Москва, 1999.-С.64. (соавт. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В.)

Актуальность проблемы

Поиск немедикаментозных методов защиты организма приобретает все большее значение, являясь важной проблемой теоретической и практической медицины. В последние годы экспериментально показано, что в результате адаптации организма к стрессорным и другим повреждающим воздействиям происходят изменения не только на уровне целого организма [Меерсон, Пшенникова, 1988], изолированных органов и тканей, но и на уровне внутриклеточных мембранных структур [Сазонтова, 1998]. Одновременно интенсивно развивается изучение отдельных низкомолекулярных компонентов цитоплазмы клеток и их роли в повреждении и защите клетки. Однако, до сих пор практически отсутствуют данные о механизме действия растворимых цитоплазматических факторов (РЦФ) в мембрано-стабилизирующем эффекте адаптации. До настоящего времени не известны способы и даже сама возможность репарации нарушенных функций на уровне внутриклеточных структур при стрессорных повреждениях.

Известно, что острое стрессорное воздействие различной природы приводит к нарушениям функционирования сердечно-сосудистой системы, снижению электрической стабильности сердца, нарушению метаболизма в кардиомиоцитах, и в конечном итоге к развитию ишемической болезни, кардиопатий, аритмий и т.д. [Меерсон, 1986]. В последнее десятилетие показано, что стресс-индуцированное повреждение на внутриклеточном уровне проявляется в значительном снижении эффективности функционирования мембранных ион-транспортирующих систем - Ма,К-АТФазы плазматической мембраны, Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума (СР), Са-АТФазы плазматической мембраны и митохондрий [АгкЫрепко et а1., 1985; Сазонтова Т.Г. и др., 1989; РатИат, 1ипес, 1986; а1., 1995]. При этом наряду со снижением устойчивости ферментов к действию 6 эндогенных повреждающих факторов, значительно уменьшается также и скорость функционирования этих важнейших систем ферментов поддержания клеточного ионного баланса. Степень ингибирования достигает 30-50%, что в отсутствии компенсации приводит к снижению порога выживаемости. Такое существенное падение активности ферментов, наблюдаемое in vitro в изолированных мембранных фракциях, вызывает закономерный вопрос о совместимости этого явления с обнаруженным поддержанием некоторых физиологических функций после стресса. Этот вопрос особенно актуален при изучении Са-транспортирующей системы CP миокарда, ответственной за поддержание Са-гомеостаза в клетке и реализацию цикла сокращение-расслабление. Действительно, показано, что даже длительный эмоционально-болевой стресс в течение 4-х или 6 часов [Белкина и др., 1983] не вызывает достоверного изменения сократительной функции сердца - развиваемое давление и частота сердечных сокращений остаются на контрольном уровне.

Следовательно, в стрессированном сердце резкое падение активности ферментов ионного транспорта должно быть хотя бы частично скомпенсировано, чтобы поддерживать физиологические функции на прежнем уровне. Поскольку при острых воздействиях компенсация не может быть осуществлена за счет быстрого массированного синтеза новых молекул ферментов ионного транспорта, можно полагать, что восстановление функции поврежденных при стрессе мембрано-связанных ферментов происходит за счет различных РЦФ, которые, как показано в последнее время, быстро накапливаются в клетке при стрессе, ишемии, тепловом шоке, индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Mulvagh et al. 1987; Graven et al., 1993; Melia et al., 1994; Nanji et al., 1995; Plumier et al., 1996; Bhattacharyya, Sen, 1998]. Однако, данные о влиянии на мембранные системы клетки различных низкомолекулярных соединений разрозненны и зачастую противоречивы, что связано с тем, что роль РЦФ практически не 7 рассматривается в целом, а выделяются и изучаются лишь отдельные цитоплазматические компоненты. Поэтому оценка суммарного эффекта РЦФ может являться актуальным информативным тестом.

Еще меньше данных о роли РЦФ при адаптации к различным факторам среды. При этом нужно учитывать, что адаптационные изменения в значительной степени реализуются на уровне самих мембран и связанных с ними ферментов - происходит смена изозимного состава, изменяется чувствительность к субстратам и регуляторам и т.д. Однако, так же, как и в ситуации со стрессорными повреждениями, вопрос о соотношении вклада в адаптационное изменение работы фермента процессов, происходящих на уровне самого мембранно-связанного белка и участия в мембранной адаптационной защите других факторов клетки, в частности, РЦФ, остается открытым. Кроме того, не ясна возможность существования не только прямого, но и перекрестного адаптационного защитного эффекта на внутриклеточном уровне, и его модулирования с помощью экзогенно добавленных мембранопротекторов.

В связи с этим цель работы заключалась в том, чтобы оценить прямой и перекрестный эффекты цитоплазматических факторов, накопленных в миокарде и скелетных мышцах при остром стрессе и адаптации к нему, а также протекторное действие природного термостабилизатора (а-кристаллина), на активность и резистентность Са-транспортирующей системы СР.

В рамках этой цели решались следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить повреждающий эффект острого стресса и протекторное действие адаптации к стрессу на активность Са-насоса СР миокарда и скелетных мышц и его резистентность к повреждающим факторам -термоденатурации, автолизу, индукции ПОЛ и др. 8

2. Провести моделирование стрессорного повреждения Са-насоса

CP скелетных мышц in vitro с помощью частичного окисления мембран и

0+ автолиза в присутствии и отсутствии высоких концентраций Са .

3. Исследовать действие РЦФ на стресс-индуцированные и адаптационные изменения активности и конформационной стабильности Са-насоса CP, выявить тканеспецифичность проявления эффектов РЦФ в сердце и скелетных мышц. Сравнить эффекты стресса и адаптации к нему на Са-насос CP, при определении его активности в гомогенатах сердца и скелетных мышц или в мембранных препаратах CP из этих тканей.

4. Оценить перекрестные эффекты РЦФ, а именно: стрессорных РЦФ на мембраны CP миокарда и скелетных мышц от контрольных и адаптированных животных, а также адаптационных РЦФ на контрольные и стресс-поврежденные мембраны CP этих тканей.

5. Исследовать протекторное действие а-кристаллина на мембранную систему Са-транспорта CP миокарда и скелетных мышц (в гомогенатах и мембранных препаратах) при стрессе и адаптации к нему. Оценить возможность усиления протекторного действия а-кристаллина с помощью РЦФ. Выяснить возможность существования репарационного эффекта а-кристаллина в отношении Са-насоса CP, поврежденного в результате стрессорного воздействия.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые на внутриклеточном уровне продемонстрировано участие комплекса цитозольных компонентов в защитном эффекте на систему транспорта Са2+ в CP миокарда контрольных, стрессорных и адаптированных животных. Этот протекторный эффект различается по степени выраженности в зависимости от состояния организма in vivo: чем значительнее исходно поврежден транспорт Са2+, тем больше защитный эффект цитозольных факторов. Максимален он при стрессе, т.е. в ситуации, при которой термоустойчивость Са-насоса CP минимальна и наименее выражен этот эффект при адаптации к стрессу (т.е. при 9 максимальной термоустойчивости). Сопоставление функционирования Са-транспортирующей системы СР, активность которой измерялась в гомогенате и в микросомальных препаратах СР в присутствии цитоплазматических компонентов, показало аналогичные результаты.

Впервые продемонстрирована тканеспецифичность эффектов РЦФ в скелетных мышцах и миокарде. Показано, что РЦФ в сердце прежде всего увеличивают терморезистентность мембранно-связанных ферментов, в то время как в скелетных мышцах не изменяя термостабильность Са-насоса СР, РЦФ значительно повышают первоначальную активность фермента. Несмотря на выраженную тканеспецифичность проявления протекторного эффекта растворимых компонентов в сердце, и в скелетной мышце стресс-индуцированные нарушения работы мембранных ферментов компенсируются в обеих тканях и поддерживается высокая эффективность их функционирования.

Впервые продемонстрирована возможность наличия перекрестных защитных эффектов адаптации на внутриклеточном уровне в отличие от существования только прямых эффектов стрессорных цитоплазматических компонентов, которые оказывают защитное действие строго специфично только в отношении стресс-поврежденных Са-насоса миокарда и скелетных мышц и не имеют выраженного действия в контроле и при адаптации к стрессу. Цитозольные компоненты от адаптированных животных как в сердце, так и скелетных мышцах, напротив, обладают ярко выраженным перекрестным протекторным эффектом во всех группах, независимо от состояния организма.

Впервые показан защитный эффект а-кристаллина, повышающего активность и конформационную стабильность Са-транспортирующей системы СР как скелетных мышц, так и миокарда, при этом его эффект проявляется только при наличии острых повреждающих воздействий, а именно при стрессе у контрольных или у адаптированных животных.

10

Обнаружена тканеспецифичность действия а-кристаллина. В мембранных препаратах скелетных мышц а-кристаллин повышает только начальную активность Са-насоса СР, причем для проявления своего действия он не требует присутствия дополнительных активаторов. В сердце защитный эффект а-кристаллина релизуется только при наличии РЦФ, накопленных при стрессе.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней впервые изучен прямой и перекрестный эффект цитозольных компонентов сердца и скелетных мышц от стрессированных и адаптированных животных на функционирование мембранно-связанного Са-насоса СР. Показана универсальность действия РЦФ, защищающих мембраны СР от свободно-радикальных, автолитических и тепловых повреждений. Обнаружен репарационный эффект а-кристаллина, восстанавливающего активность Са-насоса СР после повреждающего стрессорного воздействия.

Практическое значение работы состоит в том, что в ней на основе изучения мембранопротекторного действия РЦФ сердца и скелетных мышц показана возможность использования цитоплазматических компонентов для повышения эффективности защитного действия адаптации к факторам среды. Применение одного из РЦФ -неспецифического термостабилизатора а-кристаллина может быть эффективно при комплексной профилактике стрессорных повреждений, включающей адаптационные воздействия различной природы для снижения «цены» адаптации и для проявления максимального защитного эффекта от последующих повреждений.

Положения, выносимые на защиту.

V Цитоплазматические компоненты оказывают протекторный эффект на активность Са-насоса СР скелетных мышц и терморезистентность этого фермента в миокарде, причем степень

11 выраженности защиты тем больше, чем значительнее повреждена система транспорта Са2+ в СР.

2. Стрессорные цитоплазматические компоненты оказывают защитное действие строго специфично только в отношении стресс-поврежденных мембранно-связанных ферментов, а цитозольные компоненты от адаптированных животных имеют ярко выраженный перекрестный протекторный эффект, независимо от состояния организма.

3. а-кристаллин в сердце и скелетной мышце оказывает протекторное и репарационное действие на систему транспорта Са2+ в СР при острых повреждающих воздействиях, при этом в миокарде его эффекты проявляются только при наличии дополнительных цитоплазматических активаторов, т.е в гомогенатах или при совместном действии РЦФ и а-кристаллина.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на Первом региональном совещании по медицинским наукам «Роль свободных радикалов в здоровом состоянии и при болезнях» (Иерусалим, Израиль, 1998), Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения И.П.Павлова (С.-Петербург, 1999), Всероссийской научной конференции «Свободные радикалы и болезни человека» (Смоленск, 1999), Международной конференции по гипоксии (Москва, 1999).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов и выводов. Список литературы содержит 229 источников. Диссертация иллюстрирована 25 рисунками.

выводы

1. Острый стресс приводит к уменьшению резистентности Са-насоса СР в гомогенатах и в мембранных препаратах из миокарда и скелетных мышц к повреждающим воздействиям: автолизу, термоденатурации, высокому уровню Са2+. Стрессорные повреждения на мембранном уровне более выражены в скелетных мышцах по сравнению с миокардом. Адаптация к стрессу значительно повышает активность и резистентность Са-насоса СР в обеих тканях и предупреждает стресс-индуцированное нарушение работы этого фермента.

2. Цитоплазматические компоненты оказывают протекторное действие на эффективность функционирования Са-насоса мембранных препаратов СР миокарда и скелетных мышц в контроле, при стрессе и адаптации к нему. Степень выраженности защиты тем больше, чем значительнее повреждена система транспорта Са2+ в СР - максимальное увеличение активности фермента (в скелетных мышцах - в 2,6 раза) и максимальное повышение термостабильности (в миокарде - в 1,9 раза) зарегистрировано при стрессе.

3. РЦФ обладают не только прямым, но и перекрестным защитным эффектом, при этом стрессорные цитоплазматические компоненты оказывают защитное действие строго специфично только в отношении стресс-поврежденных мембранно-связанных ферментов, а цитозольные компоненты от адаптированных животных имеют ярко выраженный протекторный эффект в контроле, при стрессе и адаптации к нему. В миокарде он проявляется в значительном увеличении конформационной устойчивости Са-насоса, а в скелетной мышце - в повышении исходной скорости транспорта Са2+ в СР (в1,5 - 2,5 раза) во всех группах.

4. а-Кристаллин оказывает протекторное действие на эффективность функционирования системы транспорта Са2+ в СР миокарда и скелетных мышц. В мембранных препаратах СР скелетных мышц в группе стресс на

132 фоне адаптации а-кристаллин повышает исходную активность Са-насоса CP, а в гомогенатах, кроме того, увеличивает терморезистентность этого фермента. В миокарде эффекты а-кристаллина проявляются только при наличии дополнительных цитоплазматических активаторов (синтез которых наблюдается при стрессе), т.е. реализуются в гомогенатах или при совместном действии РЦФ и а-кристаллина, повышая (в 2 - 3 раза) в обоих случаях терморезистентность Са-насоса СР.

5. Обнаружен репарационный эффект а-кристаллина на Са-насос CP в скелетной мышцы, который выражается в восстановлении активности и резистентности этого фермента, сниженных в результате окислительной модификации in vitro или стрессорного воздействия in vivo.

133