Автореферат и диссертация по медицине (14.03.08) на тему:Энергетический обмен и клеточное дыхание у крыс при моделировании микрогравитационных эффектов и его коррекция сукцинатсодержащими препаратами

На правах^укописи

Л

Веселова Оксана Михайловна

Энергетический обмен и клеточное дыхание у крыс при моделировании микрогравитационных эффектов и его коррекция сукцинатсодержащими

препаратами

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 СЕН 2011

Москва-2011

4852968

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

Ларина Ирина Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Шумаев Константин Борисович кандидат биологических наук, Иванова Светлана Мансуровна

Ведущая организация: Институт кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК Минздравсоцразвития России

со

Защита диссертации состоится » 2011 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д002.111.01 при Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан в » 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Левинских М.А.

доктор биологических наук,

Актуальность работы

Адекватное обеспечение энергией является необходимым условием полноценного функционирования всех систем организма. Известно, что у космонавтов в условиях длительного космического полета наблюдается перестройка энергетического обмена, что находит отражение в снижении мышечной работоспособности, потере массы тела, модификации системы терморегуляции [Kozlovskaya, et al., 1988, 1990; Grigoriev, Egorov, Svetailo, 1998; Лакота, Ларина, 2002]. Показано, что при длительной гравитационной разгрузке дефицит потребления энергии и уменьшение статических и динамических нагрузок на мышцы (в первую очередь, на антигравитационные) ведут к снижению скорости синтеза белка и развитию его отрицательного баланса [Stein Т.Р. et al 1999; Vorobiev D. et al, 1996]. Морфофункциональные изменения, развивающиеся в мышечной ткани под действием факторов космического полета, приводят к отклонениям в регуляторных (гормональных) механизмах обеспечения мышечной работы [Ларина И.М. и др. 1999]. Гипогравитационный синдром, развивающийся под действием невесомости, приводит к снижению сократительных свойств мышечных волокон и развитию атрофии, возникающей уже к 7 суткам реальной или моделируемой микрогравитации [McDonald K.S.,1995; Litvinova K.S., 2004]. Одним из пусковых механизмов запуска атрофической программы является накопление ионов кальция, приводящее к активации капьпаинов -кальций-зависимых протеаз, которое отмечается уже к первым суткам гравитационной разгрузки [Enns D.L., 2007] и, как следствие, - к распаду цитоскелетных белков [Kasper С.Е.,2000; Шенкман Б.С., 2002]. Функциональная недогруженность организма человека в условиях моделируемой или реальной гравитационной разгрузки приводит к снижению мышечного тонуса, сопровождается уменьшением энерготрат, снижением активности тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования (Буравкова Л.Б., 1989), что впоследствии приводит к активации перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Поиск и обоснование эффективности средств профилактики при неблагоприятных изменениях в энергетическом обмене является неотъемлемым условием для осуществления в дальнейшем сверхдлительных полетов, в том числе и межпланетных. Одной из основных групп средств, используемых в настоящее время для коррекции энергетического обмена, являются сукцинатсодержащие препараты, включающие, помимо янтарной кислоты, различные субстраты цикла Кребса [Хазанов В. А., 2003]. Изучение механизма действия данной группы препаратов на энергетический обмен, а также отработка схемы их применения, с оценкой воздействия на системном уровне -является важным направлением дальнейших исследований.

Целью работы являлось изучение процесса перестройки энергетического обмена на уровне системы митохондрий в условиях моделируемой гравитационной разгрузки, а также оценка эффективности и исследование механизмов действия сукцинатсодержащих препаратов, способных в этих условиях корректировать энергетический обмен и вызывать повышение адаптивного резерва организма.

В работе решались следующие задачи:

1. Изучить биологические маркеры ферментативной активности в постуральной (камбаловидной) мышце крысы в условиях моделируемой гравитационной разгрузки.

2. Оценить влияние регуляторов энергетического обмена (РЭО) на изменение ферментативной активности в результате функциональной разгрузки у крыс.

3. Изучить изменение параметров клеточного дыхания мышечных волокон крыс под действием моделируемой гравитационной разгрузки, а также в условиях применения РЭО.

4. Выявить влияние моделируемой гравитационной разгрузки и применения РЭО на изменения свободно-радикальных процессов и системы антиоксидантной защиты крови экспериментальных животных.

5. Исследовать морфологическую картину клеточных структур сердца, печени и почек под действием моделируемой гравитационной разгрузки, а также на фоне применения регуляторов энергетического обмена.

Научная новизна работы.

Впервые с помощью морфологических методов показано, что применение препаратов РЭО оказывает протективное действие на клетки сердца, печени и почек при патологических изменениях, развивающихся в условиях моделируемой гравитационной разгрузки. Использование РЭО при вывешивании способно нивелировать увеличение активности каталазы в плазме крови и снижение её в эритроцитах, а также накопление продуктов ПОЛ в эритроцитах. Добавление в рацион животных препарата «Кардиовит» в условиях гравитационной разгрузки приводит к повышению активности гликолитического маркера а - ГФДГ (а -глицерофосфатдегидрогеназы) в быстрых и медленных волокнах камбаловидной мышцы, «Энерговит» воспроизводит этот эффект только в волокнах медленного типа. В то время как вывешивание в течение 35-ти суток вызывает снижение скорости поглощения кислорода в волокнах камбаловидной и медиальной головки икроножной мышцы, что, вероятно, обусловлено нарушением в работе первого комплекса дыхательной цепи (ТЧАОН-коэнзим <3-оксидоредуктазы), применение РЭО оказывает стимулирующее действие на интенсивность клеточного дыхания. Сукцинатсодержащие

препараты, являясь субстратом второго комплекса дыхательной цепи (сукцинат-коэнзим 0-оксидоредуктазы), способствуют сохранению и стимуляции энергообразующей функции митохондрий даже в условиях блокады первого комплекса дыхательной цепи.

Практическая значимость работы.

Данная работа является первым специальным исследованием, выполненным с целью изучения влияния сукцинатсодержащих препаратов на энергетический обмен и клеточное дыхание у крыс под действием моделируемой гравитационной разгрузки на клеточном и системном уровнях.

Показано неравнозначное влияние вывешивания на скорость поглощения кислорода в волокнах различных мышц. Выявлено протективное действие РЭО на темп поглощения кислорода постуральными мышцами. Обоснованы положительные системные эффекты РЭО при вывешивании. Результаты работы позволят на основе комплексного анализа экспериментальных данных дать научно обоснованные рекомендации для использования протекторов энергетического обмена в космической медицине, схемы, способы и дозировки применения которых, тем не менее, потребуют дальнейшей специальной разработки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При длительной моделируемой гравитационной разгрузке наблюдается снижение активности СДГ (сукцинатдегидрогеназы) и увеличение активности а -ГФДГ (а - глицерофосфатдегидрогеназы) в камбаловидной мышце, применение препарата «Кардиовит» восстанавливает активность а - ГФДГ в волокнах обоих типов, «Энерговит» обеспечивает этот эффект только в медленных волокнах.

2. Снижение скорости поглощения кислорода в скицированных волокнах медиальной головки икроножной и камбаловидной мышц после вывешивания нивелируется применением сукцинатсодержащего препарата только в отношении камбаловидной мышцы.

3. Моделируемая гравитационная разгрузка приводит к выраженному дисбалансу в функционировании систем свободно-радикального окисления и антиоксидантной защиты крови. Применение РЭО оказывает протективное действие как на эти отклонения, так и на патологические морфологические изменения в тканях сердца, печени и почек.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:

1. IV конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, апрель, 2005, Москва;

2. IX конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, 14 апреля, 2010, Москва;

3. Russian-french-belorussian conference «Neurovascular impairments induced by environmental conditions: molecular, cellular and lunctional approaches», Angers, France, 10-13 March, 2010.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета Учреждения Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медико-биологических проблем РАН «Космическая физиология и биология» (протокол №3 от 24 июня 2011года).

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах, включает 18 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Список литературы включает 140 источников, из них 90 -работа отечественных и 50 - иностранных авторов.

Методы и материалы исследования.

Все использованные биохимические реактивы были аналитической степени чистоты и приобретались в фирмах Sigma (США), Fluka (Швейцария), Галахим (Россия).

В работе были использованы 117 половозрелых самцов крыс линии Wistar. Эксперименты на животных были одобрены Комиссией по биомедицинской этике в Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН. Моделирование гравитационной разгрузки осуществляли путем антиортастатического вывешивания животных по стандартной методике Ильина-Новикова в модификации Morey-Holton [Morey-Holton Е. et al., 2005]. Наркотизацию экспериментальных животных проводили путем внутрибрюшинного введения Авертина (Нарколана) - Вг3ССН2ОН (2,2,2-Tribromethanol 97%)в дозировке 100 мг, в качестве растворителя использовался С2 Ш С(СНз)гОН (2-Methyl-2-butanol reagent plus 99%)в дозировке 100 мкл, также добавлялся 0,9% NaCl. Забой животных проводили путем передозировки наркоза Авертина.

1. Гистохимический метод. Серийные срезы камбаловидной мышцы крысы толщиной Юцт были сделаны на криостате с помощью микротома при -20°С и монтированы на предметные стекла. Срезы были окрашены для выявления сукцннатдегидрогеназы (СДГ), а - глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) тетразолиевым методом по технике Nashlas, модифицированной Lojda, 1979 [Lojda Z. et al, 1979]. После окончания срезы были фиксированы в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере. Процедура выявления ферментов проводилась при комнатной температуре. Их активность

была оценена на плато калибровочной кривой активности с использованием системы анализа изображений Leica Q500IW (Германия) и была выражена в единицах оптической плотности. Этот метод был верифицирован Martin с соавторами [Martin Т.Р. et al, 1985] в 1985 году с помощью биохимических методов и служит эквивалентом методу цитофотометрической кинетики in situ для определения активности ферментов [McAlister R.M. et al, 1990]. Цитофотометрические измерения были проведены на 10 волокнах каждого типа.

2. Полярография (Saks V.A.) и световая микроскопия. Проводилось исследование параметров клеточного дыхания скицированных волокон камбаловидной (т. soleus), медиальной головки икроножной (т. gastrocnemius caput mediale) и передней болыпеберцовой (т. tibialis anterior) мышц крыс, так как известно, что в условиях гравитационной разгрузки наиболее выраженные изменения развиваются именно в этих мышцах (Shenkman et al., 2000; Bodine-Flowler et al, 1995). Исследуемую мышцу вырезали от сухожилия до сухожилия и немедленно помещали в охлажденный раствор «А» (2.77 мМ Ca K2EGTA, 7.23 мМ K2EGTA, 6.56 мМ MgCl2-6H20, 0.5 мМ DTT, 50 мМ KMes, 20 мМ имидазол, 20 мМ таурин, 5.3 мМ АТР, 15 мМ фосфокреатин, рН=7.1), в котором ее разделяли на пучки мышечных волокон длиной 3-4 мм и толщиной около 1 мм. Далее волокна инкубировали в растворе «А» с сапонином (50 мкг/мл) в течение 30 минут при температуре 4°С и при легком помешивании с целью частичного химического скинирования мембраны (Veksler et al., 1987; Stevens et al., 1993, Saks et al, 1998). Затем пучки волокон отмывали от сапонина в течение 10 минут в растворе «Б» (2.77 мМ СаК2ЭГТА, 7.23 мМ К2ЭГТА, 1.38 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 100 мМ KMes, 20 мМ имидазол, 20 мМ таурин, 3 мМ К2НР04, рН=7.1). Пучки скинированных волокон инкубировали в растворе «Б», в который добавляли 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), свободного от жирных кислот. В качестве экзогенных субстратов дыхательной цепи использовали смесь 5 мМ глутамата + 2 мМ малата, а для определения АДФ-зависимой скорости дыхания вносили 1 мМ АДФ. Измерение концентрации кислорода проводили с помощью электрода Кларка и оксиметра YSI Model 53 Oxygen Monitor (Yellow Spring Instrument Co., USA) при температуре 22°C. Растворимость кислорода в 1 мл среды инкубации при этой температуре принимали равной 460 нг-ат [Seppet E.K. et al., 2004].

Определяли следующие дыхательные параметры: V3JU0 - скорость поглощения кислорода на эндогенных субстратах, Уэкзо - скорость на экзогенных субстратах, УАдф ■ АДФ-зависимая скорость дыхания. После измерений волокна извлекали из полярографической ячейки, высушивали при температуре +95°С и затем взвешивали, что позволяло рассчитывать скоростные параметры, нормированные на 1 мг сухого веса [Ohira et al., 2002]. Дыхательный контроль (ДК) рассчитывали как соотношение скорости дыхания в присутствии АДФ к скорости дыхания на экзогенных субстратах. На рисунке 1 представлена экспериментальная кривая поглощения кислорода волокнами камбаловидной мышцы и приведен расчет дыхательного контроля.

3. Полярография [Lessler М. А., 1980; Rio L. А. et al, 1977]. Проводили определение удельной и абсолютной активности каталазы [нг-ат О/мин/мг белка] -ведущего показателя звена антиоксидантной защиты в плазме крови и эритроцитах.

Субстрады

. (малат+глутамат)

АДФ

t63-

n «0.

ДК' = 5,7

о

100

о

«

9 10

н 16 18 min

Рисунок 1. Экспериментальная кривая поглощения кислорода волокнами камбаловидной

4. Спектрофотометрия. Определялось содержание малонового диальдегида (мкмоль/мл), отражающего уровень конечных продуктов ПОЛ. В микрометоде определения МДА смешивали 0,1 мл надосадочной жидкости, 0,02 мл 0,6 н. HCL и 0,08 мл 0,12 М ТБК (тиобарбитуровой кислоты). Смесь нагревали при 100°С в течение 10 мин. Количество образовавшегося МДА определяли, используя коэффициент молярной экстинкции с учетом разницы в рабочей длине стандартной кюветы (1см) и микрокюветы. Интенсивность окраски измеряли с помощью микроприставки к спектрофотометру СФ -4А при 535 им.

5. Морфогистологичсский метод. Проводилось исследование морфологической картины срезов печени, мозгового слоя почек и сердца после их окраски гематоксилин-эозином.

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием компьютерной программы «Statistica-6.0». Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение (M±SD). Достоверными считали отличия с уровнем значимости р<0,05.

Организация экспериментов.

1. Антиортостатическое 30-суточное вывешивание крыс в сочетании с приемом РЭО «Энерговита» и «Кардиовита». Животные были разделены на 6 групп по 8 в каждой: группа № 1- «Контроль»; группа № 2 - «Вывешивание»; группа № 3- «Контроль +

мышцы.

«Энерговит»; группа № 4 -«Вывешивание + «Энерговит»; группа № 5 «Контроль + «Кардиовит»; группа № 6 «Вывешивание + «Кардиовит»;

2. Антиортостатическое 35-суточное вывешивание крыс с применением РЭО «Янтарь-Антитокса». В эксперименте животные были разделены на 4 группы по 7 животных в каждой: группа № 1- «Контроль»; группа № 2 - «Вывешивание»; группа № 3-«Контроль + «Янтарь»; группа № 4 «Вывешивание + «Янтарь».

3. Антиортостатическое 30-суточное вывешивание крыс в сочетании с приемом РЭО «Янтарь-кардио-фито» и «Янтарь - Энерговит». Животные были разделены на 6 групп: группа № 1- «Контроль»; группа № 2 - «Вывешивание»; группа № 3- «Контроль + «Янтарь - Энерговит»; группа № 4 -«Вывешивание + «Янтарь - Энерговит»; группа № 5 «Контроль + «Янтарь-Кардио-Фито»; группа № 6 «Вывешивание + «Янтарь-Кардио-Фито».

Применение регуляторов энергетического обмена (РЭО). Расчет дозировки препаратов, вводимых животным со стандартным кормом per os, проводился: 50 мг на 1 кг веса животного по сукцинату. Использовался новый класс соединений, прошедших клиническую апробацию в качестве биологически активных добавок к пище, объединенных групповым названием "Янтарь", разработанных и изученных Натурфармацевтической компанией совместно с НИИ фармакологии Томского Научного Центра СО РАМН (ООО "Натурфармацевтическая компания"). В работе изучались следующие регуляторы энергетического обмена в таблетированной лекарственной форме: «Янтарь-Кардио-Фито» (янтарная кислота -50 мг, экстракт пустырника -5 мг, экстракт бадана -20 мг, глюкоза до 500 мг), «Кардиовит» (янтарная кислота -50 мг, яблочная кислота-50 мг, глюкоза до 500 мг), «Янтарь - Энерговит» (морковь высушенная-100 мг, кислота глутаминовая-70 мг, янтарная кислота -50 мг, витамин В2 - 2мг, витамин В6-2 мг), «Янтарь-Антитокс» (янтарная кислота -100 мг, микрокристаллическая целлюлоза до 500 мг).

Результаты экспериментов и их обсуждение.

Антиортостатическое 30-суточное вывешивание крыс выполнялось с последующим проведением гистохимического анализа. У животных в условиях гипокинезии наблюдалось достоверное снижение активности СДГ в медленных волокнах, а в быстрых - тенденция к снижению данного фермента (рис 2; рис 3) по сравнению с интактными животными, что соответствует результатам других исследователей [Takekura, Yoshioka, 1989; Jaspers et al, 1985; Wakatsuki et al, 1994]. Возможно, этот факт был связан с накоплением макроэргических фосфатов, вследствие которого происходит снижение окислительного потенциала мышц и увеличением содержания метаболитов анаэробного гликолиза [Renaud et al, 1986].

Озтач. ....................................—.....—.....—.....................................——............—1—»......—-------------„.-„..-..-.

*

................................;..................................................................................................................¿ь...........................................................................

—.......—....................................... ........-.............................................

□: ■: I П

.4'.?.[.ч-.1. Вывешив,вне Конт^о.ть^ Энергов(гт Вывевгаванве- Эверютиз

* -Достоверные отличия от группы «Контроль»; #- Достоверные отличия от группы «Вывешивание»; $- Достоверные отличия от группы «Контроль+ «Энерговит»

Рис 2. Действие препарата «Энерговит» на активность СДГ в медленных волокнах камбаловидной мышцы крысы.

□

Контроль ^'Эверговпт Вывепшвляне- Энерговит

* -Достоверные отличия от группы «Контроль»; #- Достоверные отличия от группы «Вывешивание»; $- Достоверные отличия от группы «Контроль ■ «Энерговит»

Рис 3. Действие препарата «Энерговит» на активность СДГ в быстрых волокнах камбаловидной мышцы крысы.

Показано, что применение «Энерговита» у интактных животных приводит к достоверному повышению активности СДГ в волокнах обоих типов. Эффект применения РЭО сохранялся и при вывешивании [Н.К. Мазина, И.М.Ларина, О.М. Веселова, 2006]. Положительный эффект «Энерговита» на фоне гравитационной разгрузки отмечался, в особенности в медленных волокнах, где регистрировалось достоверное повышение активности СДГ по сравнению с группой, находившейся в условиях гипокинезии без

энергопротекции, однако активность данного фермента достоверно снижалась по сравнению с группой виварного контроля на фоне применения препарата.

* -Достоверные отличия от группы «Контроль»; #- Достоверные отличия от группы «Вывешивание»; $- Достоверные отличия от группы «Контроль+ «Энерговит» Рис. 4 Действие препарата «Энерговит» на активность а - ГФДГ в медленных волокнах камбаловидной мышцы крысы.

Исследование активности а - ГФДГ показало достоверное повышение данного показателя в медленных волокнах камбаловидной мышцы крыс под действием гравитационной разгрузки. Тот же эффект наблюдался и у животных на фоне применения «Энерговита» при виварийном содержании (сравнение групп «Контроль» и «Контроль -«Энерговит»), Совместное действие двух факторов - вывешивания и применения препарата - парадоксальным образом вызывало достоверное снижение активности гликолитического маркера у животных.

Применение «Кардиовита» у интактных животных не вызывало изменений активности а - ГФДГ (сравнение групп «Контроль» и «Контроль - «Кардиовит»), В то же время вывешивание вызывало достоверное повышение активности гликолитического маркера а - ГФДГ (согласуется с данными ОЫга) в обоих типах волокон (рис 5, рис 6). Рядом авторов было установлено, что это может быть связано с усилением работы глицерофосфатного челночного механизма (повышение интенсивности гликолитического пути энергообеспечения), отражающегося, в том числе, и на повышенной утомляемости и снижении аэробной выносливости мышц при гипокинезии. При вывешивании на фоне применения «Кардиовита» (рис. 5, рис 6) наблюдалась достоверная синергия влияния факторов на активность а - ГФДГ в волокнах обоих типов (сравнение групп «Вывешивание» и «Вывешивание + «Кардиовит»).

"US

■

коигцли. Вчвгшнпликр Контроль* Кардиовит Вымтнваииг- Кардилвв!

* -Достоверные отличия от группы «Контроль»; #- Достоверные отличия от группы «Вывешивание»; $- Достоверные отличия от группы «Контроль + «Кардиовит» Рис 5. Действие препарата «Кардиовит» на активность а - ГФДГ в медленных волокнах камбаловидной мышцы крысы.

I I

Вывешнвавп« КсвтрмьтКарлиовнт Вывешивание Карзяовпт

* -Достоверные отличия от группы «Контроль»; #- Достоверные отличия от группы «Вывешивание»; $- Достоверные отличия от группы «Контроль + «Кардиовит» Рис 6. Действие препарата «Кардиовит» на активности. - ГФДГ в быстрых волокнах камбаловидной мышцы крысы.

Известно, что низкая скорость доставки кислорода к мышцам приводит к ограничению аэробной работоспособности (Saltin et al., 2006), недостаточной диффузионной способности кислорода (Wagner et al., 2006) и снижению окислительного потенциала мышц (Hoppeler et al., 1998), что сопровождается чрезмерным накоплением метаболитов анаэробного гликолиза (Renaud et al., 1986).

По-видимому, специфическое увеличение доступности некоторых из субстратов окислительного метаболизма (сукцината) оказалось вполне адекватным стимулом к интенсификации процессов окислительного фосфорилирования в мышечной ткани.

Тем не менее, характер незначительных изменений активности СДГ m. soleus крыс после приема энергопротектора «Кардиовит» не отличался от изменений, вызванных вывешиванием у контрольных животных. Состав биодобавки, включающий яблочную и янтарную кислоты (сразу два центральных метаболита цикла Кребса), предполагает

значительное увеличение доступности субстратов для окислительных ферментов этого метаболического пути (по типу субстратного регулирования). Отсутствие значимого эффекта может быть обусловлено несколькими гипотетическими причинами, среди которых можно отметить как избыточную доступность субстратов при ее несоответствии содержанию необходимых кофакторов, так и создание оптимальных условий функционирования цикла трикарбоновых кислот, не требующих дополнительного синтеза ферментативных белков.

Как показали наши исследования, после приема препарата «Энерговит» наблюдалось значительное повышение активности СДГ в rn. soleus как у вывешенных, так и у интактных крыс.

В составе этого препарата находится янтарная кислота в той же дозировке, что и в «Кардиовите», однако в дополнение к этому препарат содержит глутаминовую кислоту (является одним из субстратов белкового синтеза, участвует в процессах переаминирования аминокислот в организме в процессе катаболизма белков) и ряд витаминов группы В (кофакторов). Важно отметить, что глутаминовая кислота является заменимой аминокислотой, которая может синтезироваться в организме, стимулируя метаболизм в ЦНС, оказывает ноотропное, дезинтоксикационное (связывающее) действие. Известно, что глутаминовая кислота принимает участие, помимо белкового обмена, и в углеводном обмене, стимулирует окислительные процессы, препятствует снижению окислительно-восстановительного потенциала, повышает устойчивость организма к гипоксии, нормализует обмен веществ, изменяя функциональное состояние нервной и эндокринной систем, нормализует процессы гликолиза в тканях, оказывает гепатопротекторное действие [Koh Р. О., 2011; Kim К., et al., 2011; Quarta D., et al., 2004]. Она также способствует проникновению кальция через гематоэнцефалический барьер, синтезу ацетилхолина и АТФ, молекулы которого служат непосредственным источником энергии для мышечного сокращения [Cain, et al 1962], способствует переносу ионов калия, играет важную роль в деятельности скелетных мышц (является одним из компонентов миофибрилл).

Энергизирующее действие глутаминовой кислоты отчасти еще связано с тем, что она принимает участие в синтезе НАД (никотинамидадениндинуклеотид). НАД специфический фермент, участвующий в процессах биологического окисления, протекающих в митохондриях. В дыхательной цепи (цепи окислительно-восстановительных реакций) НАД - это переносчик электронов и ионов водорода. Превращаясь в незаменимую аминокислоту триптофан, глутаминовая кислота способствует образованию никотиновой кислоты и серотонина [Rahman MS, et al., 2011;

Dufour S, et al., 2010]. Серотонин обладает анаболическим действием, усиливает синтез белка в организме и, замедляя его распад, активизирует кору надпочечников и выброс в кровь глюкокортикоидных гормонов во время интенсивной физической работы [Del Pino J et al., 2011; Murotani T et al, 2011]. Кроме того, глутаминовая кислота несколько повышает проницаемость клеток для ионов калия, способствуя накоплению калия внутри клетки. Для скелетных мышц это имеет особое значение, так как мышечное сокращение требует поддержания электрохимического трансмембранного потенциала [Abu Hossain S et al., 2011; Larsson B, et al., 2008].

Тем не менее, трудно сказать, какой из компонентов препарата - сукцинат или глутамат - обусловил его достоверную эффективность в отношении окислительного потенциала мышечных волокон, однако полученные данные открывают определенные перспективы в использовании препарата для оптимизации окислительного потенциала сократительных свойств мышечных волокон.

Известно, что в ходе гравитационной разгрузки часто обнаруживают повышение активности энзиматических маркеров гликолитического пути энергообеспечения [Ohira Y. Et al, 1994]. Одним из наиболее часто используемых гликолитических маркеров в гистохимических исследованиях скелетных мышц является а - ГФДГ. В настоящем исследовании удалось наблюдать значительное повышение активности этого фермента после гравитационной разгрузки в волокнах обоих типов. Наиболее выраженные изменения были обнаружены в волокнах медленного типа.

Однако в ходе исследования не удалось выявить каких-либо специфических положительных эффектов применения энергопротектора «Кардиовит». Мало того, повышение активности а - ГФДГ при использовании этой биодобавки при вывешивании было еще более интенсивным, чем у контрольных животных.

При использовании энергопротектора «Энерговит» наблюдалось значительное повышение активностиа - ГФДГ в волокнах обоих типов у интактных животных. При добавлении данного энергопротектора в корм вывешенным животным не только не наблюдалось повышение гликолитического потенциала, но было выявлено достоверное снижение этого показателя, что является положительным эффектом препарата.

По-видимому, можно считать, что применение «Энерговита», понижая гликолитический потенциал у вывешенных животных, приводит к оптимизации энергетического метаболизма, сдвигая равновесие в сторону увеличения вклада окислительного пути. Таким образом, можно заключить, что при моделируемой гравитационной разгрузке наблюдалось снижение активности СДГ и увеличение активности а - ГФДГ в камбаловидной мышце, что может свидетельствовать об

увеличении интенсивности гликолитического пути энергообеспечения в условиях гипокинезии. Добавление в рацион животных препарата «Кардиовит» в условиях гравитационной разгрузки приводило к новьнцению активности гликолитического маркера а - ГФДГ в быстрых и медленных волокнах камбаловидной мышцы, при применении «Энерговита» этот эффект наблюдался только в медленных волокнах.

Антиортостатическое 35-суточнос вывешивание крыс выполнялось с целью исследования влияния препаратов РЭО на показатели дыхания митохондрий в скицированных сапонином мышечных волокнах. Как было отмечено в главе «Материалы и методы», объектом исследования в этом разделе работы служили препараты трех скицированных мышц экспериментальных животных.

Результаты исследования параметров клеточного дыхания волокон камбаловидной мышцы крысы представлены на рис.7.

Применение препарата РЭО у интактных животных вызывало снижение показателя скорости дыхания на эндогенных субстратах (Умд0) на 54%. В то же время показано, что данный показатель в волокнах камбаловидной мышцы снижался примерно в той же степени - на 62% (р<0.05) - под действием вывешивания. Кроме того, было выявлено, что применение препарата РЭО при вывешивании не оказывало положительного эффекта на параметры скорости дыхания на эндогенных субстратах по сравнению с таковыми относительно группы «Контроль + «Янтарь».

И4Т 11 ЧМ I

Кыпрвп Пиввявп»ит1« V—■ Выв*шпиаия«-Янгар»

II Уэпдо, нг-»т О'ишн г V »км. т-ы О ига г ' ч'ЛДФ.Кт-м и'чцн г

* - р<0.05 по сравнению с группой «Контроль» Рис.7 Результаты исследования параметров клеточного дыхания волокон камбаловидной мышцы крысы.

Добавление препарата в корм контрольных животных не изменяло показателей скорости дыхания на экзогенных субстратах (Уэкзо) в волокнах камбаловидной мышцы. Однако вывешивание приводило к уменьшению параметра на 60% (р<0.05) относительно группы «Контроль». Применение препарата на фоне вывешивания позволяло сохранять скорость дыхания на экзогенных субстратах (Уэкзо) практически на контрольном уровне.

АДФ - зависимая скорость дыхания волокон камбаловидной мышцы, определяемая при добавлении экзогенного АДФ (УАдф), не изменялась у контрольных животных, получавших препарат, но уменьшалась на 45% (р<0.05) у вывешенных крыс.

При этом, несмотря на наличие тенденции к снижению Уддф в группе вывешенных животных, получавших препарат РЭО, статистически значимых отличий данного показателя в группах «Вывешивание + «Янтарь» и «Контроль + «Янтарь» не выявлялось, то есть применение РЭО позволяло сохранить на контрольном уровне показатель АДФ -зависимой скорости дыхания скицированных волокон камбаловидной мышцы.

Камбаловидная мышца крыс состоит на 80% из «красных» мышечных волокон, икроножная мышца крыс содержит 70% «белых» мышечных волокон [Dawson J.M. et al., 1987; E.A.Ilyin and V.S.Oganov,1989; D.B.Thomason and F.W.Booth,I990; Y.Ohira, 1992; Shenkman B.S. 2003].

Результаты исследования параметров клеточного дыхания скинированных волокон икроножной мышцы, разгибателя (extensor) [Гамбарян П. П., Дукельская Н. М.,1955], представлены на рис 8.

1500 1000

I

т iJ8

Контроль^- Янтарь

Бывеш№ание+ Яктэрь V А/11., u.-ir О.'мин г

* - р<0.05, ** - р<0.01 по сравнению с группой «Контроль»

Рис 8. Результаты исследования параметров клеточного дыхания скинированных волокон икроножной мышцы.

Показано, что добавление в пищу животных виварного содержания препарата РЭО вызывало снижение скорости дыхания на эндогенных субстратах в волокнах икроножной мышцы на 81%. Вывешивание приводило к столь же глубокому дефициту по данному показателю - 85% (р<0.05). Вывешивание с применением биодобавки РЭО не оказывало протективного воздействия на скорость дыхания на эндогенных субстратах (рис.8).

Аналогичные тенденции отмечаются и в изменении показателя скорости дыхания на экзогенных субстратах (Уэкзо). Глубина снижения показателей Уэкзо в волокнах икроножной мышцы была сходной как под влиянием самого препарата, так и при воздействии 35-суточного вывешивания. Протективного эффекта использования препарата на фоне моделирования гравитационной разгрузки отмечено не было.

АДФ - зависимая скорость дыхания (Уадф) волокон икроножной мышцы крысы уменьшалась под действием препарата при вывешивании и при сочетании этих двух факторов эквивалентно, на 57% (р<0.05). Эти результаты свидетельствуют об отсутствии достоверного протективного эффекта использования препарата на уровне параметров дыхания скицированных мышечных волокон икроножной мышцы.

Результаты исследования параметров клеточного дыхания волокон передней большеберцовой мышцы, сгибателя (flexor) представлены на рис. 9.

ш л О мни i 4000

3500

ДООО

2500

2 ООО

IÜOO

1000

500

О

1

1

± Ив 1

■ _ ■

Mi

Контроль

энло, вг-ат о/мл

Выветивзвие Контроль+Яптпрь Выаетнвднце+Янтарь г вЛ" экзо, нг-ат О/мпн г \ ДДФ, нг-ат О мни г

* - р<0.05 по сравнению с группой «Контроль» Рис. 9 Результаты исследования параметров клеточного дыхания волокон передней большеберцовой мышцы. Использование в качестве пищевой добавки препарата РЭО у контрольных животных вызывало снижение на 72% параметров скорости дыхания на эндогенных субстратах. Однако вывешивание не затрагивало данный показатель клеточного дыхания. При одновременном воздействии вывешивания и биодобавки сохранялся эффект

препарата РЭО: скорость дыхания на эндогенных субстратах в скицированных волокнах передней большеберцовой мышцы угнеталась.

Скорость дыхания на экзогенных субстратах (Уэю0) в волокнах передней большеберцовой мышцы менялась аналогично УЭНдо: использование препарата как такового у контрольных животных приводило к снижению на 42% (р<0.05) данного показателя. Вывешивание не влияло па УЭКз0. При вывешивании с применением биодобавки сохранялся эффект препарата на скорость дыхания на экзогенных субстратах.

На показатели АДФ - зависимой скорости дыхания (Уадф) скицированных волокон передней большеберцовой мышцы крысы не оказывали влияния ни экспериментальные условия (вывешивание), ни применение энергопротектора (рис.9).

Как было показано ранее, гравитационная разгрузка продолжительностью тридцать и более суток (для мелких лабораторных грызунов) приводит к некоторому снижению окислительного потенциала (способности к энергообеспечению путем окислительного фосфорилирования) в мышечных волокнах обоих типов m. soleus, основной позно-тонической мышцы млекопитающих [Hauschka Е.О. et al., 1987]. Полученные нами результаты исследования на скицированных волокнах свидетельствуют о том, что скорость потребления кислорода в волокнах камбаловидной мышцы после 35-суточного антиортостатического вывешивания существенно снижается по сравнению с уровнем контроля, хотя дыхательный контроль достоверно не изменяется, что согласуется с литературными данными, приведенными выше. Возможно, в основе такого снижения лежит накопление фосфорилированных форм макроэргических фосфатов в мышечных волокнах при гравитационной разгрузке [Ohira Y. et al., 1994], которое может обуславливать снижение активности 5'-аденозинмонофосфат-зависимой протеинкиназы, которая через протеинкиназный каскад стимулирует экспрессию митохондриальных белков и регулирует ряд других процессов энергетического метаболизма [Winder W.W., 2001]. Изменения такого типа могут быть связаны с уменьшением числа митохондрий, уменьшением концентрации комплексов дыхательной цепи, а также со снижением и/или изменением содержания энергетических субстратов. В пользу последнего предположения свидетельствуют данные [Tavitova M.G. et al. 2007, 2008] о падении содержания триглицеридов и переходе на гликолитический тип дыхания, повышение активности энзиматических маркеров которого было ранее зарегистрировано [Ohira Y. et al 1994].

С другой стороны, нами показано, что скорость дыхания волокон камбаловидной мышцы на экзогенных субстратах практически не отличается от скорости дыхания на эндогенных субстратах, что может быть обусловлено нарушением в работе первого

комплекса дыхательной цепи -NADH-коэнзим- Q-оксидоредуктазы (NCCR-комплекса) и вызвано, по-видимому, повышением уровня свободных радикалов [Yang S. et al., 2004].

Известно, что свободные радикалы - очень нестабильные частицы, содержащие активированный кислород, активно атакующие липиды клеточной мембраны (перекисное окисление липидов), в результате чего происходит ее разрушение, нарушается проницаемость, что может вести к разрушению всей клетки.

Перекисное окисление липидов в строго ограниченных пределах - это физиологический процесс, который принимает участие в регуляции клеточных функций [Зенков Н.К., 2001; Сазонтова Т.Г., 2007]. При повышении уровня свободно-радикального окисления возможно быстрое разрушение клеточных структур в результате их повреждения. Показано, что практически все патологические состояния помимо специфического ответа сопровождаются, в качестве неспецифического компонента патогенеза, повышенным уровнем ПОЛ [Анисимов В.Н.,2003; Биленко М.В.,1989; Коган А.Х.,1997]. Повреждающим фактором при этом служит избыточный уровень активных форм кислорода (АФК), которые меняют свою физиологическую сигнальную роль на патогенетическую.

Следовательно, свободно-радикальные реакции выполняют важную регуляторную функцию, являются самым первым звеном в адаптационной перестройке организма при различного рода воздействиях. С одной стороны, при адекватной дозе воздействия вследствие активации свободно-радикальных процессов мобилизуются эндогенные резервы организма, обеспечивается утилизация недоокисленных субстратов за счет интенсификации энергетического обмена, а также поддерживается сопряженность анаболических и катаболических реакций, что содействует повышению мощности и стабильности клеточных структур и функциональных систем организма. С другой стороны, может развиваться дисбаланс систем свободно-радикальных реакций и антиоксидантной защиты, что непосредственно связано с угнетением окислительно-восстановительных реакций и их сопряжением с анаболическим обменом [В.А. Барабой, И.И. Брехман и др., 1991]. Возможно, что сукцинат, в силу своих антиоксидантных свойств, при длительном пероральном применении может снижать степень повреждения, связанного со свободно-радикальным окислением.

С другой стороны, раннее снижение ЭМГ-активности камбаловидной мышцы крысы при вывешивании [Alford E.K. et al., 1987] приводит к запуску атрофической программы, которая реализуется через деградацию цитоскелетных белков, в частности, десмина, содержание которого снижено более чем на 50% уже к третьим суткам гравитационной разгрузки [Enns D.L. et al., 2007]. Локализация субсарколеммальных митохондрий

определяется, в первую очередь, содержанием десмина [Capetanaki Y. et al., 2007]. Нарушение местоположения митохондрий может приводить к снижению их числа в условиях иммобилизации, что согласуется с литературными данными [Krieger D.A. et al., 1980]. При исследовании скоростей потребления кислорода волокнами икроножной мышцы изменение анализируемых параметров было аналогичным камбаловидной мышце с той разницей, что на экзогенных субстратах скорость потребления кислорода существенно возрастала по сравнению со скоростью на эндогенных субстратах. По-видимому, причина подобных изменений может быть такой же, как и для камбаловидной мышцы, но в этом случае более вероятна гипотеза, связанная с уменьшением числа электрон-транспортных систем [Cogsweel А.Н. et al., 1993]. Скорость потребления кислорода, как на эндогенных, так и на экзогенных субстратах, наряду с параметрами максимальной скорости в волокнах передней болыиеберцовой мышцы в условиях гравитационной разгрузки практически не изменилась. Согласно данным, полученным ранее [Tavitova M.G. et al., 2007, 2008], общее содержание триглицеридов в волокнах камбаловидной мышцы при гравитационной разгрузке падает, а в волокнах передней болыиеберцовой - растет. Учитывая корреляцию этого параметра с активностью мышц, можно предполагать, что и в волокнах икроножной мышцы имеет место снижение содержания жиров. Тогда представляется возможным считать, что при сниженном относительно контроля содержании триглицеридов наблюдается уменьшение скорости потребления кислорода, что вполне согласуется с классическими представлениями о гликолизе как аэробном типе дыхания.

В то же время не вполне ясна причинно-следственная связь между изменением содержания энергетических субстратов и скорости потребления кислорода. Мы полагаем наиболее обоснованной следующую цепочку событий. Функциональная разгрузка инициирует деградацию белков, в частности, десмина [Erms D.L. et al., 2007], потеря которого приводит к снижению числа митохондрий [Capetanaki Y. et al., 2007], наблюдаемому в условиях разгрузки [Krieger D.A. et al., 1980]. Уменьшение числа митохондрий приведет к снижению скорости потребления кислорода волокном и, как следствие, меньшему расщеплению жиров и их накоплению в мышечных волокнах на ранних сроках разгрузки [Tavitova M.G. et al. 2007, 2008]. Возможно, увеличение содержания жирных кислот впоследствии вызовет ингибирование пути их синтеза из ацетил-коА и последующее снижение концентрации триглицеридов, что также было показано [Tavitova M.G. et al 2007, 2008].

Нами показано, что введение в рацион крыс, находящихся в условиях гравитационной разгрузки препаратов, содержащих субстраты цикла трикарбоновых

кислот, ведет к увеличению активности сукцинатдегидрогеназы и глицерофосфатдегидрогеназы. Поэтому правомерно предполагать, что добавление янтарной кислоты - сукдината - может оказывать стимулирующее действие на интенсивность клеточного дыхания. Применяемый препарат являлся субстратом второго комплекса дыхательной цепи (сукцинат-коэизим-С}-оксидоредуктаза) и его действие было направлено на сохранение и стимуляцию энергообразующей функции митохондрий даже в условиях блокады МССЯ-участка дыхательной цепи.

Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что в подавляющем большинстве случаев гравитационная разгрузка не приводила к изменению скоростей потребления кислорода волокнами различных мышц по сравнению с контрольной группой крыс, также получавших препарат, то есть имела место нормализация процессов сопряжения окисления-фосфоршшрования в условиях продолжительной функциональной разгрузки.

Однако на фоне повышения содержания сукцината происходило снижение скоростей дыхания в контрольной группе крыс по сравнению с интактными крысами. Это может быть связано с изменением регуляции цикла Кребса. Возможно, подобный эффект обусловлен избыточной доступностью одного из центральных метаболитов цикла трикарбоновых кислот (сукцината) при ее несоответствии содержанию необходимых кофакторов. Тем не менее, по-видимому, именно протективное действие сукцината оказывает решающую роль при нормализации работы первого комплекса дыхательной цепи в митохондриях волокон камбаповидной мышцы крысы в условиях функциональной разгрузки.

Снижение электромиографической (ЭМГ) активности в ходе гравитационной разгрузки, характерное для камбаповидной и икроножной мышц, приводит к переходу на гликолитический тип дыхания, что ведет к снижению скорости потребления кислорода волокнами. В то же время, при повышенной ЭМГ-активности (для передней большеберцовой мышцы) скорость дыхания остается на уровне контроля. Добавление в рацион крыс сукцината приводит к снижению уровня окислительного фосфорилирования, по-видимому, вследствие шунтирования дыхательной цепи и перехода на сукцинатный путь с потерей одной из трех возможностей для сопряжения окисления-фосфоршшрования. Гравитационная разгрузка на фоне применения сукцината не оказывает значимого эффекта, что свидетельствует о преимущественном значении избыточного количества субстратов в регуляции клеточного дыхания. Таким образом, можно заключить, что применение сукцинатсодержащего препарата при вывешивании оказывало протективное воздействие в камбаповидной мышце за счет сохранения

параметров скоростей дыхания на экзогенных субстратах и максимальной скорости дыхания и при вывешивании не оказывало протективного воздействия на параметры клеточного дыхания в передней большеберцовой и медиальной головке икроножной мышцах.

Исследование параметров СРО и АОЗ в крови экспериментальных животных и при применении РЭО.

Избыточное образование ПОЛ оказывает цитотоксическое действие, что проявляется повреждением мембран эритроцитов, лизосом. Конечным продуктом ПОЛ является малоновый диальдегид, который ингибирует простациклин, способствуя агрегации тромбоцитов и тромбообразованию [Мазина Н.К., Хазанов В.А. и др., 2005]. Избыточное накопление свободных радикалов и гидроперекисей липидов в норме блокируется благодаря наличию в организме сложной и многокомпонентной системы АОЗ, способной при химическом воздействии ингибировать свободно-радикальное окисление липидов [Парин В.В., Газенко О.Г. и др.,1974]. В норме сохраняется равновесие между скоростью ПОЛ и активностью антиоксидантной системы жирорастворимых факторов (витамины А, Е, липоевая кислота и др.) и водорастворимых факторов (витамины С, В, супероксидцисмутаза, катапаза, глютатионтрансфераза, глютатионпероксидаза, глютатионредуктаза и др.) [Песков А.Б., Маевский Е.И. и др., 2005].

Гипокинезия и применение РЭО оказывали разнонаправленные эффекты на изменчивость показателей свободно-радикальных процессов и уровень АОЗ в крови экспериментальных животных.

Содержание МДА в плазме под действием вывешивания, не изменялось. В группах интактных животных, которым вводили энергопротекторы, уровень МДА увеличивался на 19-27%(р<0,01). На фоне введения РЭО при действии факторов вывешивания проявлялась тенденция к снижению уровня МДА в среднем на 9% (р<0,05).

Активность каталазы в плазме крови у вывешенных животных демонстрировала лишь тенденцию к увеличению на 32% (р>0,05). Введение РЭО интактным животным привело к значительному увеличению активности этого фермента на 89-150% (р<0,001).

Каталаза является ведущим элементом АОЗ крови, утилизирующим Н2О2, через образование которого удаляются АФК. Более 90% КА крови локализовано в эритроцитах. В определенных условиях при увеличении активности каталазы усиливается оксигенация гемоглобина и развивается антигипоксический эффект [Лукьянова Л.Д., 1987]. Активность каталазы откликается на многие внешние неблагоприятные для организма

воздействия (радиация, вибрация и др.) и изменяется при многих пред- и патологических состояниях, сопровождающихся окислительным стрессом [Лапкнп В.В. и др., 1987, Сайфутдипон Р.И. и др.. 1990, Abrash A.S. et al„ 2000J.

Окислительный стресс, по данным литературы, возможно, играет роль в регуляции рашшх стадий глнкозилировашш белков. Полагают, что способностью подавлять гликозилироиапие белков обладают' МДА, глутатиоп, витамин Е. витамин С н иные обладающие аптиокеидантным действием соединения. Это лежит в обосновании гипотезы, что ранние стадии гликозилировання белков могут инициировать избыток реактивных форм кислорода и/шш дефицит антиоксидаптов в условиях связанного с ним окислительного стресса [Selvaraj N., Bobby Z. ct al, 2008].

В отсутствие энерготропной защиты вывешивание провоцировало повышение МДА в эритроцитах и снижение каталазной активности. Применение РЭО в значительной степени сглаживало эти эффекты. Добавление в корм экспериментальных животных РЭО приводило к существенному уменьшению активности каталазы. Следует отметить, что введение РЭО интактным животным, содержащимся в виварии, не оказывало влияния на уровень МДА и каталазную активность в эритроцитах.

Таким образом, показатели плазмы крови и эритроцитов при совместном действии вывешивания и РЭО на организм экспериментальных животных подтверждают позитивное регулирующие воздействие исследуемых препаратов, которые поддерживают на оптимальном уровне системы гомеостаза, связаннные с адаптивным балансом окисления и антиоксидантной защиты.

Морфологические изменения в сердце крыс при вывешивании с

применением регуляторов энергетического обмена.

Условия 30- суточного антиортостатического вывешивания крыс вызывали отчетливые изменения в морфологической картине ткани миокарда. Так, выявлялось значительное венозное полнокровие, расширение венулярных структур, кровоизлияния в интрамуральном отделе. Для кардиомиоцитов (КМЦ) было характерно набухание, размытость рисунка поперечной исчерченности, в базофильных гиперхромных ядрах регистрировалось глыбчатое пылевидное распределение хроматина. В интрамуральном и субэпикардиальном отделах был выражен межклеточный отек. Стромапьная реакция на вывешивание проявилась в виде набухания клеток гистиоцитарного ряда. Артерии и артериолы характеризовались выраженным отеком сосудистой стенки, набухшим эндотелием, признаками спазмированности (рис 10). Капиллярная сеть слабо

прослеживалась. Наиболее значительные изменения в сосудистой системе проявились на уровне венозно-венулярного звена.

Рис.10. Влияние РЭО па морфологические перестройки в миокарде крыс при длительной гравитационной разгрузке, окраска гематоксилин-эозином.

Контроль Контроль + «Кардио» Контроль + «Энерговит»

М уь 4 г 4 * ч»

К • С/ лС - • * * I1 * ' ' »

Вывешивание Вывешивание + «Кардио» Вывешивание + «Энерговит»

Ь'ШЖ И'-'

зд&^ч тг

»- « гаим^ЗРб^'-*»- уУЛ- » ■ шс-к

'» у.^ *■ . ' |

Введение энергопротекторов «Янтарь-КФ» и «Янтарь-ЭВ» интактным животным вызвало некоторые характерные изменения в состоянии клеточных, стромальных и сосудистых элементов морфологической картины миокарда. При пероральном введении препарата «Янтарь-КФ» наблюдали незначительную гипертрофию кардиомиоцитов, которая носила диффузный характер во всех отделах сердца. Стромальная реакция проявилась в виде незначительного набухания клеток интерстиция и увеличения количества гистиоцитов. По ходу артерий и артериол отмечалась небольшая лимфоцитарная инфильтрация. В периваскулярной соединительной ткани проявилась базофилия, что свидетельствовало о метаболических перестройках в стенках артериол. В целом, капиллярная сеть отличалась от интактных животных большей активностью артериолярного звена, увеличением проницаемости артериол, формированием незначительного отека эндотелия. «Янтарь-ЭВ» оказывал минимальные эффекты на миокард интактных крыс: отмечалась незначительная активизация капиллярогенеза, которая сводилась к набуханию стенок артериол и увеличению их количества.

Отмечено, что при вывешивании РЭО по-разному влияли па морфологическую характеристику клеточных, стромальных и сосудистых элементов миокарда. При введении энергопротектора «Янтарь-КФ» гипертрофия кардиомиоцитов сохранялась, но наблюдались обширные зоны нормальных кардиомиоцитов. Отсутствовали какие-либо признаки межклеточного и межпучкового отека. Отечность сосудистой стенки уменьшалась, полностью отсутствовала базофильность периваскулярных отделов. Отмечалось венозное полнокровие. Очевидно, гемодинамическая нагрузка на миокард в равной мере распределялась между правыми и левыми отделами сердца.

При использовании энергопротектора «Янтарь-ЭВ» также отсутствовали признаки межклеточного и межпучкового отека. Явления гипертрофии кардиомиоцитов были незначительными, явления набухания минимальными, состояние сосудистой стенки практически не отличалось от нормы, хотя активизировался капиллярогенез по артериальному типу.

В целом, сравнительный анализ морфологической картины миокарда при пероральном использовании РЭО «Янтарь-КФ» и «Янтарь-ЭВ» в качестве энергопротекторов показал, что и структура кардиомиоцитов, и стромально-сосудистая реакция на возросшую гемодинамическую нагрузку при вывешивании были компенсированы и в правых, и в левых отделах сердца. РЭО активизировали функции кардиомиоцитов без признаков повреждения, усиливая капиллярогенез, и активизировали стромальные элементы.

Следовательно, на системном уровне были подтверждены протективные эффекты применения регуляторов энергетического обмена, содержащих сукцинат, для предотвращения негативных последствий антиортостатического вывешивания.

ВЫВОДЫ

1. При гравитационной разгрузке происходило снижение скорости поглощения кислорода в скинированных волокнах икроножной и камбаловидной мышц, наблюдалось снижение активности СДГ и увеличение активностиа - ГФДГ в камбаловидной мышце, что может свидетельствовать об увеличении интенсивности гликолитического пути энергообеспечения в условиях моделирования микрогравитационных эффектов.

2. Добавление в рацион животных препарата «Кардиовит» в условиях гравитационной разгрузки приводило к повышению активности гликолитического маркерах - ГФДГ в быстрых и медленных волокнах камбаловидной мышцы, при применении «Энерговита» этот эффект наблюдался только в медленных волокнах.

3. Применение препаратов РЭО в условиях гравитационной разгрузки позволило сохранить параметры скоростей потребления кислорода волокнами различных мышц на уровне контрольных групп животных, также получавших препараты, что свидетельствует о нормализации процессов сопряжения окисления-фосфорилирования в условиях продолжительной функциональной разгрузки. Особенно выраженным данный эффект был в волокнах камбаловидной мышцы.

4. Моделируемая гравитационная разгрузка оказывала существенное влияние на свободно-радикальные процессы и систему антиоксидантной защиты крови экспериментальных животных: происходило увеличение активности каталазы в плазме крови и снижение её в эритроцитах, накопление продуктов ПОЛ в эритроцитах. Применение РЭО во время вывешивания нивелировало эти процессы.

5. Моделируемая гравитационная разгрузка вызывала выраженные морфологические изменения в структуре миокарда. Применение РЭО оказывало протективное действие на патологические изменения в кардиомиоцитах и сосудах сердца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.К. Мазина, И.М. Ларина, В.А.Хазанов, Б.С.Шенкман, П.И.Цапок, В.Б.Зайцев, В.Г.Хоробрых, О.М. Веселова, В.С.Третьяков. Протективное действие регуляторов энергетического обмена при изменении гравитационных нагрузок в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006 г., т. 142, № 10-423.

2. Мухина A.M., Немировская Т.Л., Ларина И.М., Пастушкова Л.Х., Васильева Г.Ю., Истомина В.Э., Веселова О.М,, Туртикова О.В., Шенкман Б.С. Влияние конкурентного ингибитора креатинфосфокиназы на системные и тканевые параметры энергетического метаболизма у крыс в норме и в условиях разгрузки. Авиакосмическая и экологическая медицина. 2008 г., т. 42. №4. С.35-39.

3. Веселова О.М., Огнева И.В., Ларина И.М. Влияние длительной гравитационной разгрузки на клеточное дыхание волокон камбаловидной мышцы крысы. // Бюлл.эксперим. биол. и мед. -2011.-№3-С.292-294.-1.Мышцы.

4. Огнева И.В., Веселова О.М. Ларина И.М. Изменение клеточного дыхания волокон постуральных мышц крысы в условиях длительной гравитационной разгрузки при добавлении в рацион сукцината. Биофизика,2011,том 56,вып. 1,0.122-128.

5. Шенкман Б.С., Веселова О.М., Третьяков B.C., Немировская Т.Л., Таракин П., Мухина А., Ларина И.М. «Влияние модуляторов энергетического метаболизма энерговита и кардиовита на показатели энергетического метаболизма скелетных мышц крысы в норме и при функциональной разгрузке» В кн.: регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты. Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2005, стр.111-116.

6. Мазина Н.К., Зайцев В.б. Цапок П.И., Хоробрых В.Г., Арасланов С.А., Веселова О.М., Воробьева В.В., Бликов A.B., Ларина И.М., Хазанов В.А. «Протективный эффект регуляторов энергетического обмена при наземном моделировании микрогравитации» В кн.: регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты. Материалы XII российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2005, стр.122-128

Заказ № 106-а/08/2011 Подписано в печать 23.08.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 'д^'у,) www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Воздействие гравитационных сил на организм человека и животных в условиях космического полета минимально, но очевидно представляет собой новый в эволюционном плане фактор, который, как показывают исследования, комплексно влияет практически на все физиологические процессы организма, приводя к адаптивному смещению гомеостатического равновесия различных систем органов и тканей. Специфичный поток импульсов от анализаторов, изменение гемоциркуляции, снятие нагрузки силы тяжести на опорно-двигательный аппарат, снижение интенсивности произвольной двигательной активности, нервно-эмоциональное напряжение -эти непосредственные следствия условий космического полета требуют от организма развития приспособительных реакций. Ведущую роль в обеспечении подобной адаптации играет перестройка системы нейрогуморальной регуляции функциональной активности тканей и органов, следствием чего являются различные метаболические эффекты, в частности наблюдаемое выраженное снижение энергетического баланса организма. В условиях невесомости наблюдаются разобщение основных метаболических циклов, понижение активности ферментов энергетического обмена, накопление в крови промежуточных метаболитов [100].

Изучение биохимической перестройки энергетического баланса скелетных мышц при действии гравитационной разгрузки и поиск средств, нивелирующих метаболические повреждения скелетных мышечных волокон в условиях космического полета и при реадаптации к земным условиям, являются важными задачами космической медицины [57]. Особенностью энергообмена является отсутствие в организме централизованного обеспечения его энергетических запросов. Таким образом, каждая органо-тканевая система обладает собственной «встроенной» системой энергообеспечения своих потребностей, которая включается в общую энергосистему организма посредством нейрогуморальной регуляции. В современной биоэнергетике основная роль отводится митохондриям, которые рассматриваются уже не только как органеллы, где происходят биохимические превращения энергетических субстратов и окислительное фосфорилирование, но и как важные регуляторы клеточного гомеостаза, функционирующие на пересечении множества клеточных процессов [21; 30; 57].

Системная перестройка метаболизма скелетной мышцы, происходящая со временем в условиях космического полета, сопровождается параллельным изменением структуры мышечного волокна. Изменения затрагивают весь сократительный аппарат: структуру и состав клеточной мембраны, композицию сократительных и цитоскелетных белков миофибрилл, митохондриальную систему и систему саркоплазматического ретикулума. Нарушается микроциркуляция мышечной ткани, что сопровождается интенсификацией перекисного окисления липидов, активируемого также стресс - реакцией и нарушениями антиоксидантной защиты клетки, а также возможным радиационным излучением [14,61]. Продукты перекисного окисления липидов являются причиной многих клеточных патологий, повреждая клеточные структуры, ингибируя ферменты и выполняя сигнальную функцию. Баланс в функционировании систем свободнорадикального и антиоксидантной защиты определяет адаптационные возможности и резистентность организма к неблагоприятным воздействиям экстремальных факторов [6].

Митохондрии могут быть вовлечены в регуляцию клеточного и тканевого гомеостаза посредством различных механизмов. Регуляция баланса энергетических субстратов и продуктов их окисления, контроль клеточного редокс - статуса, модуляция экспрессии различных генов клетки, относящихся к митохондриальному и ядерному геномам, реализация апоптотического пути. Считается, что «локомотивом» этих фундаментальных клеточных процессов является сопряженная митохондриальная система, которая в первую очередь подвержена адаптивным перестройкам в условиях изменения двигательной активности и стрессовой реакции [132; 139; 140]. Одним из активно разрабатываемых на сегодняшний день подходов к фармакологической коррекции энергетического обмена организма в экстремальных условиях гиподинамии и гравитационной разгрузки является применение веществ, которые потенциально могут участвовать в митохондриальных гомеостатических процессах и корректируют энергообмен клетки [29; 37]. Новый класс препаратов — регуляторов энергетического обмена серии «Янтарь», содержащих только природные нетоксичные вещества могут использоваться в качестве биологически активных добавок к пище. Основным компонентом РЭО является янтарная кислота, которая представляет собой субстрат для сукцинатдегидрогеназы, второго комплекса дыхательной цепи, передающего электроны через кофермент ФАД на коэнзим Q. Янтарная кислота -эффективный эндогенный антиоксидант и антигипоксант [33; 118; 119; 120; 125; 126]. Кроме того, было показано, что ЯК является естественным лигандом для орфанового G-белок-связанного рецептора GPR 91 [115], что послужило новым стимулом для формирования представлений о сигнальной регуляторной роли малых количеств ЯК, попадающей в кровоток в результате активации гипоксического и анаэробного образования ЯК, либо при повреждении митохондрий, а также после введения в организм экзогенной ЯК, в частности, в составе БАД и лекарственных препаратов [34; 45]. Изучение медицинского влияния энергопротекторов, модулирующих уровень янтарной кислоты в тканях и органах, на адаптивные и патологические процессы показывает разностороннюю благоприятную фармакодинамику, свидетельствующую о системном влиянии препаратов на организм человека и животных [29; 33; 36; 37; 45]. Развитие современной биоэнергетической фармакологии, а также разработка подходов коррекции адаптивных реакций и адекватной мобилизации внутренних ресурсов организма человека в таких экстремальных условиях, как космическая среда, требуют системного фундаментального изучения функционирования энергетических и гомеостатических систем в их взаимосвязи в условиях микрогравитации и гиподинамии.

Актуальность темы

Адекватное обеспечение энергией является необходимым условием полноценного функционирования всех систем организма. Известно, что у космонавтов в условиях длительного космического полета наблюдается перестройка энергетического обмена, что находит отражение в снижении мышечной работоспособности, потере массы тела, модификации системы терморегуляции [25]. Показано, что во время длительного космического полета дефицит потребления энергии и уменьшение статических и динамических нагрузок на мышцы (в первую очередь, на антигравитационные) ведут к снижению скорости синтеза белка и развитию его отрицательного баланса. Функциональная разгрузка опорно-двигательной системы организма человека в условиях моделируемой гравитационной разгрузки или реального космического полета приводит к снижению мышечного тонуса, сопровождающегося уменьшением энерготрат, падением активности тканевого дыхания и последующей активации перекисного окисления липидов.

Исследование эффективных средств профилактики при неблагоприятных изменениях в ЭО является неотъемлемым условием для осуществления в дальнейшем сверхдлительных полетов, в том числе и межпланетных. Одной из основных групп средств, используемых в настоящее время для коррекции энергетического обмена, являются сукцинатсодержащие препараты, изучение механизма действия данной группы препаратов, метода их применения, а также воздействия на энергетический обмен является важным экспериментальным направлением.

Цель исследования

Целью работы являлось изучение процесса перестройки энергетического обмена на уровне системы митохондрий в условиях моделируемой гравитационной разгрузки, а также оценка эффективности и исследование механизмов действия сукцинатсодержащих препаратов, способных в этих условиях корректировать энергетический обмен и вызывать повышение адаптивного резерва организма.

Основные задачи исследования В работе решались следующие задачи:

1. Изучить биологические маркеры ферментативной активности в постральной (камбаловидной) мышце крысы в условиях моделируемой гравитационной разгрузки.

2. Оценить влияние регуляторов энергетического обмена на изменение ферментативной активности в результате функциональной разгрузки у крыс.

3. Изучить изменение параметров клеточного дыхания мышечных волокон крыс под действием моделируемой гравитационной разгрузки, а также в условиях применения РЭО.

4. Выявить влияние моделируемой гравитационной разгрузки и применения РЭО на изменения свободнорадикальных процессов и системы антиоксидантной защиты крови экспериментальных животных.

5. Исследовать морфологическую картину клеточных структур сердца, печени и почек под действием моделируемой гравитационной разгрузки, а также на фоне применения регуляторов энергетического обмена.

Научная новизна

Впервые с помощью морфологических методов показано, что применение регуляторов энергетического обмена оказывает протективное действие на измененные в условиях моделируемой гравитационной разгрузки клетки сердца, печени и почек.

Использование сукцинатсодержащих регуляторов энергетического обмена при вывешивании способствует увеличению активности каталазы в плазме крови и в эритроцитах, а так же нивелирует накопление продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах. Добавление в рацион животных препарата «Янтарь - Кардио» в условиях гравитационной разгрузки приводит к повышению активности гликолитического маркера а -ГФДГ в быстрых и медленных волокнах камбаловидной мышцы, в то время как «Энерговит» воспроизводит этот эффект только в волокнах медленного типа. Вывешивание вызывало снижение скорости поглощения кислорода в волокнах камбаловидной и медиальной головки икроножной мышцы, но не в скинированных препаратах волокон передней болыпеберцовой мышцы, применение РЭО нивелировало этот эффект лишь в камбаловидной мышце.

Практическая значимость работы

Данная работа является первым исследованием, выполненным с целью изучения влияния сукцинатсодержащих препаратов на энергетический обмен и клеточное дыхание у крыс под действием моделируемой гравитационной разгрузки на клеточном и системном уровнях. Показано неравнозначное влияние вывешивания на скорость поглощения кислорода в волокнах различных мышц. Выявлено протективное действие РЭО на темп поглощения кислорода постуральными мышцами. Обоснованы положительные системные эффекты РЭО при вывешивании. Результаты работы позволяют на основе комплексного анализа экспериментальных данных дать научно обоснованные рекомендации для использования протекторов энергетического обмена в космической медицине, схемы, способы и дозировки применения которых, в космических полетах, потребуют дальнейшей специальной разработки.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. При длительной моделируемой гравитационной разгрузке наблюдается снижение активности СДГ (сукцинатдегидрогеназы) и увеличение активности а- ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) в камбаловидной мышце, применение препарата «Янтарь - Кардио» восстанавливает активность а - ГФДГ в волокнах обоих типов, «Энерговит» обеспечивает этот эффект только в медленных волокнах.

2. Снижение скорости поглощения кислорода в скинированных волокнах медиальной головки икроножной и камбаловидной мышц после вывешивания нивелируется применением сукцинатсодержащего препарата только в отношении камбаловидной мышцы.

3. Моделируемая гравитационная разгрузка приводит к выраженному дисбалансу в функционировании систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты крови. Применение РЭО оказывает протективное действие, как на эти отклонения, так и на патологические морфологические изменения в тканях сердца, печени и почек.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:

1. IV конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, апрель, 2005, Москва;

2. IX конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, 14 апреля, 2010, Москва;

3. Russian-french-belorussian conference «Neurovascular impairments induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approaches», Angers, France, 10-13 March, 2010.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 120 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы.

выводы

1. При гравитационной разгрузке происходило снижение скорости поглощения кислорода в скинированных волокнах икроножной и камбаловидной мышц, наблюдалось снижение активности СДГ и увеличение активности а - ГФДГ в камбаловидной мышце, что может свидетельствовать об увеличении интенсивности гликолитического пути энергообеспечения в условиях моделирования микрогравитационных эффектов.

2. Добавление в рацион животных препарата «Янтарь-Кардио» в условиях гравитационной разгрузки приводило к повышению активности гликолитического маркера а - ГФДГ в быстрых и медленных волокнах камбаловидной мышцы, при применении «Энерговита» этот эффект наблюдался только в медленных волокнах.

3. Применение препаратов РЭО в условиях гравитационной разгрузки позволило сохранить параметры скоростей потребления кислорода волокнами различных мышц на уровне контрольных групп животных, также получавших препараты, что свидетельствует о нормализации процессов сопряжения окисления-фосфорилирования в условиях продолжительной функциональной разгрузки. Особенно выраженным данный эффект был в волокнах камбаловидной мышцы.

4. Моделируемая гравитационная разгрузка оказывала существенное влияние на свободнорадикальные процессы и систему антиоксидантной защиты крови экспериментальных животных: происходило увеличение активности каталазы в плазме крови и снижение её в эритроцитах, накопление продуктов ПОЛ в эритроцитах. Применение РЭО во время вывешивания нивелировало эти процессы.

5. Моделируемая гравитационная разгрузка вызывала выраженные морфологические изменения в структуре миокарда. Применение РЭО оказывало протективное действие на патологические изменения в кардиомиоцитах и сосудах сердца.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность научному руководителю Лариной Ирине Михайловне, Писаренко Олегу Ивановичу, Студневой Ирине Михайловне, Ивановой Марине Валентиновне, Минералову Владиславу Юрьевичу за возможность проведения эффективной научной работы, помощь, консультации и обмен мнениями.

Список публикаций по теме диссертации

1. Мазина Н.К, Ларина И.М., Хазанов В.А.,.Шенкман Б.С., Цапок П.И., Зайцев В.Б, Хоробрых В.Г., Веселова О.М., Третьяков B.C. Протективное действие регуляторов энергетического обмена при изменении гравитационных нагрузок в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006 г., т. 142, № 10 -423.

2. Мухина A.M., Немировская Т.Л., Ларина И.М., Пастушкова Л.Х., Васильева Г.Ю., Истомина В.Э., Веселова О.М., Туртикова О.В., Шенкман Б.С. Влияние конкурентного ингибитора креатинфосфокиназы на системные и тканевые параметры энергетического метаболизма у крыс в норме и в условиях разгрузки. Авиакосмическая и экологическая медицина. 2008 г., т. 42. №4. С.35-39.

3. Веселова О.М., Огнева И.В., Ларина И.М. Влияние длительной гравитационной разгрузки на клеточное дыхание волокон камбаловидной мышцы крысы. // Бюлл.эксперим. биол. и мед. -2011.-№3-С.292-294.-1 .Мышцы.

4. Огнева И.В., Веселова О.М. Ларина И.М. Изменение клеточного дыхания волокон постуральных мышц крысы в условиях длительной гравитационной разгрузки при добавлении в рацион сукцината. Биофизика,2011 ,том<56,вып. 1,с. 122-128.

5. Шенкман Б.С., Веселова О.М., Третьяков B.C., Немировская Т.Л., Таракин П., Мухина А., Ларина И.М. «Влияние модуляторов энергетического метаболизма энерговита и кардиовита на показатели энергетического метаболизма скелетных мышц крысы в норме и при функциональной разгрузке» В кн.: регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты. Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2005, стр.111-116.

6. Мазина Н.К., Зайцев В.б. Цапок П.И., Хоробрых В.Г., Арасланов С.А., Веселова О.М., Воробьева В.В., Бликов А.В., Ларина И.М., Хазанов В.А. «Протективный эффект регуляторов энергетического обмена при наземном моделировании микрогравитации» В кн.: регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты. Материалы XII российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2005, стр. 122-128

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенной работы дают представление о различных звеньях метаболической и морфологической адаптации организма животных к условиям длительной гравитационной разгрузки. Так, при исследовании ферментативных маркеров энергетического обмена наблюдалось снижение активности сукцинатдегидрогеназы и увеличение активности а глицерофосфатдегидрогеназы в камбаловидной мышце, что свидетельствует об увеличении интенсивности гликолитического пути энергообеспечения в условиях моделирования микрогравитационных эффектов. Полученные данные свидетельствуют об изменениях функционирования системы антиоксидантной защиты, которые подтверждены увеличением активности каталазы в плазме крови и снижением её активности в эритроцитах одновременно с накоплением конечного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида. Обнаружены интересные особенности изменения клеточного дыхания волокон постуральных мышц крысы на эндогенных и экзогенных НАДН - зависимых субстратах, свидетельствующие о блокировании переноса электронов в первом комплексе дыхательной цепи.

При проведении экспериментального исследования эффективности и механизма действия ряда биологически активных добавок, содержащих янтарную кислоту, наблюдался протективный эффект сукцинатсодержащих РЭО, который был подтвержден снижением патологических изменений в гепатоцитах, клетках почек и в кардиомиоцитах и сосудах сердца, выявляемых методом морфогистологического анализа. Представляется важным, что использование при гравитационной разгрузке РЭО, содержащих сукцинат, позволяет сохранить скорость потребления кислорода волокнами различных мышц (и в особенности камбаловидной мышцы) на контрольном уровне.

Полученные данные свидетельствуют о том, что изучение такого рода изменений может иметь практическое значение с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы организма при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.