Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Механизмы дисфункции митохондрий и нарушений ионного гомеостаза при глутаматной нейротоксичности

На правах рукописи УДК 616-092.1,8

п-

СУРИН Александр Михайлович

МЕХАНИЗМЫ ДИСФУНКЦИИ МИТОХОНДРИЙ

И НАРУШЕНИЙ ИОННОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ ГЛУТАМАТНОЙ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ.

14.03.03 - Патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 г ДЕК 2013

Москва-2013

005543817

005543817

Работа выполнена в лаборатории патологии ионного транспорта и внутриклеточной сигнализации Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук и в Лаборатории клеточных и молекулярных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр здоровья детей» Российской академии медицинских наук.

Научные консультанты: Ходоров Борис Нзраилевич,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией патологии ионного транспорта и внутриклеточной сигнализации Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Пинелнс Всеволод Григорьевич

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточных и молекулярных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр здоровья детей» Российской академии медицинских наук

Официальные оппоненты: Лукьянова Людмила Дмитриевна,

доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАМН, заведующая лабораторией биоэнергетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Зинченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт биофизики клетки» Российской академии наук

Черняк Борис Викторович,

доктор биологических наук, заведующий лабораторией биоэнергетики клетки Научно исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научный центр неврологии» Российской академии медицинских наук

Защита состоится «_26 » декабря 2013г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «НИИ общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН

Автореферат разослан « » ноября 2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.003 .01

кандидат медицинских наук Скуратовская Лариса Николаевна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ (Информационный бюллетень №310, июнь 2011г.) в странах со средним и высоким уровнем дохода инсульт и другие цереброваскулярные заболевания по уровню смертности населения прочно занимают второе место (9-13%) после сердечно-сосудистых (14-16%). С учетом нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера и др.) и травм, полученных при несчастных случаях, повреждения мозга становятся на один уровень с сердечно-сосудистыми заболеваниями по доле летальных исходов. По потерям трудоспособности инсульт, цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания опережают все остальные причины инвалидности среди выживших.

При повреждениях мозга, вызванных кислороддефицитными состояниями, травмами или инсультами, вокруг участков поражения развиваются зоны энергозависимого нарушения метаболизма клеток, в первую очередь, нейронов (так называемая «ишемическая полутень» или «пенумбра» (penumbra) (Dirnagl et al, 1999). В синапсах нейронов, оказавшихся в этих зонах, происходит неконтролируемое высвобождение основного возбуждающего нейромедиатора центральной нервной системы глутамата (Glu). Избыточная стимуляция глутаматных рецепторов, прежде всего ионотропных рецепторов NMDA-типа, приводит к перегрузке нейронов ионами Са2+ и Na+, нарушению сигнальных, метаболических и энергетических процессов и, в итоге, к увеличению области поражения мозга в результате отсроченной гибели нейронов (Mattson & Mark, 1995; Nicotera & Orrenius, 1998; Sattler & Tymianski, 2000). Разработка методов, позволяющих ограничить область вторичного поражения мозга, требует учета многих параметров, влияющих на способность нейронов к выживанию. Первичные культуры нейронов, полученные из различных отделов мозга млекопитающих (в основном крыс и мышей), являются общепризнанной и часто незаменимой моделью исследования процессов, происходящих в мозге в норме и при патологии (Choi, 1987, 1992).

Предшествующие пионерские исследования (Tymianski et al, 1993; Adamec et al, 1998; Castilho et al, 1998), выполненные, в том числе, с участием нашего коллектива (Khodorov et al, 1996; см. также обзоры Ходоров, 2000; Khodorov, 2004), показали, что в нейрональных культурах длительное воздействие высоких доз Glu вызывает двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Ca2+]¡). Вторая фаза подъема [Ca2+]¡ , т.н. отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД), всегда происходит синхронно со значительным падением трансмембранного потенциала внутренней мембраны

митохондрий (далее «митохондриального потенциала», ДЧ^) (Vergun, et al, 1999). Измерения на сестринских культурах показали, что доля нейронов, в которых возникла ОКД, почти линейно соотносится с долей нейронов, погибших через несколько часов после окончания Glu-воздействия (Limbric et al, 1995). Этим обстоятельством, а также тем, что Са2+ является вторичным мессенджером во всех типах клеток и регулирует мириады внутриклеточных процессов (Авдонин и Ткачук, 1994; Berridge, 2000), обусловлен незатухающий интерес к механизму возникновения ОКД и использованию этого феномена для тестирования нейротропных свойств различных агентов (см., например, Suwanjang et al, 2013; Vaarmann et al, 2013).

Исследования, выполненные за последние 20 лет, выявили ряд возможных причин развития ОКД и последующего сохранения высокого [Са2+], плато. Эти исследования можно разделить на два направления, в зависимости от того, какой из механизмов развития ОКД считается основным: (1) возникновение неспецифической поры высокой проводимости во внутренней мембране митохондрий (mitochondrial permeability transition роге, мРТР); (2) развитие энергетического кризиса, приводящего к дисбалансу ионного гомеостаза, кульминацией которого является ОКД. Центральная роль митохондрий не подвергается сомнению в любой из гипотез развития ОКД и последующей гибели нейронов. При этом остаются невыясненными следующие вопросы: 1) На какой стадии ОКД образуется мРТР в нейронах? 2) Является ли образование мРТР главной причиной ОКД и последующего энергетического кризиса, или наоборот, мРТР является следствием развития ОКД? 3) Предшествует ли критическое падение концентрации АТФ в цитозоле ([АТР]с) развитию ОКД или низкий уровень [АТР]с достигается только на стадиях высокого [Са2+]| плато? 4) Каковы механизмы вовлечения митохондрий в развитие ОКД и поддержание высокого [Ca2+]i плато ?

Для решения этих вопросов необходимо не только расширение арсенала методов исследования, но и разработка методических приемов, позволяющих проводить многопараметрические прижизненные высокочувствительные измерения процессов, вовлекаемых в развитие ОКД. Значительный прогресс в изучении разнообразных аспектов внутриклеточной сигнализации в норме и патологии был достигнут благодаря применению белковых конструктов, состоящих из флуоресцентных и сенсорных белков, которые селективно реагируют на изменения внутриклеточных параметров, таких как рН, концентрации Са2+, пероксида водорода, циклического АМФ и др. (Shaner et al, 2006; Chudakov et al, 2010; Lukyanov et al, 2010; Orosco et al, 2013). В дифференцированных клетках экспрессия флуоресцентных белковых сенсоров затруднена и поэтому примеры применения этого метода при исследовании

2

внутриклеточных процессов в нейронах пока немногочисленны (Rintoul et al, 2003; Shalbueva et al, 2006; Bolshakov et al, 2008; Kovac et al, 2012). Вирусная трансфекция позволяет достичь 80-90% экспрессии флуоресцентного сенсора в нейронах (Bano et al, 2005), однако требует особых мер предосторожности при проведении экспериментов и поэтому реже используется. Главными преимуществами флуоресцентных белковых сенсоров являются (1) возможность отслеживать такие внутриклеточные характеристики, для которых пока не удалось создать синтетические индикаторы и (2) адресная доставка в интересующие внутриклеточные компартменты с прецизионностью, недоступной для низкомолекулярных синтетических флуоресцентных зондов. Учитывая все это, при выполнении данной работы были разработаны способы одновременной экспрессии в культивируемых нейронах различных флуоресцентных белковых сенсоров и исследование с их помощью внутриклеточной сигнализации, ионного гомеостаза и биоэнергетики нейронов в норме и при нейротоксическом действии Glu.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось выяснение роли митохондрий в нарушениях ионного гомеостаза нейронов при гиперстимуляции ионотропных глутаматных рецепторов, приводящей к развитию отсроченной Са2+ дисрегуляции (ОКД) и последующей гибели клеток.

Задачи исследования:

1. Разработать мультипараметрическую флуоресцентно-микроскопическую систему для измерений функционального состояния митохондрий и ионного гомеостаза в индивидуальных нейронах с комбинированным использованием синтетических флуоресцентных зондов и флуоресцентных белковых сенсоров с адресной доставкой в цитозоль и митохондрии.

2. Исследовать взаимосвязь между индуцированной глутаматом ОКД, митохондриальной деполяризацией и патогенетических механизмов, ведущих к последующей гибели нейронов.

3. Исследовать влияние на развитие ОКД внешних факторов, модулирующих функциональное состояние митохондрий (инигбирования дыхания, разобщения окислительного фосфорилирования, глюкозной депривации, реверсии Na+/Ca2+ обмена).

4. Изучить вклад в развитие дисфункции митохондрий и ОКД эндогенных факторов, возникающих в результате индуцированной глутаматом активации фосфолипаз А2 и поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1.

5. Исследовать процессы, в которых митохондрии играют активную роль в противодействии развитию ОКД.

6. Исследовать различия в биоэнергетике при действии Glu на культивируемые нейроны, полученных от животных в периоды пре- и постнатального развития. Научная новизна

1. Впервые показано, что более 90% культивируемых нейронов, в которых за время аппликации Glu успела развиться ОКД и сильная митохондриальная деполяризация, погибают спустя 18-20час от некроза и апоптоза.

2. Показано, что эндогенными факторами развития ОКД, снижающими митохондриальный синтез АТФ и Са2+-буферные свойства митохондрий, являются арахидоновая кислота, высвобождаемая в результате активации фосфолипаз А2, и падение NADH вследствие активации поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1.

3. Установлено, что в культивируемых нейронах наряду с Glu-индуцированными патогенными процессами, развиваются также процессы, противодействующие дисфункции митохондрий и глутаматной токсичности: 1) переключение на другой метаболический путь окисления субстратов, компенсирующий глюкозную депривацию и дефицит пирувата;

2) увеличение градиента рН между матриксом митохондрий и цитозолем (ДрН), компенсирующее снижение митохондриального потенциала (ЛЧ^);

3) рост активности сукцинатдегидрогеназы.

4. Впервые показано, что в индивидуальных культивируемых нейронах развитию ОКД предшествует падение концентрации АТФ в цитозоле до 1020% от уровня в покоящихся клетках.

5. Обнаружены кардинальные отличия в биоэнергетике культивируемых нейронов пре- и постнатального периодов: в нейронах из гиппокампа эмбрионов крыс (Е17-Е18) основным способом производства АТФ является гликолиз, тогда как в нейронах из гиппокампа постнатальных крыс (Р1-Р2) АТФ синтезируется преимущественно за счет окислительного фосфорилирования.

Научно-практическое значение работы

Разработаны флуоресцентно-микроскопические методы регистрации в индивидуальных клетках изменений одновременно нескольких (от двух до четырех) внутриклеточных параметров, таких как внутриклеточная концентрация свободного Са2+ и Na+ , NAD(P)H и FAD автофлуоресценция, активные форм кислорода, потенциала митохондриальной и плазматической мембраны, рН в цитозоле и митохондриях.

Применены новые фармакологические подходы (ингибиторный анализ) и внедрен мультипараметрический морфологический анализ выживаемости культуры.

Впервые удалось достичь экспрессии в нейрональных культурах одновременно двух сенсорных флуоресцентных белков, имеющих разные спектральные параметры и локализованных в разных внутриклеточных компартментах.

Разработанные методы могут служить для тестирования механизмов действия биологически активные веществ. Вещества, задерживающие развитие ОКД, могут быть перспективными при разработке препаратов нейропротекторного действия. Увеличение лаг-периода ОКД под влиянием испытуемого вещества является количественным критерием эффективности подобных веществ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Развитие ОКД происходит синхронно с развитием сильной митохондриальной деполяризации (МД). Нейроны, в которых ОКД достигла фазы высокого [Ca2+]¡ плато, гибнут через 14-20час в результате некроза или апоптоза в пропорции —1:1. Длительность лаг-периода ОКД и МД может служить количественной мерой для тестирования нейропротекторных или нейротоксических свойств биологически активных соединений при патологических состояниях нейронов.

2. Развитие ОКД вызвано действием нескольких факторов, в числе которых высвобождение из фосфолипидов арахидоновой кислоты, снижение NAD(P)H, увеличение ионной (протонной) проводимости внутренней мембраны митохондрий, разобщение окислительного фосфорилирования, падение [АТР]с, снижение Са2+-буферной емкости митохондрий. Восходящая фаза ОКД и начало высокого [Ca2+]¡ плато развиваются не вследствие «классической» мРТР, поскольку являются обратимыми, сопровождаются сильным падением, но не коллапсом АЧ'т и ДрН, митохондрии удерживают в матриксе NAD+ и более низкомолекулярные субстраты цикла трикарбоновых кислот.

3. При действии нейротоксических доз Glu, одновременно с появлением факторов, ослабляющих функционирование митохондрий в качестве производителей АТФ и основных Са2+-буферных емкостей нейронов, происходит привлечение внутриклеточных ресурсов, препятствующих ОКД, а именно, мобилизация «резервного» субстрата взамен пирувата при блокаде гликолиза, рост ДрН, усиление работы FAD-зависимого комплекса II дыхательной цепи.

4. При переходе от эмбриональной (El7-Е 18) к постнатальной (Р1-Р2) стадии развития в нейронах мозга происходит перестройка биоэнергетики, проявляющаяся в том, что в основной массе (-84%) культивируемых нейронов из гиппокампа пренатальных животных основным способом

5

производства АТФ служит гликолиз, тогда как в нейронах новорожденных крыс доминирующим способом синтеза АТФ становится окислительное фосфорилирование.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2007, 2009, 2011, 2013), на 3-ем Съезде Биохимического общества России, Санкт-Петербург-2003, на Конференциях Физиологического общества Великобритании (Aberdeen-2000, London-2002), 3-ем Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва-2004), на Конференциях Американского Общества нейронаук (Society for Neurosciences, Washington-2005, 2008, 2011; Chicago 2009; San-Diego, 2010), на Съезде Американского биофизического общества (Baltimore-2011), на 8-ом Всемирном конгрессе IBRO (Florence-2011), на 3-ем Съезде физиологических обществ стран СНГ (Ялта-2011).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 43 печатных работах, из которых 16 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Crpyicrypa и объем работы

Диссертация написана на стр., состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Основные результаты и обсуждения», «Заключение» «Выводы» и «Список использованной литературы», который включает отечественных и иностранных источника. Работа иллюстрирована рисунками и содержит таблиц.

Методы и материалы Приготовление первичных нейропальных культур. Культуры приготавливали из мозжечка 6-7-дневных или из гиппокампа 1-2-дневных крыс Вистар как описано в работах (Khodorov et al, 1992; Горбачева и соавт, 2006). Эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. Животных анестезировали, декапитировапи, извлекали мозжечок или мозг, а затем гиппокампы. Суспензию клеток (10б клеток/мл) получали, обрабатывая ткань папаином (10ед/мл), диссоциировали пипептированием, и отмывали от разрушенных клеток двукратным осаждением в центрифуге. Суспензию (200мкл) переносили на покровные стекла, прикрепленные к лункам 35мм пластиковых чашек Петри (MatTek, США). Стекла предварительно покрывали поли-этиленимином (10 мг/мл). Через час добавляли 1,5мл нейробазальной среды, содержащей 2% Supplement В-27 и 0,5мМ L-глутамина. Клетки содержали при 37°С в атмосфере 5%С02/95% воздуха при 100% влажности. На

6

3-4 день добавляли арабинозид (АгаС, ЮмкМ) для подавления роста глиальных клеток. Культуры использовали на 7-16 день после посадки (7-16 дней in vitro, 7-16DIV, 2-7 дней после трансфекции).

Содержание NAD+ и NADH в клеточных культурах измеряли в плашечных ридерах с помощью наборов, в которых NAD+ восстанавливается до NADH с последующим восстанавлением формазана до интенсивно окрашенного соединения. Среднюю [АТФ] в клеточной культуре измеряли методом люциферин/люциферазной хемилюминесценции. Для измерения активности ПАРП-1 применяли иммуноцитофлуоресцентное окрашивание продукта реакции поли(АДФ-рибозы) с последующим анализом флуоресцентно-микроскопических изображений.

Флуоресцентно-микроскопические измерения. Для измерения [Са2+], клетки нагружали Са2+ индикаторами (Fura-2, Fluo-3, Rhod-2 или их низкоаффинными аналогами) в форме ацетоксиметиловых (AM) эфиров (40-50мин, 37°С, концентрации, в зависимости от индикатора, составляли 0,5-5мкМ). Изменения AlFm регистрировали, окрашивая клетки потенциал-чувствительным зондом Rhl23 (2,5мкг/мл, 15мин, 37°С) или TMRM (4-40нМ, 40мин, 37°С).

Измерения выполнены при температуре 27-29°С в буфере, содержащем (мМ): 135 NaCI, 5 КС1, 2 СаС12, 1 MgC12, 20 HEPES, 5 £>-глюкозы; рН 7,4. В безнатриевом буфере NaCI заменяли на 1М-метил-0-глкжамин (130мМ); рН 7,4 устанавливали, добавляя 20мМ HEPES и дотитровывая 1М НС1. Номинально бескальциевые растворы вместо СаС12 содержали 0,1 мМ EGTA и 2мМ MgClj. Смену растворов осуществляли 2x2мл заменой содержимого чашки с клетками за время не более 30с. Клетки термостатировали на предметном столике микроскопа при температуре 28-29°С.

Для измерения рН митохондрий и цитозоля, а также [АТР]с с помощью флуоресцентных белковых сенсоров плазмиды, несущие гены соответствующих белков, доставляли в клетки, используя Lipofectamin-2000 (LF-2000). Для одновременного измерения [АТР]с и рНс мы воспользовались тем, что в ATI.03 реализован феномен флуоресцентного (фёрстеровского) резонансного переноса энергии (FRET). При регистрации сигнала ATI.03 в условиях возбуждения флуоресценции только белка-акцептора энергии (возбуждение 485-500нм, испускание 525-535нм) практически исключена зависимость флуоресценции от [АТР]с , что позволило отслеживать изменения только рНс. Калибровку рН-зависимости сигналов флуоресцентных белковых сеносоров в нейронах проводили как описано в (Bolshakov et al, 2008) с небольшими изменениями в способе расчета, используя растворы с ионофорами, обеспечивающими выравнивание рН между буфером и

7

внутриклеточной средой. Калибровочные растворы имели состав (мМ): 0,005 нигерицина, 0,001 FCCP, 134 глюконата калия, 1 MgC12, 20 HEPES. Для установки pH использовали 1М растворы HCl или КОН. Для предотвращения работы митохондриальной АТФсинтазы в прямом или реверсивном режиме в калибровочные растворы добавляли олигомицин (2,5мкг/мл).

В экспериментах по исследованию выживаемости культивируемых нейронов с помощью флуоресцентных красителей применяли Hoechst 33342 (10мкг/мл), Syto-13 (1мкМ) и этидиум гомодимер (EthD-1, ЗмкМ). Концентрацию NAD+ и NADH определяли с помощью аналитического набора Bio Assay Systems (США).

Флуоресцентно-микроскопические измерения выполнены на установках, включающих инвертированный микроскоп Olympus IX-71 или Zeiss Axiovert-200, систему освещения Sutter Labmda 10-2 со 175Вт ксеноновой лампой (Sutter Instruments) и CCD-камеру CoolSNAP HQ2 (Photometries), управляемых через компьютерную программу MetaFluor 6.2 или 7.2 (Molecular Devices, США).

Все реагенты фирмы Sigma (США). Флуоресцентные реагенты, включая Са2+ индикаторы, потенциал-чувствительные зонды, МитоТрекеры, витальные красители, ред-окс-индикаторы приобретены у Invitrogen (США). Плазмиды, кодирующие флуоресцентные белковые сенсоры, были любезно предоставлены Dr. R.Rizzuto, Dr. H.Imamura, Д-ром Д.Чудаковым и Д-ром В.Белоусовым.

Для обсчета флуоресцентных сигналов и построения графиков, а также для статистической обработки данных использовали программы MetaFluor Analyst, Excel-2007, Prizm-4 и Origin 7.5.

Основные результаты и обсуждения 1. Исследование взаимосвязи меяеду индуцированной глутаматом отсроченной Са2+ диерегуляцией, митохондриальной деполяризацией и механизмом последующей гибели нейронов.

1.1. Синхронность изменений внутриклеточной концентрации свободного Ca2* ([Ca2+]¡) и трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий (Л Ч0^. Типичные изменения [Ca2+]¡ (Рис. 1А) и AvFm (Рис. 1Б), индуцированные Glu в культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы и в двух представительных нейронах (Рис. 1В,Г) из этой группы клеток, показаны на рисунке 1А,В. Видно, что токсическая доза Glu (ЮОкМ, ЮмкМ глицина, 0 Mg2+) вызвала вторичный подъем [Ca2+]¡ (ОКД) и митохондриальную деполяризацию (падение Д¥т) с лаг-периодами (DCD-Lag), индивидуальными для каждого нейрона. Совмещение графиков [Са2+], и изменений сигнала

3000 Время (с)

2500 3000 3500 4000 Время (с)

2000 3000 4000

Время (с)

1500 2000 2500 3000 3500 4000 Время (с)

Рис. 1. Глутамат индуцирует двухфазные [Ca2+]j и А*Рт в культивируемых гранулярных нейронах мозжечка крысы (7DIV).

Изменения [Ca2+]j (А) и АЧ!т (Б) в группе клеток и в двух представительных нейронах (В и Г) из этой группы. (Д) Соотношение между началом ОКД (DCD-Lag) и началом второй фазы митохондриальной деполяризации (MD-Lag). (Е) Соотношение между лаг-периодами ОКД и восстановления [Ca2+]j в постглутаматный период (Recovery-Lag).

FCCP

потенциал-чувствительного зонда Rhl23 (Рис. 1В,Г) демонстрирует, что при развитии ОКД рост [Ca2+]i и падение AvPm происходят синхронно. Соотношение между началом ОКД и началом сильной митохондриальной деполяризации (МД) соответствует линейной функции во всем диапазоне измерений (г2=0,995) (Рис. 1Д). Отмывание Glu бескальциевым буфером способствует восстановлению низкой [Са2+]( , причем задержка между моментом удаления Glu и началом снижения [Ca2+]j (Recovery-Lag) также индивидуальна для каждого нейрона, как и задержка между моментом добавления Glu и началом ОКД (DCD-Lag) (Рис. 1Е). Такое соотношение объясняется, вероятно тем, что при более раннем наступлении ОКД (короткий DCD-Lag) в митохондриях накапливается больше Са2+ и, соответственно, требуется больше времени на его удаление в постглутаматный период (более длительный Recovery-Lag). Деполяризация митохондрий в бескальциевом буфере высвобождает из них Са2+ (Рис. 1А,В,Г), причем тем больше, чем короче период между удалением Glu и деполяризацией митохондрий что согласуется с опубликованными ранее данными (Kiedrowski et al., 1994; Brocard et al, 2001). Коэффициент линейной корреляции между DCD-Lag и Recovery-Lag невелик (на Рис. 1Д г2=0,45), что отражает различие механизмов, регулирующих поступление и удаление Са2+ во время ОКД и в постглутаматный период. На это же указывает различие в сигналах потенциал-чувствительного зонда в нейронах, имеющих разную кинетику снижения [Ca2+]i в постглутаматный период (Рис. 1В,Г). В среднем, чем раньше возникала ОКД, тем продолжительнее была фаза высокого [Ca2+]i плато (Рис. 1Е).

1.2. Математическое моделирование сигналов потенциал-чувствительных флуоресцентных зондов Rhl23 и TMRM. Важно отметить, что сигналы потенциал-чувствительных зондов сложным образом зависят от потенциала как митохондриальной (AvPm), так и плазматической мембраны (ДЧ'р). Анализ данных с помощью математической модели, связывающей изменения флуоресценции «одноволновых» потенциал-чувствительных зондов, таких как Rhl23 и TMRM (Ward et al., 2000; Nicholls & Ward, 2000), показал следующее: наиболее критическими факторами, которые, помимо АЧ'п, и ДЧ'р, определяют изменения сигналов Rhl23 и TMRM, являются проницаемость этих зондов через плазматическую мембрану, доля митохондриального матрикса в объеме клетки и концентрация самотушения. Мы выполнили расчеты изменений Д^ и ДЧ'р на основании алгоритмов, предложенных в указанных работах. Имитация изменений флуоресценции TMRM и Rhl23 во время 1-ой фазы Glu-индуцированных изменений [Са2+]; и при развитии ОКД показала следующее: более гидрофобный и быстро проникающий через плазмалемму

10

зонд TMRM вытекает из нейронов в ответ на Glu настолько быстро, что возникновение ОКД отражается на его сигнале лишь как небольшое ускорение снижения флуоресценции. В то же время проницаемость Rhl23 сквозь плазмалемму почти в 20 раз меньше по сравнению с TMRM (соответственно 0,00045с- и 0,007с-1) и поэтому за время от момента добавления Glu и до развития высокого [Ca2+]j плато Rh 123 циркулирует преимущественно между цитозолем и митохондриями, не вытекая наружу. Благодаря этому свойству, изменения сигнала Rh 123 отражают изменения АЧ^ и слабо зависят от ДЧ^. Это упрощает интерпретацию данных и поэтому мы использовали в основном Rh 123, за исключением случаев, когда перекрывание спектров Rh 123 со спектрами других флуорофоров не допускало такого применения.

Анализ кинетики Rh 123 показывает также, что снижение флуоресценции, наступающее во время высокого [Ca2+]i плато и пост-глутаматного периода, может быть вызвано ускорением вытекания зонда из клетки за счет изменения барьерных свойств плазмалеммы. Важным фактором, облегчающим вытекание зонда из клетки, может быть появление в мембране гидрофобного аниона в качестве противоионов для липофильных катионов Rh 123 и TMRM (Nicholls, 2006). В роли таких противоионов могут выступать свободные жирные кислоты (Severin et al, 2010), которые при Glu воздействии образуются в результате активации фосфолипаз А2 (см. далее §3.6).

1.3. Продолжительность ОКД и механизм гибели нейронов. Нейроны гиппокампа, имевшие ОКД и не восстановившие исходную [Ca2+]i после удаления Glu, погибают (Limbric et al, 1995). Необходимо отметить, что эти измерения были выполнены на сестринских культурах. Вывод о том, что гибли именно те нейроны, которые имели затруднения в восстановлении низкой [Ca2+]i, был сделан на основании сопоставления статистических данных, а не прямого наблюдения за теми же самыми нейронами. Мы проверили, имеется ли корреляция между длительностью лаг-периода ОКД (продолжительностью высокого [Ca2+]i плато во время действия Glu, см. Рис. 1Е) и последующей гибелью именно тех нейронов, которые имели ОКД. Для этого клетки, не нарушая стерильности культур, подвергали действию Glu, а затем возвращали в кондиционную среду и оставляли на 18-20час в СОг-инкубаторе. Выживаемость определяли, анализируя изображения в проходящем свете и флуоресцентные изображения тех же самых нейронов, окрасив их одновременно Hoechst33342 (или DAPI), Syto-13 и EthD-1. Разделение нейронов на живые и погибшие в результате некроза или апоптоза проводили в соответствии с рекомендациями, предложенными Номенклатурным комитетом (Kroemer et al, 2005,2009).

Некроз Glu

О 400 800 1200

В

1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 Время (с)

Апоптоз Glu

400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000

Время (с)

Рис. 2. Кинетика изменений [Са2+]| в гранулярных нейронах мозжечка (11-12DIV), рассортированных по признаку последующей

гибели от некроза или апоптоза. Пути гибели нейронов определены с помощью витальных

флуоресцентных красителей Hoechst33342, Syto-13 и этидиум гомодимера, EthD-1. [Ca2+]i ответы на Glu рассортированы в зависимости от последующего пути гибели по некротическому (А) или апоптотическому (Б) пути. Времена наступления ОКД для каждого из указанных типов гибели представлены в виде прямоугольников (некротические клетки) и треугольников (апоптотические клетки). Горизонтальные

отрезки на (В) отмечают среднее время наступления ОКД (DCD Lag Period, сек). Числа в скобках указывают количество клеток.

На рисунке 2 графики [Са +]; ответов клеток на Glu разделены на две группы в зависимости от того, погибли клетки впоследствии от некроза (Рис. 2А) или апоптоза (Рис. 2Б). Видно, что кинетика развития ОКД одинакова как в клетках погибших от некроза, так и от апоптоза, хотя в первых DCD-Lag в среднем короче и ОКД наступала раньше, чем в нейронах, погибших по апоптотическому пути (Рис. 2В). Из всех нейронов, имевших ОКД, удалось обнаружить среди живых только 3% клеток (2 из 76 нейронов в трех посадках культур). Среди погибших 60% находились в некрозе, остальные 37% в апоптозе. Все нейроны, которые перед удалением Glu сохранили относительно

низкую [Ca2+]¡ и не имели ОКД, остались живы. Возможно, при развитии ОКД происходит активация сразу нескольких внутриклеточных механизмов гибели, кульминацией которых (через 18-20час) является некроз либо апоптоз.

1.4. Исследование роли ингибирования протонных насосов и увеличения проводимости внутренней митохондриальной мембраны в возникновении Са2+ дисрегуляции. Учитывая тесную связь индуцированных нейротоксическими дозами Glu изменений [Ca2+]¡ и ДЧ'п, (Рис.1), и последующей гибели нейронов (Рис.2), мы исследовали как отражается на этих параметрах дисфункция митохондрий, вызванная митохондриальными ядами, и повышением протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны.

Кратковременная аппликация Glu не успевала, как правило, вызвать ОКД и сильную МД в молодой культуре нейронов (7DIV) (Рис. ЗА,Б). Для предотвращения действия эндогенного Glu в отмывающий раствор добавляли ингибитор NMDA-каналов МК-801 (ЮмкМ). Протонофор FCCP (0,ЗмкМ), добавленный перед Glu, быстро деполяризовал митохондрии, но не влиял на [Ca2+]¡ (Рис.ЗВ,Г), свидетельствуя о том, что в покоящихся нейронах концентрация Са2+ в матриксе митохондрий и цитозоле одинаково низкая. Аппликация Glu в присутствии FCCP вызывала скачок [Ca2+]¡ , названный немедленной Са2+ дисрегуляцией, (НКД, Tymianski et al, 1993; Nicholls & Budd, 2000). Одна из двух причин НКД состоит в том, что деполяризованные митохондрии не способны на электрофоретический захват Са2+, поступающего в цитозоль по Glu-активированным каналами, указывая на важную роль митохондрий как Са2+ буфера. Высокое [Ca2+]¡ плато удерживалось даже после удаления Glu до тех пор, пока протонофор оставался в растворе (Рис.ЗВ,Г), свидетельствуя о нарушении системы удаления избытка Са2+ из цитозоля. Очевидно, в результате вызванного протонофором коллапса Д*Рт митохондриальная АТФсинтаза переходит в режим АТФазы и, становясь протонным насосом, поддерживает A4Jm . Реверсия АТФсинтазы в АТФазу создает дефицит АТФ для Са2+ насосов плазматической мембраны, что и служит второй причиной НКД. Это предположение было подтверждено экспериментами, в которых протонофор добавляли вместе с ингибитором FlFo-АТФазы олигомицином (Oligo, 2,5мкг/мл). В этом протоколе Glu также вызвал НКД, однако большинство нейронов восстанавливало исходную [Ca2+]¡ сразу после удаления Glu, несмотря на сохраняющуюся сильную МД (Рис.ЗД,Е). Оубаин (Ouab, 0.5мМ), ингибитор №+/К+-АТФазы плазматической мембраны, являющейся в нейронах одним из главных потребителей АТФ (Ames, 2000), подобно олигомицину, придавал нейронам способность восстанавливать низкую [Ca2+]j после удаления Glu при продолжающейся МД (Рис.3ж,3).

800 1200 1600 0 400 800

Time (s) Time (s)

00-12-11_3/ Hippoc. 1101V

Рис. 3. Немедленная Ca2+ дисрегуляция (НКД), вызванная Glu в условиях коллапс A4',,, , может быть подавлена в постглутаматный период ингибиторами FlFo-АТФазы митохондрий или Na+/K+-AT®a3bi плазмалеммы. Подробные пояснения см. в тексте.

s 4.0

о u. 3.5

ô

я 3.0

uT

LL 2.5

n

| 2.0

1.5

О 1.0

п =12

п=13 — MK-S01

Ouab

3 ,

FCCP-Ca

Ouab

Напротив, ингибирование Ca2-насосов плазматической мембраны эозином Ж (0,25мМ) затягивало восстановление низкой [Ca2+]i. Такой же эффект вызывала замена Са2+ его суррогатом Ва2+, который может входить в клетку по Са2+-проницаемым каналам (Ascher et al, 1988), но плохо удаляется Са2+-АТФазой (Graf et al, 1982).

Стоит отметить, что в астроцитах, не содержащих NMDA-рецепторов, Glu вызывал лишь небольшой подъем [Ca2+]j , часто имевший характер осцилляций, хотя FCCP вызывал в астроцитах такую же сильную деполяризацию митохондрий, как и в нейронах. Пример такого вида Са2+ и Л1Р,П ответов на Glu показан пунктиром на рисунке 3ж,3.

НКД можно было получить, используя в аналогичных протоколах вместо протонофоров ингибиторы дыхательной цепи (ротенон, антимицин А, цианид). Добавление цианида (ЗмМ NaCN) к покоящимся нейронам вызывало небольшую МД за счет того, что FlFo-АТФаза, расходуя поступающий из цитозоля АТФ, работала как протонный насос, генерируя A4V НКД и сильная МД возникала после добавления Glu в результате поступления в цитозоль Са2+ и Na+ по Glu-управляемым каналам. Расход АТФ, производимого гликолизом, многократно возрастал за счет потребления Ыа+/К+-АТФазами и при такой конкуренции за АТФ производительности FlFo-АТФазы уже не хватало для генерации высокого ДЧ'П| при поступлении Са2+ в митохондрии по унипортеру. Удаление Са2+ из буфера значительно уменьшало МД, вызванную Glu в присутствии блокатора комплекса IV дыхательной цепи цианида. МД, вызванную Glu в присутствии CN, можно было уменьшить еще больше, отменив потребление АТФ Na/K'-АТФазам и предынкубацией клеток с оубаином.

НКД возникала также при добавлении протонофоров или ингибиторов протонных насосов дыхательной цепи, если эти агенты добавляли не заранее, а уже после начала действия Glu. Так же, как в протоколе с предварительным добавлением этих агентов, восстановление низкой [Ca2+]j в постглутаматный период становилось возможным только после отмывания митохондриальных ядов и восстановления A4V Блокада FlFo-АТФазы олигомицином способствовала восстановлению [Са2+]; сразу после удаления Glu при продолжающемся присутствии митохондриальных ядов

Поскольку отключение Na7K -АТФазы от потребления АТФ с помощью оубаина облегчало восстановление [Са2+], в постглутаматный период, был применен другой способ блокирования №+/К+-АТФазы, а именно, замена Na+ в буфере на непроникающий органический катион N-метил-О-глюкамин (NMG+).

15 20 25

ОКД (МИН)

Рис. 4. Замена на непроникающий органический катион NMG+ усиливает индуцированный глутаматом рост внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Са2+]^ и вызывала глубокую митохондриальную деполяризацию. Нейроны из гиппокампа крысы (1101У).

Замена Na+ на NMG+ не повлияла на базальный уровень [Са2+], и Avf'm покоящихся нейронов (Рис. 4Г,Д,Е). Glu вызвал в безнатриевом буфере (NMG-буфере) настолько сильный рост [Са2+], и быстрое падение A'Fm, что практически отсутствовала стабилизация [Са2+]| и AvFm на промежуточном относительно низком уровне и изменение этих параметров было таким же, как при НКД. Вызвано это тем, что в отсутствие трансмембранного Na+ тока (1) АТр почти не снижается и поэтому увеличен электрофоретический захват Са2+ нейронами (Kiedrowski, 1999; Czyz et al., 2002) и (2) Na+/Ca2'-обмен через плазматическую мембрану осуществляется только в реверсивном режиме, превращая №+/Са2+-обмен из механизма поддержания Са2+ гомеостаза в дополнительный путь поступления Са2+ в нейроны (Kiedrowski, 1999; Czyz et al., 2002; Storozhevikh et al., 2007).

Синхронность изменений [ATP] и A'fm в NMG-буфере сохранилась, что более ясно видно на совмещенных графиках [Ca2+]j и Д^Рт представительных нейронов (Рис. 4В,Е), входящих в группу клеток на рисунках 4Г,Д. На кумулятивной кривой (Рис. 4Ж) видно, что в NMG-буфере 50% клеток вступило в фазу высокого [Са2+]; плато быстрее, чем в обычном Na+-содержащем буфере. Сходство с НКД подкрепляется тем, что олигомицин отдалял наступление ОКД и сильной МД (Рис. 1Ж), указывая на реверсию F1 Fo-АТФсинтазы.

Данные, представленные на рисунке 6, показывают, что экономия АТФ за счет уменьшения его расхода Ыа+/К+-АТФазой не гарантирует удаления Са2+ из нейронов Са -АТФазой плазмалеммы. В случае одновременного поступления Са2+ по NMDA-каналам и реверсированным Na+/C а2 о б м е н н и кам Са2+ дисрегуляция и дисфункция митохондрий могут наступить также быстро, как при НКД, индуцированной Glu в присутствии митохондриальных ядов.

2. Исследование влияния внешних факторов, модулирующих функциональное состояние митохондрий, на развитие ОКД.

2.1. Изменения митохондриального NAD(P)H и ЛЧ/т при химической гипоксии, разобщении окислительного фосфорилирования и глюкозной депривации. Протонные насосы дыхательной цепи черпают энергию для перекачивания протонов из матрикса в цитозоль (межмембранное пространство митохондрий) и создания трансмембранного электрохимического потенциала за счет окисления NADH комплексом I, убихинола комплексом III и цитохрома С комплексом IV. NADH образуется в результате восстановления NAD+ пируватдегидрогеназой и тремя ферментами цикла трикарбоновых кислот.

Изменения концентрации митохондриального NADH являются важным показателем окислительно-восстановительных процессов в митохондриях и поэтому были исследованы нами в нейронах в условиях, нарушающих фукционирование митохондрий и при токсическом воздействии Glu. Для этого измеряли собственную флуоресценцию клеток, обусловленную суммой сигналов NADH и NADPH (ЫЛО(Р)Н-автофлуоресценцию). Доминирующим компонентом является NADH-флуоресценция (Chance et al, 1979). Сопоставление МАБ(Р)Н-автофлуоресцентных изображений нейронов с флуоресцентными изображениями Rhl23 тех же самых клеток (не показано), согласуется с данными двухфотонной микроскопии высокого разрешения, свидетельствующими о том, что ~70% флуоресценции NAD(P)H сигнала всей клетки принадлежит митохондриальному NADH (Li et al, 2008).

В покоящихся нейронах ингибирование комплекса IV дыхательной цепи цианидом (CN, ЗмМ) прекращает окисление субстратов всеми протонными насосами, в том числе NADH комплексом I, и вызывает максимально возможный подъем флуоресценции этого динуклеотида (Рис. 5А). Возникающая при этом небольшая деполяризация митохондрий (Рис. 5В), обусловлена тем, что инверсия митохондриальной АТФсинтазы в АТФазу и гидролиза поступающего из цитозоля АТФ позволяет поддерживать AvFm+ на уровне близком к тому, который создают насосы дыхательной цепи (Nicholls & Budd, 2000). Отмывание CN восстанавливало сигналы как Rhl23, так и NADH. Последующая блокада ПРоАТФазы олигомицином вызывала рост флуоресценции NAD(P)H до 87.1+1.9% (п=24) от подъема, вызванного цианидом (Рис. 5А). Оставшиеся 13% NADH дыхательная цепь затрачивает, очевидно, на компенсацию «токов утечки» сквозь внутреннюю митохондриальную мембрану.

Добавка CN в присутствии Oligo вызывала полную деполяризацию, как и применение высокой концентрации протонофора (FCCP, 1мкМ) в конце эксперимента (Рис. 5В). Изменения флуоресценции NAD(P)H в ответ на CN и FCCP имели противоположную направленность — протонофор снижал сигнал NAD(P)H до минимального уровня, что отражает максимальную скорость дыхания и, соответственно, потребления NADH дыхательной цепью. (Jackobson & Nicholls, 2004). В дальнейшем остановка дыхания цианидом, являющаяся химической имитацией аноксии, и максимальное потребление NADH в присутствии высокой концентрации протонофора служили процедурами калибровки максимального и минимального сигналов NAD(P)H.

Рис. 5. В покоящихся нейронах основная часть NAD(P)H тратится на обеспечение синтеза АТФ.

Изменения

митохондриального NAD(P)H (А) и ДЧ^ (В), вызванные блокадой дыхательной цепи и ингибированием митохондриальной АТФсинтазы в

культивированных гранулярных нейронах

мозжечка крысы (701У). На этом и последующем рисунках блокаду дыхания осуществляли цианидом

натрия (С1М, ЗмМ), АТФсинтазу ингибировали олигомицином (О^о,

2,5мкг/мл). Для определения минимального уровня

NAD(P)H флуоресценции к нейронам добавляли

протонофор РССР (1мкМ).

Пируват (Руг), окисление которого служит первым из четырех процессов восстановления NAD+ до ЫАОН митохондриальными дегидрогеназами, образуется в результате окисления глюкозы в цитозоле. Поэтому мы проверили, как будут изменяться важнейшие энергетические показатели митохондрий, ЫАО(Р)Н и ДЧ^т , при глюкозном голодании нейронов. Замена глюкозы на неметаболизируемый аналог 2-дезоксиглюкозу (Ой) вызывала медленную деполяризацию митохондрий и постепенное снижение NAD(P)H автофлуоресценции (Рис.6). Плавное падение ДЧ^ и ЫАО(Р)Н является отражением того, что в условиях ингибирования гликолиза снижается соотношение АТФ/АДФ в цитозоле, увеличивается нагрузка на Н1 РоАТФазу по синтезу АТФ и, соответственно, растет протонный ток через Р1 РоАТФазу, деполяризующий митохондрии. Ингибирование Р1РоАТФазы олигомицином повышало ДЧ'щ , резко снижая сигнал КЫ23, подобно представленному на Рис.5Б, но с большей амплитудой (не показано).

3.0т

■5 2.5 а>

I 2.(Я

СМ

м : 1

О

г 0.5

• «г

(п=9)

V

1000 1500 Время (с)

ОИдо

РССР

т

2.0т

1.8

£ 1.6 и!

м* л 4.

еч

£ 1.2

Е

Ъ 1.0

<

о.в 0.6

сы

(п=9)

РССР

см

№

ОПдо

1000 1500 Время (с)

(п=9)

О 1000 2000 3000 4000 500С

Время (с)

см

а Р*! = сг™

гл

(М

Е

^ 1.0

Л

1000 2000 3000 4000 5000

Время (с)

Рис. 6. Влияние

ингибирования гликолиза и митохондриальных ядов на NAD(P)H и

митохондриальный потенциал (А^Рщ) нейронов. Усредненные сигналы

ЫАБ(Р)Н (А) и ЯЫ23 (Б) одного из экспериментов (9 клеток). (С) Усредненные изменения ЫАО(Р)Н (6 экспериментов; 47 клеток) при ингибировании дыхательной цепи цианидом (ЗмМ, С1М), замене глюкозы на неметабо-лизируемый аналог 2-дезоксиглюкозу (ОС, 1 ОмМ), при сочетанном применении Эв с митохондриальным субстратом пируватом (Руг, ЮмМ), при одновременном ингибировании гликолиза и дыхания (Бв+СЫ) и при коллапсе АЧ'п, с помощью высокой концентрации

протонофора РССР (1мкМ). Все флуоресцентные сигналы (Р) нормированы относительно исходных значений (Ро); на (С) отношение (Р/То) обозначено пунктирной линией.

Гранулярные нейроны

мозжечка крысы (1301У).

СМ РЄ РЄ+Руг Рб+СМ РССР

Добавление Руг в безглюкозный буфер быстро восстанавливало ЫАЭ(Р)Н и А до исходного уровня в покоящихся нейронах (Рис. 6), в соответствии с тем, что Руг служит основным субстратом митохондрий, а ЫАОН, в свою очередь, является основным источником автофлуоресценции нейронов. После

20

отмывания Руг добавление цианида в безглюкозный буфер вызвало сильный рост сигнала Rh 123, такой же как FCCP в конце измерений (Рис. 6Б). Вызвано это тем, что в условиях ингибирования гликолиза F1 РоАТФаза не может поддерживать потенциал за счет гидролиза цитозольного АТФ и поэтому остановка дыхательной цепи цианидом в безглюкозном буфере индуцировала коллапс A4V Неожиданным оказалось то, что, несмотря на отсутствие глюкозы (и Руг), цианид вызвал сильный подъем NAD(P)H, составлявший 74±5% (п=47) от максимального, вызванного CN в обычном буфере с глюкозой (Рис. 6А,В). Этот эффект указывает на то, что нейроны имеют для митохондрий «запасной» субстрат, который окисляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), обеспечивая относительно небольшое снижение ДУт в отсутствие гликолиза. Наиболее вероятным субстратом, на наш взгляд, является Glu, поскольку концентрация этой аминокислоты в цитозоле может достигать ЮмМ (Nicholl, 2009) и имеется механизм ее транспорта в митохондрии (Frigerio et al, 2008), где Glu окисляется до одного из субстратов ЦТК, а-кетоглутарата. 2.2. Изменения [Са2+/, и А'/',„ индуцированные Glu в отсутствии глюкозы. Молодые нейрональные культуры (6-8DIV), особенно гранулярных клеток мозжечка крысы, более устойчивы к действию Glu и в течение первых 10-20мин ОКД и вторичное падение ДЧ^ развивается в небольшой доле нейронов (Рис. 7А,В,Е; см. также, Рис. ЗА,Б), по сравнению с более зрелыми культурами (>12DIV) (см. также Vergun et al, 1999). Блокада гликолиза заменой глюкозы на DG резко ускоряло наступление ОКД и сильной МД (Рис. 7Б,Г,Е). Синхронность ОКД и вторичного падения ДЧ^ при этом не нарушалась (Рис. 7Д). Любопытно, что Glu вызывал в безглюкозном буфере кратковременную гиперполяризацию митохондрий, проявившуюся в снижении сигнала Rh 123 ниже уровня, предшествующего добавлению Glu (Рис. 7Д). Возможно, вход Са2+ в цитозоль и захват его митохондриями активирует работу ЦТК (МсСоппас & Denton, 1990; Denton, 2009). Не исключено также, что Glu индуцирует Са2+-зависимое ингибирование FlFoATOa3bi (Mareno-Sanches, 1985), вызывая, подобно олигомицину рост ДЧ^ .

Введение в безглюкозный буфер Руг или лактата (Lac) восстанавливало лаг-период ОКД (снижало долю клеток, имевших ОКД за время наблюдения) до контрольного уровня в обычном буфере с глюкозой (Рис. 7Е). Lac оказывал даже несколько больший положительный эффект, чем Руг. Вероятно, Lac, окисляясь цитозольной лактатдегидрогеназой до Руг и восстанавливая NAD+ до NADH, предоставлял митохондриям через посредство челноков дикарбоновых кислот дополнительный источник восстановительных эквивалентов для Ред-Окс процессов дыхательной цепи.

Время (мин)

10 15 20 Время (мин)

5 10 15 20 Время (мин)

10 1S 20 Время (мин)

10 15 20 Время (мин)

£

1.6 * О

1.5 » X X

1.4 L 3 m

3 1-3 5 Ф

S

в X

1.2 2 зс

о

1.1 г. t- 0)

1.0 5 tr

0.9 | ^ о се

DG DOfy DG+Lac

Рис. 7. Блокада гликолиза приближает наступление Са + дисрегуляции и вторичного падения ДЧ*т, а митохондриальный субстрат пируват отдаляет ОКД и сильную МД. Изменения [Ca2+]j (А,В) и ДЧ'1П (Б,Г) в группе нейронов буфере, содержащем в глюкозу (А,Б), и в буфере, в котором глюкоза заменена на 2-дезоксиглюкозу (DG, ЮмМ) (В,Г). (Д) Изменения [Са2+]( и А*Рт в представительном нейроне в условиях блокады гликолиза. (Е) Доля нейронов (%), имевших ОКД при действии одного Glu (Control), а также Glu в безглюкозном буфере (DG) и в DG-буфере в присутствии пирувата (DG+Pyr) или лактата (DG+Lac). Концентрации Glu (ЮОмкМ), Руг и Lac по ЮмМ. Гранулярные нейроны мозжечка крысы (8DIV).

22

2.3. Изменения NAD(P)H при глутаматном воздействии. При действии Glu на нейроны на митохондрии ложится дополнительная нагрузка по увеличению производства АТФ для ионных насосов, удаляющих Са2+ и Na+ из цитозоля наружу, а также по поглощению избытка Са2+ из цитозоля, благодаря его электрофоретическому транспорту по кальциевому унипортеру (Kirichok et al, 2004) и, возможно, другими Са2+ каналами внутренней мембраны митохондрий (Michels et al, 2009). Поэтому мы проверили, как изменяется соотношение между затратами NADH на производство АТФ и на компенсацию других ионных потоков через внутреннюю мембрану во время первой фазы действия Glu и во время ОКД. В 57% нейронов (113/206) мозжечка крысы во время первой фазы Glu-индуцированных изменений [Ca2+]j происходило снижение NAD(P)H до уровня, промежуточного между исходным в покоящихся клетках и минимальным, наблюдаемым при добавлении высокой концентрации протонофора в конце эксперимента. Развитие сильной МД (и, следовательно, ОКД, см. Рис. 1Д) происходило одновременно со вторичным падением NAD(P)H. Пример изменений ДЧ'т и NAD(P)H в группе гранулярных нейронов мозжечка и в одном из представительных нейронов показан на Рис. 8А,Б. Низкие концентрации протонофоров (10-50нМ FCCP или 5-8мкМ динитрофенола), не вызывавшие коллапса Д(Рт , снижали NAD(P)H и ускоряли наступление ОКД (не показано). На этом основании можно заключить, что ОКД начинается тогда, когда [NADH] в митохондриях опускается ниже величины, необходимой для поддержания ДЧ'т на уровне, достаточном для синтеза АТФ и поглощения избытка Са2+ из цитозоля. Однако частичная блокада дыхания с помощью небольшой концентрации ингибитора комплекса IV дыхательной цепи (0,1-0,2мМ NaCN) снижала АН'т примерно настолько же, насколько низкая концентрация FCCP, и тоже значительно ускоряла наступление сильной митохондриальной деполяризации (Рис. 8В,Д). Принципиальным различием в действии цианида и протонофора является то, что первый не уменьшал, а увеличивал NAD(P)H (сравните Рис. 8Б и 8Г) за счет понижения окисления NADH комплексом I дыхательной цепи. На примере нейрона на рисунке 8Г видно, что сильная МД (и, следовательно, ОКД) могут развиваться при уровне NAD(P)H, даже превышающем исходный в покоящихся нейронах. Из этого следует, что причиной наступления ОКД является не снижение NADH как таковое, а неспособность протонных насосов дыхательной цепи поддерживать электрохимический потенциал на уровне, необходимом для поглощения избытка Са2+ из цитозоля и осуществления ОксФос. Такая ситуация может возникнуть даже при достаточном уровне

д

MD-Lag (мин)

Рис. 8. Частичное ингибироваиие дыхательной цепи ускоряет наступление ОКД. Изменения ДЧ'п, и NAD(P)H в нейронах из мозжечка крысы (16DIV) под действием одного глутамата (Glu, ЮОмкМ, ЮмкМ Gly, 0 Mg2+) (А,Б) и Glu в присутствии низких концентраций ингибитора дыхания (0,2мМ NaCN) (В,Г). Для калибровки максимального и минимального сигнала NAD(P)H в начале и конце эксперимента добавлены, соответственно, 1мМ NaCN и 1 мкМ FCCP. (Д) Увеличение доли клеток (%), в которых Glu и Glu+CN индуцировали сильную митохондриальную деполяризацию. (Б,Г) Изменения сигналов потенциал-чувствительного зонда Rhl23 и NAD(P)H автофлуоресценции в двух представительных нейронах.

24

NAD(P)H, если при патологическом состоянии (токсической концентрации Glu) в нейронах появляются эндогенные ингибиторы дыхательной цепи, например, оксид азота (Moneada & Bolaños, 2006) и другие низкомолекулярные соединения (Brown, 2010). Пример такого эндогенного ингибитора рассмотрен далее в параграфе, в котором рассматривается влияние арахидоновой кислоты на Glu-индуцированные изменения [Ca2+]¡ и Д*Рт. Более высокий уровень NADH является, очевидно, показателем способности протонных насосов дыхательной цепи поддерживать достаточно высокий АЧ^щ , но не гарантией предотвращения ОКД.

3. Вклад эндогенных факторов, возникающих в результате индуцированной глутаматом активации поли(АДФ-

рибоза)полимеразы-1 и фосфолнпаз А2, в развитие дисфункции митохондрий и ОКД.

3.1. Роль поли(АДФ-рибоза)полимеризы-1 (ПАРП-1) в возникновении ОКД и гибели нейронов. При гиперстимуляции NMDA рецепторов происходит избыточная активация фермента ПАРП-1, который расщепляет NAD+, присоединяя АДФ-рибозильную часть динуклеотида к ядерным белкам и запуская, таким образом, процесс репарации повреждений ДНК (Cosi et al, 1994; Zhang et al., 1994; Duan et al., 2007; Wang et al., 2007). Недавно появились сообщения о том, что в культуре гиппокампальных нейронов причиной возникновения ОКД может быть исчерпание NAD+ в результате повышенной активности ПАРП-1 и, как следствие, дефицит NADH (Abramov & Duchen, 2008, 2010). Выполненный нами биохимический анализ содержания NAD+ и NADH в культуре гранулярных нейронов мозжечка показал, что при действии Glu NAD+ снижался на 25% относительно уровня в покоящихся клетках (2,2пикомоль/мг белка), тогда как NADH падал на 75% (в контроле 1,6 пикомоль/мг белка). Наиболее потентный из ингибиторов ПАРП-1 антибиотик миноциклин (Alano et al, 2006) удерживал NAD+ при действии Glu на контрольном уровне, но не предотвращал падения NADH. Миноциклин (0,2мкМ) удлинял время, за которое в 50% нейронов развивалась ОКД, на -35% (п=198), не влияя на синхронность второй фазы роста [Ca2+]¡ и падения АЧ^.

Таким образом, представление об исчерпании NAD+, ведущем к дефициту NADH и, соответственно, снижению эффективности работы дыхательной цепи, не получили подтверждения в наших исследованиях. Для дополнительной проверки было изучено влияние блокады дыхательной цепи на уровень NAD(P)H на разных стадиях [Ca2+]¡ ответа нейронов на Glu (Рис. 9). Поскольку лаг-период ОКД находится в диапазоне десятков минут (см. Рис.1), то добавка CN застает соседние нейроны на разных стадиях изменений [Ca2+]¡ и ДЧ'щ.

25

Glu

O-S.tííXWIlDW«

Б 1.4-t

Z 1.2

О

Z 1.0-

о

+ 0.8-

(Э

0.6-

I

0.4'

Ü

<

z 0.2-

0.0-

2000

Время (с)

ъ

4-

в □

о о

□ □ очч о

п=41 г2=0,415

500

2000

2500

1000 1500 Т (С)

Рис. 9. Развитию ОКД не предшествует исчерпание NAD+. (А)

Изменения [Ca2+]¡ (левая ось ординат) и автофлуоресценции NAD(P)H (правая ось ординат) в одном из гранулярных нейронов мозжечка (11DIV) при ингибировании дыхательной цепи цианидом (CN, ЗмМ) перед добавлением глутамата (Glu, ЮОмкМ) и во время его действия. (Б) Изменения NAD(P)H, индуцированные CN во время Glu, отнесенные к изменениям NAD(P)H в покоящихся нейронах ((Glu+CN)/CN) в зависимости от времени (Т) от начала ОКД до момента добавления CN. На панели (А) значения флуоресценции, использованные при расчете отношения (Glu+CN)/CN, показаны вертикальными стрелками, а величины Т обозначены горизонтальной стрелкой. Изменения [Ca2+]¡ измерены с помощью флуоресцентного индикатора Fluo-3FF. Точки, лежащие на вертикальной пунктирной линии на панели (Б), соответствуют относительным изменениям NAD(P)H в нейронах, которые находились в первой фазе [Ca2+]¡ ответа на Glu в момент добавления CN.

Если ОКД была в фазе развития или только что достигла [Ca2+]¡ плато, то добавка NaCN вызывала такой же подъем NAD(P)H, как и в нейронах, находившихся к моменту добавления CN в первой фазе [Ca2+]¡ ответа на Glu (Рис. 9). Из этого следует, что, если бы к началу ОКД весь NAD+ был израсходован ПАРП-1 на реакцию поли(АДФ-рибозилирования), то подъем флуоресценции в момент добавления CN был бы невозможен. Другими словами, вторичное падение NAD(P)H, совпадающее с развитием ОКД (см. вставку на Рис.9 и Рис.8Б,Г) не является последствием исчерпания NAD+.

Продление графика линейной регрессии на рисунке 9 до пересечения с осью абсцисс показывает, что спустя примерно 30-40 минут после начала ОКД, добавление CN уже не вызывает подъема флуоресценции NAD(P)H. Нейроны, находившиеся в стадии [Ca2+]¡ плато такое длительное время, как правило, не способны восстановить низкий уровень [Ca2+]¡ и вернуться к высокому ДЧ'т после удаления Glu. По нашему мнению, такие последствия длительного пребывания нейронов в фазе высокого [Ca2+]¡ плато, как и необратимость этой фазы и отсутствие роста NAD(P)H в ответ на CN, могут свидетельствовать о возникновении в митохондриях нейронов мРТР. ОКД, возможно, является начальной стадией образования такой поры, но не «классическим» ее состоянием, при котором мРТР способна пропускать молекулы размером до 1500Да (Zoratti & Szabo, 2005; Bernardi et al, 2006; Zorov et al, 2009). Благодаря большому диаметру мРТР, митохондриальный NAD+ способен «вытекать» из матрикса в цитозоль, прекращая дыхание (Di Lisa et al, 2001). Судя по быстрому увеличению NAD(P)H при остановке дыхания цианидом, NAD+ остается в митохондриях нейронов, по крайней мере, вплоть до выхода на высокое [Ca2+]¡ плато (Рис.9).

3.2. ОКД и образование активных форм кислорода (АФК'). Считается, что повреждения ядерной ДНК активными формами кислорода являются пусковым фактором ПАРП-1 (von Zglinicki et al., Beneke & Bürkle, 2007). Поскольку проверка гипотезы об исчерпании NAD+ как основном факторе энергетического кризиса нейронов (Abramov & Duchen, 2008, 2010) привела к отрицательному результату, мы решили убедиться, происходит ли образование АФК в условиях наших экспериментов. Для этого проверили, каково соотношение между возникновением ОКД и образованием АФК в культуре, используя флуоресцентный индикатор MitoSox, наиболее избирательный для обнаружения супероксиданион радикала в митохондриях (Robinson et al., 2006).

Мы обнаружили, что за время действия Glu флуоресцентный сигнал MitoSox возрастал только в тех нейронах, в которых возникла ОКД, и оставался

27

на постоянно низком уровне в нейронах, не имевших ОКД. Добавление протонофора FCCP (1мкМ) в постглутаматный период вызывала коллапс ДЧ^ , однако роста флуоресценции MitoSox не происходило. Эти данные показывают, что при действии нейротоксических доз глутамата возникают АФК, а, значит, и условия для повреждения ДНК и гиперактивации PARP-1, но только в тех нейронах, в которых произошла ОКД.

3.3. Иммунофлуоресцентный анализ локализации продукта активности ПАРП-1 при действии глутамата. Если ОКД возникает вследствие слишком сильного расхода NAD+, потраченного на образование избыточного количества поли(АДФ-рибозы) (ПАР), то естественно ожидать более высокий уровень ПАР в тех нейронах, в которых возникла ОКД, по сравнению с нейронами, сохранившими [Ca2+]i на относительно низком уровне. Для проверки этого предположения на культуру гранулярных нейронов мозжечка воздействовали нейротоксической дозой глутамата (Glu) до тех пор, пока примерно в половине нейронов возникла ОКД. Затем методом иммунофлуоресцентного окрашивания определяли распределение ПАР в этих же самых клетках. Результаты представлены на рисунке 10. Видно, что большинство нейронов, в которых возникла ОКД, имели распределение PAR преимущественно по периметру ядра (например, клетка 9). Однако подобное окрашивание наблюдалось и в некоторых нейронах, в которых ОКД не возникла (например, клетка 26). Остальные нейроны, не испытавшие ОКД, имели более слабую и диффузную иммунофлуоресценцию (например, клетка 24). Для сравнения на Рис.10 буквами «а» отмечены два астроцита, поскольку в этих клетках Glu вызывает лишь небольшой монофазный подъем [Ca2+]i , либо осцилляции [Ca2+]i малой амплитуды (см., например, Рис. ЗЖ). Астроциты имели слабое окрашивание цитоплазмы и еще более бледное окрашивание -ядерной зоны.

Сопоставление [Ca2+]j ответов и иммунофлуоресцентного окрашивания показывает, что причиной гибели нейронов может быть не столько дефицит NAD+, сколько продукт ферментативной активности ПАРПР-1 - поли(АДФ-рибоза), способствующая высвобождению из перимембранного пространства митохондрий фактора апоптоза, AIF (Andrabi et al., 2006, 2008). Исследование протекторного действия ингибиторов ПАРП-1-1 3-аминобензамида (АВА, 1мМ) и миноциклина (0,2мкМ) на гибель гранулярных нейронов мозжечка крысы, вызванную Glu (бОмин, ЮОмкМ), показало, что оба ингибитора снижают долю погибших клеток примерно на 14%. Эти данные согласуются с

Рис. 10. Распределение поли(АДФ-рибозы) и графики изменения [Са2+]| в нейронах, подвергнутых нейротоксическому воздействию глутамата. Сопоставление изображения клеток, нагруженных Са2+ индикатором Рига-РР и подвергнутых нейротоксическому действию С1и, с изображениями, полученными последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием тех же клеток моноклональными антителами против поли(АДФ-рибозы) (ПАР), а затем вторичными поликлональными антителами, содержащими флуоресцентную метку А1еха-568. (А) Изображение клеток, окрашенных Рига-РР, является рэйшиометрическим (Р340/Т380); желто-зеленой псевдоцвет имеют нейроны, в которых возникла ОКД. (Б) Иммуноцитофлуоресцентное окрашивание, показывающее распределение ПАР в клетках, после глутаматного воздействия. (В) Ядра клеток локализованы с помощью флуоресцентного красителя ЭАР1 после завершения иммунофлуоресцентного окрашивания. Буквами «а» отмечены астроциты. (Г) Изменения [Са2+]1 в контрольных клетках и (Д) инкубированных с высокоаффинным ингибитором ПАРП-1 миноциклином (Мсп, 0,2мкМ). (Е) Кумулятивные графики увеличения доли нейронов, имевших ОКД : левая кривая - контроль, правая - в присутствии миноциклина.

результатами измерения [Ca"+]j , продемонстрировавшими, что доля нейронов, имевших ОКД после 1часа экспонирования Glu, составляла 65%, тогда как в присутствии миноциклина Glu вызывал ОКД в 55% нейронов.

3.4. Исследование обратимости ОКД при прекращении поступления Са2+ из внеклеточной среды. Развитие ОКД, т.е. переход от относительно небольшого стационарного уровнях [Ca2+]i к высокому плато, может отражать возникновение и развитие во внутренней мембране митохондрий обратимой поры низкой проводимости, способной закрыться при удалении Са2+ (Ichas & Mazat, 1998; Brustovetsky & Dubinsky 2000). Мы проверили, существует ли такая обратимость по отношению к субстратам дыхательной цепи. На рисунке 11 приведены изменения [Ca2+]j и автофлуоресценции, обусловленной NAD(P)H и FAD, в двух представительных нейронах из гиппокампа крысы.

24

ô 20 U-UL - 16 Ц. LU

І 12

25

S

Li. ï 20 u_

Li_

T> 15 О -С

a.

10

Glu

-Ca

1000 1500 2000 Время (с)

Glu

-Ca

1000 1500 2000 Время (с)

1.4

z

>

1.2 S

1.0

> a

0.4

2500 3000

>

1.2 5

1.0

0.6

0.2

2500 3000

Рис. 11. Начальная стадия ОКД является обратимой.

Изменения [Са"+], и автофлуоресценции, обусловленной NAD(P)H и FAD, индуцированные

глутаматом в культуре нейронов гиппокампа

(10DIV). Приведены сигналы представительных нейронов, в одном из которых ОКД не возникла, а в другом ОКД достигла стадии высокого [Са2+]; плато

непосредственно перед

удалением Са2+ из буфера. Для измерения [Ca2+]j использовали Rhod-FF.

Флуоресценцию возбуждали и регистрировали при (нм): 565 и >610 (Rhod-FF); 360 и 460 (NAD(P)H); 440 и 525 (FAD). Все сигналы нормированы относительно исходных значений.

У флавинадениндинуклеотида, являющегося кофактором сукцинат-дегидрогеназы (комплекса II дыхательной цепи), в отличие от

30

никотинамидаденин динуклеотида, флуоресцирует не восстановленная, а окисленная форма (FAD), поэтому при усилении дыхания и увеличении концентрации окисленных форм этих динуклеотидов изменения их сигналов имеют противоположную направленность (Chance et al, 1979). Сигнал NAD(P)H снижался сразу после добавления Glu (Рис. 11) тогда как флуоресценция FAD, отражающая активность сукцинат-дегидрогеназы, изменялась слабо (Рис. ПА). Это может означать, что во время первой фазы Са2+ ответа на Glu восстановление убихинона происходит преимущественно в комплексе I, тогда как комплекс II находится в «резерве». Во время развития ОКД резко увеличивается нагрузка на протонные насосы по поддержанию электрохимического потенциала митохондрий и в этом случае в действие вступает комплекс II, что проявляется в резком увеличении сигнала FAD.

При развитии ОКД происходило вторичное снижение NAD(P)H и одновременно увеличение FAD (Рис. 11 Б). Эти изменения показывают, что ни NAD(P)H, ни FADH2 не находились на минимальном уровне перед развитием ОКД и свидетельствуют о том, что дефицит субстратов дыхательной цепи не является причиной развития ОКД.

Удаление Са2+ из буфера при продолжающемся действии Glu вызывало снижение [Ca2+]¡, которое всегда происходили синхронно с ростом NAD(P)H и FAD (Рис. 11) и увеличением AlFm (не показано). Рост NAD(P)H и FAD и восстановление Avfm были бы невозможны в том случае, если ОКД вызвано образованием поры такого размера, через которую способен пройти NAD+ и тем более низкомолекулярные субстраты ЦТК, в частности сукцинат. Другими словами, если при ОКД образуется пора, то она, вероятно, относится к «низкопроводящей, не классической», способной пропускать неорганические ионы, но не молекулы размера субстратов ЦТК и выше.

Способность нейронов к немедленному восстановлению [Са2+], и реполяризации митохондрий при удалении Са2+ из буфера вскоре после выхода на высокое [Ca +]¡ плато указывает на то, что повреждение Са2+-насосной функции Са2+-АТФазы (Schwab et al. 2002) или прямой моды Na+/Ca2+-обменника (Bano et al, 2005), если и происходит, то не перед развитием ОКД, а уже после того, как клетки достаточно долго пребывали в стадии высокого [Са2+], плато (Brustovetsky et al, 2010).

Возвращение Са2+ в буфер приводило к подъему [Ca2+]¡ . В тех нейронах, в которых удаление Са2+ из буфера произошло до возникновения ОКД, этот подъем [Ca2+]¡ имел двухфазный характер, напоминающий ОКД (Рис. IIA). Если до удаления Са2+ нейроны успели войти в фазу высокого [Са2+], плато, то возвращение Са2+ в буфер вызывало быстрое увеличение [Ca2+]¡, напоминающее НКД (Рис. 11Б). В -80% нейронов (п=6) подъем [Ca2+]¡ начинался до того, как

31

NAD(P)H и FADH2 падали до минимального уровня, указывая на то, что развитие «повторной» Са2+ дисрегуляции вызвано в большинстве случаев не падением субстратов дыхания до минимального уровня, а другой причиной.

3.5. Влияние блокады FlFo-АТФаза на NAD(P)H и A Сопоставление эффектов блокатора дыхания CN и ингибитора FlFo-АТФазы олигомицина на ДТт и NAD(P)H (Рис.5) показало, что в покоящихся нейронах -87% NAD(P)H затрачивается на обеспечение синтеза АТФ. Используя тот же методический прием, мы исследовали, как меняется это соотношение при действии нейротоксических концентраций Glu. Добавление олигомицина во время воздействия Glu вызывало увеличение ДТп, и рост NAD(P)H в нейронах, имевших небольшую митохондриальную деполяризацию и находившихся, следовательно, в первой фазе [Ca2+]¡ ответа на Glu (Рис. 12А,В,Г). Эти данные свидетельствуют о том, что FlFo-АТФаза работала в режиме синтеза АТФ (Nicholls & Budd, 2000). Рост NAD(P)H в ответ на Oligo составил 65,4±3,8% (п=15), указывая на повышение до 35% потребления NAD(P)H на процессы, не связанные непосредственно с синтезом АТФ, по сравнению с 13% в покоящихся нейронах (см. Рис.5).

В основной части нейронов к моменту добавления Oligo уже произошло вторичное падение Ах¥т и, следовательно, синхронно с деполяризацией развилась ОКД, т.е. добавление Oligo пришлось на фазу [Ca2+]¡ плато. В этих нейронах ингибирование FlFo-АТФазы также увеличивало Д1Рт (Рис. 12Б,В). Это говорит о том, что, несмотря на сильную митохондриальную деполяризацию, FlFo-АТФаза продолжала синтезировать АТФ. Другими словами, синхронная с ОКД сильная МД не снижала ДЧ'т настолько глубоко, чтобы прекратился синтез АТФ. Кроме того, снижение Д1Рт может быть компенсировано поддержанием ДрН на таком уровне, что электрохимический потенциала остается достаточно высоким для синтеза АТФ (см. ниже Рис. 17). Данные о продолжающемся синтезе АТФ согласуются с изложенными выше аргументами того, что развитие ОКД не является результатом образования классической поры высокой проводимости.

Ингибирование FlFo-АТФазы в тех нейронах, в которых Oligo был добавлен во время [Са2+], плато, не увеличивало NAD(P)H (Рис. 12Б,Г), что указывает на отсутствие сопряжения окисления NAD(P)H с синтезом АТФ. Таким образом, гиперполяризация митохондрий в ответ на Oligo указывает на продолжение синтеза АТФ во время ОКД, а отсутствие роста NAD(P)H - на прекращение работы FlFo-АТФазы в режиме АТФсинтазы во время ОКД. Это противоречие между митохондриапьным синтезом АТФ и отсутствием сопряжения окисления NAD(P)H с фосфорилированием можно разрешить, на

наш взгляд, если учесть подключение сукцинатдегидрогеназы и усиление окисления FADH2 до FAD во время развития ОКД (см. Рис. 11Б). Кроме того,

В

1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75

1000 1500 2000 Время (С|

0,90±0,01

1000 1500 2000 2500 3000 3500 Время (С)

0,94±0,01 ■ ■

Вп

□ go

■ ■-■I

□ <

z

1,33+0,02 _HuoS_

1,00±0,01

1-я фаза

ОКД

1-я фаза ОКД

Рис.12. В гранулярных нейронах, подвергнутых токсическому действию глутамата (Glu), при достижении высокого [Ca2+]j плато происходит разобщение окислительного фосфорилирования. Изменения митохондриального трансмембранного потенциала (АЧ7,,,) и NAD(P)H в двух представительных гранулярных нейронах мозжечка, в одном из которых (А) добавление ингибитора FlFo-АТФазы олигомицина (Oligo, 2,5мкг/мл) совпало с 1-ой фазой [Ca2+]j ответа на Glu (ЮОмкМ, ЮмкМ глицина, 0 Mg2+), а во втором нейроне (Б) добавка Oligo пришлась на фазу высокого [Ca2+]j плато. Данные экспериментов на трех культурах (45 нейронов), полученных в разные дни, суммированы на панелях (В,Г), показывающих относительное снижение сигналов Rh 123 (В) и NAD(P)H (Г) при добавлении Oligo.

добавление Oligo и прекращение расходования энергии на поддержание Н+-тока через FlFo-АТФазы высвобождает часть NAD(P)H, которая немедленно расходуется комплексом I на компенсацию «токов утечки». В результате Oligo не увеличивает автофлуоресценцию, если добавлен во время высокого [Ca2+]j плато, зато увеличивает (Рис. 12Б,Г). Последующая блокада дыхания цанидом при продолжающемся присутствии Oligo вызывала быстрый рост NAD(P)H (Рис. 12Б). Этот рост NAD(P)H подтверждает то, что снижение

33

автофлуоресценции до минимального уровня не связано с исчерпанием NAD+ , а так же то, что сильная митохондриальная деполяризация во время [Ca2+]j плато не равнозначна понятию «коллапс митохондриального потенциала». 3.6. Роль глутамат-индуцированной активации фосфолипазы А2 и арахидоновой кислоты (АА) в развитии ОКД. Выше было показано, что частичная блокада дыхательной цепи и глюкозная депривация приближают ОКД (см. Рис. 7 и 8). Воздействие Glu, особенно в отсутствие глюкозы, вызывает в культуре нейронов или срезах мозга Са2+ -зависимое высвобождение жирных кислот, среди которых значительная доля принадлежит АА (Lazarewicz et al, 1990; Williams et al, 1995). АА образуется в нейронах в результате индуцированной Glu активации различных подтипов фосфолипазы А2 (PLA2) (см., например, обзор Sun et al, 2004). Свободные жирные кислоты, особенно в сочетании с поступлением в клетку Са2+, могут значительно влиять на функциональное состояние митохондрий, увеличивая ионную проводимость митохондриальной мембраны (Sultan & Sokolove, 2001; Mironova et al, 2004), блокируя комплекс I дыхательной цепи (Morii et al, 1991; Loskovich et al, 2005) и индуцируя образование неспецифической поры высокой проводимости.

Экзогенная АА (=< ЮмкМ), не влияя на [Са2+]; , немного снижала AlFm. (Рис. 13Б,Д). Добавление АА при воздействии Glu приводило к тому, что индуцированные Glu подъем [Са2+], и падение ДЧ'п, были гораздо значительнее, чем при действии одной АА (Рис. 13В,Е). Независимо от способа добавления АА (до Glu или после начала действия Glu) высокое [Са2+], плато и сильная МД сохранялись в пост-глутаматный период, напоминая эффекты блокатора дыхания и протонофора (Рис.ЗВ,Г). Предотвращение метаболизма экзогенной АА с помощью ETYA, ингибитора цикло- и липоксигеназного окисления АА, увеличивало долю нейронов, в которых Glu вызывал двухфазное повышение [Ca2+]j и падение ДЧ'т., свидетельствуя о том, что АА, а не продукты ее метаболизма вызывают обнаруженные эффекты.

Полученные результаты показывают, что АА может вызывать изменения функционального состояния митохондрий, способствующие возникновению двухфазных [Ca2+]j и ДЧ'щ ответов нейронов на Glu, и напоминает совместное действие Glu с ингибитором дыхания или протонофором (см. Рис.3). Поэтому мы сопоставили влияние АА на ДЧ'п, с эффектами протонофоров DNP и FCCP, и ингибитора дыхания цианида в покоящихся нейронах (Рис. 13).

Деполяризация, вызванная АА была сравнительно небольшой, сопоставимой с той, которую можно получить с помощью низкой концентрации DNP (8мкМ) (Рис. 14Б). Высокие дозы протонофоров DNP (200мкМ) или FCCP (1мкМ), вызывающие полную деполяризацию

митохондрий, увеличивали флуоресценцию 11Ы23 в 3^1 раза сильнее, чем АА. Сочетанное действие А А и ингибитора Р1 Ро-АТФазы олигомицина приводило

Рис. 13. Действие арахидоновой кислоты (АА) на изменения [Ca2+li (А, Б, В) и Л*Рт (Г, Д, Е), вызванные глутаматом (Glu ЮОмкМ; ЮмкМ глицина, 0 Mg2+) в гранулярных нейронах мозжечка крысы. Концентрация АА ЮмкМ. Возраст культуры 8DIV.

к резкой деполяризации, почти столь же сильной, как и МД, вызванная FCCP (Рис. 14А), тогда как сам Oligo вызывал гиперполяризацию митохондрий нейронов. В отличие от небольшой деполяризации, вызванной АА, равное по величине снижение Д вызванное низкой концентрацией DNP, было нечувствительно к Oligo (Рис. 14Б). Совместное действие АА с Oligo (Рис. 14А) вызывало такую же полную деполяризацию, как цианид с Oligo (Рис. 14В). Из сравнения данных, представленных на рисунке 14, можно заключить, что действие АА на митохондриальный потенциал нейронов вызвано не только или не столько протонофорными свойствами АА, сколько тем, что она каким-то образом блокирует дыхание.

Характер изменений [Ca2+]j и A*Pm, индуцированных Glu в присутствии экзогенной АА (Рис. 13), а также сопоставление изменений ЛЧ'т под влиянием АА и митохондриальных ядов в покоящихся нейронах (Рис. 14), согласуются с

35

предположением о возможном участии АА в развитии ОКД. Поэтому мы проверили, будет ли предотвращение образования АА за счет

О 300 600 900 1200

Время (с)

600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 Время (с)

О 300 600 900

Время (с)

п=13

Б п=12

200 ONP 8 DNP

Рис. 14. Изменения митохондриального потенциала (А*Рт ), вызванные арахидоновой кислотой, напоминают действие ингибитора дыхания.

Изменения A4V в гранулярных клетках мозжечка, обработанных протонофорами динитроферолом (DNP, 200 и 8мкМ) и FCCP (1мкМ), арахидоновой кислотой (АА, ЮмкМ), ингибитором FlFo-АТАазы олигомицином (Oligo, 2,5мкг/мл) и ингибитором дыхания цианидом (NaCN, ЗмМ). Изменения ДЧ'ш регистрировали с помощью зонда Rh 123 .

Рис. 15. Ингибитор фосфолипазы А2 задерживал наступление ОКД.

Зависимость доли гранулярных нейронов (%) (7D1V), в которых возникла ОКД, от длительности действия глутамата в контрольноу опыте без ингибитора (сплошные

квадратики, п=52) и в культуре, в которую за 5 мин до Glu и в течение действия Glu присутствовал ингибитор

фосфолипаз А2 арахидоноил трифторметил кетон

(AACOCF3, 50мкМ, полые "о 500 ю'оо 1500 2000 квадратики, п=44).

Лаг-период ОКД (сек) Вертикальные стрелки

отмечают момент времени, когда в 50% нейронов наступила ОКД.

ингибирования гидролиза фосфолипидов клеточных мембран фосфолипазами А2 задерживать наступление ОКД. Для этого сопоставили изменения [Ca2+]j ,

Glu + AACOCF3

вызванные одним Glu и в присутствии арахидоноил-трифторметил кетона (AACOCF3, 50мкМ), который ингибирует преимущественно Са2+-зависимую цитозольную PLA2 (cPLA2, MW 61-114kDa) и, в меньшей степени, Са2+-независимую PLA2 (iPLA2, MW 84-88kDa) (Ackermann et al, 1995; Street et al,1995), причем AACOCF3 подавляет гидролиз преимущественно тех фосфолипидов, в состав которых входит АА. AACOCF3 удлинял лаг-период ОКД, сдвигая вправо кумулятивную кривую увеличения доли нейронов, имевших ОКД (Рис.15).

Измерения [АТР] методом люциферин-люциферазной люминесценции показали, что совместное применение АА и Glu приводит к падению [АТР] в 2-3 раза большему, чем вызванному АА и Glu по отдельности (не показано). Результаты исследования эффектов экзогенной АА, блокады высвобождения АА (и других жирных кислот) фосфолипазой А2 из фосфолипидов, позволяют предположить, что свободные жирные кислоты, обладая свойствами протонофоров (и ингибиторов дыхания в случае АА), могут быть одним из факторов развития сильной МД и ОКД.

4. Различия в биоэнергетике культивируемых нейронов при действии

глутамата и в эмбриональный и постнатальный периоды развития 4.1. Изменения [АТР/с при нейротоксическом воздействии глутамата.

В предыдущих параграфах изменения [Ca2+]i и ДУ,,, при действии Glu, митохондриальных ядов и протонофоров трактовали в тесной связи с изменениями [АТР]с, хотя прямых измерений [АТР]с в тех же самых нейронах, в которых отслеживали [Са2+], и ДЧ^,, не проводили. Возможность восполнить этот пробел появилась благодаря применению флуоресцентного белкового АТФ-сенсора. Установлено, что в культуре гиппокампальных нейронов, полученных от одно- двухдневных (Р1-Р2) крыс Glu (20мкМ, ЮмкМ глицина, О Mg"+) вызывал быстрое снижение [АТР]с . Между скоростью снижения [АТР]с и латентным периодом развития ОКД существует примерно линейная зависимость (г2=0,47), при которой большей скорости падения [АТР]с соответствует более короткий лаг-период ОКД. В среднем (п=15) ОКД начиналась при снижении [АТР]с до 16% и далее опускалась в фазе высокого [Ca2+]j плато до 10% относительно [АТР]с в покоящихся нейронах. Если Glu добавляли в присутствии ингибитора №+/К+-АТФазы плазматической мембраны, оубаина (0,5мМ), то ОКД возникала при [АТР]с -37% относительно уровня в покоящихся нейронах (п=5).

Скорость синтеза АТФ в митохондриях определяется (помимо концентраций АДФ и неорганического фосфата) протонным электрохимическим потенциалом, который включает два слагаемых —АТт и

37

разность pH между матриксом митохондрий и цитозолем (ДрН = рНм - рНс) (Mitchell, 1968). Конструктивная особенность АТФ-сенсора AT 1.03 позволяет использовать его для измерения pH в том же внутриклеточном компартменте, в котором одновременно производят измерения [АТР] (см. Методы и Материалы). Поэтому мы выполнили двойную трансфекцию нейронов, направив в цитозоль AT 1.03, а в митохондрии - pH-чувствительный красный флуоресцентный белок mito-mKate-1 (Chudakov et al, 2010).

Рис. 16. Изменения |Ca2+]j , [ATPJc, pH цнтозоля и митохондрий (рНс и рНм) и трансмембранной разности рН (рНм-рНс), вызванные глутаматом (Glu) в представительном нейроне из гиппокампа новорожденной крысы, экспрессирующем в цитозоле флуоресцентный АТФ-сенсор. (А) Изменения [Ca2+]i и [АТР]с, (Б) рН цитозоля и рН митохондрий и (В) [АТР]с и разности рН между матриксом митохондрий и цитозолем. Концентрация Glu 20мкМ (ЮмкМ глицина, 0 Mg2+). Возраст культуры 8D1V.

[АТР]с

Время (мин)

На рисунке 16 представлены изменения [Са2+]; , [АТР]с , рНм и рНс , индуцированные Glu в одном из таких гиппокампальных нейронов. Видно, что [АТР]с может опускаться до минимального уровня прежде, чем начнется ОКД (Рис. 16А) и, соответственно, предшествует падению NAD(P)H до минимального уровня (см. Рис. 8Б, 9А, 11Б, 12Б). Это еще раз свидетельствует о том, что падение NAD(P)H до минимального уровня не является необходимым условием или причиной падения [АТР]с, поскольку наступает позже. Неожиданным оказалось то, что восстановление низкого [Ca2+]f в постглутаматный период, а значит и рост ДЧ'п, (см. Рис. 1Г), могут происходить до начала увеличения [АТР]с (Рис. 16А). Вероятно, значительный расход АТФ на выкачивание из цитозоля Na+, при котором снижение [Na+] начинается после снижения [Ca2+]i (Сторожевых и соавт., 2007), задерживает восстановление [АТР]с. Протонофор FCCP (1мкМ) в конце эксперимента индуцировал резкое падение [АТР]с и высвобождение Са2+ в цитозоль (Рис. 16А), очевидно, в результате коллапса ДЧ^, и последовавшими за этим реверсией митохондриальной АТФсинтазы в АТФазу и исчезновением электрофоретической силы, удерживавшей Са2+ в митохондриях.

Glu вызывал быстрое снижение рНс, которое сменялось ростом рНс примерно тогда же, когда начиналось развитие ОКД (Рис. 16Б). Изменения рНм имели более сложный вид (Рис. 16Б), причем профили этих изменений были более индивидуальны для каждого отдельного нейрона, чем графики изменений рНс. Этот феномен более четко виден на графике изменений ДрН (Рис. 16В). FCCP (1мкМ) в конце эксперимента ликвидировал различие между рНм и рНс (Рис. 16Б), делая ДрН=0 (Рис. 16В).

Одновременные измерения рНм и рНс показали, что даже во время [Ca2+]i плато может не происходить коллапса ДрН. Аналогичный результат был получен при одновременной экспрессии двух белковых флуоресцентных рН-сенсоров - красного mKate в цитозоле и желто-зеленого YFP в матриксе митохондрий (не показано). Это наблюдение является еще одним аргументом против «классической» поры высокой проводимости, по крайней мере, в начальный период высокого [Ca2+]j плато. Необходимо подчеркнуть, что изменения [Са2+]| на рисунке 16А,В синхронны с изменения ДЧ'т (см. Рис.1 В,Г и Рис.2) и поэтому в совокупности с графиками ДрН указывают на сложный характер изменений протонного электрохимического потенциала митохондрий нейронов под воздействием Glu.

4.2. Изменения концентрации АТФ в цитозоле пре- и постнатальных индивидуальных нейронов ([АТР]с), вызванные химической гипоксией и глюкозной депривацией. Считается, что в нейрональной культуре, так же как и в мозге, более 90% АТФ производится митохондриями. Тот факт, что Oligo

39

вызывает лишь небольшое снижение [АТР], измеренное биохимическими методами в среднем по клеточной популяции в культуре (см., например, обзор Б.И. Ходорова, 2003), объясняют компенсаторным эффектом усиления гликолитического синтеза АТФ в цитозоле. Мы впервые исследовали изменения концентрации АТФ в цитозоле индивидуальных нейронов ([АТР]с), вызванные химической гипоксией (блокадой дыхательной цепи митохондрий цианидом) или/и удалением глюкозы (чаще с эквимолярной заменой ее на 2-дезоксиглюкозу). Для этого в цитозоле клеток экспрессировали

Нейроны из гиппокампа эмбрионов

В

I

1.0

0.80 0.75 0.70 0.65 0.60

10 20 30 40 50 60 Время (мин)

10 20 30 40 50

Время (мин)

Нейроны из гиппокампа новорожденных

[АТР]с

<XCcPQcP

Ollgo

ЗО 40 50

Время (мин) Время (мин)

Рис.17. В культивируемых нейронах из гиппокампа эмбрионов крысы (А,Б) АТФ производится в результате гликолиза, а в нейронах из гиппокампа новорожденных крыс (В,Г) преимущественно благодаря окислительному фосфорилированию. Изменения [АТР]с (зеленые графики -о-о-, правые оси ординат) и ДЧ^ (красные графики —, левые оси ординат), индуцированные в нейронах последовательной заменой (А,В) буфера с глюкозой на безглюкозный с 5мМ 2-дезоксиглюкозы (-С1ис+2ЭС), добавлением митохондриального субстрата пирувата (Руг, ЮмМ), ингибитора Р1Ро-АТФазы олигомицина (О^о, 5мкг/мл) и цианида (СІЧ, ЗмМ), либо последовательным (Б,Г) добавлением О^о, заменой глюкозы на 2БО и добавлением С1Ч. Культуры Е 17-Е 18 и Р1-Р2 имели возраст 7-801V.

белковый АТФ-сенсор, ATI.03 (Imamura et al, 2009). Культуры, часть нейронов в которых экспрессировала ATI .03, нагружали TMRM, что позволяло проводить одновременные измерения [АТР]с и A*Pm Было обнаружено, что в культурах, приготовленных из гиппокампов эмбрионов крысы (17-18 день беременности, Е17-Е18), удаление глюкозы (Glue) вызывало падение [АТР]с почти до минимального уровня (Рис.17А). Последующая замена Glue на 2-дезоксиглюкозу (2-DG) при одновременной блокаде дыхательной цепи цианидом вызвала дальнейшее понижение [АТР]с лишь на 2,5±1,0% (принимая исходную [АТР]с в покоящихся нейронах за 100%). Блокада гликолиза вызывала небольшую деполяризацию (Рис.17А). Руг не увеличивал [АТР]с в безглюкозном буфере в 84% нейронов (96/114; 43 эксперимента), хотя при этом Руг увеличивал ДЧ'т (Рис.17А) и закислял цитозоль (не показано), что свидетельствует о проникновении этого субстрата митохондрий в клетку и его поступлении в митохондрии.

Oligo не уменьшал [АТР]с в этих нейронах, но при этом вызывал снижение АЧ'т (Рис.17Б), свидетельствуя о том, что FlFo-АТФсинтаза работала в реверсивном режиме, не синтезируя, а потребляя АТФ. Эта особенность Е17-Е18 нейронов оставалась неизменной на протяжении всего срока исследования культуры (от 5 до 15 дней).

Нейроны в культурах клеток из гиппокампов постнатальных крыс (1-2 день после рождения, Р1-Р2) кардинально отличались от Е 17-Е 18 по реакции на митохондриальные яды и глюкозную депривацию. Удаление Glue вызывало гораздо меньшее снижение [АТР]с (на 30,1±6,5%) по сравнению с нейронами из Е17-18 (на 97,5±1,0%), но при этом заметно деполяризовала митохондрии (Рис. 17В). Руг, добавленный во время глюкозного голодания, значительно увеличивал как [АТР]с (на 54±8%), так и ДЧ^ (Рис.17В). Oligo резко уменьшал [АТР]с (на 66±11%, п=8) и гиперполяризовал митохондрии (Рис.17В,Г). Исходя из перечисленных характеристик, мы заключили, что Р1-Р2 нейроны синтезировали АТФ преимущественно благодаря ОксФос. В перинатальный период в нейронах мозга (по крайней мере, гиппокампа крыс), по-видимому, происходит переключение синтеза АТФ с преимущественно гликолитического. в цитозоле на ОксФос в митохондриях.

Заключение

Проведенные нами исследования на нейрональных культурах мозжечка и гиппокампа крысы показали, что индуцированное глутаматом поступление в нейроны Са+ и Na+ запускает каскад патогенных событий, в которых митохондрии демонстрируют самые разные аспекты своих функциональных

возможностей. Вход Са2+ в цитозоль по NMDA-каналам в первую же минуту повышает [Ca2+]i до уровня, необходимого для активации кальциевого унипортера и захвата Са2+ митохондриями. Быстрая деполяризация плазматической мембраны (Czyz et al, 2002) и падение градиента концентрации Na+ между буфером и цитозолем (Czyz et al, 2002; Сторожевых и соавт, 2007) существенно снижают способность Ыа+/Са2+-обменников, наиболее производительных механизмов плазмалеммы, удалять избыток Са2+ из нейронов, вынуждая митохондрии поглощать значительную, если не основную, долю поступающего в цитозоль Са2+. Сильный ацидоз цитоплазмы, возникающий в результате активации Са2+-АТФаз плазматической мембраны сразу после добавления Glu, приводит к снижению рН митохондрий (Рис. 23Б), подавляя их способность удерживать Са2+ в форме комплексов с фосфатами (Chalmers & Nicholls, 2003). Быстрое падение [АТР]с во время первой фазы [Са2+], ответа на Glu до уровня, лишь на ~16% превышающего минимальный [АТР]с, вызвано, судя по влиянию оубаина, интенсивной работой Na+/K+-АТФазы плазмалеммы. Одновременный мониторинг рН цитозоля и митохондрий позволил обнаружить, что во время низкого [Са2+], плато, относительно небольшая митохондриальная деполяризация (снижение ДЧ'т на 40-60мВ, см. Рис. 2В) компенсируется ростом АрН на 0,8-1,2 (Рис. 23В). Таким образом, сильное падение [АТР]с во время первой фазы [Са2+], ответа на Glu вызвано не столько значительным ослаблением электрохимического потенциала митохондрий, сколько многократным усилением его потребления в цитозоле. Нельзя, однако, исключить и такого фактора падения [АТР]с, как способность высоких концентраций Са2+ снижать эффективность работы АТФ/АДФ-транслокатора и FlFo-АТФсинтазы (Moreno-Sanchez, 1985), хотя влияние Са2+ на функциональные и структурные элементы митохондрий зачастую неоднозначно (Hansford & Zorov, 1998; Brookes et al, 2004). Полученные результаты показывают, что любой способ снижения ДЧ'т и [АТР]с будет способствовать развитию ОКД. Поэтому ингибирование гликолиза или химическая гипоксия, моделируемая применением ингибиторов дыхательной цепи, сокращали лаг-период ОКД. Поскольку доставка глюкозы сквозь плазматическую мембрану нейронов осуществляется в форме котранспорта с Na+ (Espinoza-Rojo et al, 2010), снижение потенциала плазматической мембраны и трансмембранного градиента концентрации Na+, происходящее при действии Glu, также можно рассматривать как факторы, ухудшающие синтез АТФ и приближающие ОКД. Аноксия, имитируемая высокими концентрациями CN, оказалась опаснее блокады гликолиза, так как вызывала немедленную дисрегуляцию Са2+ гомеостаза, тогда как глюкозная депривация приближала наступление ОКД, но не превращала ее в НКД. В

42

отсутствие гликолиза нейроны в состоянии на некоторое время (от единиц до -ЗОмин, в зависимости от типа нейронов и возраста культуры) (Рис. 9,12) компенсировать дефицит пирувата мобилизацией эндогенного субстрата цикла трикарбоновых кислот. Таким субстратом, по нашим представлениям, может быть цитозольный глутамат, концентрация которого в соме культивируемых нейронов составляет около ЮмМ (Nicholls, 2009).

Повышенный уровень [Ca2+]j в совокупности с другими внутриклеточными сигнальными системами, запускаемыми Glu (Farooqui & Horrocks, 2004, 2006; Ferraguti et al, 2008), приводит к активации фосфолипаз А2 и высвобождению свободных жирных кислот (СЖК), которые (по крайней мере, арахидоновая кислота) способны усиливать митохондриальную деполяризацию, вызванную Glu или ингибированием дыхания (Рис. 13,14). Необходимо отметить, что СЖК не имеют быстрой системы удаления и накапливаются в клеточных мембранах, ухудшая их барьерные свойства тем сильнее, чем дольше действует Glu.

Совокупность перечисленных выше процессов, происходящих во время первой фазы [Са2+]; ответа на Glu, приводит к тому, что наступает момент, индивидуальный для каждого нейрона, когда удаление Са2+ из цитозоля во внеклеточное пространство и захват его митохондриями перестают уравновешивать поток Са2+ из внеклеточного пространства. Это событие быстро приобретает характер кооперативного процесса. На ключевую роль дисфункции митохондрий в возникновении ОКД указывает синхронность этого процесса cl) началом сильной деполяризации митохондрий, 2) появлением второй ступени снижения NAD(P)H и усилением окисления флавиновых нуклеотидов, 3) сильным снижением рНм и АрН на восходящей фазе ОКД, 4) образованием АФК.

Начало ОКД не обусловлено исчерпанием NAD+ в результате гиперактивации ПАРП-1 и, соответственно, истощением митохондриального NADH, необходимого для питания комплекса I дыхательной цепи. Наши данные свидетельствуют в пользу развития неселективной поры, способной пропускать неорганические ионы, но слишком узкой для NAD+ и даже для молекул меньшего, чем NAD+ размера, таких, как субстраты цикла трикарбоновых кислот.

Сопоставление Glu-индуцированных изменений [Са2+], и распределения поли(АДФ-рибозы) (ПАР) в одних и тех же нейронах показало, что за время действия Glu ПАР успевает диффундировать в цитозоль. Взаимодействие ПАР с внешней митохондриальной мембраной способствует высвобождению фактора апоптоза AIF (Wang Y. et al, 2009). Вероятно, это является одной причин того, что в течение первых суток после действия Glu около половины нейронов, имевших ОКД, погибает от апотоза (Рис. 4 и 15).

43

Сопоставление изменений [Ca2+]j при действии Glu и путей последующей гибели тех же самых нейронов показало, что развитие ОКД ведет к смерти -97% клеток в течение первых суток после глутаматного стресса. Нейроны с более длительным лаг-периодом ОКД, имели более высокую вероятность гибели от апоптоза, чем от некроза. Необходимо отметить, что все нейроны, в которых за время действия Glu не возникла ОКД, выживали. Поэтому удлинение лаг-периода ОКД может служить полезным для практики критерием отбора химических агентов на пригодность в качестве нейропротекторных препаратов.

Выводы

1. Индуцированная глутаматом отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД) и синхронная с ней сильная митохондриальная деполяризация (МД) в нейронах in vitro являются результатом патогенных изменений внутриклеточных концентрации Са2+, Na+, Н\ АТФ, NAD(P)H, потенциалов митохондриальной и плазматической мембраны.

2. Культивируемые нейроны, в которых возникла ОКД, гибнут в результате апоптоза и некроза, причем вероятность смерти от некроза тем выше, чем длительнее фаза высокого [Са2+]| плато. Увеличение или сокращение лаг-периода ОКД и МД может служить количественным критерием соответственно нейропротекторных или нейротоксических свойств биологически активных веществ.

3. ОКД возникает тогда, когда скорость поступления Са2+ в цитоплазму начинает превышать скорость удаления Са2+ из клетки. Важным фактором дисбаланса скоростей является реверсия Na+/Ca2+ обмена через плазмалемму.

4. Сопоставление эффектов глюкозной депривации, экзогенных ингибиторов протонных насосов дыхательной цепи, протонофоров и усиления потока Са2+ в цитозоль показывает, что причиной развития ОКД являются процессы, снижающие митохондриальный синтез АТФ и способность митохондрий захватывать и удерживать Са2+.

5. Эндогенными факторами ускорения ОКД являются: усиление потребления NADH и разобщение окислительного фосфорилирования; активация фосфолипаз А2 (PLA2), приводящая к высвобождению арахидоновой кислоты, способной снижать эффективность работы протонных насосов; активация фермента поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1 (ПАРП-1), расходующего NAD+ на репарацию ДНК и вызывающего дефицит NADH. Ингибиторы PLA2 и ПАРП-1 задерживают наступление ОКД.

6. Во время первой фазы Са2+ ответа на глутамат в культивируемых нейронах усиливаются процессы, препятствующие развитию ОКД: увеличивается градиент рН между митохондриями и цитозолем (АрН), который компенсирует снижение митохондриального потенциала; активируются альтернативные пути окисления субстратов; повышается активность сукцинатдегирогеназы.

7. При развитии ОКД происходит падение ДЧ'щ и ДрН, что приводит к ослаблению захвата митохондриями избытка Са2+ из цитозоля и дополнительному снижению концентрации цитозольного АТФ, необходимого Са2+- и Ка+/К+-АТФазам для поддержания потенциала плазмалеммы и концентрации этих ионов в цитозоле.

8. В перинатальный период происходят кардинальные перестройки биоэнергетики нейронов. В культивируемых нейронах из гиппокампа эмбрионов крысы (Е17-Е18), доминирующим способом синтеза АТФ является гликолиз, тогда как в нейронах, полученных из гиппокампа постнатальных крыс (Р1-Р2), АТФ синтезируется преимущественно за счет окислительного фосфорилирования.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Ходоров Б.И., Сторожевых Т., Сурин А.. Сорокина Е., Юравичус А., Бородин А., Винская Н., Каспеков Л., Пинелис В. Митохондриальная деполяризация играет доминирующую роль в механизме нарушения нейронального кальциевого гомеостаза вызванного глутаматом // Биологические Мембраны.-2001,- Т.18, №6.-С.421-432.

2. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин A.M., Ходоров Б.И. Ведущая роль митохондриальной деполляризации в механизме глутамат-вызванного нарушения Са2+ гомеостаза// Физиол. Журнал им.И.М.Сеченова. -2001 Т.87, №4.-С.459-467.

3. Duchen M.R., Surin A.M.. On the role of mitochondria and calcium in glutamate-induced neurotoxicity in hippocampal neurons in culture // Биологические Мембраны.-2002.-T.19, №1.-C. 97-109.

4. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин A.M., Ходоров Б.И. Ведущая роль Са2+-АТФазы плазматической мембраны в восстановлении Са2+ гомеостаза нейронов после глутаматного удара // Бюллетень Экспернм. Биол. и Медицины. -2003,-Т.135, №2.-С. 162-165

5. Bolshakov А.Р., Mikhailova М.М., Jurevicius A., Surin A.M., Pinelis V.G., Khodorov B.I. Contribution of Ca2+ and Na+ to glutamate-induced mitochondrial depolarization in cerebellar granule cells // Биологические Мембраны. -2003,-T.20, №5,- С. 443-445.

6. Михайлова М.М., Большаков А.П., Сурин A.M., Пинелис В.Г. Ходоров Б.И.. Снижение устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в отсутствие глюкозы // Биологические Мембраны. -2003.- Т.20, №5,- С. 446-448.

7. Surin A.M., Storozhevykh Т.Р., Vinskaya N.P., Pinelis V.G., Duchen M.R., Khodorov B.I. Does mitochondrial ATP synthase reversal play a crucial role in glutamate-induced deterioration of Ca2+ homeostasis in cultured mature neurons? // Биологические Мембраны. -2004,- T.21, №2,- С. 157-160

8. Вабниц А.В., Сенилова Я.Е., Колесникова Е.В., Сурин A.M.. Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Отсроченная Са2+ дерегуляция в молодых нейронах мозжечка

45

при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Роль NMDA-каналов // Биологические Мембраны.-2006,- Т.23, №3.- С. 311-319

9. Сурин A.M., Большаков А.П., Михайлова М.М., Сорокина Е.Г., Сенилова Я. Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Арахидоновая кислота усиливает рост концентрации Са" и митохондриальную деполяризацию, вызванные глутаматом в гранулярных нейронах мозжечка // Биохимия. -2006. Т.71, №8,- С. 1066-1073.

10.А.М. Сурин. С.Н. Зобова, Г.Р. Тухбатова, Я.Е. Сенилова, В.Г. Пинелис, Б.И. Ходоров. (). Изменения митохондриального NAD(P)H и нарушения кальциевого гомеостаза в культивируемых нейронах мозжечка крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов // Биологические Мембраны.-

2010,- Т.27, №1,- С. 39-45.

11 .Миронова Г.Д., Белослудцев К.Н., Сурин A.M., Трудовишников А.С., Белослудцева Н.В., Пинелис В.Г., Красильникова И.А., Ходоров Б.И. Митохондриальная липидная пора в механизме глутамат-индуцируемой кальциевой дисрегуляции нейронов мозга // Биологические Мембраны.-

2011,- Т.28, №6.- С. 483-494.

12.Khodorov B.I., Mikhailova М М., Bolshakov А P., Surin A.M., Sorokina E.G., Rozhnev, S.A., and Pinelis, V.G. Dramatic effect of glycolysis inhibition on the cerebellar granule cells bioenergetics // Biochemistry (Mosc.) Suppl. Series A: Membrane Cell. Biol.- 2012,- T.6, №2,- P. 186-197.

Статьи в иных рецензируемых научных журналах.

13.Duchen M.R., Surin A.M., Jacobson J. Imaging mitochondrial function in intact cells // Methods in Enzymology. 2003. V.361, P. 353-389.

14. Kolikova J, Afzalov R, Giniatullina A, Surin A. Giniatullin R, Khiroug L. Calcium-dependent trapping of mitochondria near plasma membrane in stimulated astrocytes // Brain Cell Biol. -2006,-V.35,№l.-P. 75-86.

15.Kolikova J, Afzalov R, Surin A. Lehesjoki AE, Khiroug L. Deficient mitochondrial Ca(2+) buffering in the Cln8(mnd) mouse model of neuronal ceroid lipofuscinosis. Cell Calcium. -2011.- V. V.50,№6.-P. 491-501.

16.Surin A.M., S. Khiroug, L.R. Gorbacheva, B.I. Khodorov, V.G. Pinelis and L. Khiroug. Comparative analysis of cytosolic and mitochondrial ATP synthesis in embryonic and postnatal hippocampal neuronal cultures. Front. Mol. Neurosci. 5:102. doi: 10.3389/fnmol.2012.00102. Epub 2013 Jan 10.

Статьи в сборниках и тезисы докладов на конференциях.

17.Пинелис В.Г., Сторожевых Т.П., Сурин A.M., Большаков А.П., Михайлова М.М., Ходоров Б.И. Роль Са2+ насоса плазматической мембраны в нарушениях Са2+ гомеостаза нейронов при токсическом действии глутамата и разобщителей. // Материалы научной конференции "Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты", (Москва 2-4 апреля 2000)

18.Сурин A.M., Большаков А.П., Михайлова М.М., Сорокина Е.Г., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г. Роль арахидоновой кислоты в нарушениях Са2+ гомеостаза, вызванных глутаматом в культивируемых нейронах. Материалы

Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 6-8 июня 2005, стр.158-161.

19.Пинелис В.Г., Сторожевых Т.П., Сурин A.M.. Черняк Б.В., Сорокина Е.Г., Ходоров Б.И. Механизмы стойкого повышения [Са2+ ] , в культивируемых нейронах, вызванного разобщителями после гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Роль уменьшения уровня АТФ. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 6-8 июня 2005, стр. 153-155.

20.А.М. Surin, А.Р. Bolshakov, М.М. Mikhailova, V.G. Pinelis, B.I. Khodorov and L. Khiroug. Simultaneous measurement of cytosolic and mitochondrial free Ca2+ concentrations in neuronal soma using fluorescent indicator pairs. Society for Neuroscience 35th Annual Meeting, Washington DC, November 12-16, 2005, Abstract 790.13

21 .Сурин A.M.. Большаков А.П., Михайлова M.M., Мотин В.Г., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г. Ходоров Б.И., Хируг JI.C. Изменения концентрации кальция и pH в культивируемых нейронах во время действия глутамата и в постглутаматный период. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 5-7 июня 2007, стр.103-105.

22.Сурин A.M.. Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е , Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Исследование роли изменений NAD(P)H в возникновении отсроченной кальциевой дисрегуляции в гранулярных нейронах мозжечка. Материалы конференции «Гипоксия - механизмы, адаптация, коррекция». Москва, 9-11 октября 2008 г

23.Surin AM.. Zobova S.N., V.G. Pinelis, B.I. Khodorov. Role of mitochondrial NADH in the glutamate-induced delayed Ca2+ deregulation in cerebellar granule neurons. Society for Neuroscience 38th Annual Meeting, Washington DC, November 15-18, 2008, Abstract 51.19

24.A.M. Surin. V. G. Pinelis, Д. D. Vinogradov, В. I. Khodorov. Evidence for pore opening in mitochondrial membrane during glutamate-induced delayed calcium deregulation in brain neurons. Материалы научной конференции «Ионные каналы: Структура и функции», 17-18 марта 2009, С.-Петербург. Биол. Мембраны Т.26, № 4, С.330

25.Сурин A.M.. Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Изменения митохондриального NAD(P)H и нарушения кальциевого гомеостаза в культивируемых нейронах мозжечка крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 4-6 июня 2009, стр.157-162

26.A.M. Surin. V. G. Pinelis*, Д. D. Vinogradov, В. I. Khodorov. Evidence for pore opening in mitochondrial membrane during glutamate-induced delayed calcium deregulation in brain neurons. Материалы научной конференции «Ионные каналы: Структура и функции», 17-18 марта 2009, С.-Петербург. Биол. Мембраны Т.26, № 4, С.330

27.Сурин A.M., Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Изменения митохондриального NAD(P)H и нарушения кальциевого гомеостаза в культивируемых нейронах мозжечка крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 4-6 июня 2009, стр. 15 7-162

28.Pinelis V. G., Tuhbatova G., Surin A., Khodorov В., Khiroug L. Disturbance of oxidative phosphorilation coupling during glutamate-induced delayed calcium deregulation in cultured brain neurons. Society for Neuroscience 38th Annual Meeting, Chicago, IL, October 17-21, 2009, Program 634.21, N13

29.Pinelis V.G., Surin A.M.. Leo S. Khiroug, Krasilnikova I.A., Rozhnev S.V., Khodorov B.I. Role of Ca2+/H+ exchange and disturbance of oxidative phosphorilation in glutamate-induced delayed calcium deregulation in cultured neurons Biophysical Society 55th Annual Meeting, Baltimore, March 5-9,2011.

30.Сурин A.M., Красильникова И.А., Персиянцева H.A. , Ефремова A.C., Шрам С.И., Горбачева JI.P., Савинкова И.Г., Зобова С.Н., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Роль поли(АДФ-рибоза)-полимеразы-1 (PARP-1) в нарушении кальциевого гомеостаза нейронов мозжечка крысы. Международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" Пущино, 24-26 мая 2011г. Сборник статей, Т.1 стр. 150-156.

31.Миронова Г.Д., Белослудцев К.Н., Сурин A.M., Трудовишников А.С., Белослудцева Н.В., Пинелис В.Г., Красильникова И.А., Ходоров Б.И. Возможная роль митохондриальной Са2+-зависимой липидной поры в глутамат-индуцируемой кальциевой дерегуляции нейронов. Международная конференция "рецепторы и внутриклеточная сигнализация" Пущино, 24-26 мая 2011г. Сборник статей, Т.2 стр. 680-687.

32.Pinelis V, Surin A, Imamura Н, Khiroug S, Zobova S, Molotkov D, Gorbacheva L, Noji H, Khodorov В and Khiroug L. Dynamic imaging of intracellular ATP concentration in single cultured neurons. Society for Neuroscience 40th Annual Meeting, Washington, DC, November 12-16, 2011, Program#/Poster#: 106.18/YY27.

33.Surin A.M., Pinelis V.G., Krasilnikova I.A., Khiroug L.S., Chudakov D., Khodorov B.I. On the mechanism of glutamate-induced delayed mitochondrial depolarization in brain neurons. 8lh IBRO World Congress of Neuroscience. Florence, Italy, July 14-18, 2011. Abstract C074.

34. Сурин A.M., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Шарипов P.P., Ходоров Б.И., Пинелис В.Г. Флуоресцентно-микроскопические измерения [АТФ] в цитозоле культивируемых нейронов при токсическом действии глутамата. Международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" Пущино, 24-26 мая 2013г. Сборник статей , Т.2 стр. 718-723.

Alexander Mikhailovich SURIN MECHANISMS OF MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION AND DISTURBANCE OF IONIC HOMEOSTASIS AT GLUTAMATE NEUROTOXICITY Abstract

Ischemic insult and some neurodegenerative diseases results in neuronal death caused by glutamate (Glu) excitotoxicity. The relationship of the Glu-induced delayed calcium deregulation (DCD) and synchronous with it profound mitochondrial depolarization (MD) was investigated employing primary cultures of rat cerebellar granule cells and hippocampal neurons. Excessive stimulation of the NMDA-type ionotropic glutamate receptors result in pathogenic changes in intracellular Ca2+, H+, ATP, NAD(P)H and reactive oxygen species (ROS) production. An important factor of DCD incidence is the reversion of Na+/Ca2+ exchange across the cell plasma membrane. Neurons that revealed DCD die in 18-24hrs by apoptosis and necrosis at about equal proportion. Increase or decrease of the DCD lag-period can serve as a quantitative criterion neuroprotective or neurotoxic properties of biologically active substances. The effects of glucose deprivation, inhibitors of the respiratory chain proton pumps, protonophores indicate that DCD is promote by reduction of mitochondrial ATP synthesis and failure of mitochondria to capture and retain Ca2+. The increased consumption of NADH and uncoupling of oxidative phosphorylation due to activation of phospholipases A2 (PLA2) are the endogenous factors accelerating DCD incidence. Arachidonic acid released by PLA2 is able to reduce the proton pump capacity and promotes transmembrane H+ fluxes. Glu-induced activation of poly(ADP-ribose)polymerase-l declines NADH due to partial NAD+ consumption. Mitochondrial succinate dehydrogenase activity increases during the DCD thus partially overcoming NADH deficit. Dual transfection of neurons with green and red fluorescent proteins revealed that during the lag-period of DCD the decrease of the mitochondrial potential (AvPm) is compensated by the increase of pH gradient between mitochondria matrix and cytosol (ApH). Expression of the FRET-based ATP-sensor in hippocampal neurons showed that Glu induced a dramatic decrease of [ATP] in cytosol and its strong acidosis. ATP-sensor also revealed that during the perinatal period a fundamental restructuring of neuronal bioenergetics occurs. In cultured hippocampal neurons from embryonic rats, the dominant way for the ATP synthesis is glycolysis, whereas in neurons derived from the hippocampus of postnatal rats ATP is predominantly synthesized by oxidative phosphorylation.

Заказ № 87-а/11/2013 Подписано в печать 25.11.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2.4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maii.info@cfr.ru