Автореферат и диссертация по медицине (14.01.23) на тему:Трансляционная клеточная иммунотерапия при аллотрансплантации трупной почки у урологических больных

На правах рукописи

ФЕДУЛКИНА ВЕРОНИКА АНДРЕЕВНА

ТРАНСЛЯЦИОННАЯ КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТРУПНОЙ ПОЧКИ У УРОЛОГИЧЕСКИХ

БОЛЬНЫХ

14.01.23 - урология 14.01.24 — трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ 2 <5 '-'05? 2013

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005540668

Москва-2013

005540668

Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского»

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Ватазин Андрей Владимирович

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Кильдюшевский Александр

Вадимович

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой урологии

ФУВ «МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского» Трапезникова Маргарита

Федоровна

доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом клинической трансплантологии ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова»

Министерства здравоохранения РФ Мойсюк Ян Геннадьевич

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт урологии» Министерства здравоохранения РФ.

Защита диссертации состоится З-лу'Сл^с'с 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д.208.049.01 при ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского» по адресу: 129110, Москва, ул. Щепкина, д. 61/2, корпус 15а, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского»

Автореферат разослан «

/Р» иО^^АЛ^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Астахов П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее важных проблем аллотрансплантации трупной почки (АТТП), возникающих в раннем послеоперационном периоде и требующих своего решения, является предупреждение и лечение острого отторжения почечного аллотрансплантата (ПАТ) [Nafar M, Farrokhi F, Vaezi M et al., 2008]. Количество и тяжесть перенесенных острых реакций отторжения имеет прямую корреляцию с потерей массы действующих нефронов и длительностью жизни трансплантата [Karczewski J. и соавт.,2008].

Современная терапия острого отторжения, включающая большие дозы кортикостероидов и антилимфоцитарные препараты, позволяет полностью купировать это осложнение только примерно в 80% случаев [Cattaneo D., Baldelli S., Perico N., 2008], а острое отторжение остаётся серьезной проблемой трансплантологии [Karczewski J, Karczewski M, Glyda M, Wiktorowicz K., 2008]. Во-первых, современная иммуносупрессия является неспецифической. Пациенты имеют существенный риск оппортунистических инфекций, что особенно актуально у больных с хронической болезнью почек 5 (ХБП5) урологической этиологии, и онкологических заболеваний [Klemens Budde, Petra Glander, 2008]. Помимо этого существуют побочные эффекты, не связанные с непосредственным иммуносупрессивным действием препаратов, такие как нефротоксичность циклоспорина и такролимуса, а также диабетические последствия применения такролимуса и др. [Sahin G. et.al., 2011]. Во-вторых, эти препараты, подавляя иммунный ответ на аллотрансплантат, не формируют иммунологическую толерантность по отношению к трансплантату, что на фоне глобальной иммуносупрессии в конечном итоге может привести и неизбежно приводит к хроническому отторжению ипотере пересаженного органа [Franklin H. et.al., 2010].

Именно эти факторы определяют непрекращающийся поиск новых иммуносупрессивных агентов и совершенствование тактики их применения, что послужило основанием для разработки нового метода ведения больных после трансплантации - трансляционной клеточной иммунотерапии (ТКИ).

Данный метод представляет собой модифицированную методику уже известной экстракорпоральной фотохимимиотерапии, которая зарекомендовала себя

во всем мире как успешный и эффективный метод иммунотерапии. В его основе лежит воздействие активированных ультрафиолетовым светом молекул фотосенсибилизатора на лимфоциты крови. Экстракорпоральная фотохимиотерапия успешно применяется для лечения заболеваний, обусловленных нарушением функции Т-клеточной системы иммунитета, при пересадке органов [S.Rummler, D.Barz, 2011], а также в случае развития реакции «трансплантат против хозяина» при аллотрансплантации стволовых гемопоэтических клеток [Jagasia M.N. et.al., 2009].

Метод был предложен в 1987 г. группой исследователей Иельского университета (США) во главе с профессором R.L.Edelsori в качестве терапии Т-клеточной лимфомы кожи. Известно несколько сообщений с участием в общей сложности до 50 пациентов после аллотрансплантации трупной почки, где курсы трансляционной клеточной иммунотерапии были с успехом использованы для купирования устойчивых эпизодов острого отторжения. Авторы пришли к заключению, что трансляционная клеточная иммунотерапия может иметь значение в качестве адъювантной терапии или как метод выбора для предотвращения отторжения при пересадке солидного органа [Meg J. et.al., 2009]. Встречаются также единичные публикации о применении данного метода в качестве профилактики острого отторжения почечного аллотрансплантата [Lamioni A. et.al., 2007].

•Вместе с тем недостаточны и противоречивы данные о механизмах терапевтического действия метода трансляционной клеточной иммунотерапии. Прежде всего, неясным остается механизм индукции толерантности к чужеродным антигенам - приобретение свойства иммунной системы не реагировать на антигены пересаженного донорского органа. Кроме того, при ХБП урологической этиологии, когда за долгие годы у больных была сформирована толерантность к большинству антибактериальных агентов, чрезвычайно важно сохранить механизмы антиинфекционной защиты.

Представленные данные являются подтверждением необходимости дальнейшего исследования проблемы тканевой толерантности при трансплантации почки, разработки новой иммуномодулирующей концепции на основании комплексного подхода с включением трансляционной клеточной иммунотерапии в стандартный протокол иммуносупрессивной терапии для предотвращения острого

отторжения почечного аллотрансплантата в раннем послеоперационном периоде путем формирования механизмов устойчивого адоптивного иммунного ответа к аллоантигенам, и тем самым для улучшения функции пересаженного органа и повышения его выживаемости, в частности, у урологических больных, что послужило основанием для настоящего исследования.

Цель исследования. Сравнительное проспективное изучение результатов аллотрансплантации трупной почки у урологических больных при включении в протокол медикаментозной иммуносупрессивной терапии метода трансляционной клеточной иммунотерапии.

Задачи исследования:

1. оценить безопасность, эффективность и патогенетическую обоснованность применения трансляционной клеточной иммунотерапии в комбинации с лекарственной иммуносупрессивной терапией при аллотрансплантации трупной почки у урологических больных;

2. разработать методологию применения трансляционной клеточной иммунотерапии при аллотрансплантации трупной почки;

3. проанализировать функциональное состояние почечного аллотрансплантата в различные сроки после операции при стандартном и комбинированном лечении с помощью клинических, лабораторных и инструментальных методов обследования;

4. определить частоту и тяжесть эпизодов острого отторжения аллотрансплантата при стандартном и комбинированном лечении на основании клинических данных и гистологических исследований биопсийного материала почечных аллотрансплантатов;

5. исследовать возможность достижения иммунологической толерантности к почечному трансплантату с помощью метода трансляционной клеточной иммунотерапии путем анализа экспрессии молекул адгезии, коактивации на дендритных клетках, эффекторных и наивных Т-лимфоцитах.

Научная новизна. Работа посвящена новому научному направлению в отечественной трансплантологии, основанному на разработке и внедрении в клиническую практику трансляционной клеточной иммунотерапии, которая создает условия для формирования иммунологической толерантности, снижая тем самым уровень медикаментозной иммуносупрессии.

В ходе выполнения работы изучена безопасность трансляционной клеточной иммунотерапии, на основе анализа клинического материала оценено функциональное состояние почечного аллотрансплантата в различные сроки после операции при стандартном и комбинированном лечении.

На основании изучения комплекса клинико - иммунологических параметров и результатов морфологического исследования биопсийного материала почечных аллотрансплантатов дана сравнительная оценка частоты и степени тяжести эпизодов острого отторжения аллотрансплантата при стандартном и комбинированном лечении.

Путем анализа широкого спектра иммунологических параметров доказана возможность достижения иммунологической толерантности к почечному трансплантату с помощью метода трансляционной клеточной иммунотерапии, что открывает новые возможности изучения способов ведения урологических больных после аллотрансплантации трупной почки. Изучены механизмы формирования тканевой толерантности путем анализа экспрессии молекул коактивации на дендритных клетках, эффекторных и наивных Т-лимфоцитах.

Научно - практическая значимость. Проведенные исследования позволяют внедрить в клиническую практику метод трансляционной клеточной иммунотерапии у реципиентов почечного аллотрансплантата с хронической болезнью почек (ХБП) урологической этиологии, направленный на профилактику и лечение острого отторжения трансплантата в сочетании с предупреждением различных осложнений, связанных с медикаментозной иммуносупрессивной терапией у урологических больных, в ранние сроки послеоперационного периода.

В результате внедрения данной методики улучшены результаты лечения урологических больных в ранние сроки после трансплантации почки, проявляющиеся в предупреждении кризов отторжения почечного аллотрансплантата в сочетании с отсутствием инфекционных осложнений, что в дальнейшем позволит достигнуть более высокого уровня выживаемости трансплантатов и реципиентов, причиной хронической болезни почек у которых явились урологические заболевания.

Комплексный анализ полученных данных в сопоставлении с результатами обследования реципиентов парных почечных трансплантатов позволил разработать

четкие клинические и лабораторные критерии эффективности применения трансляционной клеточной иммунотерапии у урологических больных после трансплантации почки. В целом, проведенные исследования позволяют уменьшить количество эпизодов острого отторжения и улучшить результаты трансплантации почки у урологических больных.

Внедрение результатов в практику. Полученные результаты внедрены в практическую деятельность отдела трансплантологии, нефрологии и хирургической гемокоррекции ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского».

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены: на научно-практической конференции Центрального Федерального округа РФ «Актуальные вопросы гемафереза, хирургической гемокоррекции и диализа» - Москва, 2011 год; научно-практической конференции Центрального Федерального округа РФ «Актуальные вопросы нефрологии, диализа, хирургической гемокоррекции и гемафереза» - Москва-Тверь, 2013 год; IX международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения» - Астрахань, 2013 год; совместной научно-практической конференции отдела трансплантологии, нефрологии и хирургической гемокоррекции и кафедры эфферентной медицины, клинической и оперативной нефрологии ГБУЗ МО «МОНИКИ им.М.Ф.Владимирского» 13.01.2012г.; совместной научно-практической конференции отделения урологии, хирургического отделения трансплантологии и диализа, кафедры урологии и кафедры трансплантологии, нефрологии и искусственных органов ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского» 26.04.2013г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 6 - статьи в журналах, рецензируемых ВАК РФ, имеется 1 учебное пособие и 1 изобретение (решение о выдаче патента РФ на изобретение от 24.10.2013 по заявке № 2013107727 от 21.02.2013).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 рисунками и 9 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, клинической характеристики больных и 2 глав

собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 145 ссылок, из них 22 на отечественные и 123 на иностранные источники.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования. В исследовании приняли участие 40 пациентов после аллотрансплантации трупной почки, которые являлись реципиентами парных трансплантатов, полученных от 20 доноров.

В число пациентов основной группы (п=20) вошли 12 мужчин в возрасте от 31 года до 56 лет (в среднем 45 лет) и 8 женщин в возрасте от 27 до 50 лет (в среднем 33 года), которые получали стандартную медикаментозную иммуносупрессивную терапию в сочетании с трансляционной клеточной иммунотерапией. Группу сравнения (п=20) составили 12 мужчин в возрасте от 21 года до 55 лет (в среднем 35 лет) и 8 женщин в возрасте от 37 до 48 лет (в среднем 43 года), которые являлись реципиентами парных основной группе трансплантатов и получали только общепринятую медикаментозную иммуносупрессивную терапию (Таблица 1).

Таблица 1.

Клиническая характеристика больных

Параметр Основная группа (Иммуносупрессия + ТКИ) (п = 20) Контрольная группа (Иммуносупрессия) (п = 20) Р

Пол, м/ж 12/8 12/8 >0,05

Возраст, лет 41,4±12,2 39,6±14,1 >0,05

Продолжительность диализа, мес. 25,2±8,4 28,6±7,2 >0,05

Число совпадений по НЬА 8(4;13) 9(5;13)

Диагноз

Хронический пиелонефрит 9 9

Хронический гломерулонефрит 5 5

Поликистоз почек 4 4

Артериальная гипертония с исходом в нефросклероз в сочетании с инфравезикальной обструкцией 2 0

Антифосфолипидный синдром 0 2

Критериями включения в исследование являлись такие показатели, как ХБП урологической этиологии, возраст от 18 до 60 лет, наличие адекватного сосудистого доступа, отсутствие повышенной чувствительности или аллергии на 8-

ше1Ьохур80га1еп, гепарин и продукты цитрата, систолическое артериальное давление не ниже 90 мм. рт. ст. на момент рандомизации. Критериями исключения являлись заболевания, обусловленные фоточувствительностью, повторная трансплантация почки, наличие предсуществующих антител и другие факторы, относящие пациентов к группе повышенного иммунологического риска. Длительность заместительной почечной терапии перед трансплантацией у пациентов исследуемой группы составила в среднем 25 месяцев, в группе сравнения - 28 месяцев (Таблица 1)-

Причинами ХБП у реципиентов почечных аллотрансплантотов в двух группах больных явились практически идентичные, в большинстве своем, урологические заболевания (70% больных).

Видно, что у 28 больных (70%) причиной ХБП5 явились урологические заболевания. При этом необструктивный пиелонефрит был наиболее частой причиной ХБП5 (18 больных). При подготовке этой категории урологических больных к трансплантации почки использовалась тактика, отраженная в рисунке 1.

Рисунок 1. Алгоритм лечебной тактики при трансплантации почки у больных с необструктивным пиелонефритом.

Вторым по частоте урологическом заболеванием, приведшим к ХБП5, явился поликистоз почек (9 больных). Показанием к удалению поликистозных почек

считалось резкое увеличение размеров почек, что препятствует выполнению пересадки трупной почки в подвздошную область, наличие гематурии, частые атаки пиелонефрита, разрывы кист, наличие конкрементов, постоянные боли в области поликистозной почки. У 6-ти больных перед трансплантацией была выполнена односторонняя нефрэктомия, у 2-х больных поэтапная бинефрэктомия. Из двух больных с гипертоническим нефросклерозом и инфравезикальной обструкцией в одном случае во время трансплантации была наложена эпицистостома, которая ликвидирована после бужирования стриктуры задней уретры; во втором случае перед трансплантацией была выполнена трансуретральная резекция предстательной железы. Обе операции были выполнены в отделении урологии ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского».

Средний возраст доноров составил 44 года (от 29 до 55 лет). Причиной смерти 8 доноров было острое нарушение мозгового кровообращения, 12 - открытая черепно-мозговая травма. Совместимость по НЬА антигенам доноров и реципиентов в основной группе составила 8 (4; 13), в контрольной группе этот показатель оказался выше - 9 (5; 13).

Процедуры трансляционной клеточной иммунотерапии проводились пациентам исследуемой группы в первые 2 недели после трансплантации почки с кратностью 2 раза в неделю, в последующие 2 недели - 1 раз в неделю, в течение 2-го месяца - 1 раз в 2 недели, 1 раз в течение 3-го месяца и завершались одной процедурой на 180-е сутки после трансплантации почки. В качестве фотосенсибилизатора использовался аммифурин в дозе 1 мг/кг массы тела, который принимался пациентом за 2 часа до проведения процедуры. Методика трансляционной клеточной иммунотерапии заключалась в сепарации и накоплении в экстракорпоральном контуре мононуклеарных клеток с помощью аппаратов «Тегаков» или «Наетопейсв». За одну процедуру выделяли от 40 до 70 мл. концентрата мононуклеарных клеток, которые ресуспендировали в 0,9% р-ре хлористого натрия, доводя общий объем до 200,0 мл. Клеточную суспензию подвергали ультафиолетовому воздействию при длине волны 320-400 нм. Общая доза экспозиции составляла 0,8-1,2 дж/см2. После 90 минут инкубационного периода при температуре 37 С0 клетки реинфузировали пациенту в течение 30 мин.

У больных группы сравнения при развитии криза отторжения, подтвержденного данными биопсии, в качестве метода иммуномодуляции применяли каскадный плазмаферез. Процедуру проводили дважды с интервалом в 1 сутки на аппарате «Okto Nova» (Япония) с использованием каскадных плазмофильтров компании «Asahi» (Япония).

Базовая иммуносупрессивная терапия в двух группах состояла из такролимуса (Програф или Адваграф). Стартовая доза составила 0,12 мг/кг массы тела в сутки. Преднизолон принимался всеми пациентами по 30 мг в сутки. С 14-го дня доза преднизолона снижалась по 2,5 мг в 3 дня до дозы 20 мг/сут к концу месяца. Микофенолаты (Селлсепт, Майсепт, Майфортик) назначались в стартовой дозе 1,5 г/сут и 1,08 г/сут соответственно. Метилпреднизолон (метипред) вводился в/в капельно по 0,25 г. во время операции, а также на 2 и 4 сутки после трансплантации, симулект - по 0,2 г. во время операции и на 4 сутки после операции. При развитии острого отторжения трансплантата, подтвержденного гистологическим исследованием биоптата почечного аллотрансплантата, больным проводилась пульс-терапия внутривенным введением метилпреднизолона по 250 мг в течение трех последовательных суток. При развитии острого гуморального отторжения у одного пациента контрольной группы помимо пульс - терапии метилпреднизолоном применялся ритуксимаб в дозе 650 мг, у другого -антитимоцитарный глобулин в дозе 4 мг на 1 кг массы тела.

В исследовании использован комплекс методов клинико-лабораторного обследования пациентов: общеклинические, биохимические, иммунологические, а также инструментальные методы обследования: УЗИ-исследование почечных аллотрансплантатов, включая допплерографию сосудов ПАТ, протокольное морфологическое исследование биоптатов трансплантированных почек, проводимое на 30-е и 180-е сутки после аллотрансплантации, а также при клинических признаках острого отторжения трансплантата. Гистологическое исследование биопсийного материала проводилось в ФГУ «ФНЦ ТИО им. академика В.И. Шумакова» (Е.С. Столяревич) в соответствии с классификацией острого отторжения трансплантата Банфф 2007 года. Иммунофенотипические исследования проводили в иммунологической лаборатории Московского городского центра СПИД Департамента здравоохранения города Москвы (Руководитель центра - д.м.н. Мазус

А.И., руководитель лабораторного отдела - Ольшанский А.Я.) методом проточной цитометрии с использованием проточных цитометров: Beckman Coulter «Cytomics FC 500». Предподготовка проводилась на автоматической станции TQ-prep. Для клинического анализа крови использовали гематологический анализатор Sysmex ICX-21. Помимо этого проводился многопараметровый (5-параметровый) проточно-цитофлюориметрический субпопуляционный анализ с использованием коммерческих моноклональных антител фирмы Beckman Coulter с реактогенной направленностью против дифференцировочных антигенов и маркеров активации: CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, HLA-DR, CD28, CD27 конъюгированных FITC, РЕ, ECD, РС5, и РС7. В качестве контроля применяли коммерческие сыворотки, содержащие изотипические антимышинные Ig, конъюгированные соответствующим флюорохромом. При анализе гистограмм оценивался уровень антиген-позитивных клеток (%) и интенсивность флюоресценции (MFI). По показателю MFI (ед.) судили о плотности присутствия соответствующего антигена, что косвенно отражает его функциональную активность. Результаты сравнивались с группой здоровых доноров и в процессе лечения. Статистический, регрессионный и корреляционный анализ иммунологических параметров проводился с использованием программы Statistica v.6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты иммунологических исследований. Динамика изменения активности молекулы коактивации CD28 на наивных хелперных Т-лимфоцитах, имеющих фенотип CD3+CD4+CD27+CD28+CD45RO-, у больных после трансплантации почки и у здоровых людей представлена в таблице 2. Исходные иммунологические параметры двух групп больных (основной и контрольной) объединялись.

Выявлено, что эта молекула представлена на поверхности практически всего пула наивных хелперных Т-лимфоцитов (96,6±3,23%). Однако плотность ее экспрессии подвержена значительной вариабельности, что отражается значением MFI (33,7±22,7). Это указывает на то, что в норме регуляция процессов активации зависит от степени выраженности CD28 на наивных лимфоцитах, отражающей функциональную активность этого рецептора.

Таблица 2.

Динамика изменения активности молекулы коактивации CD28 на наивных хелперных Т-лимфоцитах у больных после трансплантации почки и здоровых людей (М±ш).

№ Этап исследования % наивных хелперных Т-лимфоцитов, коэкспресирующих CD28 MFI CD28 (ед) (средняя интенсивность флюоресценции)

1 Здоровые (п=11) 96,6±3,23 33,7±22,7

2 Исходные значения на 4 сутки после АТТП (п=38) 57,7±18,2 22,7±6,0

3 30 сутки после АТТП, контрольная группа (п = 19) 52,7±23,2 19,6±7,0

4 30 сутки после АТТП, основная группа (п = 19) 34,5±11,4 16,8±5,1

В результате воздействия иммуносупрессивной терапии на 4-е сутки после трансплантации количество клеток, экспрессирующих коактивационные молекулы С1Э28, было почти в 2 раза меньше, чем в норме у здоровых людей (Рисунок 2). а) б)

Рисунок 2. а). Коэкспрессия CD28 на наивных CD4+ лимфоцитах на 4 сутки после трансплантации почки и стандартной иммуносупрессии в сравнении с нормой; б) MFI CD28 на наивных CD4+ лимфоцитах в норме и у реципиентов на 4 сутки после трансплантации почки и иммуносупрессии.

При этом плотность коэкспрессии их на наивных лимфоцитах уменьшалась пропорционально количеству этих клеток, что подтверждалось прямой достоверной корреляционной зависимостью MFI и процентом клеток, экспрессирующих эти маркеры (г = 0,58, р=0,01) (Рисунок 3).

Корреляционная зависимость между % лимфоцитов, экспрессирующих молекулу С D2S и MFI у больных на 4 сутки после Трансл+ИС Correlation:»= ,563:6

Рисунок 3. Корреляция между % лимфоцитов, экспрессирующих молекулу С028 и МИ на 4 сутки после назначения иммуносупрессии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что иммуносупрессивная терапия не обладает избирательным действием в отношении подавления активности 2-го коактивационного сигнального пути активации Т-клеточного рецептора.

Через 30 дней после трансплантации в контрольной группе больных не происходило существенного изменения как количества клеток, экспрессирующих молекулы коактивации (57,7±18,2% и 52,7±23,2% соответственно, р>0,05), так и плотности их коэкспрессии (22,7±6,0 ед. и 19,6±7,0 ед. соответственно, р>0,05) (Рисунок 4).

а) б)

С,™. поел, т^неппакгации Сртки поел. тра«спл.нт>ции

Рисунок 4. а) динамика коэкспрессии CD28 на наивных CD4+ лимфоцитах у реципиентов группы контроля в ближайшем посттрансплантационном периоде; б) динамика средней интенсивности флюоресценции (MFI) CD28 на наивных CD4+ лимфоцитах у реципиентов группы контроля в ближайшем посттрансплантационном периоде.

Значительная вариабельность этих показателей в течение первого месяца после трансплантации может свидетельствовать о разной степени чувствительности иммунных рецепторов к иммуносупресивным препаратам у разных пациентов.

В тоже время, в основной группе больных с включением в стандартный протокол иммуносупрессивной терапии курса ТКИ, было обнаружено выраженное и статистически достоверное уменьшение как количества клеток, экспрессирующих коактивационные рецепторы (с 57,7±18,2% до 34,5±11,4%, р<0,05), так и плотности этих рецепторов на наивных хелперных Т-лимфоцитах (с 22,7±6,0 ед. до 16,8±5,1 ед., р<0,05) (Рисунок 5). При этом видно, что вариабельность полученных результатов была значительно меньше, чем в группе контроля. Это может свидетельствовать об универсальности и большей чувствительности данного метода лечения в отношении ингибирования коактивационных молекул на наивных Т-лимфоцитах, которое в меньшей степени зависит от индивидуальных особенностей пациента. При анализе корреляционной зависимости плотности экспрессии CD28 от количества клеток, экспрессирующих этот маркер, была установлена между ними обратная корреляционная зависимость. На этом основании можно предположить, что данный метод лечения направлен, в первую очередь, на подавление синтеза (трансляции) этого гликопротеина, возможно на транскрипционном уровне кодирующего гена.

а) б)

О «5 2

22

•3 20

СО N

а 1в

о

d

= 16

Сутки после трансплактации

• С р«. I—I ±С. ОТИ1. ) tOunOca

т

т _L

Сутки после трансплантации

■ Сред. □ ±Ст. откл. Щ ±Ошибка

Рисунок 5. а) динамика коэкспрессии СБ28 на наивных СЭ4+ лимфоцитах у реципиентов основной группы в ближайшем посттрансплантационном периоде; б) динамика средней интенсивности флюоресценции (МИ) С028 на наивных С04+ лимфоцитах у реципиентов основной группы в ближайшем посттрансплантационном периоде.

При анализе экспрессии Т-клеточных линейных антигенов было установлено, что в результате медикаментозной иммуносупрессии на 4 сутки после трансплантации у всех пациентов отмечалось снижение общего количества Т-лимфоцитов, сокращение хелперной субпопуляции, в результате чего иммунорегуляторный индекс составлял в среднем 1,4 ед. Через 30 дней после начала иммуносупрессии (контрольная группа) происходило равномерное увеличение экспрессии как хелперной, так и супрессорной субпопуляции. В результате, иммунорегуляторный индекс практически не изменялся и составлял в среднем 1,5 ед. (Таблица 3).

Таблица 3.

Динамика экспрессии линейных Т-клеточных маркеров в посттрансплантационном периоде в двух группах больных (М+т)

№ Этап исследования % СЭЗ % СВ4 % СЭ8 ИРИ (ед)

1 Здоровые (п =11) 71,25±8,3 42,25±10,7 25,0±5,8 1,7

2 Исходные значения на 4 сутки после трансплантации и иммуносупрессии в обеих группах больных (п = 38) 66,7±7,7 37,5±8,5 26,4±10,1 1,4

3 30 сутки после трансплантации и иммуносупрессии (контрольная группа) (п = 18) 73,3±4,4 45,5±6,0 30,8±6,5 1,5

4 30 сутки после трансплантации, иммуносупрессии и ТКИ (основная группа) (п = 20) 75,3±5,2 57,0±5,1 21,5±2,4 2,6

В основной группе через 30 дней после трансплантации и включения в стандартный иммуносупрессивный протокол ТКИ наблюдалось статистически значимое увеличение экспрессии С04+ Т-лимфоцитов и снижение количества эффекторных цитолитических Т-клеток. При этом относительное количество эффекторных цитолитических Т-клеток в контрольной группе через 30 дней после трансплантации увеличилось на 17%, в то время как в основной группе, с дополнительным включением ТКИ, их количество уменьшилось на 18,6%. Таким

образом, разница экспрессии эффекторных цитолитических Т-лимфоцитов в двух группах составила 35,6%, а ИРИ возрос в среднем до 2,6 ед. (Рисунок 6 а, б).

Рисунок 6. Динамика экспрессии цитолитических эффекторных лимфоцитов (а) и хелперных лимфоцитов (б) в основной и контрольной группах больных

Полученные данные позволили сформировать концепцию иммунологической толерантности при использовании трансляционной клеточной иммунотерапии при трансплантации почки. Известно, что эффективная активация и пролиферация Т-лимфоцитов с выработкой в последующем Т-клеточных эффекторов в ответ на чужеродный антиген определяется, как минимум, двумя сигнальными путями. Первый сигнальный путь обеспечивается распознаванием антигенных пептидов, представленных в иммуногенной форме (в контексте с молекулами ГКГ) Т-клеточным рецепторам на наивных Т-лимфоцитах. Ключевыми регуляторами Т-клеточных ответов является второй - коактивационный сигнальный путь, реализующийся путем взаимодействия молекул коактивации семейства В-7 (CD80 и CD86) и CD40 на антигенпрезентирующих клетках, с соответствующими им лигандами - CD28 или CTLA-4 (CD 152) и CD40L (CD 154) на поверхности Т-лимфоцита. Молекула CD28 при этом является первичным Т-клеточным костимуляторным рецептором, стимулирующий эффект которой обеспечивает положительный сигнал, приводящий к полной активации и пролиферации Т-клеток, усилению продукции IL-2 и других цитокинов, в том числе и антиапоптотических,

предотвращая гибель Т-клеток. В отсутствие адекватной костимуляции Т-клеток (при снижении плотности экспрессии этого антигена на лимфоцитах или блокировании коактивационного пути специфическими антителами и др.) может развиваться энергическое состояние, при котором Т-клетки не способны пролиферировать и синтезировать цитокины. CD28 проявляет определенную степень структурной гомологии с другим В7-рецептором - CTLA-4, который также играет важную роль в процессе коактивации. Несмотря на то, что в активированных Т-клетках in vitro CTLA-4 экспрессирован лишь на уровне 2-3% от CD28, он связывает лиганды CD80 и CD86 с авидностью в 20 - 100 раз большей, чем CD28, действуя, таким образом, как конкурентный его ингибитор, ограничивая Т-клеточную активацию, и терминируя лимфоцитарный ответ. Взаимодействие CD28, CTLA-4 с их лигандами CD80 и CD86 в процессе костимуляции является основополагающим фактором в индукции и супрессии иммунных ответов. Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют охарактеризовать ТКИ как индуктор процессов толерантности к антигенам гистосовместимости донорского органа. Процедура не оказывает иммуносупрессирующего эффекта на выработку специфического противоинфекционного действия к респираторным вирусам и оппортунистическим инфекциям, что выгодно отличает ее от терапии только иммуносупрессивными препаратами, применяемыми в трансплантологии. Полученные имунологические данные подтверждаются динамикой клинической картины, результатами инструментальных методов исследования и данными биопсии трансплантированной почки в двух группах больных.

Оценка функции почечного трансплантата. Анализ клинических и лабораторных данных позволил выявить более раннее восстановление функции почечного трансплантата в основной группе по сравнению с контрольной у 5 пар реципиентов, о чем свидетельствует меньшая продолжительность олигоанурии, более уверенные темпы снижения цифр азотемии и меньшая длительность проведения заместительной почечной терапии у пациентов основной группы с применением ТКИ. Еще в двух парах пациентов не отмечено существенных отличий клинических и лабораторных результатов. В восьмой паре у пациента основной группы развился острый пиелонефрит трансплантата после удаления стента из мочеточника с техническими проблемами, что сделало сопоставление с группой

сравнения не корректным. Еще у двух пар реципиентов сравнить клинические результаты не представлялось возможным по причине трансплантэктомий, выполненных в ранние сроки после операции у пациентов группы сравнения в связи с не купируемым острым отторжением ПАТ и тромбозом почечной вены трансплантата, что, в целом, склоняет общий результат в пользу основной группы.

Так, восстановление диуреза в основной группе отмечено на 5,3±1,1 сутки, в группе сравнения - на 7,8±1,2 сутки после операции, нормализация азотемии наступила на 23±3,1 и 26,4±4,2 сутки соответственно, а необходимость в проведении заместительной почечной терапии сохранялась в основной группе в течении 10,6± 1,2 дней, в группе сравнения - в течении 14,6 ±2,4 дней. Необходимо отметить, что все пациенты основной группы выписаны после аллотрансплантации трупной почки в удовлетворительном состоянии и сохранили удовлетворительную функцию почечного аллотрансплантата в течение 6 месяцев после АТТП.

Наиболее отчетливые и достоверные отличия основной группы от контрольной отмечены через 6 месяцев после трансплантации. Так, скорость клубочковой фильтрации через 6 месяцев была выше в основной группе по сравнению с контрольной на 47,2%, а суточная протеинурия в группе сравнения к 180 суткам после трансплантации достигала 4,47 г/л, в то время, как в основной группе составляла 0,35 г/л. При этом в основной группе суточная протеинурия за 6 месяцев после трансплантации снизилась с 0,93 г/л до 0,35 г/л, а в группе сравнения оставалась неизменной (Таблица 4).

Таблица 4.

Лабораторные данные в двух группах больных на 30 - е и 180 - е сутки

после трансплантации почки (М+т)

Параметр Основная группа. М+т Контрольная группа, М+т Р

Мочевина крови, ммоль/л 30 сутки 16,2+0,6 14,4+0,4 >0,05

180 сутки 12,4+0,21 15,3+0,11 <0,05

Кретинин крови, ммоль/л 30 сутки 0,22+0,07 0,17+0,1 >0,05

180 сутки 0,15+0,02 0,08+0,01 <0,05

Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин 30 сутки 55,2+2,1 36,1+3,1 <0,05

180 сутки 59,7+3,2 31,5+4,1 <0,05

Суточная протеинурия, г/сут 30 сутки 0,93+0,24 0,92+0,18 >0,05

180 сутки 0,35+0,08 4,47+0,14 <0,05

Результаты биопсии почечного трансплантата. У 4 из 20 пациентов (20%), получавших только медикаментозную иммуносупрессию без ТКИ (контрольная группа), и которым в ранние сроки после АТТП была выполнена протокольная биопсия, диагностировано острое отторжение трансплантата, причем, у одного из них - III Banff стадии. Еще у одного пациента группы сравнения через 6 месяцев после АТТП при биопсии диагностирован фокально - сегментарный гломерулосклероз, а еще у двух больных - хроническая трансплантационная нефропатия (ХТН) 3 стадии (Таблица 5).

Таблица 5.

Результаты биопсии ПАТ у пациентов двух групп на 30 и 180 сутки

Диагностические категории Основная г| руппа Контрольная группа

30 сутки (п=19) 180 сутки (п=14) 30 сутки (п=16) 180 сутки (п=14)

Острый канальцевый некроз 8 0 3 0

IA Banff 0 0 1* 0

IB Banff 0 0 0 1*

IIA Banff 0 0 0 0

IIB Banff 0 0 1* 0

III Banff 0 0 1* 0

Локально—сегментарный ломерулосклероз 0 0 0 1*

ХТН 1-2 ст. 1 4 0 1

ХТН 3 ст. 0 0 0 2*

* - изменения, угрожавшие функциональному состоянию почечного трансплантата и потребовавшие дополнительной терапии

В свою очередь, ни у одного пациента из 20, которым выполнена протокольная биопсия ПАТ, получавших ТКИ, не диагностировано острое отторжение трансплантата, изменения в трансплантате соответствовали остаточным явлениям острого канальцевого некроза на 30 сутки после АТТП или начальным проявлениям хронической трансплантационной нефропатии 1 -2 стадии на 180 сутки после АТТП Инфекционные осложнения. Настоящее исследование сознательно проведено у больных, причиной развития ХБП5 у которых являлись урологические заболевания. Это обусловлено с одной стороны сформированной у пациентов ХПН урологической этиологии за долгие годы болезни толерантностью ко многим классам антибактериальных препаратов, с другой - высокой частотой устойчивости внебольничных штаммов микроорганизмов, вызывающих инфекционно-воспалительные заболевания мочевых путей, к широко применяемым препаратам.

На этом фоне применение иммуносупрессии, в том числе - ТКИ, могло сопровождаться тяжелыми гнойно-септическими и инфекционными осложнениями.

Предварительные результаты применения ТКИ, полученные у больных, страдавших хроническим гломерулонефритом, не выявили увеличения числа инфекционных осложнений. В этой связи настоящее исследование проведено у наиболее скомпрометированной группы больных, причиной ХБП5 у которых были урологические заболевания.

В результате анализа инфекционных осложнений в раннем посттрансплантационном периоде было установлено, что абсолютное большинство инфекционных событий относились к реципиентам контрольной группы (13 больных), и только у двух реципиентов основной группы - пиелонефрит трансплантата в раннем посттрансплантационном периоде. Необходимо отметить, что у одного из них была обнаружена бессимптомная бактериурия, как проявление основного заболевания: аномалия развития моче-половой системы. При КТ был выявлен двусторонний пассивный пузырно - мочеточниково - лоханочный рефлюкс. Выполнена билатеральная нефрэктомия. Второй случай пиелонефрита трансплантата в основной группе был обусловлен осложнениями, возникшими при цистоскопическом извлечении стента мочеточника.

В свою очередь в контрольной группе наблюдали 4 случая пиелонефрита. У одного пациента в связи с развитием мочевого затека на 3 сутки после АТТП и последующим некрозом мочеточника, реконструктивными оперативными вмешательствами, рецидивирующими пиелонефритами трансплантат был утерян.

В контрольной группе наибольшее количество инфекционных осложнений наблюдали со стороны дыхательной системы в виде пневмонии - в 6 наблюдениях. В одном случае у пациента контрольной группы диагностирована пневмония после введения антитимоцитарного глобулина для терапии криза отторжения ПАТ, из-за чего введение препарата пришлось отменить. У другого развитие пневмоцистной пневмонии закончилось летальным исходом. В основной группе легочные осложнения не наблюдались.

ЦМВ инфекция занимает особое место у реципиентов ренального алло-трансплантата, так как при несвоевременной диагностике с высокой вероятностью приводит не только к дисфункции трансплантата, но и к гибели пациента. ДНК ЦМВ

в сыворотке крови определялась с помощью качественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). У 20% реципиентов основной группы и группы контроля было выявлено присутствие в сыворотке крови ДНК ЦМВ. При этом, ни у одного из реципиентов основной группы не было выявлено клинических симптомов ЦМВ инфекции, которая протекала в виде бессимптомной виремии. У пациентов контрольной группы в посттрансплантационный период в 3 случаях наблюдалась репликация цитомегаловирусной инфекции, сопровождавшаяся клиническими проявлениями, потребовавшая стационарного лечения. В 2 случаях инфекция осложнилась дисфункцией трансплантата — гистологически выявлены пограничные изменения с лимфоцитарной инфильтрацией канальцев 5-6 лимфоцитами. Терапия включала внутривенный ганцикловир, Метипред, IУЮ. Еще У 1 больного имела место тяжелая панцитопения, ассоциированная с ЦМВ, потребовавшая отмены ми-кофеноловой кислоты и введения гранулоцитарно-макрофагального колони-естимулирующего фактора роста.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что ТКИ в раннем посттрансплантационном периоде после АТТП не только не увеличивает риск инфекционных осложнений, но и существенно уменьшает вероятность их развития. В связи с этим, данную процедуру можно рекомендовать больным с повышенным риском инфекционных осложнений, в частности пациентам с ХБП урологической этиологии.

ВЫВОДЫ

1. Трансляционная клеточная иммунотерапия является эффективным, патогенетически обоснованным и безопасным методом адьювантной иммунотерапии при трансплантации почки и не сопровождается увеличением числа инфекционных и других осложнений в раннем послеоперационном периоде после аплотрансплантации трупной почки у урологических больных.

2. Процедуру трансляционной клеточной иммунотерапии целесообразно проводить по модифицированной методике фотохимиотерапии в первые 2 недели после трансплантации почки с кратностью 2 раза в неделю, в последующие 2 недели - 1 раз в неделю, в течение 2-го месяца - 1 раз в 2 недели, 1 раз в течение 3-го месяца и однократно на 180 - е сутки после трансплантации почки.

3. Применение трансляционной клеточной иммунотерапии в раннем посттрансплантационном периоде сопровождается стабильной и с течением времени улучшающейся функцией почечного трансплантата. Скорость клубочковой фильтрации через 6 месяцев выше в основной группе по сравнению с контрольной на 47,2%, суточная протеинурия в группе сравнения к 180 суткам после трансплантации достигает 4,47 г/л, в то время, как в основной снижается до 0,35 г/л, что обусловлено отсутствием эпизодов острого отторжения почечного трансплантата в основной группе.

4. Анализ биопсийного материала свидетельствует, что трансляционная клеточная иммунотерапия является эффективной методикой предупреждения острого отторжения почечного аллотрансплантата. У 31,2% пациентов контрольной группы при протокольной биопсии диагностировано острое отторжение трансплантата. В свою очередь, у пациентов основной группы изменения в трансплантате соответствовали остаточным явлениям острого канальцевого некроза на 30 сутки после АТТП или начальным проявлениям хронической трансплантационной нефропатии 1 - 2 стадии на 180 сутки после трансплантации почки.

5. Применение трансляционной клеточной иммунотерапии приводит к достоверному уменьшению как количества клеток, экспрессирующих коактивационные рецепторы CD28 (с 57,7±18,2% до 34,5±11,4%, р<0,05), так и плотности этих рецепторов на наивных хелперных Т-лимфоцитах (с 22,7±6,0 ед. до

16,8±5,1 ед., р<0,05), увеличению числа эффекторных цитолитических Т-лимфоцитов в контрольной группе на 17%, и снижению их количества на 18,6 % в основной группе, что позволяет рассматривать метод как индуктор процессов толерантности к антигенам гистосовместимости донорского органа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Трансляционная клеточная иммунотерапия является адъювантным методом в комплексе медикаментозной иммуносупрессии. Применение трансляционной клеточной иммунотерапии для предупреждения и лечения кризов отторжения почечного аллотрансплантата не должно исключать полного комплекса лечебных мероприятий, применяемых в общепринятой клинической практике.

2. С целью профилактики кризов отторжения почечного аллотрансплантата процедуру трансляционной клеточной иммунотерапии целесообразно проводить по модифицированной методике фотохимиотерапии в первые 2 недели после трансплантации почки с кратностью 2 раза в неделю, в последующие 2 недели - 1 раз в неделю, в течение 2-го месяца - 1 раз в 2 недели, 1 раз в течение 3-го месяца и однократно на 180-е сутки после трансплантации почки.

3. Для оценки эффективности трансляционной клеточной иммунотерапии целесообразно выполнять протокольную биопсию почечного аллотрансплантата на 30-е и 180-е сутки после операции. Показаниями к биопсии почечного аллотранспланта являются также все случаи подозрения на криз отторжения в любые сроки после трансплантации, а также необходимость контроля эффективности противокризовой терапии.

4. Прямым подтверждением эффективности трансляционной клеточной иммунотерапии является уменьшение как количества клеток, экспрессирующих коактивационные рецепторы CD28, так и плотности этих рецепторов на наивных хелперных Т-лимфоцитах, снижение количества эффекторных цитолитических Т-лимфоцитов, а также увеличение ИРИ (отношение CD4 к CD8).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ватазин A.B., Кильдюшевский A.B., Федулкина В.А. и др. / Первый опыт применения трансляционной клеточной иммунотерапии при аллогенной трансплантации почек. // Тезисы докладов научно - практической конференции ЦФО РФ «Актуальные вопросы нефрологии, диализа, хирургической гемокоррекции и гемафереза». -Москва. -2011. - С.39-40.

2. Ватазин A.B., Кантария P.O., Зулькарнаев А.Б. и др. / Эффект посттрансплантационной каскадной плазмофильтрации у реципиентов ренального аллотрансплантата с высоким иммунологическим риском. // Тезисы докладов VII конференции Российского диализного общества. -Москва. -2011. -С.330-331.

3. Ватазин A.B., Зулькарнаев А.Б., Крстич М. и др. / Методики экстракорпоральной гемокоррекции в лечении осложнений после трансплантации почки - ишемическое/реперфузионное повреждение, отторжение трансплантата // Альманах клинической медицины. - 2012. - № 26. - С. 81-87.

4. Ватазин A.B., Кильдюшевский A.B., Зулькарнаев А.Б. и др. / Трансляционная клеточная иммунотерапия при трансплантации почки. // Материалы IX международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения».-Астрахань. - 2013. - С.50-51.

5. Ватазин A.B., Дутов В.В., Зулькарнаев А.Б., Федулкина В.А. и др. / Инфекционные осложнения после трансплантации почки // Урология. - 2013. - №3. -С.107-110.

6. Ватазин A.B., Круглое Е.Е., Астахов П.В., Зулькарнаев А.Б. и др. / Бактериальные инфекции и долгосрочные результаты трансплантации почки. // Нефрология. - 2013. - Т. 17. - № 2. - С. 75-78.

7. Ватазин A.B., Астахов П.В., Зулькарнаев А.Б. и др. / Методы экстракорпоральной гемокоррекции в комплексном лечении бактериальных и вирусных инфекций после трансплантации почки // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С.72 - 78.

8. Ватазин A.B., Зулькарнаев А.Б., Астахов П.В., Федулкина В.А. / Хроническая почечная недостаточность - социально-эпидемиологические аспекты // Общественное здоровье и здравоохранение. - 2013. - № 3. - С.4-9.

9. Федулкина В.А., Ватазин A.B., Кильдюшевский A.B. и др. / Трансляционная клеточная иммунотерапия при аллотрансплантации трупной почки у урологических больных //Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С.25-31.

10. Ватазин A.B., Кильдюшевский A.B., Федулкина В.А. и др. / Трансляционная клеточная иммунотерапия при трансплантации почки // Учебное пособие - Москва. -2013.-16 с.

ИЗОБРЕТЕНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Кильдюшевский A.B., Ватазин A.B., Федулкина В.А. и др. / Способ профилактики и лечения отторжения почечного трансплантата // Решение о выдаче патента РФ на изобретение от 24.10.2013 по заявке № 2013107727 от 21.02.2013.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АТТП - аллотрансплантация трупной почки

ПАТ - почечный аллотрансплантат

ХБП - хроническая болезнь почек

ТКИ - трансляционная клеточная иммунотерапия

ИС - иммуносупрессия

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости

ХТН - хроническая трансплантационная нефропатия

ЦМВ - цитомегаловирусная инфекция

HLA - гены тканевой совместимости

MFI - интенсивность флюоресценции

CD - кластер дифференцировки

IL - интерлейкин

CTLA4 - цитотоксический т-лимфоцитарный антиген 4

На правах рукописи

Федулкина Вероника Андреевна

ТРАНСЛЯЦИОННАЯ КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТРУПНОЙ ПОЧКИ У УРОЛОГИЧЕСКИХ

БОЛЬНЫХ

14.01.23 - урология 14.01.24 - трансплантология и искусственные органы

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2013

Подписано в печать 13.11.2013. Формат 60 х 90 /16. Гарнитура «Times». Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 42251

Отпечатано в типографии «Onebook.ru» ООО «Сам Полиграфист» 129090 г. Москва, Протопоповский переулок д.6 E-mail: info@onebook.ru Сайт: www.onebook.ru