Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Трансгенные Т-клеточные рецепторы в противоопухолевом иммунном ответе

На правах рукописи

Силаева Юлия Юрьевна

ТРАНСГЕННЫЕ Т-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ

14.01.12— Онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

гтшгщ

Москва — 2014

005546508

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор — академик РАН и РАМН, профессор М. И. Давыдов Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Казанский Дмитрий Борисович

Официальные оппоненты:

Якубовская Раиса Ивановна

Купраш Дмитрий Владимирович

доктор биологических наук, профессор, ФГУП «Московский научно-

исследовательский онкологический институт имени П. А. Герцена» МЗ РФ, руководитель отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии

доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгарта Российской Академии Наук,

заведующий лабораторией передачи внутриклеточных сигналов в норме и патологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 2-i » d^e^ 2014 г. в « /Оу> часов на заседании диссертационного совета Д001.017.02 ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Автореферат разослан« ^ » ск^ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одной из важных функций системы приобретенного иммунитета является осуществление иммунологического надзора, то есть своевременное распознание и уничтожение иммуногенных вариантов злокачественно трансформированных клеток, возникающих в организме человека и животных. Основная роль в осуществлении иммунологического надзора принадлежит Т-лимфоцитам. Способность осуществлять иммунологический надзор прежде всего определяется широтой репертуара Т-лимфоцитов CD8+ и специфичностью Т-клеточных рецепторов отдельных клонов. Кроме того, по всей видимости, способность к осуществлению иммунологического надзора может определяться функциональным состоянием Т-лимфоцита. Известно, что в организме одновременно присутствуют Т-лимфоциты, находящиеся в различных функциональных состояниях. Наивные Т-клетки CD8+ не активированы и могут циркулировать только через лимфоидные ткани. После активации наивные Т-клётки CD8+ превращаются в эффекторные CTL, способные проникать в нелимфоидные ткани и убивать клетки-мишени, несущие специфический антиген. Большая часть эффекторных Т-лимфоцитов погибает во время фазы завершения иммунного ответа, но небольшая часть становится клетками памяти. Одной из основных особенностей клеток памяти является то, что, однажды образовавшись, они циркулируют в организме длительное время, ожидая встречи со специфическим антигеном. Вторичный иммунный ответ, определяемый клетками памяти, имеет ряд особенностей, отличающих его от первичного иммунного ответа: более быстрая активация и пролиферация клеток памяти, вследствие этого быстрая элиминация антигенов, относительная независимость клеток Памяти от костимуляции. Именно на этих свойствах иммунологической памяти основаны все- методы вакцинации, известные на сегодняшний момент Тем не менее, не существует четких и однозначных критериев, по которым ту или иную популяцию Т-лимфоцитов можно отнести к клеткам памяти.

Существуют два подхода к проблеме идентификации Т-клеток памяти: первый подход направлен на исследование функциональных особенностей Т-клеток памяти, второй подход основывается на определении их специфических поверхностных маркеров. Идентификация пула Т-клеток памяти на основании экспрессии ряда поверхностных маркеров широко используется, но не всегда она коррелирует с функциональными характеристиками Т-клеток. Например, в условиях лимфопении наивные Т-лимфоциты приобретают поверхностный фенотип клеток памяти, что не всегда однозначно коррелирует с их функциональными

характеристиками. Более того, в условиях лимфопении может формироваться популяция CD8+ Т-клеток с поверхностным фенотипом, характерным для клеток памяти, подавляющая противоопухолевый иммунный ответ. Таким образом, механизмы приобретения Т-клегкой того или иного поверхностного фенотипа и его взаимосвязь с функциональными характеристиками Т-лимфоцита остаются неясными. Между тем, исследование этих вопросов важно для верификации и определения граяиц применимости диагностических тестов, выявляющих клетки памяти методом проточной цитофлуориметрии в клинике, а также для создания новых методов иммунотерапии опухолей.

Цель исследования

Изучение взаимосвязи между поверхностным фенотипом популяции CD8+ Т-лимфоцитов и их функциональными характеристиками.

Задачи исследования

1. Изучить взаимосвязь акгивационного поверхностного фенотипа CD8+ Т-лимфоцитов и их функциональных особенностей в условиях лимфопении.

2. Получить первичных трансгенных животных, • Т-лимфоциты которых экспрессируют р-цепь Т-клегочного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, на генетической основе гибридной линии (СВАХ C57BL/6)Fi.

3. Получить чистые линии трансгенных животных на генетической основе линии B10.D2(R101) и гибридов F, (B10.D2(R101) X C57BL/10).

4. Оценить влияние экспрессии трансгенной (3-цепи TCR на процессы развития Т-клеток в тимусе.

5. Охарактеризовать поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных животных.

6. Оценить поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных животных в условиях лимфопении.

7. Охарактеризовать функции Т-лимфоцитов трансгенных животных in vitro и in vivo.

Научная новизна исследования

Взаимосвязь поверхностного акгивационного фенотипа с функциональными характеристиками популяций Т-лимфоцитов в условиях лимфопении впервые исследована с помощью экспериментальной системы, позволяющей селективно вызвать иммунный ответ аллоспецифичных Т-клеток памяти. Впервые установлено, что появление функциональных

свойств антигенспецифических клеток памяти возможно лишь после первичного контакта с антигеном. Впервые получены и охарактеризованы линии трансгенных животных, Т-лимфоциты которых экспрессируют Р-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти CD8+. Разработана новая модель иммунной селекции опухолевых клеток с использованием животных, трансгенных по р-цепи Т-клеточного рецептора.

Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическое значение работы состоит в обнаружении и детализации механизмов, управляющих формированием поверхностного акгивационного фенотипа Т-лимфоцитов. Показана особая важность разнообразия репертуара Т-лимфоцитов для эффективного развития реакций трансплантационного и противоопухолевого иммунитета. Получена принципиально новая модель иммунодефицита, который возникает вследствие генетического воздействия, ограничивающего разнообразие рецепторов Т-лимфоцитов. Практическое значение работы определяется тем, что она выявила неоднозначность оценки поверхностного фенотипа CD8+ Т-лимфоцитов как критерия принадлежности Т-клетки к популяции клеток памяти. Разработанная модель иммунной селекции опухолевых клеток может быть использована для скрининга и оценки биологической активности новых противоопухолевых препаратов и стимуляторов противоопухолевого иммунитета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для появления функциональных свойств антигенспецифических клеток памяти необходим первичный контакт с антигеном.

2. Получены и охарактеризованы две независимые линии мышей, трансгенных по р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 на генетической основе линии B10.D2(R101).

3. Экспрессия трансгена Р-цепи Т-клеточного рецептора изменяет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме.

4. Т-лимфоциты CD8+ линии lDlbFF, экспрессирующие трансгенную р-цепь Т-клеточного рецептора, приобретают поверхностный фенотип активированных клеток в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением.

5. Уровень аллогенного иммунного ответа in vitro у мышей трансгенной линии lDlbFM заметно снижен по сравнению с мышами дикого типа.

6. Иммунный ответ Т-лимфоцитов трансгенных животных in vivo недостаточен для эффективного отторжения аллогенной опухоли: мыши линии lDlbFM на

генетической основе В10.02(Я101) погибают через 40-60 дней после введения клеток тимомы ЕЬ-4.

7. Иммунный ответ лимфоцитов мышей трансгенной линии Ш1ЬБМ на генетической основе В10.02(11101) на клетки тимомы ЕЬ-4 вызывает потерю экспрессии молекулы Кь МНС I класса клетками тимомы.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 10 октября 2013 года на объединенной конференции лаборатории механизмов регуляции иммунитета, лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток и лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 сообщений на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 175 источников, из которых 4 отечественных и 171 иностранных. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 4 таблицами.

Материалы и методы исследования Животные. В работе были использованы линии мыщей С57В1У6 (Кь1-АьОь), С57В1Л0 (Кь1-АьОь), В10Х>2(Д101) (КЛ-А^-Е^), БУВ (КЧ-АЧ-ЕЧ)4), С57В1У6-Т£М(АСТЬЕОРР) ЮэЬ (КЬ1-АЬБЬ) (далее С57ВШ.ОРР) и В10.О2(1Ш1Н8И(АСТЬЕОРР)1О5Ъ (КЛ-АТ-Е^) (далее - ВЮ.В2(Ш01).ОРР) разведения вивария Российского Онкологического Научного Центра РАМН, гибриды р1(СВА X С57В176) (питомник «Столбовая»). Мыши, трансгенные * -цепи Т-клеточного рецептора гибридов клеток памяти Ш1 были получены и под держивались в лаборатории механизмов регуляции иммунитета ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Клеточные линии. В работе были использованы клетки тимомы ЕЬ4 (КЬБЬ) и мастоцитомы Р815(К"П").

Трансгенные животные были получены методом микроинъекции раствора ДНК в

пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Наличие трансгена в геноме подтверждали методом ПЦР. Для оценки количества периферических Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансген, мононуклеары периферической крови трансгенных животных окрашивали моноклональными флуоресцентно мечеными антителами к вариабельному участку Р-цепи Т-клеточного рецептора VP6 и анализировали на проточном цитофлуориметре. Для получения чистых линий трансгенных животных на генетической основе линии B10.D2(R101) было проведено не менее 7 возвратных скрещиваний с мышами линии B10.D2(R101). Иммунизацию мышей проводили, вводя внутрибрюшинно каждому животному линии B10.D2(R101) 1 мл клеточной суспензии тимомы EL-4 (конентрация 2 х 107 клеток/мл) или внутрибрюшинно каждому животному линии C57BL/6.GFP 1 мл клеточной суспензии мастоцитомы Р815 в PBS (концентрация 2 х 107 клеток/мл). Контрольной группе мышей вводили внутрибрюшинно 1мл lx PBS (ПанЭко, Россия). Через 2 месяца после иммунизации спленоциты этих мышей, облученных или интакгных, использовали в экспериментах как источник долгоживущих клеток памяти.

Иммунизацию мышей трансгенной линии lDlbFM тимомой EL-4 проводили также, как описано выше.

Облучение мышей. Самок мышей линий B10.D2(R101), C57BL/6 и lDlbFF, интакгиых или предварительно иммунизированных как описано' выше, облучали в дозе 4,5 Gy при помощи терапевтического аппарата "Агат-Р" (Россия), содержащего источник гамма-излучения Со60 с начальной мощностью 1,9x10м Бк.

Адоптивный перенос. Интактных мышей линии B10.D2(R101) или C57BL/6 облучали в дозе 4,5 Gy как описано выше, затем через 24 часа им вводили внутривенно спленоциты от интакгных или иммунных животных в количестве 1,5х107. Через 10 дней спленоциты мышей-реципиентов использовали для окраски флуоресцентно мечеными антителами, а также в MLR в качестве отвечающих клеток.

Оценка уровня аллогенного ответа in vitro. Способность Т-лимфоцитов трансгенных и облученных животных к аллогенному иммунному ответу in vitro оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR).

Оценка уровня противоопухолевого иммунного ответа in vivo. Через 12 дней после иммунизации выделяли клетки селезенки у интакгных и иммунизированных животных, окрашивали флуоресцентно мечеными антителами к корецепторам и поверхностным активационным маркерам и анализировали соотношение различных субпопуляций Т-клеток на проточном цитофлуориметре.

Цитотоксическин тест. Клеточные суспензии, содержащие цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), и аллогенные клетки-мишени, полученные в реакции бласттрансформации, смешивали в соотношениях: 100:1, 50:1, 20:1 и 10:1. В качестве контроля CTL смешивали аналогично с сингенными клетками-мишенями. Клетки инкубировали 4 часа в полной ростовой среде при 37"С, 5% ССЪ и 100% влажности и затем анализировали содержание в суспензии живых GFP+ клеток методом проточной цитофлуориметрии.

Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре. Окрашивание антителами проводили при 4°С в течение 30-50 мин. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto П (Becton Dickinson, USA) с использованием программы BD FACSDiva 6.0. Погибшие клетки исключали из анализа по окрашиванию PI (в ряде экспериментов - 7AAD ) и по показателям рассеивания. Анализировали не менее 100 тыс. событий для характеристики популяций Т-лимфоцитов в периферической крови трансгенных животных, не менее 1 млн. событий для характеристики популяций Т-лимфоцитов в тимусе и не менее 3 млн. событий для характеристики акгивационного поверхностного фенотипа популяций периферических Т-лимфоцитов. Для анализа результатов использовали программу FlowJo 7.6.

Методы статистической обработки данных

Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-теста Стьюдента в программе Excel (Microsoft, USA). Различия признавались значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Функциональная активность Т-клеток памяти в условиях лимфопении, вызванной

сублетальным облучением

Для исследования взаимосвязи поверхностного активационного фенотипа и функциональной активности CD8+ Т-клеток мы сравнивали функциональные свойства спленоцитов двух групп сублегально облученных животных: в одну из трупп входили неиммунизированные животные, а в другую — животные, иммунизированные клетками аллогенной опухоли за два месяца до облучения. Мы исследовали также функциональную активность спленоцитов сублетально облученных мышей, которым были адоптивно перенесены сингенные спленоциты от интактных или предварительно иммунизированных животных.

В результате сублетального облучения большая часть CD8+ Т-лимфоцитов как интактных,

так и предварительно иммунизированных животных погибает, а оставшаяся часть приобретает поверхностный фенотип активированных Т-клеток. Способность спленоцитов осуществлять первичный и вторичный ответ in vitro оценивали в MLR с использованием сингенных (B10.D2(R101), аллогенных специфических (C57BL/6 (Н-2Ь)) и аллогенных сторонних (FVB (Н-24)) стимуляторов. Для оценки первичного иммунного ответа стимуляторы обрабатывали митомицином С, а вторичный иммунный ответ оценивали по способности Т-лимфоцитов отвечать на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку (прогревание в течение 1 часа при температуре 45° С).

Способность Т-лимфоцитов селезенки отвечать на аллогенные стимуляторы, обработанные митомицином С, сохраняется после сублетального облучения интактных и иммунных животных. Однако, несмотря на практически одинаковое соотношение клеток с поверхностным фенотипом активированных и наивных Т-лимфоцитов в селезенке интактных и иммунных животных, антигенспецифический ответ клеток памяти (способность отвечать на специфические стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку) имеет место только у предварительно иммунизированных животных (рис. 1). Для исследования функциональных свойств Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти, образовавшихся в процессе гомеостатической пролиферации, мы адоптивно перенесли сублетально облученным животным линии B10.D2(R101) сингенные клетки селезенки интактных и предварительно иммунизированных мышей. Через 10 дней после адоптивного переноса мы оценивали способность спленоцитов этих мышей отвечать в MLR на аллогенные стимуляторы, обработанные митомицином С, или подвергнутые острому тепловому шоку. Независимо от того, были адоптивно перенесены сингенные спленоциты интактных или предварительно иммунизированных животных, первичный и вторичный иммунный ответ in vitro практически отсутствует (рис. 2).

Соотношение CD4+ и CD8* Т-клеток в селезенке сублетально облученных мышей после адоптивного переноса не отличалось от такового у интактных животных, поэтому отсутствие первичного иммунного ответа не может объясняться недостаточностью одной из популяций. При исследовании поверхностного активационного фенотипа Т-клеток донора и реципиента оказалось, что среди CD8+ Т-клеток донора практически все клетки приобрели поверхностный фенотип активированных Т-клеток (CD44+). Соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов CD8+ с различными профилями экспрессии активационных маркеров не изменялось вне зависимости от того, были перенесены клетки интактных или предварительно иммунизированных животных.

Поскольку существуют данные о наличии киллерной активности у клеток с поверхностным фенотипом Т-клеток памяти, мы оценили цитотоксическую активность спленоцитов сублетально облученных мышей-реципиентов, которым были адоптивно перенесены клетки селезенки мышей-доноров (интактных или предварительно иммунизированных) линии ВКШ2(Ш01). В качестве контроля использовали спленоциты интактных и иммунных мышей линии В 1(Ш2(Ш01). Оказалось, что в используемой нами экспериментальной системе спленоциты донора и реципиента специфической киллерной активностью не обладают.

П R101 MitC ER101t°C HBLIOMitC ■ BL10 t°C Ш FVB MitC □ FVBt°C

60000,0 55000,0 50000,0 45000,0 40000,0 35000,0 £ 30000,0 - Г ° 25000,0 20000,0 15000,0 10000,0 5000,0 0,0

Riol int

R101 imm

R101 int rad

R101 irnnrad

Рисунок 1. Аллогенный иммунный ответ клеток селезенки сублетально облученных животных in vitro. Пролиферация смешанной культуры лимфоцитов интактных и иммунных мышей линии B10.D2(R101) через 10 дней после сублетального облучения в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С (MitC) или подвегрнутые острому тепловому шоку (t"). В качестве отвечающей популяции были использованы интактные (R101 int) или иммунные (R101 imm) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101), а также интакгные (RIO int rad) или иммунные (R101 imm rad) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101) через 3 и 10 дней после сублетального облучения. В качестве стимулирующей популяции были использованы спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (KdDd), обработанные митомицином С (R101 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (45'С в течение часа) (R101 t°C); спленоциты мышей линии C57BL/10 (KbDb), обработанные митомицином С (BL10 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (BL10 t°C); спленоциты мышей линии FVB (Н-2"), обработанные митомицином С (FVB MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (FVB t°C) Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. Значимость отличия данных определяли с использованием t-теста Стьюдента (*р<0.05). На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех.

Использование двух разных экспериментальных моделей индукции Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти СБ44+ привело к получению различных результатов. Сублетальное облучение интактных животных приводит к увеличению доли Т-

клеток с активационным фенотипом, но эти клетки не обладают функциями клеток памяти. Таким образом, акгивационный фенотип, приобретаемый Т-лимфоцитами в условиях лимфопении, не коррелирует с функциональной активностью истинных антигенспецифических клеток памяти. Облучение иммунизированных животных не приводит к подавлению функциональной активности клеток памяти, что может объясняться их радиорезистентностью. Вместе с тем мы выяснили, что в результате адоптивного переноса спленоцитов интактных и иммунизированных животных сингенным сублетально облученным мышам формируется популяция CD8+CD44+ Т-лимфоцитов, которая не способна осуществлять аллогенный иммунный ответ in vitro.

□ Riol mite BRlOlfC с: BLIO rratC HBL10t°C CJ FVB rnrcC CI FVB t°C *

16000,0 |-;--1

14000,0 T [IT

12000,0

10000,0

E 8000,0 p.

6000,0 4000,0 2000,0 0,0

R101 ¡nt R101 ¡mm R101 rad int adopt trans R101 rad immadopt trans

Рисунок 2. Аллогенный иммунный ответ клеток селезенки сублетально облученных животных после адоптивного переноса.

Пролиферация смешанной культуры спленоцитов сублетально облученных мышей линии B10.D2(R]01) через 10 дней после того, как им были адоптино перенесены сингенные интактные или иммунные спленоциты, в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С (MitC) или подвегрнутые острому тепловому шоку (f). В качестве отвечающей популяции были использованы интактные (R101 int) или иммунные (R101 imm) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101), а также спленоциты сублетально облученных мышей, которым были адоптивно перенесены интактные (RIO rad int adopt trans) или иммунные (R101 rad imm adopt trans) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101). В качестве стимулирующей популяции были использованы спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (KdDJ), обработанные митомицином С (R10X MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (45°С в течение часа) (R10I t°C); спленоциты мышей линии C57BL/10 (KbDh), обработанные митомицином С (BLIO MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (BL10 t'C); спленоциты мышей линии FVB (Н-2Ч), обработанные митомицином С (FVB MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (FVB t"C) Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. Значимость отличия данных определяли с использованием t-теста Стьюдента (*р<0.05). На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех.

Создание первичных трансгенов по Р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 и получение трансгенных линий lDlbFM и lDlbFF на генетической основе

линии B10.D2(R101)

При исследовании пролиферативного ответа Т-клеток памяти в состоянии лимфопении мы показали, что профиль экспрессии поверхностных активационных маркеров не коррелирует не только с ответами клеток памяти, но и со способностью Т-лимфоцитов к аллогенному иммунному ответу in vitro. Мы предположили, что структура Т-клеточного рецептора является главным фактором, определяющим судьбу и функциональные свойства индивидуального клона Т-лимфоцитов. Для проверки этой гипотезы были получены два первичных трансгена по р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1. Наличие трансгена в геноме было подтверждено методом ПЦР. Наличие в организме трансгенных животных Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансгенную р-цепь, было подтверждено с помощью окрашивания мононуклеаров периферической крови моноклональными флуоресцентно мечеными антителами к семейству VP6 вариабельного сегмента Р-цепи TCR (рис. 3).

б

C57BU10

1D1Ь tg №1

<91*

— —■ — — Рг

IF1 2F1 Sri 1 2 spl IDlb

Чй» м pr tg

1F1 2F1 3F1 1 2 spt IDlb

1D1b tg №2

40О- л -

1 CD3+Vb6+ 5"

1 5.93% 305-

:1 L

Рисунок 3. Получение первичных трансгенов по р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти Ш1.

а — Анализ ПЦР-продукта ДНК мышей, рожденных после микроинъекции полноразмерной кДНК р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы Ш1, клонированной в экспрессионный вектор ЪСТ>2, и мышей первого поколения р! трансгенной линии Ш1ЬРМ. Рг — праймеры к гену СЕМ; Рг tg - праймеры к гену Р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы Ш1; №1, 2И, ЗР1 - ДНК-матрица мьппей поколения Р, трансгенной линии Ш1ЬРМ №1, №2 и №3, соответственно; 1,2 — ДНК-матрица первичных трансгенов Ш1Ь №1 и №2; $р1 - ДНК-матрица мыши линии С57ВЬ/6 (негативный контроль); Ш1Ь — ДНК-матрица экспрессионного вектора ЬСБ2, содержащего полноразмерную кДНК р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы Ш1 (позитивный контроль), б — Цитофлуориметрнческий анализ количества СБЗ+ лимфоцитов (верхняя панель) и экспрессии р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти Ш1 (нижняя панель) в периферической крови первичных трансгенов Ш1Ь. С57ВЬ/10 — клетки периферической крови мыши линии С57в£/10; Ш1Ь tg№l — клетки периферической крови первичного трансгена Ш1Ь № 1; 1ШЬ tg№2 — клетки периферической крови

первичного трансгена lDlb№2.

Рисунок 4. Экспрессия трансгенной [3-цепи TCR CD3+ лимфоцитами мышей трансгенной линии lDlbFM поколения F? и Fs.

Относительное количество CD3+ лимфоцитов (а) и экспрессия р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 (б) в периферической крови трансгенов lDlbFM поколений F2, F, и Fs. RX01 — клетки периферической крови мыши линии B10.D2(R101) (n=7); lDlbFM F2' — клетки периферической крови трансгена 1D1FM F2 (n=6); lDlbFM F7-F8 — клетки периферической крови трансгенных мышей lDlbFM F, и F, (п=25).

Оба первичных трансгена были использованы в качестве основателей линии: сублиния lDlb, ведущая начало от первичного трансгена №1 получила название lDlbFM, сублиния, основателем которой стал первичный трансген №2 -lDlbFF.

Для получения чистых линий трансгенных животных на генетической основе линии B10/D2(R101) мы провели не менее 7 возвратных скрещиваний с мышами этой линии. В каждом поколении выявляли животных, у которых максимальное количество лимфоцитов экспрессирует трансген Р-цепи TCR. В поколении F7 мышей обеих трансгенных линий 7080% периферических Т-лимфоцитов экспрессируют трансгенную р-цепь; общее количество CD3+ клеток в периферической крови мышей обеих трансгенных линий не изменено по сравнению с контролем (рис. 4). Мы не обнаружили изменений клеточности лимфоидных органов у трансгенных животных линий lDlbFM и lDlbFF по сравнению с животными дикого типа. Продолжительность жизни животных обеих трансгенных линий не отличается от продолжительности жизни мышей дикого типа.

Таким образом, мы получили две независимые сублинии мышей, трансгенных по Р~ цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, на генетической основе линии B10.D2(R101): lDlbFM и lDlbFF. Обе линии характеризуются стабильной тканеспецифической экспрессией трансгена.

Развитие и поддержание гомеостаза СШ+ лимфоцитов мышей трансгенных линий

lDlbFM и lDlbFF

Экспрессия трансгенных а- и Р-цепей TCR может влиять на прохождение Т-клеткой внутритимусной селекции и, соответственно, на периферический репертуар Т-клеток. В нашем исследовании прежде всего необходимо было оценить, вызывает ли экспрессия трансгенной р-цепи TCR клеток памяти какие-либо нарушения в онтогенезе CD3+ Т-лимфоцитов; существует ли предпочтительная линия дифференцировки (CD4+ или CD8+) трансгенных клеток; сопровождается ли экспрессия p-трансгена изменением соотношения популяций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах; изменяется ли поверхностный активационный фенотип Т-клеток под влиянием экспрессии Р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти. Все эксперименты были проведены на двух независимых трансгенньк сублиниях (lDlbFM и lDlbFF) для исключения возможных сторонних эффектов трансгенеза на процессы онтогенеза Т-клеток.

Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенных линий lDlbFM и lDlbFF. В

тимусе мышей трансгенных линии lDlbFM и lDlbFF соотношение двойных негативных CD4-CD8" (DN), двойных позитивных CD4+CD8+ (DP) и одаопозитавных CD4+CD8~ и CD4 ~CD8+ (SP) тимоцитов не изменено по сравнению с мышами линии B10.D2(R101). Соотношение CD4+ и CD8+ тимоцитов у трансгенных животных не нарушено, что означает отсутствие предпочтительной линии дифференцировки трансгенных клеток. Появление трансгенной Р-цепи на поверхности тимоцитов коррелирует со стадиями их созревания. Среди двойных негативных тимоцитов практически нет клеток, окрашивающихся антителами к \ф6. На стадии DP доля клеток, несущих трансгенную Р-цепь, значительно возрастает. Большая часть однопозитивных CD4+ и CD8+ тимоцитов экспрессирует трансген Р-цепи и несет на поверхности его продукт, что, по-видимому, связано с тем, что эспрессия трансгенной Р-цепи TCR подавляет реаранжировку эндогенных цепей. Кроме того, экспрессия трансгенной Р-цепи TCR в значительной степени подавляет реаранжировку цепей, входящих в состав TCRy/5. Тем не менее, около 20% Т-клеток успевают реаранжировать собственную эндогенную р-цепь и не экспрессируют трансген. Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-клеток мышей трансгенных линий lDlbFM и lDlbFF. Соотношение субпопуляций спленоцитов CD4+ и CD8+ не изменено у животных трансгенных линий lDlbFM и lDlbFF по сравнению с животными дикого типа (рис. 5, а). Трансген экспрессируют обе субпопуляции CD34" спленоцитов (рис. 5, б, в). Таким образом, CD4+ и CD8+ клетки, экспрессирующие трансген Р-цепи Т-рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, не только проходят тимусную селекцию, но и успешно рециркулируют на

периферии.

1D1bFF

Рисунок 5. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии lDlbFF. а — цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 одиночными живыми клетками селезенки мышей трансгенной линии lDlbFF на генетической основе линии B10.D2(R101).

б, в — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 CD44" (б) и CD8* (в) спленоцитами мышей трансгенной линии lDlbFF на генетической основе линии B10.D2(R101). B10.D2(R101)— сппеноциты линии B10.D2(R101); lDlbFF — сшзеноциты мыши трансгенной линии lDlbFF поколения F7;

Исследуемая р-цепь ТС11 происходит из Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти. Мы решили оценить, влияет ли экспрессия (3-цепи ТСЯ клеток памяти на поверхностный активационный фенотип

периферических Т-лимфоцитов. Мы решили сравнить долю активированных Т-клеток в субпопуляциях спленоцитов, экспрессирующих эндогенные цепи ТСЛ Офб-) и трансген (\ф6+) (рис. 6). У мьппей линии В1(Ш2(К101) дикого типа процентное содержание СВ44+ клеток в субпопуляциях \ф6— и \ф6+ практически одинаково (рис. 6, а, б). У мьппей трансгенной линии Ш1ЬРМ в субпопуляции Урб- преобладают Т-клетки с фенотипом С044+, а в субпопуляции \ф6+ — Т-лимфоциты с фенотипом наивных Т-клеток СБ44—. (рис. 6, в, г).

Таким образом, соотношение Т-лимфоцитов с фенотипом наивных и активированных Т-клеток в субпопуляциях \ф6— и у мьппей линиии Ш1ЬРМ существенно нарушено по сравнению с животными дикого типа. Наблюдаемый феномен не является особенностью Т-клеток селезенки, эти же закономерности наблюдаются у Т-лимфоцитов в других периферических лимфоидных органах.Чтобы исключить влияния сторонних эффектов трансгенеза на активационный фенотип трансгенных периферических СВЗ* лимфоцитов мы

сравнили поверхностный акггивационный фенотип спленоцитов мышей трансгенной линии Ш1ЬБМ с поверхностным фенотипом спленоцитов трансгенной линии Ш1ЬРЕ Мыши обеих линий несут в геноме один и тот же трансген, однако между ними могут существовать различия, обусловленные разным количеством копий трансгена и различными местами интеграции трансгена в геном. Оказалось, что в популяциях периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии Ш1ЬРБ доля клеток с поверхностным фенотипом СТ)44+ заметно снижена в популяции клеток СЮ+\ф6+ и сильно увеличена в популяции СШ+Урб~".

уаг

B10.D2(R101)

vpe*

Рисунок 6. Поверхностный активационный фенотип Т-лимфоцитов с трансгенной и эндогенными р-цепями TCR.

Процентное содержание Т-лимфоцитов с активационным фенотипом (CD44+) в субпопулядиях GDe^Vpe-, CD8+vp6+, CD4+vp6~ и CD4~Vp6+ спленоцитов мышей линии lDlbFM (lDlbFM, в, г) на генетической основе линии B10.D2(R101) по сравнению с линией B10.D2(R101) (B10.D2(R101), а, 6). _

Vp6 — процентное содержание CD44* лимфоцитов в субпопуляции CD8+VP6— и CD4+VP6~; Vp6* — процентное содержание CD44' лимфоцитов в субпопугопши CD8*Vp6+ и CD4+Vp6i; а, в — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8*; б, г — процентное содержание CD44* лимфоцитов в субпопуляции CD4V; проанализировано 6 контрольных животных и 8 трансгенных животных; данные получены в трех независимых экспериментах).

Это означает, что увеличение доли клеток с поверхностным фенотипом наивных Т-лимфоцитов в популяции СВЗ^Урб"1" не является следствием сторонних эффектов трансгенеза и может объясняться только влиянием экспрессии трансгенной (З-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы Ш1.

CD44

Т-лимфоциты мышей трансгенной линии 101ЬГГ в условиях лимфопении

Хорошо известно, что сигнал, необходимый для выживания и поддержания гомеостаза,

периферические Т-лимфоциты получают, взаимодействуя со «своими» комплексами МНС/пептид. У животных трансгенных линий Ш1ЬРМ и 1Б1ЬРР происходит уменьшение репертуара Т-клеточных рецепторов из-за экспрессии «инвариантной» Р-цепи, что, очевидно, должно приводить к сужению спектра комплексов МНС/пептид, с которыми могут взаимодействовать трансгенные Т-клетки. Таким образом, следовало ожидать, что у трансгенных животных индивидуальные клоны Т-лимфоцитов с трансгенной Р-цепью конкурируют за ограниченное количество комплексов МНС/пептид, необходимых для их выживания на периферии. Мы предположили, что «наивный» фенотип Т-лимфоцитов с трансгенной цепью формируется именно из-за нехватки сигналов, получаемых Т-клеткой при взаимодействии с эндогенными комплексами МНС/пептид.

Для проверки этой гипотезы мы решили снизить конкуренцию Т-клеток с трансгенной р-цепью в организме животных линии Ш1ЬРЕ Мы подвергли мышей сублетальному облучению, таким образом значительно уменьшив количество Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах. Оказалось, что в условиях лимфопении большая часть Т-клеток с трансгенной Р-цепью приобретает поверхностный фенотип СБ44+ (рис. 7, б).

Интактные

Облученные

CD62L R101 1D1bFF

Рисунок 7. Поверхностный акгивационный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии ID lbFF через 3 дня после сублетального облучения.

Коэкспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L CD8* Т-клетками селезенки интакгных (а) и облученных (б) мышей линии lDlbFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101). Цитофлуориметрический анализ проведен через 3 дня после сублетального облучения животных. Проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных.

Таким образом, поверхностный фенотип наивных Т-клеток, характерный для трансгенных Т-лимфоцитов не является неизменным и способен меняться в зависимости от условий, в которых оказалась Т-клетка. По всей видимости, сигналом для изменения поверхностного фенотипа служит снижение конкуренции за эндогенные комплексы МНС/пептид между различными клонами Т-клеток, несущих трансгенную р-цепь TCR.

Первичный аллогенный ответ Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии IDlbFM in

vitro

При исследовании функциональных свойств CD8+ Т-клеток трансгенных животных необходимо прежде всего определить, способны ли Т-клетки, экспрессирующие трансгенную р-цепь, к полноценному иммунному ответу и «наследуют» ли они специфичность исходного гетеродимера TCR а/р. Т-клеточный рецептор гибридомы 1D1, из которой была клонирована исследуемая р-цепь, специфичен к молекуле МНС I класса Н-2КЬ. Мы решили исследовать пролиферативный ответ in vitro спленоцитов мышей трансгенной линии IDlbFM на спленопиты линий C57BL/10 (KbI-AbDb), обработанные цитостатиком митомицином С (рис. 8).

35000,0

30000,0

Е

о 25000,0

I

го Q. 20000,0

-8-s с; 15000,0

О.

-0 X 0) 10000,0

ш о & 5000,0

0,0

□ R101 В1D1bFM

1D1bFM BL10

Стимуляторы

FVB

Рисунок 8. Пролиферация смешанной культуры лимфоцитов мышей линии IDlbFM в отвегг на различные стимуляторы, обработанные митомицином С.

В качестве отвечающей популяции использованы спленоциты мышей линии IDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (IDlbFM) и спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (R101). В качестве стимулирующей популяции использовали спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (R101); IDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (IDlbFM); C57BL/10 (BL10); FVB (FVB). Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех.

Оказалось, что первичный иммунный ответ спленоцитов трансгенных животных на спленоциты линии C57BL/10 снижен по сравнению с мышами дикого типа. Более того, ответ на сторонние аллогенные стимуляторы FVB (K4-A4-EqD4) также заметно снижен по сравнению с мышами дикого типа.

Таким образом, стало ясно, что трансгенные Т-лимфоциты, экспрессирующие р-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1, во-первых, не сохраняют специфичность исходного гетеродимера TCR а/р, и, во-вторых, их способность отвечать на аллоантигены снижена.

Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии lDlbFM на клетки аллогенной опухоли

in vivo

Интактные

central memoiy

Мышам линии lDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb) вводили внутрибрюшинно 20 млн. клеток тимомы EL-4 (KbDb). Через 12 дней выделяли клетки селезенки интакгных и предварительно иммунизированных мышей и оценивали относительное количество активированных CD8+ Т-лимфмщтов. При иммунном ответе на клетки аллогенной опухоли у трансгенных животных, так же, как и у мышей дикого типа увеличивается относительное количество CD8+ Т-лимфоцитов. Однако доля клеток-эффекторов (CD44+CD62L-) среди CD8+ Т-лимфоцитов с трансгенной р-цепью TCR у животных линии lDlbFM была значительно меньше, чем среди Т-лимфоцитов CD8* мышей дикого типа (рис. 9, а, г).

CD44 17

CD62L _B10.D2(R101)

* а Интактные

Рисунок 9. Относительное количество клеток-эффекторов в иммунном ответе мышей линии IDlbFM на клетки аллогенной опухоли in vivo. Цитофлуориметрический анализ коэкспрессии маркеров CD44 и CD62L CD8+ Т-клетками селезенки интактных (левая панель) и предварительно

CD44

CD62L

1D1bFM

иммунизированных (правая панель) животных линии lDlbFM (в, г) по сравнению с животными дикого типа (а, б), а, в — Т-лимфоциты, экспрессирующие эндогенные Р-цепи TCR (CD8*Vp6~); б — Т-лимфоциты, экспрессирующие (З-цепь семейства VP6 (CD8*VP6+); г — Т-лимфоциты, экспрессирующие трансгенную Р-цепъ TCR (CD8*Vp6"0. Проанализировано 6 контрольных и б трансгенных животных.

Кроме того, у трансгенных животных практически не изменялась доля активированных клеток среди Т-лимфоцитов CD8+, экспрессирующих эндогенные |3-цепи Т-клеточного рецептора (CD8TV|36_). Таким образом, пул клеток-эффекторов, формирующийся в организме трансгенных животных в процессе иммунного ответа на клетки тимомы EL-4, значительно меньше, чем у животных дикого типа.

Продолжительность жизни трансгенных мышей линии lDlbFM, иммунизированных

аллогенной опухолью

Пул эффекгсорных Т-клеток, формирующийся в процессе иммунного ответа на клетки тимомы EL-4, у трансгенных животных значительно сокращен по сравнению с животными дикого типа. Остается неясным, достаточен ли его размер для эффективного отторжения клеток тимомы. Для исследования этого вопроса мышам трансгенной линии lDlbFM (Ш-К*1) вводили внутрибрюшинно 20 млн. клеток тимомы EL-4 (Н2-Кь). В качестве контроля использовали мышей линии B10.D2(R101) дикого типа (Ш-К"), которых также иммунизировали тимомой EL-4. В ходе эксперимента оценивали продолжительность жизни трансгенных животных, иммунизированных тимомой EL-4 по сравнению с мышами дикого типа.

£

120

100 -

60

Э 40

I 20

CD

о

1 3 5 7 9 1113151719212325272931333537394143454749515355575961636567697173757779 Время, ДНИ

....... .......101ЬЯМ+Е^ (п=9) -В10.02(В101 )+Е!_-4 (п=9)

Рисунок 10. Продолжительность жизни мышей трансгенной линии Ш1ЬРМ после иммунизации клетками тимомы ЕЬ-4.

Ш1ЬГМ+ЕЬ-4 — мыши трансгенной линии Ш1ЬРМ, иммунизированные клетками тимомы ЕЬ-4;

В10.02(Ш01)+ЕЬ-4 — мыши линии В10.Ш(1Ш1), иммунизированные клетками тимомы ЕЬ-4. Проанализировано 9 опытных и 9 контрольных животных,

Оказалось, что 90% трансгенных животных, иммунизированных тимомой EL-4, погибает в течение 80 дней после введения тимомы (рис. 10), причем пик гибели приходится на 40-60 дни после введения аллогенной опухоли. Гибели мышей дикого типа после иммунизации тимомой EL-4 зафиксировано не было.

Селекция опухолевых клеток в организме трансгенных животных

Различия в главных трансплантационных антигенах мышей линии B10.D2(R101) и клеток тимомы EL-4 сводятся к различиям продуктов, кодируемых локусом К — клетки тимомы EL-4 экспрессируют молекулу МНС I класса Н-2КЬ, а клетки организма мышей линии lDlbFM - молекулу Н-2КА Этого достаточно для развития полноценного иммунного ответа, отторжения опухоли и формирования пула долгоживущих клеток памяти. Мыши трансгенной линии IDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) оказались неспособны к эффективной элиминации опухолевых клеток. Тем не менее, тимома EL-4 развивается в организме животных линии IDlbFM значительно медленнее, чем в организме сингенных животных. Это связано с тем, что клетки тимомы находятся под давлением иммунного ответа, который недостаточен для полного отторжения опухоли, однако способен вызвать процессы селекции опухолевых клеток. Мы предположили, что селекция опухолевых клеток пойдет по пути утраты экспрессии молекулы Н-2КЬ. Из асцита брюшной полости мышей линии IDlbFM мы выделили опухолевые клетки и проанализировали экспрессию молекулы Н-2КЬ. В качестве контроля были использованы клетки тимомы EL-4, выделенные из асцита брюшной полости мыши линии C57BL/10. Оказалось, что клетки тимомы EL-4, выделенные из асцита брюшной полости мышей линии IDlbFM полностью утратили молекулу Н-2КЬМНС I класса на своей поверхности (рис. 11).

Полученная сублиния тимомы EL-4 получила название EL-4.lb. Утрата экспрессии молекулы МНС I класса оказалась стабильной: поверхностный фенотип сохранялся через 21 день культивирования in vitro.

Рисунок 11. Экспрессия молекулы Н-2КЬ МНС I класса клетками тимомы EL-4, прошедшими иммунную селекцию в организме трансгенных животных.

Сплошная линия — клетки тимомы EL-4 выделены из асцита брюшной полости мыши линии IDlbFM на генетической основе B10.D2(RW1).

Пунктирная линия — клетки тимомы EL-4 выделены из асцита брюшной полости мыши линии C57BL/10;

/ А

1 ) кь+

0.586%

у И

Como-FUC-A:: Kb

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы исследовали взаимосвязь между поверхностным активационным фенотипом CD8+ Т-лимфодитов и их функциональными характеристиками в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением, с помощью экспериментальной методики, позволяющей оценить иммунный ответ Т-клеток памяти без вовлечения наивных Т-лимфоцитов. Эта методика основана на способности аллоспецифичных Т-клеток памяти пролиферировать in vitro в ответе на аллогенные спленоциты или опухолевые клетки, подвергнутые острому тепловому шоку (прогревание в течение 1 часа при 45°С). Оказалось, что приобретение Т-клеткой поверхностного активационного фенотипа не приводит к появлению у нее функциональных характеристик Т-клетки памяти. Таким образом, способность Т-лимфоцита пролиферировать в ответ на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку, определяется исключительно предыдущим «антигенным опытом» Т-клетки.

Для исследования механизмов, лежащих в основе приобретения Т-лимфоцитом того или иного поверхностного фенотипа, мы создали две линии трансгенных животных, экспрессирующих ß-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1.

Экспрессия трансгенной ß-цепи TCR гибридомы 1D1 не вызывает каких-либо нарушений в развитии Т-лимфоцитов. Трансгенные Т-клетки успешно проходят внутритимусную селекцию и выходят на периферию. Для трансгенных Т-лимфоцитов не существует предпочтительной линии дифференцировки (CD4 или CD8).

Оказалось, что экспрессия трансгенной ß-цепи Т-клеточного рецептора значительно изменяет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме. 70-75% CD8+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансгенную ß-цепь TCR обладают поверхностным фенотипом наивных Т-клеток (CD44~CD62L+). В то же время, значительная доля Т-лимфоцитов, экспрессирующих эндогенные цепи TCR, находится в активированном состоянии. Этот эффёкт наблюдается у мышей обеих трансгенных линий, что свидетельствует о том, что он не является следствием каких-либо сторонних эффектов трансгенеза. В условия снижения конкуренции за эндогенные комплексы МНС/пептид трансгенные Т-лимфоциты приобретают поверхностный фенотип CD44+. Таким образом, поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов определяется доступностью эндогенных МНС-пептидных лигандов, с которыми может взаимодействовать их Т-клеточный рецептор.

Экспрессия трансгенной ß-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 приводит к значительному снижению уровня аллогенных ответов in vitro и in vivo. Слабый аллогенный

ответ; развивающийся в организме трансгенных животных, делает невозможным отторжение клеток аллогенной тимомы EL-4, однако приводит к иммунной селекции опухолевых клеток.

Таким образом, в работе исследована взаимосвязь поверхностного акгивационного фенотипа CD8+ Т-клеток с их функциональными свойствами, а также механизмы, лежащие в основе приобретения Т-лимфоцитом того или иного поверхностного фенотипа. Эти результаты могут иметь важное значение для понимания процессов формирования пулов Т-клеток с различными функциональными характеристиками и поверхностным акгивационным фенотипом.

ВЫВОДЫ

1. Т-лимфоциты в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением, приобретают поверхностный фенотип клеток памяти, однако оказываются неспособными отвечать in vitro на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку.

2. Т-лимфоциты, адоптивно перенесенные сублетально облученным животньш, приобретают поверхностный фенотип активированных Т-клеток, однако их способность к первичному и вторичному аллогенному иммунному' ответу in vitro значительно подавлена.

3. Впервые получены и охарактеризованы две независимые линии мышей, трансгенных по Р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 на генетической основе линии B10.D2(R101).

4. Структура Т-клеточного рецептора в значительной степени определяет уровень экспрессии поверхностных маркеров CD44 и CD62L.

5. Экспрессия трансгена р-цепи Т-клеточного рецептора изменяет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме.

6. Т-лимфоциты CD8+ линии lDlbFF, экспрессирующие трансгенную Р-цепь, приобретают поверхностный фенотип активированных клеток в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением.

7. Уровень аллогенного иммунного ответа in vitro мышей трансгенной линии lDlbFM заметно снижен по сравнению с мышами дикого ила.

8. Иммунный ответ Т-лимфоцитов трансгенных животных in vivo недостаточен для эффективного отторжения аллогенной опухоли: мыши линии lDlbFM на генетической основе B10.D2(R101) погибают через 40-60 дней после введения клеток тимомы EL-4.

9. Иммунный ответ лимфоцитов мышей трансгенной линии lDlbFM на генетической основе B10.D2(R101) на клетки тимомы EL-4 вызывает потерю экспрессии молекулы Кь МНС I класса клетками тимомы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации журналах, рекомендованных ВАК

РФ

1. Казанский, Д. Б. Использование мультиплетных пептидов для форсификации вакцин, стимулирующих специфический клеточный иммунитет/ Д. Б. Казанский, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, В. Н. Петрищев, Е. JI. Агафонова, Н. В. Сернова, Д. А. Лим, Ю. Ю. Силаева, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А. Копина // Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 1999. — №9. —с. 57-60.

2. Казанский, Д. Б. Использование мультиплетных пептидов для стимуляции специфического клеточного иммунитета. / Д. Б. Казанский, Ю. Ю. Силаева, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, В. Н. Петрищев, Л. А. Побезинский, Е. Л. Агафонова, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А. Копина, И. Г. Сидорович // Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 2001.—№1. —с. 48-5i.

3. Pobezinskaya, E.L. Cross reactivity of T cell receptor on memory CD8+ cells isolated after immunization with allogeneic tumor cells. / E. L. Pobezinskaya, L. A. Pobezinskii, Y. Y. Silaeva, Т. V. Anfalova, L. M. Khromykh, T. S. Tereshchenko, E. S. Zvezdova, D. B. Kazanskii // Bull Exp Biol Med. — 2004. — V.137. — №5. — c. 493-498.

4. Звездова, E. С. Создание трансгенных животных, экспрессирующих а- и Р-цепи аугореактивного TCR / Е. С. Звездова, Ю. Ю. Силаева, М. С. Вагида, Е. В. Марюхнич, А. В. Дейкин, Т. Г. Ермолкевич, С. Г. Кадулин, Е. Р. Садчикова, И. Л. Гольдман, Д. Б. Казанский // Мол. Биол. — 2010. — Т. 44. — №2. — с. 311-322.

5. Силаева, Ю. Ю. Сокращение пула Т-лимфоцитов с поверхностным фенотипом эффекторов и клеток памяти под воздействием экспрессии трансгена Р-цепи Т-клеточного рецептора / Ю. Ю. Силаева, А. А. Калинина, М.С. Вашда, Л. М. Хромых, А.В. Дейкин, Т. Г. Ермолкевич, Е. Р. Садчикова, И. Л. Гольдман, Д. Б. Казанский // Биохимия. — 2013. — Т. 78. — №5. — с. 714-726.

Другие работы, опубликованные по теме диссертации: 1. Kazansky, D. В. Heat shock of АРС results in profound decrease in constitutive expression of CD80 and CD86: Implication for expression of different patterns of cytokines by naive and memory T cells / D. B. Kazansky, V. N. Petrishchev, D. A. Lim, Y. Y. Silaeva, Т. V.

Anfalova, L. M. Khromykh // John Humphrey Course "Self tolerance and self-recognition".

— 2000.— Sinaia, Romania May 15-19. — P. 44-45.

2. Казанский, Д. Б. Использование мультиплетных пептидов для индукции специфического клеточного иммунитета / Д. Б. Казанский, Ю. Ю. Силаева, JI. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А Копина, И. Г. Сидорович // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. — 2000. — Т. 4. — №. 1. — с. 93.

3. Казанский, Д. Б. Использование мультиплетных пептидов для индукции специфического клеточного иммунитета / Д. Б. Казанский, Ю. Ю. Силаева, В. Н. Петрищев, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, JI. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А. Копина, И. Г. Сидорович // Материалы отчетной конференции по Межведомственной научно-технической программе "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего". Аллергология и иммунология. — 2000._Т.1.

— №3, —с. 110.

4. Казанский, Д. Б. Активация Т-клеток CD4+ древовидными пептидами с последовательностью молекул МНС / Д. Б. Казанский, Л. А. Побезинский, Е. Л. Побезинская, Ю. Ю. Силаева, В. Н. Петрищев, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А. Копина, И. Г. Сидорович И Медицинская иммунология.

— 2001, —Т.З. —№2, —с. 125.

5. Kazansky, D. Generation of effector and memory CD8 T cells: The abundance of memorylike T cells depends on TCR/MHC interactions (P1442) / D. Kazansky, Yu. Silaeva, A. Kalinina, M. Vagida, L. Khromykh, A. Deikin, T. Ermolkevich, E. Sadchikova, I. Goldman // Immunology 2013 Meeting Abstracts. J. Immunol. — 2013. — 190 (Meeting Abstract Supplement): 117.21.

6. Silaeva, Y. Expression of TCR trangenic beta-chain leads to contraction of T lymphocytes pools with surface phenotypes of effector and central memory cells / Y. Silaeva, A. Kalinina, M. Vagida, L. Khromykh, A. Deikin, T. Ermolkevich, E. Sadchikova, I. Goldman, D. Kazansky, // Front. Immunol. Conference Abstract: 15th International Congress of Immunology (ICI).—2013. — doi: 10.3389/conf.fimmu.2013.02.00339.

Подписано в печать 07.02.14 . Формат 60x84/16. Бумага офисная «8уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 103 Отпечатано на участке множительной техники • ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24