Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Гуморальный иммунный ответ у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии

На правах рукописи

ГОЛУБЦОВА НАТАЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ У БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ

В ПРОЦЕССЕ ВАКЦИНОТЕРАПИИ

14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 0 м '3 т")

Москва - 2012

005017267

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина»

Российской академии медицинских наук

(директор - академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович)

Научные руководители:

доктор медицинских наук кандидат медицинских наук

Павел Константинович Иванов Ирина Николаевна Михайлова

Официальные оппоненты:

Петерсон Сергей Борисович

доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой онкологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова » Минздравсоцразвития России

Вайнсон Адольф Адольфович доктор биологических наук, профессор,

зав. лабораторией лучевых методов лечения опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН

Ведущая организация:

ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России

Защита состоится « 3» ^2012 г. в /Очасов на заседании диссертационного совета Д.001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр

им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

(115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН ( 115478, г.Москва Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан & У 12 ]

; г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор / Юрий Андреевич Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Характер опухолевого роста во многом зависит от эффективности .гаунологических защитных механизмов и от способности трансформированных [еток уходить от иммунологического надзора.

Меланома считается иммуногенной опухолью, экспрессирующей 1ухолеассоциированные антигены: раково-тестикулярные антигены (MAGE), гланоцитные дифференцирующие антигены (тирозиназа, тирозиназа-связанные ;лки TRP-1/-2, MelanA/MART-1, gp 100 и gp75). Специфический клеточный лмунный ответ на меланомные антигены происходит путем узнавания лжеродных пептидов рецепторами Т-клеток посредством молекул главного змплекса гистосовместимости (МНС) дендритных клеток.

К белкам, способным регулировать иммунные механизмы и выступать в 1честве факторов ухода опухоли от иммунологического контроля, относятся 1стпоримыс формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. Каждая из истворимых дифференцировочных молекул или растворимых молекул тстосовместимости может быть представлена несколькими изоформами, эразующимися за счет шеддинга с мембраны клетки или альтернативного 1лайсинга матричной РНК. В норме растворимые формы мембранных антигенов аходятся в равновесном состоянии. Нарушение их равновесного содержания в ежклеточном пространстве и биологических жидкостях организма приводит к одуляции межклеточных мембранных взаимодействий и, соответственно, ммунного ответа. Уровень растворимых молекул HLA I класса, антигена CD8 и астворимого комплекса HLA I - CD8 показывает состояние Т-клеточного иммун-ого ответа.

Межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется также с омощью цитокинов. Это белковые или полипептидные продукты активи-ованных клеток иммунной системы, которые являются медиаторами ежклеточных коммуникаций при иммунном ответе, осуществляют взаимосвязь ежду специфическим иммунитетом и неспецифическими защитными реакциями,

действуя в обоих направлениях. Изменение равновесия клеточного Thl гуморального Th2 звена приводит к существенным изменениям иммунных реакций у больных меланомой в процессе вакцинотерапии.

В процессе противоопухолевой вакцинотерапии в сыворотке крови больных меланомой могут образовываться антитела против антигенов, которые экспрессируются в клетках, используемых для вакцины. Роль гуморальны> антител в противоопухолевой защите неоднозначна. В некоторых работах выявлено их защитное действие, в других - противоопухолевые антитела содействуют прогрессивному росту опухоли.

В связи с этим является актуальным изучение гуморального иммунногс ответа при аллогенной и аутологичной вакцинации у больных диссеминированноР меланомой.

Цель исследования

Изучить гуморальное звено противоопухолевого иммунитета в процессе вакцинотерапии больных с диссеминированной меланомой. Задачи исследования

1. Оценить уровень растворимой формы молекулы HLA I класса в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой как предполагаемый прогностический маркер для контроля над состоянием иммунологической системы организма при вакцинотерапии.

2. Оценить значение содержания уровня растворимого антигена CD8 в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

3. Определить уровень растворимого комплекса HLA I -CD8 в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

4. Определить уровни цитокинов ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-4, ИЛ-10 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

5. Определить появление в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой антител против опухолеассоциированных антигенов в процессе вакцинотерапии.

Научная новизна

Впервые исследованы растворимые молекулы HLA I, растворимый антиген CD8 и растворимый комплекс HLA I-CD8 в сыворотке крови больных диссе-минированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

Впервые выявлена прогностическая значимость повышенного уровня растворимых молекул HLA I класса, белка S-100 и интерлейкина-2 (ИЛ-2) у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологич-ными дендритными клетками.

Впервые выявлено образование противоопухолевых антител в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии вакциной Мелавак.

Научно-практическая значимость

Обнаружены новые прогностические маркеры у больных меланомой: уровень растворимых сывороточных антигенов - растворимые молекулы HLA I, растворимый антиген CD8, белок S-100 и ИЛ-2. Полученные данные имеют мониторинговую значимость и могут быть использованы для разработки новых методов оценки эффективности терапии больных.

Целесообразно использовать образование специфических антител в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой при оценке иммунологической эффективности противоопухолевой вакцинации.

Апробация работы. Апробация диссертационной работы состоялась 4 августа 2011 г. на совместной научной конференции лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории иммунофармако-логии, лаборатории лучевых методов лечения опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, а также отделения биотерапии НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН.

Материалы, изложенные в диссертационной работе представлены на IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные

противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 2010), на X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), на II Конференции отдела клинической химии ГУП МНКЦ «ИНТЕРМЕДБИОФИЗХИМ» (Москва, 20011).

По материалам диссертации опубликовано 5 работ в рецензируемых ВАК РФ журналах: 3 статьи и 2 тезиса докладов.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (120 источников). Список литературы содержит 47 отечественных и 73 иностранных источника. Материалы диссертации изложены на 9У страницах машинописного текста и включают 19 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследований служили образцы сыворотки крови 55 больных диссеминированной меланомой, полученные из отделения биотерапии НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, которые после хирургического удаления опухоли получали аутологичную дендритную вакцину и 9 больных диссеминированной меланомой, которые после хирургического удаления опухоли получали вакцину Мелавак. В качестве контроля использовались образцы сыворотки крови 32 здоровых доноров.

Определение сывороточного уровня растворимых молекул HLA I класса и CD8 антигена проводилось иммуноферментным методом, разработанным в Нижегородском госуниверситете им. Н.И.Лобачевского (Новиков В.В. и др., 2008).

Определение сывороточного уровня белка S-100 (S-100 А1В и S-100 ВВ формы) проводилось иммуноферментным методом с использованием диагностической тест-системы CanAg Diagnostics (Швеция). Определение сывороточных уровней интерлейкинов проводилось иммуноферментным методом с

.¿пользованием диагностических тест-систем Bender MedSystems (Австрия) и ест-систем ООО «Цитокин».

Относительное содержание сывороточных уровней (СУ) рассчитывали по формуле: СУ = (опыт-контроль) /контроль х 100%, где в качестве контроля 5ыло принято среднее значение исследуемого показателя в группе здоровых хоноров.

Оценка связывания IgM и IgG антител проводилась методом иммунофлуо-зесценции (РИФ) и методом флуоресцентной иммуноцитохимии (ФИЦХ) с ^пользованием поликлональных антител против человеческих иммуногло-Зулинов IgG, конъюгированных с FITC (Goat F(ab)2 ANTI HUMAN IgG:FITC) и юликлональных антител против человеческих иммуноглобулинов IgM, конъюгированных с РЕ (Goat F(ab')2 ANTI HUMAN IgM:PE) («Serotec»),

Для проведения РИФ и ФИЦХ использовались клеточные линии меланомы человека mel Kor и mel Ibr, различающиеся экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости I и II класса. Результаты оценивали по уровню и частоте экспрессии антиген - положительных клеток.

Статистический анализ данных проводился с помощью пакета программ EXCEL 2003, STATISTICA 6.0, SPSS 13.0 и 17.0. Расчет выживаемости проводили методом Каплана-Мейера. Сравнение двух кривых выживаемости проводили с помощью логранкового критерия. Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, антигена CD8 и растворимого комплекса HLA I-CD8 j' больных диссемипировапной меланомой

Был проведен анализ содержания растворимых антигенов в образцах сыворотки крови больных меланомой в процессе вакцинотерапии дендритными клетками. Выявлено, что уровни сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у больных меланомой до лечения достоверно превышали значения содержания

исследуемых растворимых антигенов в сыворотке крови здоровых доноров (р< 0,05). К концу вакцинотерапии дендритными клетками достоверного изменения сывороточного содержания исследуемых антигенов в сыворотке крови больных ' диссеминированной меланомой выявлено не было (р>0,05) (таблица 1).

Таблица 1. Содержание растворимых антигенов в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками; ME/мл, (М±т)

Антиген Контрольная группа (доноры) п = 32 Пациенты до лечения п = 55 Пациенты после лечения п=55

HLA I 1011,53±117,8 1501,50±182,2* 1507,00±189,5

CD 8 377,18±30,0 489,43±33,0* 474,46±24,5

HLA-I-CD 8 513,53±51,0 599,67±44,4* 532,15±34,4

* - статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой здоровых доноров (р < 0,05)

Показатели исследуемых антигенов имели сильные индивидуальные колебания, поэтому в анализе полученных данных мы перешли от абсолютных чисел к относительным. В качестве контроля было принято среднее значение исследуемого показателя в группе здоровых доноров (рисунок 1).

HLA-I-CD 8

И пациенты до

лечения □ пациенты после

лечения О контроль

* - статистически достоверные различия по сравнению с контролем (группа здоровых доноров), (р < 0,05)

Рисунок 1. Распределение относительного содержания растворимых антигенов в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой (п=55)

Больные были разделены на 2 группы: группу №1 составили пациенты с исходно повышенным содержанием сывороточных уровней исследуемых антигенов относительно показателей в группе здоровых доноров, а группу №2 -больные с пониженным сывороточным содержанием растворимых молекул HLA I класса, антигена CD8 и растворимого комплекса HLA-I-CD8 (таблица 2).

Таблица 2. Относительное содержание растворимых антигенов в сыворотке крови в группах №1 и №2 больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками; %, ( М±т)

Антиген Группа №1 (с повышенными значениями) Группа №2 (с пониженными значениями)

до лечения после лечения до лечения после лечения

HLAI (п=33) 203,03±21,6*'** (п=33) 165,80±9,2*' ** (п=22) 66,60±6,1*-** (п=22) 77,47±4,4*' **

CD 8 (п=46) 137,54±9,36* (п=46) 131,51±7,1* (п=9) 88,0±3,7 (п=9) 57,25±8,6*

HLA I-CD 8 (п=31) 141,02±10,9*'** (п=31) 118,94±55,6** (п=24) 85,00±4,9** (п=24) 40,26±4,8*'**

* - статистически достоверные различия по сравнению с группой доноров (р< 0,05) ** - статистически достоверные различия между группами 1 и 2 (р < 0,05)

В таблице №2 представлено распределение относительного содержания растворимых антигенов в сыворотке крови в группах №1 и №2 больных в ходе вакцинотерапии. Проведенный анализ относительного содержания НЬА I выявил понижение сывороточного уровня данного маркера у пациентов группы №1 к концу лечения (203% в начале лечения и 165% к концу вакцинотерапии). У больных группы №2 в конце вакцинотерапии отмечено повышение уровня данного маркера в образцах сыворотки крови (66% и 77% соответственно). Таким образом, при вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками наблюдается снижение уровня растворимых молекул НЬА I класса у больных с повышенными значениями и повышение до нормальных значений у больных с пониженным содержанием растворимого сывороточного НЬА I. Следовательно, вакцинотерапия приводит к нормализации сывороточного уровня НЬА I класса.

Достоверных изменений в относительном содержании растворимых фор. CD8 антигена в образцах сыворотки крови пациентов 1 группы выявлено не былс (137% до лечения и 131% в конце вакцинотерапии), а у больных группы №2 отмечено снижение сывороточного уровня CD8 в конце лечения (88% до начале вакцинотерапии и 57% в конце лечения).

В группах HLAI-CD8 выявлено понижение относительного содержат« сывороточного уровня в обеих группах больных в ходе лечения. Понижение сывороточного уровня HLAI-CD8 у пациентов группы №1 - со 141% в начале лечения до 118% к концу вакцинотерапии относительно контроля (группе здоровых доноров) и у больных с пониженным сывороточным уровнем HLAI-CD8 (группа №2) - 85% и 40% соответственно.

Прогностическое значение сывороточных уровней растворимых молекул HLA I класса и антигена CD8y больных меланомой

Одним из сывороточных маркеров меланомы является опухолеассоциированный антиген S-100. S-100 белки представляют собой семейство Са-связывающих белков, которые обнаружены в клетках различных тканей. Они активно участвуют в процессах клеточного деления, дифференцировки, гомеостаза ионов Са++, проведении внутриклеточного регуляторного сигнала апоптоза. Рост концентрации белка S-100 в сыворотке крови был обнаружен при глиоме, меланоме, нейробластоме. Установлено, что при меланоме белок S-100 проявляет свойства стадиоспецифичности, его средние значения растут с уровнем инвазии и размером первичного опухолевого очага. Уровень S-100 также коррелирует с числом пораженных органов, наличием метастазов в печени или кости и ответом на химио- или иммунотерапию.

В данной работе мы исследовали взаимосвязь между сывороточным содержанием растворимой молекулы HLA I класса, растворимого антигена CD8 и белка S-100 как маркера прогрессии опухоли в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками.

Перед началом вакцинотерапии среднее значение уровня S-100 в сыворотке крови всех больных диссеминированной меланомой (п=45) составляло 95,66±7,64

нг/мл и в ходе лечения достоверно повысилось до 136,83±13,68 нг/мл (р< 0,05). Среднее значение данного маркера в контрольной группе доноров (п=15) составило 69,40±9,84 нг/мл.

В зависимости от исходного уровня относительного содержания 8-100 в образцах сыворотки крови пациентов (п=45) больные были разделены на 2 группы. Группу №1 составили пациенты с повышенными показателями 5-100, а группу №2 - больные с пониженными показателями 8-100 относительно значений данного маркера в группе доноров.

Проведенный анализ относительного содержания Я-100 (таблица 3) выявил, что до начала вакцинотерапии уровень относительного содержания данного маркера у пациентов группы №1 (п=20) был достоверно повышен в 2 раза по сравнению с контролем (доноры) и повысился в 3 раза относительно показателей в контрольной группе доноров в ходе лечения (р < 0,05). В образцах сыворотки крови больных группы №2 (п = 25) исходный уровень относительного содержания Б-100 был снижен в 1,4 раза в сравнении с контролем (группа доноров) и достоверно повысился в 1,1 раза относительно контроля в ходе вакцинотерапии.

Таблица №3. Относительное содержание S-100 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии дендритными клетками, %, (М±т)

Группы Сывороточный уровень S-100, %

до лечения после лечения

Все пациенты (п=45) 137,83±10,5 *** 196,83±20,3 ***

1. Группа №1 (п= 20) повышенные значения Б-100 204,65±12,2 ♦•**■*** 294,3б±25,4 *•♦*■***

2. Группа №2 (п= 25) пониженные значения Б-100 72,66±2,4 **'*** 111,43±6,4 **■*«

3. Контрольная группа доноров (п=15) 99,99±2,93 *

* - статистически достоверные различия по сравнению с группой доноров (р< 0,05) ** - статистически достоверные различия между группами №1 и №2 (р< 0,05) *** - статистически достоверные различия внутри группы (до и после лечения), (р< 0,05)

Динамика сывороточного уровня S-100 представлена на рисунке 2.

всо пациенты группа! группа 2 контроль

* - статистически достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) ** - статистически достоверные различия внутри группы (до и после лечения) (р < 0,05)

*** - статистически достоверные различия между группами №1 и № 2 (р < 0,05)

Рисунок 2. Динамика сывороточного уровня 8-100 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии

Был проведен анализ выживаемости пациентов в двух группах больных, распределенных в зависимости от начального сывороточного уровня Б-100 (рисунок 3). Выявлены статистически значимые различия в выживаемости больных в зависимости от исходного уровня относительного содержания уровня Б-100 в образцах сыворотки крови пациентов. Медиана выживаемости пациентов составила в группе № 1(с повышенными значениями Б-100) = 22,0±7,8 мес.. В группе №2 (с пониженными значениями Б-100) медиана выживаемости составила 54,0±25,2 мес. (р=0,045).

группа 1

группа 2

iij 40

Время, месяцы

Рисунок 3. Выживаемость пациентов диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в зависимости от начального уровня сывороточного маркера меланомы S-100

Далее был проведен анализ относительного содержания сывороточного уровня S-100 в группах больных №1 и №2, распределенных относительно исходных сывороточных уровней растворимых молекул HLA I класса и CD8 антигена (см. таблицу 2). Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4. Относительное содержание сывороточного уровня S-100 в группах №1 и №2 больных меланомой, распределенных в зависимости от исходного уровня растворимых антигенов HLA I и CD8 в процессе вакцинотерапии, %, (М±гп)

Группы Сывороточный уровень S-100, %

до лечения после лечения

1. HLA I группа №1 (п=28) повышенные значения HLA I 130,06±11,6 159,18±14,4

группа №2(п=17) пониженные значения HLA I 150,19±9,4 * 256,62±25,6 *

2.CD8 группа №1 (п=38) повышенные значения CD8 145,99±11,0 * 211,41 ±21,6 *

группа №2 (п=7) повышенные значения CD8 94,73±6,7 1 19,75±7,4

- статистически достоверные различия внутри группы (до и после лечения) (р < 0,05)

Проведенные исследования выявили, что у больных с повышенными значениями сывороточного уровня HLA I уровень S-100 статистически значимо не изменялся (130% в начале лечения и 159% к концу вакцинотерапии), т.е. прогрессия заболевания при высоком HLA I отсутствует. Однако у больных с пониженным сывороточным уровнем HLA I наблюдается статистически значимое повышение уровня S-100 (150% и 256% соответственно), т.е. имело место прогрессия заболевания. Как показали наши исследования и по данным других авторов, повышение уровня S-I00 коррелирует с низкой продолжительностью жизни и является неблагоприятным фактором прогноза. Следовательно, повышенный сывороточный уровень HLA I является благоприятным фактором прогноза. Также уровень S-100 демонстрирует, что повышенные значения растворимого сывороточного антигена CD8 являются неблагоприятным фактором, так как отмечено статистически значимое повышение уровня S-100 (146 и 211% соответственно) в образцах сыворотки крови больных с повышенным растворимым CD8, тогда как у больных с пониженными значениями CD8 антигена уровень S-100 практически не изменился.

Изменение относительного содержания сывороточных уровней цитокинов у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками

Первоначально проведенный сравнительный анализ исследуемых показателей свидетельствовал о том, что уровни сывороточного содержания ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10 у больных диссеминированной меланомой, получавших дендритную вакцину достоверно превышали значения содержания исследуемых цитокинов в сыворотке крови здоровых доноров (р< 0,05). Сывороточный уровень ИЛ-12 в исследуемых образцах сывороток крови пациентов был ниже, чем значения данного показателя в группе доноров, однако достоверного изменения сывороточного содержания исследуемого цитокина выявлено не было (р>0,05) Полученные данные представлены в таблице 5.

Таблица 5. Содержание сывороточных уровней цитокииов в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками, пкг/мл, (М ± ш)

Группы ИЛ-2 ИЛ-12 ИЛ-4 ИЛ-10

до лечения после лечения ДО лечения после лечени я до лечения после лечения до лечения после лечения

1. Все пациенты 18,10± 1,30 * (п=48) 21,33± 2,79* 83,86± 4,92 11=45) 89,15 ±5,4 6,5± 12,19 * (п=48) 8,7± 22,09 * 9,62± 1,50 * (п=48) 8,96± 1,9 *

2. Контрольная группа доноров 5,53±3,7* (11=102) 100,6± 5,3 (п=13) 3,5± 1,6 * (п=102) 3,2± 3,2 (п=102)

* - статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой (р< 0,05)

Больные были разделены на 2 группы. Группу №1 составили пациенты с изначально повышенными значениями, а группу №2 - больные с пониженными показателями ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-4 и ИЛ-10 относительно значений в группе доноров. Анализ относительного содержания ИЛ-2 выявил, что до начала вакцинотерапии сывороточный уровень данного маркера у пациентов группы №1 был достоверно повышен в 3,7 раза по сравнению с контролем (группа здоровых доноров). Отмечено дальнейшее повышение в 4,4 раза сывороточного уровня данного цитокина относительно показателей в контрольной группе доноров в ходе лечения (р< 0,05). В образцах сыворотки крови больных группы №2 исходный уровень относительного содержания ИЛ-2 до лечения было достоверно снижен в 1,9 раза относительно контроля (доноры) и практически не изменился в ходе лечения.

Сывороточный уровень ИЛ-12 у пациентов группы №1 до начала вакцинотерапии было достоверно повышен в 1,4 раза по сравнению с контролем (доноры) и не менялся в ходе лечения. В группе №2 до лечения относительное сывороточное содержание данного цитокина было достоверно снижено в 1,6 раза

в сравнении с нормальными значениями исследуемого показателя в контрольной группе доноров и изменений в конце вакцинотерапии выявлено не было.

Относительное содержание сывороточного уровня ИЛ-4 в группе №1 до лечения было достоверно выше в 3,7 раза и в процессе вакцинотерапии было отмечено достоверное снижение исследуемого показателя в 2,2 раза относительно контроля (доноры). У пациентов группы №2 в начале вакцинотерапии относительное содержание сывороточного уровня интерлейкина-4 было достоверно ниже в 2,3 раза относительно значений ИЛ-2 в группе здоровых доноров и практически не изменилось к концу лечения.

Относительное содержание ИЛ-10 в сыворотке крови больных в группе №1 до лечения было достоверно выше в 4,4 раза по сравнению с контролем (доноры) и незначительно снизилось в конце лечения. В группе №2 до начала вакцинотерапии относительное сывороточное содержание интерлейкина-10 было снижено в 1,4 раза и осталось без изменений к концу вакцинотерапии. Полученные результаты продемонстрированы на рисунке 4.

Изменение уровня цитокинов в группе 1 Изменение уровня цитокинов в группе 2

ИЛ-2 ИЛ-12 ИЛ-4 ИЛ-10

*— статистически достоверные различия внутри группы (до и после лечения) (р< 0,05)

Рисунок 4. Изменение сывороточных уровней цитокинов у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии в группах 1 и 2

Проведенный анализ выживаемости больных не выявил статистически значимых различий в выживаемости больных в зависимости от исходных уровней ИЛ-12, ИЛ-4, ИЛ-10. Однако, выживаемость больных с высоким уровнем ИЛ-2 (рисунок 5) была выше, чем у больных с пониженными значениями ИЛ-2. Медиана выживаемости в группе № 1 составила 34,0±4,6 мес., а в группе №2-24,0± 16,7 мес. (р = 0,131).

i »•

О

О

X

jQ

СО о, К

сз

3 ю О О

Рисунок 5. Выживаемость больных диссеминированной меланомой в зависимости от начального уровня ИЛ-2 в сыворотке крови в группах 1 и 2

Определение противоопухолевых антител в образцах сыворотки крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии

В процессе противоопухолевой вакцинотерапии в сыворотке крови больных меланомой могут образовываться антитела против антигенов, которые экспрессируются в клетках, используемых для вакцины. Эти антитела могут быть направлены против опухолеассоциированных или трансплантационных антигенов. Для выявления специфических антител в образцах сыворотки крови пациентов мы использовали две клеточные линии меланомы человека mel Kor и mei Ibr, различающиеся экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости I и II класса.

р_ ш

U

ч 1

1 группа 1

п..........1 - | группа 2

—I-1-1-1—

0,00 20.00 40,00 60,00

время (мес)

Было выявлено неспецифическое связывание и 1§С-антител в образцах сыворотки крови больных и здоровых доноров методом непрямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ). Полученные результаты представлены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6. Результаты определения специфических ^М в сыворотке крови больных

диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии, (М ± т), %, РИФ

Группы пациентов Количество антиген-положительных клеток на клетках линии меланомы человека mel Kor, (%) Количество антиген-положительных клеток на клетках линии меланомы человека mel Ibr, (%)

до лечения в ходе лечения до лечения в ходе лечения

1 .Дендритная вакцина (п=20) 7,35±4,55 7,54±4,38 (п=20) 5,43±2,44 5.29±2,79

2. Вакцина Мелавак (.1=9) 5,99±1,58 5,69±2,25 (п=9) 7,02±3,02 6,82±2,19

3. Контроль (доноры) (п=6) 4,08±0,71 (п=6) 3,54±0,50

Таблица 7. Результаты определения специфических в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой процессе вакцинотерапии, ( М ± т), %.

РИФ

Группы пациентов

.Дендритная вакцина

2.Вакцина Мелавак

3. Контроль (доноры)

Количество антиген-положительных клеток на клетках линии меланомы человека mel Kor, (%)

до лечения

(п=20) 0,91±0,63

(п=9) 1,09±0,57

(п=б) 0,80±0,51

в ходе лечения

0.79±0,60

1,76±0,93

Количество антиген-положительных клеток на клетках линии меланомы человека mel Ibr, (%)

до лечения

(п=20) 1,2б±1,4

(п=9) 1,06±3,02

(п=6) 0,90±0,60

в ходе лечения

1,07±1,01 1,22±0,75

Таким образом, специфических 1§М и 1§0-антител против поверхностных антигенов меланомы в образцах сыворотки крови вакцинированных больных диссеминированной меланомой методом непрямой РИФ выявлено не было.

Было проведено исследование наличия антител в сыворотке крови больных методом флуоресцентного иммуноцитохимического анализа. В образцах сыворотки крови здоровых доноров и больных меланомой, получавших дендритную вакцину, реакция с клетками mel Kor была отрицательной. Однако положительная реакция с этими клетками IgM-антител выявлена в образцах сыворотки крови у 7 из 9 больных меланомой, получавших вакцину Мелавак. Антитела обнаруживались после первой вакцинации (рисунок 6). В процессе вакцинотерапии количество антиген-положительных клеток увеличилось.

В. Г.

Рисунок б. А - отрицательная реакция в контроле (сыворотка крови здорового донора), Б - отрицательная реакция в сыворотке крови больного меланомой, получавшего дендритную вакцину;

В, Г - положительная реакция (специфическое окрашивание) в сыворотке крови больных, получавших вакцину Мелавак); mel Kor, увеличение х400

Выявлена положительная реакция с клетками mel Kor специфических IgG-антител в образцах сыворотки крови у 4 из 9 больных меланомой, получавших вакцину Мелавак (рисунок 7). Интенсивность окрашивания с клетками mel Kor была от 1 до 2+. Процент антиген-положительных клеток был 20 - 30%.

; Ф '

А.

Б.

В. Г.

Рисунок 7. А - отрицательная реакция в контроле (сыворотка крови здорового донора), Б -отрицательная реакция в сыворотке крови больного меланомой, получавшего дендритную вакцину;

В, Г - положительная реакция (специфическое окрашивание) в сыворотке крови больных, получавших вакцину Мелавак); mel Kor, увеличение х400.

Обнаружена отрицательная реакция с клетками mel Ibr IgM-антител в образцах сыворотки крови доноров и больных меланомой, получавших дендритную вакцину и положительная реакция IgM-антител в образцах сыворотки крови у 7 из 9 больных меланомой, получавших вакцину Мелавак. Интенсивность окрашивания с клетками mei Ibr была от 1 до 2+, выявляя от 20% до 90% антиген-положительных клеток. Полученные результаты представлены на рисунке 8.

А. Б. В.

I

Рисунок 8. А - отрицательная реакция в контроле (сыворотка крови здорового донора), Б - отрицательная реакция в сыворотке крови больного меланомой, получавшего дендритную вакцину;

В - положительная реакция (специфическое окрашивание) в сыворотке крови больных, получавших вакцину Мелавак); ше1 1Ьг, увеличение х400.

Положительная реакция с клетками ше11Ьг ^О-антител была обнаружена только в одном из 9 образцов сыворотки крови больных меланомой, получавших вакцину Мелавак. Было выявлено 30% антиген-положительных клеток (рисунок 9).

А. Б. В.

Рисунок 9. А - отрицательная реакция в контроле (сыворотка крови здорового донора), Б - отрицательная реакция в сыворотке крови больного меланомой. получавшего дендритную вакцину;

В - положительная реакция (специфическое окрашивание) в сыворотке крови больного, получавшего вакцину Мелавак); mel Ihr, увеличение х400.

Таким образом, при иммуноцитохимическом исследовании было выявлено появление специфических антител против меланомных антигенов в сыворотке крови больных метастатической меланомой, получавших вакцину Мелавак.

Выводы

1. Установлено, что уровни содержания растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и комплекса HLA I-CD8 в сыворотке крови у всех больных диссеминированной меланомой превышали значения содержания исследуемых растворимых антигенов в сыворотке крови здоровых доноров.

2. Выявлено, что при вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками наблюдается снижение уровня растворимых молекул HLA I класса у больных с повышенными значениями и повышение до нормальных значений у больных с пониженным содержанием растворимого сывороточного HLA I.

3. Достоверных изменений в содержании растворимых форм CD8 антигена в образцах сыворотки крови пациентов с повышенными показателями выявлено не было, но была отмечена тенденция к понижению сывороточного содержания в группе с пониженными значениями относительно контрольной группы.

4. Выявлено понижение сывороточного содержания растворимого комплекса HLA-I-CD8 в образцах сыворотки крови больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в обеих группах

5. Установлено, что у пациентов с изначально повышенными значениями уровня S-100 в сыворотке крови продолжительность жизни меньше, чем у пациентов с пониженными значениями данного маркера.

6. Выявлено статистически достоверное повышение S-100 в ходе лечения у больных с пониженным HLA I и повышенным CD8.

7. Показано, что у больных меланомой с повышенным сывороточным растворимым HLA I и пониженным растворимым CD8 повышение уровня S-100 в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками менее выражено, чем у больных с пониженными значениями HLA I и повышенным CD8 в образцах сыворотки крови.

8. Установлено, что у больных с диссеминированной меланомой кожи при вакцинации аутологичной дендритной вакциной наблюдается снижение

изначально повышенных сывороточных уровней относительного содержания ИЛ-4 и ИЛ-10 (ТЪ2-тип цитокинов) и повышение уровня относительного содержания ИЛ-2 (Thl-тип цитокинов), которое свидетельствует об активации клеточного звена противоопухолевого иммунитета

9. Выявлено, что у больных с диссеминированной меланомой кожи при вакцинации вакциной Мелавак образуются в сыворотке крови антитела против внутриклеточных антигенов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Голубцова, Н.В. Содержание сывороточного уровня растворимой формы молекул HLA I класса у больных с диссеминированной меланомой кожи при дендритноклеточпой вакцинотерапии / Н.В. Голубцова, Н.Б. Преснякова, В.В. Новиков, К.А. Барышников, H.H. Михайлова, АЛО. Барышников // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Нижний Новгород 18-19 мая 2010. Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, №2. - С. 50

2. Голубцова, Н.В. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, антигена CD 8 и растворимого комплекса HLA I-CD8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии / Н.В. Голубцова, И.Н. Михайлова, В.В. Новиков, К.А. Барышников, Н.Б. Преснякова, Е.В. Огородникова, H.H. Петенко, К.А. Парсункова, О.С. Бурова, Г.З. Чкадуа, JI.B. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, №3. - С.41-47.

3. Голубцова, Н.В. Прогностическое значение сывороточных уровней растворимых молекул HLA I класса и антигена CD8 у больных диссеминированной меланомой / Н.В. Голубцова, И.Н. Михайлова, В.В. Новиков, К.А. Парсункова, И.В. Самойленко, H.H. Петенко, Е.В. Огородникова, В.Н. Тазаев, Е.А. Черемушкин, К.А. Барышников, Е.В. Коржевская, Н.Б. Преснякова, Г.З. Чкадуа, JI.B. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский бнотерапевтический журнал. — 2010. - Т.9, №4. - С.103-106.

4. Голубцова Н.В. Прогностическое значение сывороточного уровня растворимой формы молекул HLA I класса у больных с диссеминированной меланомой / Н.В. Голубцова, И.Н. Михайлова, В.В. Новиков, К.А. Парсункова, H.H. Петенко, Е.В. Огородникова, В.Н. Тазаев, К.С. Титов, Е.А. Черемушкин, К.А. Барышников, Н.Б. Преснякова, Г.З. Чкадуа. JI.B. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы X Всероссийской научно-практической

конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые пре, раты» Москва 22-23 марта 2011. Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 1 ( №1,-С.18-19.

5. Голубцова, Н.В. Изменение относительного содержания интерлейкина-2 у больны диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии / Н.В. Голубцова, ИГ Михайлова, К.А. Парсункова, H.A. Балацкая, К.А. Барышников, И.В. Евсегнеева, М.Е Огородникова, И.В. Манина, И.Н. Григорьева, Е.В. Коржевская, Г.З. Чкадуа, Л.Е Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т.1С №4.-С. 13-16.

Подписано в печать 05.03.12 Формат 60x84/16. Бумага офисная «5уек)Сору». Тираж 100 экз. Заказ №340 Отпечатано на участке множительной техиники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24