Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин

Бережной, Алексей Евгеньевич

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Бережной, Алексей Евгеньевич Москва 2007 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин

На правах рукописи

БЕРЕЖНОЙ АЛЕКСЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН

14 00 14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007 г

003058099

Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр имени Н Н. Блохина Российской Академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, профессор М И Давыдов)

Научные руководители доктор медицинских наук кандидат биологических наук

А.М. Козлов

С.С. Ларин

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор В.М. Бухман

доктор биологических наук

Т.Н.Заботина

Ведущая организация

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П А Герцена РОСмедтехнологий

Защита диссертации состоится «18» мая 2007 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета К 001 17.01 при ГУ Российский онкологический научный центр им Н.Н Блохина РАМН по адресу 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН

Автореферат разослан «17» апреля 2007 г. Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Известно, что при терапии опухолевых заболеваний основной проблемой является не подавление роста первичного опухолевого узла, а борьба с метастатической диссеминацией опухоли Химиотерапия и все иные современные методы противоопухолевой терапии эффективны на начальной стадии заболевания, однако не оказывают радикального излечивающего воздействия при распространенном опухолевом процессе Современные научные данные достоверно подтверждают способность иммунной системы организма подавлять рост опухоли, в некоторых случаях, обуславливая стойкую ремиссию Противоопухолевый эффект иммунотерапии связан с цитотоксическим действием лимфоцитов в отношении опухолевых клеток и воздействием секретируемых лимфоцитами цитокинов, нарушающим формирование опухолевой стромы

Эти данные обусловили многочисленные попытки терапевтического применения противоопухолевой иммунотерапии, одним из направлений которой стало использование противоопухолевых вакцин Опыт клинического применения одной из наиболее перспективных вакцин, ГМ-КСФ-секретирующей вакцины на основе транзиторно трансфицированных аутологичных опухолевых клеток пациентов, подтвердил эффективность такого вида биотерапии при различных опухолях В то же время, технологические аспекты создания персонализированных вакцин стали причиной, по которой данный метод не получил широкого распространения

Анализ механизма воздействия иммунной системы на опухоль показал, что мишенью противоопухолевых Т-клеток и антител являются опухолевые антигены, часть из которых характерна для многих опухолей Убедительно также показано, что формирование противоопухолевого иммунного ответа при вакцинации происходит в результате презентации опухолевых антигенов собственными антигенпрезентирующими клетками вакцинируемого индивида, в то время, как клетки вакцины являются лишь источником необходимых антигенов Общность антигенов разных опухолей и вовлечение собственных антигенпрезентирующих клеток в формирование противоопухолевого иммунного ответа обосновали возможность применения вакцин, созданных на основе аллогенных опухолевых клеток

При этом существует возможность подбирать для иммунизации отдельных пациентов противоопухолевые вакцины на базе аллогенных клеток,

антигенный спектр которых совпадает с антигенами, экспрессируемыми клетками опухоли пациента Принимая во внимание постоянно растущую коллекцию клеточных линий, можно предположить, что аллогенные клетки способны при надлежащем подборе полностью представлять антигенный состав опухоли и выступать в роли универсального средства иммунотерапии опухолей

В тоже время, не сформулированы унифицированные представления о рациональном составе противоопухолевых вакцин, недостаточно охарактеризованы условия, необходимые для реализации их противоопухолевого эффекта в сингенной и аллогенной системах Актуальной является разработка модельных систем, необходимых для корректного доклинического изучения влияния антигенного состава и количества продуцируемого цитокина на противоопухолевую активность вакцин в условиях аллогенного и сингенного применения

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель работы:

Изучение специфической активности клеточных генно-инженерных противоопухолевых вакцин, секретирующих ГМ-КСФ и разработка способов повышения эффективности иммунотерапии опухолей

Задачи работы:

1 Разработать экспериментальную модельную систему для доклинического изучения эффективности противоопухолевой иммунотерапии мышей

2 Получить стабильно трансфицированные геном ГМ-КСФ линии клеток меланомы мышей с высоким уровнем продукции ГМ-КСФ и разработать рациональные подходы к созданию на их основе противоопухолевых вакцин

3 Изучить эффективность иммунотерапии опухолей генно-инженерными клеточными вакцинами в зависимости от характеристик вакцины и особенностей экспериментальной модели опухоли

4 Оценить возможность повышения активности генно-инженерных вакцин, оптимизируя антигенный спектр включением в их состав клеток различных опухолей

5 Изучить возможности повышения эффективности противоопухолевой иммунотерапии путем применения вакцин, состоящих из смеси клеточных линий, экспрессирующих различные цитокины

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В настоящем исследовании впервые разработана экспериментальная модельная система для доклинического изучения эффективности иммунотерапии меланомы ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами Впервые проведено корректное сравнение эффективности иммунопрофилактики низкоиммуногенной меланомы В16 и высокоиммуногенной меланомы М-3 иммунотерапии ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами в сингенном и аллогенном режиме Впервые для разработанного типа вакцин проанализировано значение аллогенной стимуляции для индукции эффективного противоопухолевого иммунного ответа

Впервые показана недостаточная эффективность аллогенной ГМ-КСФ-секретирующей клеточной вакцины на основе генно-модифицированных клеток линии М-3 для иммунопрофилактики меланомы B16-F10 Установлено, что включение в состав аллогенной вакцины инактивированных немодифицированных сингенных опухолевых клеток повышает эффективность применения вакцины до уровня эффективности сингенной вакцины

Впервые изучена эффективность комбинированных клеточных вакцин, состоящих из смеси клеток, продуцирующих белки Tag-7 и ГМ-КСФ Показан синергизм адьювантной активности этих молекул в составе генно-модифицированных клеточных вакцин

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Выполненная работа выявила недостаточность совпадения спектров опухолевых антигенов вакцины и опухоли -мишени для эффективной иммунопрофилактики экспериментальной меланомы, что должно найти отражение в клинической практике использования аллогенных ГМ-КСФ-секретирующих вакцин Изучение эффективности иммунопрофилактики в модельных системах показало, что наиболее универсальным и эффективным средством вакцинотерапии опухолей являются байстендерные вакцины, состоящие из смеси аллогенных клеток, секретирующих ГМ-КСФ и клеток сингенной опухоли

Изучение вакцины на основе смеси клеток продуцирующих Tag-7 и ГМ-КСФ выявило увеличение эффективности комбинированной вакцины по сравнению с вакцинами, состоящими из клеток, продуцирующих один из цитокинов Применение подобной вакцины для иммунотерапии пациентов со злокачественной меланомой способно повысить эффективность вакцинотерапии

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящий момент в ГУ РОНЦ им Н Н Блохина проходят ограниченные испытания вакцины на основе аллогенных опухолевых клеток, продуцирующих Tag-7 человека, также вакцины на основе аллогенных клеток меланомы человека, секретирующих ГМ-КСФ человека Результаты настоящей работы, посвященной доклиническому изучению вакцин на основе опухолевых клеток, генетически модифицированных генами иммунологически активных молекул, учитываются при проведении клинических испытаний

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация работы состоялась I марта 2007 года на совместной научной конференции лабораторий экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, фармакоцитокинетики, медицинской биотехнологии, экспериментальной терапии метастазов, клеточного иммунитета, комбинированной терапии опухолей НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (199 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов) Изложена работа на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные

Эксперименты были проведены с использованием мышей линии C57BI/6 (гаплотип Н-2Ь), мышей линии DBA/2 (гаплотип H-2d) и BDF! - гибридов первого поколения C57BI/6 х DBA/2 (комбинированный гаплотип H-2b/d) Все животные были получены из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая» В экспериментах использовали мышей-самцов 8-12 недельного возраста, весом 20-25 г

Клеточные линии и их культивирование

Клетки меланомы мышей В16 (клон F10) и меланомы мышей Клаудмана S91 (клон МЗ) были любезно предоставлены профессором М Бернстилом (IMP, Вена, Австрия) Клетки ГМ-КСФ-секретирующих клонов BG получены при помощи стабильной трансфекции клеток линии B16-F10 генетической конструкцией, кодирующей кДНК ГМ-КСФ мыши В работе были использованы различные варианты клеток BG BG10 и BG50, секретирующие 10 и 50 нг (10б клеток за 24 часа) мГМ-КСФ Клетки ГМ-КСФ- секретирующего клона MG также были получены при помощи стабильной трансфекции клеток линии мышиной меланомы Клаудмана S91 (клон МЗ) генетической конструкцией, кодирующей кДНК ГМ-КСФ мыши В работе использовали клетки клонов MG10 и MG50, секретирующие 10 и 50 нг ГМ-КСФ, соответственно

Обе исходные клеточные линии и клетки стабильно трансфицированных клонов культивировали в стандартных условиях в среде DMEM с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (HyClone, США), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen, США) при 37°С и 5% С02

Иммунизация мышей

Непосредственно перед началом иммунизации, клетки линий B16-F10 и S91-M3, а также клонов MG и BG, снимали с поверхности культурального пластика раствором трипсина и двукратно отмывали в полной среде DMEM Затем клетки переносили во флаконы для облучения в концентрации 107 клеток

в мл и облучали в дозе 100 Гр на источнике гамма-облучения в клинике экспериментальной терапии ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН После облучения клетки дважды отмывали бессывороточной средой 199 и ресуспендировали в этой среде в концентрации 107 клеток в мл и вводили экспериментальным животным подкожно, в область левой подмышечной впадины по 106 клеток в 100 мкл культуральной среды

Трансплантация опухолевых клеток и учет динамики роста опухоли Клетки для трансплантации предварительно выращивали т vitro в стандартных условиях Непосредственно перед трансплантацией животным клетки снимали с поверхности культурального пластика раствором трипсина, дважды отмывали в бессывороточной среде 199 и ресуспендировали в ней в концентрации 106 клеток в мл для B16-F10, или 107 клеток в мл для МЗ Для индукции опухолей животным линии C57BI/6 трансплантировали по 105 клеток линии B16-F10 в 100 мкл культуральной среды подкожно, в область правой подмышечной впадины Для индукции опухолей у мышей линии DBA/2 использовали 10б клеток линии S91-M3 Через 5 дней после трансплантации и далее через каждые 2-3 дня животных обследовали на наличие пальпируемых опухолей в области введения клеток Формирующиеся опухоли измеряли дважды в неделю, объем опухоли определяли по формуле V=DmaxxDlx(Dmax/2), где Dmax равен максимальному диаметру опухоли, a D1 - диаметру, перпендикулярному максимальному Отмечали сроки достижения опухолями линейного размера 15 мм в любом измерении, а также сроки гибели животных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Получение и характеристика целыюклеточиой вакцины.

В результате проделанной работы получены стабильно трансфицировййные клоны клеток меланомы В16-Р10, секретирующие рекомбинантный ГМ-КСФ в количестве 10 и 50 нг/ 1 млн клеток за 24 часа, названные соответственно: ВО 10 и В050. Аналогичная работа позволила получить клоны мышиной меланомы МЗ, продуцирующие 10 н 50 нг/ 1 млн клеток ча 24 часа, названные МОЮ и М050, соответственно.

Для подбора оптимальных условий инактивации вакцин, определяли количество клеток, выживающих на разные сроки после облучения и выясняли их способность к пролиферации (рис. 1).

А «

В Ц

350

- зоо

1260 з гоо

I 150

0 §

1 я

о 100 г 08Я

О60

О 40

■ 20 | 1

_ г' Ь X

Время после облучения, дни

О 5 10

Время после облучения, дни

-1

5 10 15 20 25 30 35 Время после облучения, дни

50.

1 о £ - 30 , = □ 100 ООО и60 а 40

I 20 ■ 20

к 10

5 10 15 20 25 30 3 5 Время после облучения, дни

Рис. 1, Влияние гамма-облучения на жизнеспособность и пролифератив-ный потенциал стабильно трансфицированвых опухолевых клеток.

Левая панель: клетки клонов ВС50 и КТС50 были облучены в дозах 20, 40, 60, 80 и 100 Гр. Количество жизнеспособных клеток В050 и 1УЮ50 на разные дни после облучения представлено на рисунке 2А и 2В, соответственно.

Правая панель клетки после облучения высевали в плотности 3x104 клеток/см2 на чашки для культивирования и культивировали их не менее 35 дней, отмечая формирование колоний пролиферирующих клеток Количество колоний для линий Вв50 и Мв50 отражено на рисунках 2Б и 2Г, соответственно

Из полученных результатов можно заключить, что облучение в дозе 100 Гр и 80 Гр вызывало гибель значительного количества облученных клеток При облучении в указанных дозах, колоний пролиферирующих клеток не формировалось

На рис 2 представлены результаты изучения способности инактивированных клеток продуцировать рекомбинантный ГМ-КСФ на разные дни после облучения

400 0 ' 350 0 300 0 250 0 200 0 ■ 150 0 -100 0 50 0 00

-100 Гр

£120 0 100 0 80 0 60 0 40 0

Время после облучения, дни

Рис. 2. Влияние гамма-облучения на количество рекомбинантного цито-кина, секретируемого клетками стабильно трансфицированных клонов.

Представлено количество ГМ-КСФ, продуцируемого за 24 часа 10б клеток клона Вв50 (А) или клона Мв50 (Б) на разные сроки после облучения Приведены репрезентативные результаты одного из пяти независимых экспериментов

Как видно из приводимых графиков, гамма-облучение в исследованном диапазоне доз не отменяет способности генетически модифицированных клеток к синтезу и секреции трансгенного цитокина

Изучение эффективности противоопухолевой вакцинации клетками ВаО в сингенной и аллогенной системе.

Эффективность сингенной иммунопрофилактики меланомы В16 оценивали путем иммунизации сингенных мышей клетками ГМ-КСФ секретирующего

клона ВвЮ и последующей трансплантации иммунизированным животным сингенных опухолевых клеток Одновременно осуществляли иммунизацию мышей линии Б В А/2 Одну из экспериментальных групп сравнения иммунизировали ^модифицированными инактивированными клетками меланомы, контрольных животных не иммунизировали (рис 3)

7 14 21

Время после трансплантации, дни

21 28 Время после трансплантации опухоли дни

ЮС

£ 751

§6 л ш

-»Не вакц ♦ Вакц ВСЮ -*-Вакц В16-Р10

3 7 14 21 28 35 42 49 Время после трансплантации, дни

75-

I-—

•■Без вак I Вакц В16-Р10 > Вакц ВЭЮ

7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Время после трансплантации дни

Рис. 3. Влияние иммунизации мышей клетками ВСЮ на динамику роста опухолей и выживаемость экспериментальных животных.

Сверху представлены результаты сингенной иммунизации мышей линии С57В1/6, снизу - аллогенной иммунизации мышей линии Б В А/2 Слева представлена динамика роста опухолей, справа - выживаемость экспериментальных животных

*-различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,05)

В эксперименте не было установлено какого-либо влияния сингенной вакцинации на продолжительность жизни животных после трансплантации опухоли, напротив, вакцинация мышей аллогенными ГМ-КСФ-секретирующими клетками оказала выраженное влияние на скорость роста опухолей после трансплантации клеток меланомы МЗ Объем опухолей у иммунизированных животных линии DBA/2 оказался в среднем в 4 раза меньше, а продолжительность жизни 2 раза больше по сравнению как с невакцинированными животными, так и с животными, вакцинированными клетками линии B16-F10

Изучение эффективности противоопухолевой иммунизации вакциной на основе клеток MG10 в сингенной и аллогенной системе. Преимущество иммунизации аллогенными клетками, по сравнению с использованием сингенных клеток может быть обусловлено влиянием реакции трансплантационного отторжения, которые усиливают противоопухолевый иммунный ответ, либо же тем, что модель опухолевого роста, индуцируемого трансплантацией клеток М-3, является более чувствительной к иммунотерапевтическим воздействиям

Одной из возможностей прояснить механизмы полученных эффектов стало использование экспериментальной системы, в которой иммунитет будет стимулирован против опухолей, индуцируемых трансплантацией клеток М-3, однако в режиме сингенной, а не аллогенной иммунизации Для этого была разработана вакцина на основе ГМ-КСФ секретирующего клона клеток линии М-3 и изучена противоопухолевая эффективность вакцины на основе этих клеток (MG10) в сингенной системе, на мышах линии DBA/2 и в аллогенной системе, на мышах линии C57BI/6 (рис 4)

150001

10000

5000

• Без вакц -•■Вакц МЗ *Вакц МСЮ

10СГ

75'

Я 50

0 7 14 21 28

Время после трансплантации, дни

• Без вакц

♦ Вакц М-3 Вакц 1\Л310

"О 7 14 21 28 35 42 49 Время с момента трансплантации дни

200001

<2 15000-

' 10000

5000

¡5 50

7 14 21 28 35 Время с момента трансплантации дни

■»Не вакц Вакц МЗ Вакц МОЮ

"и,

.......1,-

О 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 Время с момента трасплантации, дни

Рис. 4. Влияние иммунизации мышей клетками МвЮ на динамику роста трансплантируемой меланомы В16-П0 (сверху) и меланомы М-3 (снизу) и выживаемость экспериментальных животных.

Слева представлена динамика роста опухолей, справа - выживаемость экспериментальных животных

*-различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,001)

Как видно из приведенных графиков, иммунизация мышей сингенными клетками клона МвЮ оказывала выраженное воздействие на рост опухоли, формирующейся в результате трансплантации мышам сингенных клеток линии М-3 В результате иммунизации рост опухолей замедлялся более чем в 8 раз, а у 30% животных наблюдалось отторжение трансплантируемых опухолевых клеток Высокая эффективность не только аллогенной, но и сингенной противоопухолевой иммунизации в отношении изучаемой экспериментальной

модели опухоли (М-3), позволяет говорить о том, что данная модель является высокочувствительной к иммунотерапевтическим воздействиям

Применение аллогенных клеток, как секретирующего ГМ-КСФ клона MG10, так и ^модифицированных клеток линии М-3 не оказывало влияния на рост сингенной опухоли B16-F10 у животных линии С57В1/б Приводимые показатели динамики опухолевого роста достоверно не различаются на протяжении всего периода наблюдения Выживаемость экспериментальных животных разных групп также не имеет достоверных различий Вероятной причиной недостаточной эффективности иммунизации можно считать низкую продуктивность клеток вакцины, в то время как эффект от аллогенной стимуляции, если и оказывал влияние на развитие противоопухолевого ответа, то явно оказывался недостаточным для того, чтобы вакцинация влияла на рост индуцированных опухолей

Изучение противоопухолевого эффекта вакцин на основе клеток BG10 и MG10 на гибридных мышах BDF1.

Эффективность иммунопрофилактики меланомы B16-F10 была низкой, а меланомы М-3, достаточно высокой Одной из возможных причин феномена могли быть различия в функционировании иммунной системы у мышей двух разных инбредных линий Другая возможная причина могла заключаться в различии эффектов вакцинации разными клетками, поскольку клетка вакцин, как и клетки исходных клеточных линий, различались по экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости Также весьма вероятно, что клетки B16-F10 и М-3 различны по многим другим параметрам, и эти отличия позволяют легко подавлять рост опухолей, растущих после трансплантации клеток линии М-3, но не B16-F10 Для того, чтобы изучить влияние различных факторов на эффективность иммунизации, были проведены эксперименты на мышах-гибридах BDFi, которым после иммунизации трансплантировали клетки линии B16-F10, либо линии М-3 (рис 5)

юсг

г? 75-

I 501

♦ Без вакц

♦ Вакц Вв х Вакц МС

1----.

ЮСГ

75'

2 50

■•■Не вакц ♦Вакц Вв •х Вакц МО

30 60 90 120

Время с момента трасплантации, дни

90 120 Время с момента трасплантации, дни

Рис. 5. Влияние противоопухолевой иммунизации гибридных мышей ВЭр! на динамику роста и выживаемость экспериментальных животных после трансплантации им клеток линии В16-Г10 и М-3.

Через 7 дней после вакцинации иммунизированных животных в случайном порядке распределяли на две равных подгруппы и трансплантировали им живые опухолевые клетки Представлена выживаемость мышей, которым были трансплантированы клетки В16-Р10 (слева), либо клетки М-3 (справа) *-различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,01) **-различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,001)

Как следует из полученных результатов, эффективность иммунопрофилактики меланомы М-3, значительно превосходила эффективность иммунопрофилактики меланомы В16-Р10 Это наблюдение указывает на то, что различная эффективность иммунопрофилактики меланом В16-Р10 и М-3 обусловлена в значительной степени различиями свойств опухолевых клеток, используемых для трансплантации

Важно также отметить, что эффект от применения клеток ВвЮ в качестве средства профилактики роста опухолей после трансплантации клеток М-3, сохраняется при переходе от аллогенной к сингенной системе, что подтверждает независимость эффекта вакцинации от аллогенной стимуляции

Влияние количества секретируемого клетками вакцины ГМ-КСФ на

эффективность сингенной противоопухолевой вакцинации Для оценки влияния продуктивности клеток вакцины на эффективность иммунопрофилактики был получен клон В050, клетки которого секретировали в 5 раз превосходящее количество ГМ-КСФ, по сравнению с клоном ВОЮ, использованным ранее Были воспроизведены эксперименты по сингенной иммунопрофилактике меланомы В16-П0 путем иммунизации животных клетками клона В050, либо клона ВОЮ (рис 6)

250001

10№

^ 75

7 14 21 28 Время после трансплантации, дни

»Без вакц ■т Вакц В16-Р10

Вакц ВвЮ х Вакц Вв50

7 14 21 28 35 42 49 Время после трансплантации, дни

Рис. 6. Повышение эффективности сингенной иммунопрофилактики меланомы В16-И0 при увеличении количества секретируемого клетками вакцины рекомбинантного цитокина.

Слева представлена динамика роста опухолей, справа — выживаемость экспериментальных животных

*-различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,05)

Вакцинация клетками В050 вызывает снижение скорости роста опухоли и достоверно увеличивает продолжительность жизни экспериментальных животных Примечательно, что опухоли у не вакцинированных животных появляются раньше и растут быстрее, нежели у мышей, вакцинированных клетками ВОЮ Однако через 10 дней размер опухолей у этих животных становится одинаковым с размером опухолей у контрольных животных, в то время как у мышей, вакцинированных В050, опухоли по-прежнему продолжают расти достоверно медленнее Эффекты в отношение роста опухоли сопровождаются увеличением продолжительности жизни экспериментальных животных

Влияние количества секретируемого клетками вакцины ГМ-КСФ на эффективность аллогенной иммунопрофилактики мелапомы B16-F10 Эффективность сингенной иммунопрофилактики меланомы B16-F10, увеличивалась при увеличении количества цитокина, продуцируемого клетками клона, используемого для иммунизации Повышение продукции ГМ-КСФ с 10 до 50 нг позволило получить достоверные отличия в выживаемости иммунизируемых животных и снизить скорость роста опухоли более чем в 2 раза Как и сингенная иммунизация, аллогенная иммунизация клетками клона MG10, продуцирующего 10 нг ГМ-КСФ была недостаточно эффективной при иммунопрофилактике меланомы B16-F10 В последующей работе был получен субклон MG50, клетки которого продуцировали пятикратно большее количество ГМ-КСФ в сравнении с клоном MG10, использованным в первоначальных экспериментах Далее была проведена оценка эффективности иммунопрофилактики меланомы B16-F10 вакцинами на основе низко- и высокопродуктивных клонов MG10 и MG50 (рис 7)

250001

20000

£■ 10000

5000

• Без вакц -* Вакц М-3 -•-Вакц MG10 -• Вакц MG50

100

1 501

2 CD

7 14 21 28 35 Время с момента трасплантации дни

• Без вакц Вакц М-3 Вакц MG10 Вакц MG50

1--1

¡'i

1—ь

Н-: U-,

3 7 14 21 28 35 42 49 Время с момента трасплантации, дни

секретируемого клетками вакцины на эффективность аллогенной

Рис. 7. Влияние количества рекомбинантного ГМ-КСФ противоопухолевой вакцинации.

Слева представлена динамика роста опухолей, справа - выживаемость экспериментальных животных

Как видно из представленных данных, применение аллогенных клеток как низкопродуктивного клона МОЮ, так и более высокопродуктивного клона

Мв50 не вызывало замедление роста меланомы В16 у вакцинированных животных Выживаемость вакцинированных и контрольных животных была практически одинаковой

Предшествовавшие эксперименты показали, что фактором, стимулирующим иммунный ответ на опухолевые антигены, является ГМ-КСФ, секретируемый клетками стабильно трансфецированных клонов Таким образом, неэффективность аллогенной вакцинации против опухолей, формирующихся в результате трансплантации клеток В16-Р10, может обуславливаться характеристиками антигенного состава клеток линии М-3

Повышение эффективности аллогенной иммунизации путем введения в состав вакцины сингенных опухолевых клеток Для индукции противоопухолевого иммунного ответа в отношение меланомы В16-Р10, необходимо, чтобы клетки вакцины продуцировали не менее 50 нг рекомбинантного ГМ-КСФ Тем не менее, при использовании аллогенной вакцины на основе генно-модифицированных клонов линии клеток М-3, секретирующих необходимое количество ГМ-КСФ, не было выявлено противоопухолевых эффектов иммунотерапии Поскольку одна из функциональных составляющих аллогенной вакцины, а именно секретируемый ГМ-КСФ, соответствовал необходимым условиям для эффективной иммунизации, основой гипотезой недостаточной активности вакцины стало несоответствие антигенного состава меланомы В16-П0 и меланомы М-3

Для того, чтобы проверить данную гипотезу оценили эффективность совместного введения инактивированных клеток линии В16-П0, которые могли служить источником необходимых антигенов и инактивированных клеток клона М050, секретирующих рекомбинантный ГМ-КСФ (рис 8)

150001

100

s? 75

X-i

• Без вакц 25 ♦Вакц MG

■» Вакц В16+МЗ х Вакц B16+MG

7 14 21 28

Время после трансплантации дни

I . . , . ■

и0 7 14 21 28 35 42 49

Время с момента трансплантации клеток дни

Рис. 8. Повышение эффективности иммунопрофилактики меланомы B16-F10 путем включения в состав аллогенной вакцины сингенных опухолевых клеток в качестве источника опухолевых антигенов.

Слева представлена динамика роста опухолей, справа - выживаемость экспериментальных животных

*-различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,05)

На представленных графиках показано, что введение в состав аллогенной вакцины клеток B16-F10 существенно повышает эффективность вакцинации, что выражается в замедлении роста меланомы B16-F10 и увеличении продолжительности жизни экспериментальных животных Вакцинация клетками MG50, как и в серии предшествовавших экспериментов, не вызывала достоверного увеличения сроков выживаемости или замедления роста опухолей

Увеличение эффективности противоопухолевой вакцинации при включении в состав вакцины линий, продуцирующих различные цитокины Ранее было показано, что вакцинация мышей генно-модифицированными опухолевыми клетками, продуцирующими рекомбинантный белок Tag-7 мыши, вызывает формирование противоопухолевого ответа, опосредуемого в значительной части NK-клетками В настоящем исследовании была предпринята попытка увеличить эффективность иммунопрофилактики меланомы B16-F10 путем включения в состав вакцины на основе инактивированных клеток, секретирующих ГМ-КСФ, инактивированных сингенных клеток В16-F10, продуцирующих белок Tag-7 мыши (рис 9)

юс

10 TP

25"

• Без вакц -►■Вакц В16 ■• Вакц BG о Вакц ВТ -хВакц BG+BT

юа

SS 75

I 501

: I

: I ft"*

л-r-

! ! I I I

•Без вакц ■♦Вакц В16 Вакц BG о Вакц ВТ •мВакц BG+BT

Время после трансплантации дни

Рис. 9. Увеличение эффективности сингенной иммунопрофилактики меланомы B16-F10 путем включения в состав ГМ-КСФ-секретирующей вакцины клеток, продуцирующих Tag-7.

Мышей-самцов линии С57В1/б вакцинировали смесью инактивированных клеток ВТ и BG50, животных групп сравнения иммунизировали клетками B16-F10, или BG50, или ВТ Через 7 дней животным трансплантировали 105 живых клеток линии B16-F10 Слева представлена частота и динамика формирования опухолей, справа - выживаемость экспериментальных животных

*-различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,001) ** -различия от контрольной группы статистически достоверны (Р<0,05)

Животные, вакцинированные по отдельности клетками BG50 или ВТ, показывали достоверное увеличение продолжительности жизни Кроме этого, у 20% животных трансплантируемые опухолевые клетки отторгались Отличия между двумя этими группами статистически не достоверны как по срокам формирования опухолей, так и по продолжительности жизни

При использовании вакцины, состоящей из смеси клеток секретирующих ГМ-КСФ и продуцирующих Tag-7 получены наиболее значимые результаты ы У 90% животных, иммунизированных комплексной вакциной, наблюдали отторжение трансплантируемых опухолевых клеток

Эксперименты по изучению эффективности комбинированной противоопухолевой вакцины показали целесообразность сочетания различных клеточных линий в составе противоопухолевых генно-инженерных вакцин Добавление к вакцине клеток - источника опухолевых антигенов делает ее

эффективной в отношении опухолей, которые были устойчивы к аллогенной вакцинации Кроме этого, включение в состав сингенной ГМ-КСФ-секретирующей вакцины клеток, продуцирующих рекомбинантный белок Tag-7, приводит к значительному увеличению эффективности противоопухолевой вакцинации

ВЫВОДЫ

1 Получен набор стабильно трансфицированных клеточных линий меланомы мышей, продуцирующих рекомбинантный ГМ-КСФ в различных количествах Клетки клонов меланомы Клаудмана S91-M3 (MG10) и меланомы B16-F10 (BG10) секретируют 10 нг ГМ-КСФ на 10б кл/24 часа Клетки клонов меланомы Клаудмана S91-M3 (MG50) и меланомы B16-F10 (BG50) секретируют 50 нг ГМ-КСФ на 10б кл/24 часа

2 Инактивация путем гамма-облучения в дозе 100 Гр предотвращает пролиферацию клеток данных клонов, но сохраняет их жизнеспособность и секрецию ГМ-КСФ

3 Создана и апробирована экспериментальная модельная система для изучения эффективности и механизмов аллогенной противоопухолевой вакцинации на примере использования генно-инженерных клеточных вакцин гаплотипа H-2d для мышей гаплотипа Н-2Ь и наоборот вакцин гаплотипа Н-2Ь, для мышей гаплотипа H-2d

4 Эффективность противоопухолевой иммунотерапии цельноклеточными ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами зависит от экспериментальной модели опухоли меланома Клаудмана S91 (клон МЗ), экспрессирующая антигены МНС I класса, трансплантируемая мышам линии DBA/2, высоко чувствительна к воздействию противоопухолевой иммунизации, в то время как меланома В16 (клон F10), не экспрессирующая антигены МНС, трансплантируемая мышам линии С57В1/б, более устойчива к противоопухолевой иммунизации

5 Увеличение количества секретируемого клетками вакцины ГМ-КСФ с 10 до 50 нг (106 кл/24 часа) повышает эффективность иммунопрофилактики меланомы В16 в сингенной системе, однако не оказывает влияние на эффективность аллогенной иммунизации

6 Оптимизация антигенного состава вакцины, увеличивает эффективность иммунотерапии низкоиммуногенных опухолей Вакцина, состоящая из смеси аллогенных клеток клона MG50, секретирующих ГМ-КСФ и

инактивированных сингенных клеток B16-F10 является эффективным средством иммунопрофилактики меланомы В16, трансплантируемой мышам линии C57BI4 7 Вакцина, состоящая из комбинации клеток, секретирующих рекомбинантный ГМ-КСФ и клеток, продуцирующих рекомбинантный Tag-7, является более эффективным средством иммунопрофилактики меланомы В16, трансплантируемой мышам линии С57В1/6, чем вакцины, продуцирующие отдельно ГМ-КСФ или Tag-7.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Berezhnoy A Allogeneic Granulocyte-Macrophage colony-stimulating factor-secreting tumor vaccine for cancer immunotherapy preclinical investigation in murine model // Poster at "Current trends in comparative immunology", S -Petersburg, 2005, p 11

2 Berezhnoy A E , Saprykina N S , Lann S S , Kozlov A M and Baryshmkov A Yu Allogeneic GM-CSF-secreting anticancer vaccines preclinical evaluation // Poster at «BIOTECHNOLOGY AND ONCOLOGY», S-Petersburg, 2005, p 11

3 Бережной A E, Ларин С С , Бурова О С , Морозова JI Ф , Михайлова И Н , Киселев С Л , Демидов Л В , Барышников А Ю Получение стабильной линии клеток меланомы человека, секретирующей ГМ-КСФ // Российский биотерапевтический журнал, № 1, 2005, с 6

4 Berezhnoy А Е, Saprykina N S , Lann S S , Kozlov A M and Baryshmkov AYu Syngeneic and allogeneic GM-CSF-secreting anticancer vaccines preclinical evaluation // Poster at «The interface between immunology and medicine », Moscow, 2005, p 6

5 Berezhnoy A E , Saprykina N S , Burova О S , Morozova L F , Mikhailova IN, Kozlov A M , Georgiev G P , Baryshmkov A Yu, and Lann S S Allogeneic vs bystander antimelanoma vaccination preclinical evaluation // Poster at «CANCER VACCINES 2005 Barners, Endpoints & Opportunities», New York, USA, 2005, p-08

6 Baryshmkov A Yu, Berezhnoy A E , Kozlov A M , Georgiev G P, and Lann S S «Effectiveness of allogeneic GM-CSF-secreting antimelanoma vaccination depends on overlapping of antigens profile between vaccine and

tumor cells» // 6th International Conference on the Adjuvant Therapy of Malignant Melanoma, Stockholm, Sweden, 2006, p 31

7 Бережной A E , Закеева И P , Чернышева А Д, Кибардин А В , Михайлова И Н , Барышников А Ю , Демидов JIВ , Гнучев Н В , Георгиев Г П , Ларин С.С. Новые мишени для противоопухолевой иммунотерапии // Мат конференции «Фундаментальная наука - биотехнологии и медицине», Новосибирск, 2006, с 27

8 Бережной А Е, Георгиев Г П , Ларин С.С Комбинация генно-клеточных вакцин, активирующих факторы врожденного и адаптивного иммунного ответа, повышает эффективность противоопухолевой иммунотерапии // Мат конференции «Фундаментальная наука - биотехнологии и медицине», Новосибирск, 2006, с. 69

9 Berezhnoy А, Zakeyeva I, Kibardm А, Chemysheva А, Moiseenko V, Demidov L , Danilov A., Baryshmkov A , Gnuchev N , Georgiev G , and S Larin HLA-E expression m tumor cells in context of tumor immune rejection // Poster at «CANCER IMMUNOTHERAPY», New York, USA, 2006, p-07

10 Бережной A E , Закеева И P, Кибардин А В , Чернышева А Д, Моисеенко В М , Данилов А О, Демидов Л В , Барышников А Ю , Гнучев Н В , Георгиев Г П , Ларин С С Анализ экспрессии HLA-E в клетках меланомы человека // Российский биотерапевтический журнал, № 3,2006, с 66-71

11 Бережной А Е, Сапрыкина Н С , Барышников А Ю , Ларин С С, Козлов А М Изучение противоопухолевой активности вакцин на основе генетически модифицированных опухолевых клеток, секретирующих ГМ-КСФ Н Российский биотерапевтический журнал, № 4, 2006, с 47-53

12. Бережной А Е , Закеева И Р , Кибардин А В , Чернышева А Д, Моисеенко В М , Данилов А О, Михайлова И Н , Данилова А Б , Демидов Л В , Барышников А Ю, Гнучев Н В , Георгиев Г П, Ларин С С Выход молекулы HLA-E на поверхность клеток под действием интерферона-гамма защищает клетки меланомы от цитотоксического действия NK-клеток // Российский биотерапевтический журнал, № 1,2007, с 55

13 Володина Е В , Островская А С , Бережной А Е , Ларин С.С Изучение влияния цельноклеточных генно-инженерных вакцин на гуморальный противоопухолевый иммунитет // Российский биотерапевтический журнал, № 1,2007, с 56

Подписано в печать 11 04 07 г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ № 224 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН нм Н.Н Бчохинз РАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24

Оглавление диссертации Бережной, Алексей Евгеньевич :: 2007 :: Москва

Введение.

1. Обзор литературы, молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы.

1.1. Общие закономерности взаимодействия опухоли и иммунной системы.

1.2. Причины иммуногенности опухолевых клеток и стратегии иммунного распознавания опухолей.

1.3. Распознавание опухолей Т-лимфоцитами.

1.4. Опухолевые антигены как мишень противоопухолевой иммунотерапии.

1.4.1. Опухолевые антигены - продукты онкобелков и мутированных опухолевых супрессоров.

1.4.2. Опухолевые антигены, происходящие из молекул, создающих селективное преимущество для опухолевой клетки.

1.4.3. Опухолевые антигены, появляющиеся в результате нестабильности генома опухолевой клетки и опухолевой катаплазии.

1.5. Формирование и реализация противоопухолевого иммунного ответа.

1.6. Принципы рациональной иммунотерапии опухолей.

1.7. Механизм действия цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих ГМ-КСФ.

1.8. Разновидности цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих ГМ-КСФ.

1.9. Комбинирование как способ повышения эффективности вакцинотерапии опухолей

2. Материалы и методы.

2.1. Клеточные линии и их культивирование.

2.2. Трансфекция и получение стабильно трансфицированных клонов.

2.3. Определение ГМ-КСФ в супернатантах клеточных линий.

2.4. Инактивация клеток ионизирующим облучением.

2.5. Определение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток.

2.6. Экспериментальные животные.

2.7. Схемы иммунизации мышей и трансплантации опухолевых клеток.

2.8. Иммунизация мышей.

2.9. Трансплантация опухолевых клеток и учет динамики роста опухоли.

2.10. Статистическая обработка результатов.

3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Получение и характеристика цельноклеточной вакцины.

3.1.1. Получение стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы B16-F10 и меланомы Клаудмана S91-M3.

3.1.2. Изучение влияния гамма-облучения на пролиферативный потенциал стабильно трансфицированных клеток.

3.1.3. Влияние гамма-облучения на секрецию ГМ-КСФ стабильно трансфицированными опухолевыми клетками.

3.1.4. Влияние секреции рекомбинантного ГМ-КСФ на туморогенность клеток стабильно трансфицированных клонов.

Введение диссертации по теме "Онкология", Бережной, Алексей Евгеньевич, автореферат

Актуальность работы

Эффективность методов лечения злокачественных новообразований значительно возросла за последние десять лет. Появились препараты, активность которых основана на принципиально новых механизмах действия: ингибиторы протеасомальной деградации белков, антиангиогенные средства, ингибиторы сигнальных путей, поддерживающих злокачественный фенотип опухолевой клетки [51, 39, 42]. Кроме этого, эффективность известных противоопухолевых препаратов значительно увеличилась благодаря разработке новых лекарственных форм, применению их более совершенных аналогов, а также схем комбинированной терапии [130].

Вместе с тем, онкологические заболевания по-прежнему являются одной из наиболее распространенных причин смерти в Европе и Северной Америке [3]. Происходит это отчасти в силу того, что большинство фармакологических методов терапии опухолей, несмотря на новизну механизмов действия, оказывают влияние не только на опухолевые клетки, но и на нормальные клетки организма, для которых свойственна интенсивная пролиферация: эпителий кишечника, клетки иммунной системы. Воздействие противоопухолевых препаратов на нормальные клетки обуславливает побочные токсические явления, что ограничивает их применение и снижает эффективность. С другой стороны, препараты, обладающие чрезвычайно высокой избирательностью действия, становятся «заложниками» присутствия в опухолевых клетках конкретной белковой молекулы. В тоже время, происходящая в опухоли селекция, порождает клоны клеток с мутированной молекулой-мишенью, которые полностью теряют чувствительность к препарату [137].

Известно, что при терапии опухолевых заболеваний основной проблемой является не подавление первичного локального процесса, а предотвращение рецидивирования и метастатической диссеминации опухоли. Распространенным сценарием является эффективный курс терапии при первичном обращении пациента по поводу онкологического заболевания и последующее рецидивирование процесса с повторным обращением через год или более [139]. Химиотерапия и все иные современные методы противоопухолевой терапии эффективны на начальной стадии заболевания, однако не могут быть применены для контроля минимальной остаточной болезни и профилактики рецидивирования в силу токсичности и селекции устойчивых клонов опухолевых клеток.

Идеальное средство, предназначенное для профилактики рецидивов онкологических заболеваний должно обладать рядом качеств, а именно: минимальным побочным действием, длительностью противоопухолевого эффекта, а также способностью подавлять возникновение устойчивых опухолевых клонов. Примечательно, что эти же критерии характеризуют феномен иммунологической памяти - состояние активности иммунной системы, поддерживающее резистентность организма к повторному заражению [188]. Современные данные достоверно подтверждают способность иммунного ответа не только бороться с инфекционными заболеваниями, но и подавлять рост опухоли, а в некоторых случаях, обуславливать стойкую ремиссию пациентов, иммунных к антигенам неопластических клеток [139].

В основе иммунологических механизмов подавления роста опухоли лежит способность лимфоцитов к цитотоксическому действию в отношении клеток, экспонирующих на своей поверхности опухолевые антигены. Также установлено, что значимыми молекулами для реализации противоопухолевого иммунитета являются интерферон-гамма и его рецептор, экспрессируемый на клетках опухолевой стромы. Это позволяет предполагать, что противоопухолевый эффект иммунотерапии связан с цитотоксическим действием лимфоцитов в отношении опухолевых клеток и с локальным воздействием секретируемых лимфоцитами цитокинов, которые нарушают формирование опухолевого микроокружения [91].

Факторам противоопухолевого иммунитета противостоят защитные системы опухолевых клеток, опосредуемые растворимыми и поверхностными иммуносупрессорными молекулами [10, 171, 177], а также способность опухолевых клеток избегать инструктивного апоптоза [2, 156]. Взаимодействие противоопухолевого иммунного ответа и иммуносупрессивных факторов опухоли образует своего рода равновесие, поддерживаемое постоянным давлением иммунного ответа, с одной стороны, и селекцией иммунорезистентных опухолевых клонов, с другой.

Пластичность фенотипа опухолевых клеток и способность иммунитета селективно уничтожать определенные субклоны делает иммунную систему не только и не столько противоопухолевой защитой, сколько основной системой, формирующей фенотип опухолевых клеток [56]. Закономерным результатом этой селекции является появление опухолевых клеток не только резистентных к противоопухолевому иммунитету, но и использующих его для стимуляции роста и прогресии [101]. На уровне организма появление резистентных клеток и неспособность иммунной системы контролировать рост опухоли сопровождается прогрессией заболевания и появлением метастатических очагов: состоянием, в котором большая часть пациентов попадает на приём к врачам-онкологам.

Вместе с тем, баланс между опухолью и иммунитетом можно изменить при помощи стимуляции иммунного ответа вакцинами, или пассивного переноса антител или 8 противоопухолевых лимфоцитов. Значительные успехи в иммунотерапии опухолей достигнуты при помощи переноса противоопухолевых Т-лимфоцитов, а также вакцин на основе аутологичных дендритных клеток и аллогенных цельноклеточных генно-инженерных вакцин, секретирующих рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) [94,103,151].

Из методов эффективной иммунотерапии опухолей наиболее технологичным является вакцинотерапия - введение в организм опухолевых антигенов в комплексе с адъювантами, способствующими развитию специфического противоопухолевого иммунитета. Адъюванты способны изменять иммунологический контекст, в котором опухолевые антигены встречаются с иммунной системой: в таком окружении нивелируется иммуносупрессорное воздействие опухоли, а также создаются оптимальные условия для формирования эффективного иммунитета против иммуногенных опухолевых антигенов.

Хорошими адъювантами являются различные факторы, обеспечивающие активацию иммунной системы (двуспиральная РНК вирусов, липополисахарид и протеогликаны бактериальной мембраны и др.) и некоторые цитокины, секретируемые при такой активации. Прямым сравнением было показано, что усиления противоопухолевой активности вакцинотерапии можно достичь, используя в качестве адъювантов ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-1, ИЛ-7, фактор стволовых клеток, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, однако наибольшей активностью обладает ГМ-КСФ [52].

Опыт клинического применения ГМ-КСФ-секретирующих вакцин из транзиторно трансфицированных аутологичных опухолевых клеток пациентов подтвердил эффективность такого вида биотерапии опухолей человека. Позитивные клинические изменения были получены у 25-30% пациентов с III и IV стадией меланомы, недостаточно отвечающих на предшествующие курсы химиотерапии [165, 166]. Дополнительным преимуществом вакцин, секретирующих ГМ-КСФ, оказались хорошая переносимость и широкий (в сравнении с ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, интерфероном-гамма) интервал терапевтических доз [157].

В то же время, противоопухолевая вакцинация оказалась недостаточно эффективной в качестве самостоятельного средства терапии злокачественных новообразований. Сложившаяся ситуация подталкивает исследователей к поиску более эффективных комбинаций иммунотерапевтических методов с радио- и химиотерапией, а также к сочетанному применению иммунопрепаратов, воздействующих на разные этапы формирования и реализации противоопухолевого иммунного ответа.

Цель работы:

Задачи работы:

1. Разработать экспериментальную модельную систему для доклинического изучения эффективности противоопухолевой иммунотерапии мышей.

2. Получить стабильно трансфицированные геном ГМ-КСФ линии клеток меланомы мышей с высоким уровнем продукции ГМ-КСФ и разработать рациональные подходы к созданию на их основе противоопухолевых вакцин.

3. Изучить эффективность иммунотерапии опухолей генно-инженерными клеточными вакцинами в зависимости от характеристик вакцины и особенностей экспериментальной модели опухоли.

4. Оценить возможность повышения активности генно-инженерных вакцин, оптимизируя антигенный спектр включением в их состав клеток различных опухолей.

5. Изучить возможности повышения эффективности противоопухолевой иммунотерапии путем применения вакцин, состоящих из смеси клеточных линий, экспрессирующих различные цитокины.

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые разработана экспериментальная модельная система для доклинического изучения эффективности иммунотерапии меланомы ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами. Впервые проведено корректное сравнение эффективности иммунопрофилактики низкоиммуногенной меланомы В16 и высокоиммуногенной меланомы М-3 иммунотерапии ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами в сингенном и аллогенном режиме. Впервые для разработанного типа вакцин проанализировано значение аллогенной стимуляции для индукции эффективного противоопухолевого иммунного ответа.

Впервые показана недостаточная эффективность аллогенной ГМ-КСФ-секретирующей клеточной вакцины на основе генно-модифицированных клеток линии М-3 для иммунопрофилактики меланомы B16-F10. Установлено, что включение в состав аллогенной вакцины инактивированных немодифицированных сингенных опухолевых клеток повышает эффективность применения вакцины до уровня эффективности сингенной вакцины.

Впервые изучена эффективность комбинированных клеточных вакцин, состоящих из смеси клеток, продуцирующих белки Tag-7 и ГМ-КСФ. Показан синергизм

10 адьювантной активности этих молекул в составе генно-модифицированных клеточных вакцин.

Научно-практическая значимость

Выполненная работа выявила недостаточность совпадения спектров опухолевых антигенов вакцины и опухоли -мишени для эффективной иммунопрофилактики экспериментальной меланомы, что должно найти отражение в клинической практике использования аллогенных ГМ-КСФ-секретирующих вакцин. Изучение эффективности иммунопрофилактики в модельных системах показало, что наиболее универсальным и эффективным средством вакцинотерапии опухолей являются байстендерные вакцины, состоящие из смеси аллогенных клеток, секретирующих ГМ-КСФ и клеток сингенной опухоли.

Изучение вакцины на основе смеси клеток продуцирующих Tag-7 и ГМ-КСФ выявило увеличение эффективности комбинированной вакцины по сравнению с вакцинами, состоящими из клеток, продуцирующих один из цитокинов. Применение подобной вакцины для иммунотерапии пациентов со злокачественной меланомой способно повысить эффективность вакцинотерапии.

В настоящее время в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина проходят ограниченные испытания вакцины на основе аллогенных опухолевых клеток, продуцирующих Tag-7 человека, также вакцины на основе аллогенных клеток меланомы человека, секретирующих ГМ-КСФ человека. Результаты настоящей работы, посвященной доклиническому изучению вакцин на основе опухолевых клеток, генетически модифицированных генами иммунологически активных молекул, учитываются при проведении клинических испытаний.

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин"

5. Выводы

1. Получен набор стабильно трансфицированных клеточных линий меланомы мышей, продуцирующих рекомбинантный ГМ-КСФ в различных количествах. Клетки клонов меланомы Клаудмана S91-M3 (MG10) и меланомы B16-F10 (BG10) секретируют 10 нг ГМ-КСФ на 106 кл/24 часа. Клетки клонов меланомы Клаудмана S91-M3 (MG50) и меланомы B16-F10 (BG50) секретируют 50 нг ГМ-КСФ на 106 кл/24 часа.

2. Инактивация путем гамма-облучения в дозе 100 Гр предотвращает пролиферацию клеток данных клонов, но сохраняет их жизнеспособность и секрецию ГМ-КСФ.

3. Создана и апробирована экспериментальная модельная система для изучения эффективности и механизмов аллогенной противоопухолевой вакцинации на примере использования генно-инженерных клеточных вакцин гаплотипа H-2d для мышей гаплотипа Н-2Ь и наоборот вакцин гаплотипа Н-2Ь, для мышей гаплотипа Н-2d.

4. Эффективность противоопухолевой иммунотерапии цельноклеточными ГМ-КСФ-секретирующими вакцинами зависит от экспериментальной модели опухоли: меланома Клаудмана S91 (клон МЗ), экспрессирующая антигены МНС I класса, трансплантируемая мышам линии DBA/2, высоко чувствительна к воздействию противоопухолевой иммунизации, в то время как меланома В16 (клон F10), не экспрессирующая антигены МНС, трансплантируемая мышам линии C57BI/6, более устойчива к противоопухолевой иммунизации.

5. Увеличение количества секретируемого клетками вакцины ГМ-КСФ с 10 до 50 нг (106 кл/24 часа) повышает эффективность иммунопрофилактики меланомы В16 в сингенной системе, однако не оказывает влияние на эффективность аллогенной иммунизации.

6. Оптимизация антигенного состава вакцины, увеличивает эффективность иммунотерапии низкоиммуногенных опухолей. Вакцина, состоящая из смеси аллогенных клеток клона MG50, секретирующих ГМ-КСФ и инактивированных сингенных клеток B16-F10 является эффективным средством иммунопрофилактики меланомы В16, трансплантируемой мышам линии C57BI/6.

7. Вакцина, состоящая из комбинации клеток, секретирующих рекомбинантный ГМ-КСФ и клеток, продуцирующих рекомбинантный Tag-7, является более эффективным средством иммунопрофилактики меланомы В16, трансплантируемой мышам линии C57BI/6, чем вакцины, продуцирующие отдельно ГМ-КСФ или Tag-7.

4. Заключение

Вакцинотерапия опухолей активно развивается последние десятилетия, отчасти благодаря тому, что не существует рациональных альтернатив для профилактики рецидивирования и метастазирования опухолевых заболеваний у пациентов, находящихся в ремиссии. Изначально предложенная в качестве средства лечения злокачественных опухолей, вакцинотерапия нашла свое применение скорее как профилактическое, а не терапевтическое средство. Такие методы как вакцинация против опухолеродных вирусов у здоровых людей, а также применение вакцин на основе дендритных клеток и генно-модифицированных опухолевых клеток у пациентов, находящихся в ремиссии, становятся во многих странах стандартным методом профилактики злокачественных новообразований [18]. Однако, вместе с хорошим опытом клинического применения, существуют случаи, когда выбранные методы вакцинации оказывались неэффективными и, в отдельных случаях, приводили к стимуляции роста опухолей [150]. Закономерности, лежащие в основе как позитивных, так и негативных последствий известны только в общих чертах.

В настоящий момент идентифицированы ключевые регуляторы, управляющие развитием иммунного ответа. Более того, осуществлены успешные попытки терапии заболеваний при помощи управления цитокиновыми каскадами [26]. Современные методы генной инженерии открывают возможности создания широкого разнообразия вакцин на основе трансгенных опухолевых клеток. Подтвержденная эффективность применения аллогенных опухолевых клеток в качестве основы получения вакцин позволяет ориентироваться на широкомасштабное внедрение разработанных вакцин в клиническую практику лечения онкологических заболеваний. Все это делает актуальным задачу изучения основ эффективности противоопухолевых вакцин и поиска путей увеличения этой эффективности.

В настоящей работе мы создали две различных модели противоопухолевой иммунопрофилактики и изучили эффективность применения цельноклеточных ГМ-КСФ-секретирующих вакцин в режиме сингенной и аллогенной профилактики. Мы выявили высокую эффективность как сингенных, так и аллогенных вакцин против высокоиммуногенных опухолей, и только умеренный эффект по отношению к низкоиммуногенным. Полученные результаты указывают на то, что одним из наиболее важных факторов, обуславливающих эффективность профилактической иммунопрофилактики опухолей, является мишень, на которую направлен иммунный ответ. Экстраполируя наши результаты в область клинического использования противоопухолевой иммунопрофилактики, можно заключить, что поиск и подбор пациентов, имеющих опухоли со сниженной иммунорезистентностью, способен кардинально повысить эффективность применения вакцин.

Изучение эффектов аллогенной иммунопрофилактики показало, что, аллогенные молекулы главного комплекса гистосовместимости, экспрессированные на клетках вакцины, не препятствуют пребыванию клеток в организме в течение периода времени, необходимого для формирования противоопухолевого иммунного ответа. Поскольку на клетках аллогенной вакцины отсутствуют варианты молекул гистосовместимости I класса, необходимые для стимуляции у вакцинируемых мышей CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, отвечающих за отторжение сингенной опухоли, высоко вероятно, что противоопухолевые лимфоциты формируются в результате функционирования собственных АПК вакцинируемых животных. Данный факт подкрепляет возможность применения в клинической практике вакцин на основе аллогенных клеточных линий без учета совпадения аллельных вариантов молекул гистосовместимости у пациента и клеток используемой аллогенной вакцины.

Поскольку применение аллогенных клеток стимулирует реакции трансплантационного отторжения, эффективность повторной вакцинации может существенно снижаться за счет ускоренного уничтожения клеток вакцины аллореактивными факторами адаптивного иммунитета. Возможным вариантом получения стабильной реакции на вакцину, без снижения эффективности при ее повторных введениях, является применение клеточных линий, не экспрессирующих антигенов гистосовместимости на клеточной поверхности. В модельной системе мы изучили данный аспект и выяснили, что отсутствие молекул МНС на поверхности клеток вакцины также не нарушает формирования противоопухолевого иммунитета.

В то же время, исследование эффективности иммунотерапии опухолей в режиме аллогенной профилактической иммунизации показало, что перекрывание антигенного состава вакцины и опухоли имеет решающее значение для формирования протективного иммунитета. Существенно то, что совпадения значительного числа антигенов в составе вакцины и опухоли оказалось недостаточным для защиты иммунизированных мышей от формирования у них опухолей после трансплантации сингенных клеток. Байстендерная вакцина, состоящая из смеси аллогенных клеток, продуцирующих цитокин и сингенных клеток, оказалась наиболее универсальным средством иммунопрофилактики опухолей, поскольку в данном случае присутствие всех антигенов опухоли комбинировалось со стабильным источником иммуностимулирующего цитокина. Именно байстендерную вакцину можно рекомендовать в качестве препарата выбора для иммунопрофилактики рецидивирования опухолевого процесса у пациентов.

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор является цитокином, активность которого придает свойства вакцины клеткам низкоиммуногенных опухолевых линий. Доказано, что паракринно секретируемый ГМ-КСФ является наиболее мощным средством стимуляции противоопухолевого иммунитета при цельноклеточной вакцинации [52]. Известно также, что эффективность цельноклеточных вакцин, секретирующих рекомбинантный цитокин, можно повысить при помощи комбинирования иммунизации с применением препаратов, блокирующих опухолевую иммуносупрессию. В настоящей работе мы показали, что эффективность иммунотерапии опухолей при помощи цельноклеточной вакцинации можно повысить путем сочетания в составе вакцины клеточных линий, продуцирующих рекомбинантные белки, участвующие в регуляции различных составляющих иммунного ответа.

Применение комбинированной вакцины, состоящей из смеси клеток, продуцирующих Tag-7 и ГМ-КСФ существенно повышает результативность иммунизации. Комбинация вакцин продуцирующих Tag-7 и ГМ-КСФ доступна для использования в клинической практике, благодаря тому, что данные препараты разработаны [6], а эффективность и безопасность их раздельного применения показана в серии клинических испытаний. Кроме того, усиление эффективности противоопухолевой иммунотерапии без вмешательства в процессы опухолевой иммуносупрессии оставляет возможность для дальнейшего увеличения эффективности иммунотерапии.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2007 года, Бережной, Алексей Евгеньевич

1. Брондз Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании. М.: Наука, 1987.

2. Дейчман Г.И. Естественный отбор и ранние изменения фенотипа опухолевых клеток in vivo: приобретение механизмов защиты. Биохимия. 2000; 65:92-111.

3. Заридзе Д.Г. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований. В кн. «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе. -М: Медицина, 2004.

4. Киселев, СЛ., Ларин, С.С., Гнучев, Н.В., Георгиев, Г.П. Ген tag7 и генотерапия рака. Генетика. 2000,36:1431-1435.

5. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых принципов канцерогенеза. // Биохимия. 2000 Т. 65, С.5-33.

6. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Палкина Т.Н., Козлов A.M., Голубева В.А., Черемушкин Е.А., Дорошенко М.Б., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Ларин С.С. Георгиев Г.П. // Вестник РАМН 2005 Т.7, С.37-40.

7. Радиобиология человека и животных. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Москва, Высшая школа; 2004.

8. Andersen MH, Thor SP. Survivin a universal tumor antigen. // Histol Histopathol. 2002 Vol. 17, P.669-75.

9. Banchereau, J., Steinman, R.M Dendritic cells and the control of immunity. // Nature 1998 Vol. 392, P.245-252.

10. Bauer, S., Groh, V., Wu, J., Steinle, A., Phillips, J.H., Lanier, L.L., Spies, T. Activation of Ж cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. // Science 1999 Vol. 285, P.727-729.

11. Bendelac, A., Rivera, M.N., Park, S.H., Roark, J.H. Mouse CDl-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. //Annu. Rev. Immunol. 1997 Vol. 15, P.535-562

12. Berd, D., Maguire, H.C.J., McCue, P., Mastrangelo, M.J. Treatment of metastatic melanoma with an autologous tumor-cell vaccine: clinical and immunologic results in 64 patients. // Clin. Oncol. 1990 Vol. 8, P.1858-1867.

13. Bernards R, Destree A, McKenzie S, Gordon E, Weinberg RA, Panicali D. Effective tumor immunotherapy directed against an oncogene-encoded product using a vaccinia virus vector. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987 Vol. 84, P.6854-6858.

14. Berzofsky JA, Terabe M, Oh S, Belyakov IM, Ahlers JD, Janik JE, Morris JC. Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer. // J Clin Invest. 2004 Vol. 113, P. 1515-25.

15. Biassoni R, Cantoni C, Marras D, Giron-Michel J, Falco M, Moretta L, Dimasi N. Human natural killer cell receptors: insights into their molecular function and structure. // J Cell Mol Med. 2003 Vol. 7, P.376-87.

16. Blankenstein T, Rowley DA, Schreiber H. Cytokines and cancer: experimental systems. // Curr Opin Immunol. 1991 Vol. 3, P.694-8.

17. Blankenstein T. The role of tumor stroma in the interaction between tumor and immune system. // Curr Opin Immunol. 2005 Vol. 17, P. 180-6.

18. Boczkowski, D., Nair, S.K., Snyder, D., Gilboa, E. Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo. // J. Exp. Med. 1996 Vol. 184, P.465-472.

19. Boon Т., Van den Eynde B.J. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. International Journal Clinical Laboratory Research //1997 Vol. 27, P.81-6.

20. Borrello I, Pardoll D. GM-CSF-based cellular vaccines: a review of the clinical experience. // Cytokine Growth Factor Rev. 2002 Vol. 13, P. 185-193.

21. Braun J, Sieper J. Therapy of ankylosing spondylitis and other spondyloarthritides: established medical treatment, anti-TNF-alpha therapy and other novel approaches. // Arthritis Res. 2002 Vol. 4, P.307-21.

22. Brumbaugh KM, Binstadt BA, Billadeau DD, Schoon RA, Dick CJ, Ten RM, Leibson PJ. Functional role for Syk tyrosine kinase in natural killer cell-mediated natural cytotoxicity. //J Exp Med. 1997 Vol. 186, P. 1965-74.

23. Burgess, A.W. and Metcalf, D. The nature and action of granulocyte-macrophage colony stimulating factors. // Blood 1980 Vol. 56, P.947-958.

24. Burnet, F.M. (1970). The concept of immunological surveillance. Prog. Exp. Tumor Res. 13,1-27.

25. Cahalan MD, Parker I. Imaging the choreography of lymphocyte trafficking and the immune response. // Curr Opin Immunol. 2006 Vol. 18, P.476-82

26. Cancer Biology в книге Cancer Medicine. 6th ed. Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C., Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil, editors. Hamilton (Canada): ВС Decker Inc; 2003.

27. Cancer Immunome Database Ludwig Institute for Cancer Research, Office of Information Technology Lausanne, Switzerland http://www2.licr.org/CancerImmunomeDB/

28. Carr WH, Pando MJ, Parham P. KIR3DL1 polymorphisms that affect Ж cell inhibition by HLA-Bw4 ligand. // J Immunol. 2005 Vol. 175, P.5222-9.

29. Cavaillon J.M. Cytokines and macrophages. // Biomedical Pharmacotherapy 1994 Vol. 48, P. 445-53.

30. Chang EY, Chen CH, Ji H, Wang TL, Hung K, Lee BP, Huang AY, Kurman RJ, Pardoll DM, Wu T. Antigen-specific cancer immunotherapy using a GM-CSF secreting allogeneic tumor cell-based vaccine. // International Journal of Cancer. 2000 Vol. 86, P.725-30.

31. Chang JT, Morton SC, Rubenstein LZ, Mojica WA, Maglione M, Suttorp MJ, Roth EA, Shekelle PG. Interventions for the prevention of falls in older adults: systematic review and meta-analysis of randomised clinical trials. // BMJ. 2004 Vol. 328, P.680.

32. Chaperot L, Jacob MC, Molens JP, Manches O, Bensa JC, Plumas J. From the study of tumor cell immunogenicity to the generation of antitumor cytotoxic cells in non-Hodgkin's lymphomas. // Leuk Lymphoma. 2000 Vol. 38, P.247-63.

33. Chauhan D, Hideshima T, Anderson КС. Proteasome inhibition in multiple myeloma: therapeutic implication. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2005 Vol. 45 P.465-76.

34. Chen PW, Wang M, Bronte V, Zhai Y, Rosenberg SA, Restifo NP. Therapeutic antitumor response after immunization with a recombinant adenovirus encoding a model tumor-associated antigen. // J Immunol. Vol. 156, P.224-231.

35. Cohen EE. Role of epidermal growth factor receptor pathway-targeted therapy in patients with recurrent and/or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck. // J Clin Oncol. 2006 Vol. 24, P.2659-65.

36. Coley WB. The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas: with a report often original cases. // Am J Med Sci 1893 Vol. 105, P.487-511.113

37. Coley WB. Treatment of inoperable malignant tumors with toxins of erysipelas and the bacillus prodigiosus. // Trans Am Surg Assn 1894 Vol. 12, P. 183-212.

38. Deichman GI, Kluchareva ТЕ. Prevention of tumour induction in SV40-infected hamsters. // Nature. 1964 Vol. 202, P. 1126-8.

39. Diefenbach A, Jensen ER, Jamieson AM, Raulet DH. Rae 1 and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity. // Nature. 2001 Vol. 413, P. 165-71.

40. Diefenbach A, Tomasello E, Lucas M, Jamieson AM, Hsia JK, Vivier E, Raulet DH. Selective associations with signaling proteins determine stimulatory versus costimulatory activity of NKG2D. //Nat Immunol. 2002 Vol. 12, P.l 142-1149.

41. Disis, M.L., Cheever, M.A. Oncogenic proteins as tumor antigens. // Curr. Opin. Immunol., 1996 Vol. 8, P.637-642.

42. Dolle L, Depypere HT, Bracke ME. Anti-invasive/anti-metastasis strategies: new roads, new tools and new hopes. // Curr Cancer Drug Targets. 2006 Vol. 8, P.729-51.

43. Dranoff G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. // Nat Rev Cancer. 2004 Vol. 4, P.l 1-22.

44. Dranoff G. GM-CSF-secreting melanoma vaccines. // Oncogene. 2003 Vol. 22, P.3188-92.

45. Driessens G, Hamdane M, Cool V, Velu T, Bruyns C. Highly successful therapeutic vaccinations combining dendritic cells and tumor cells secreting granulocyte macrophage colony-stimulating factor. Cancer Res. 2004 Nov 15;64(22):8435-42.

46. Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. // Nature Immunology. 2002 Vol, 11, P.991-8.

47. Emens LA. Roadmap to a better therapeutic tumor vaccine. // Int Rev Immunol. 2006 Vol.25, P. 415-43.

48. Feldman JD. Immunological enhancement: a study of blocking antibodies. // Advances in Immunology. 1972 Vol. 15, P.167-214.

49. Fidler IJ. Biological behavior of malignant melanoma cells correlated to their survival in vivo. // Cancer Res. 1975 Vol. 35, P.218-224.

50. Fogler WE, Fidler IJ. Nonselective destruction of murine neoplastic cells by syngeneic tumoricidal macrophages. // Cancer Res. 1985 Vol. 45, P. 14-8.

51. Fry AM, Lanier LL, Weiss A. Phosphotyrosines in the killer cell inhibitory receptor motif of NKB1 are required for negative signaling and for association with protein tyrosine phosphatase 1С. // J Exp Med. 1996 Vol. 184, P.295-300.

52. Fulginiti VA, Papier A, Lane JM, Neff JM, Henderson DA. Smallpox vaccination: a review, part I. Background, vaccination technique, normal vaccination and revaccination, and expected normal reactions. // Clin Infect Dis. 2003 Vol. 37, P.241-50.

53. Gallimore A, Hengartner H, Zinkernagel R. Hierarchies of antigen-specific cytotoxic T-cell responses. // Immunol Rev. 1998 Vol. 164, P.29-36.

54. Garcia-Lora A, Algarra I, Collado A, Garrido F. Tumour immunology, vaccination and escape strategies. //European Journal of Immunogenetic 2003 Vol. 30, P.177-83.

55. Gasser S, Raulet D. The DNA damage response, immunity and cancer. // Semin Cancer Biol. 2006 Vol. 16, P.344-7.

56. Gattinoni L, Powell DJ Jr, Rosenberg SA, Restifo NP. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. // Nat Rev Immunol. 2006 Vol. 6, P.383-93.

57. Gavin A., Hoebe K., Duong В., Ota Т., Martin C., Beutler В., Nemazee D. Adjuvant-Enhanced Antibody Responses in the Absence of Toll-Like Receptor Signaling. // Science 2006 Vol. 314, P. 1936-1938.

58. Girardi M, Oppenheim DE, Steele CR, Lewis JM, Glusac E, Filler R, Hobby P, Sutton B, Tigelaar RE, Hayday AC. Regulation of cutaneous malignancy by gammadelta T cells. // Science. 2001 Vol. 294, P.605-9.

59. Golumbek PT, Azhari R, Jaffee EM, Levitsky HI, Lazenby A, Leong K, Pardoll DM. Controlled release, biodegradable cytokine depots: a new approach in cancer vaccine design. // Cancer Res. 1993 Vol. 53, P. 1-4.

60. Gorbachev AV, Fairchild RL. Activated NKT cells increase dendritic cell migration and enhance CD8+ T cell responses in the skin. // Eur J Immunol. 2006 Vol. 36, P.2494-503.

61. Groh V, Bahram S, Bauer S, Herman A, Beauchamp M, Spies T. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Vol. 93, P.12445-50.

62. Groh V, Rhinehart R, Randolph-Habecker J, Topp MS, Riddell SR, Spies T. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. // Nat Immunol. 2001 Vol. 2, P.255-60.

63. Groh, V., Rhinehart, R., Secrist, H., Bauer, S., Grabstein, K.H., Spies, T. Broad tumor-associated expression and recognition by tumor-derived gamma delta T cells of MICA and MICB. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 Vol. 96, P.6879-6884.

64. Guevara-Patino JA, Engelhorn ME, Turk MJ, Liu C, Duan F, Rizzuto G, Cohen AD, Merghoub T, Wolchok JD, Houghton AN. Optimization of a self antigen for presentation of multiple epitopes in cancer immunity. // J Clin Invest. 2006 Vol. 116, P. 1382-90.

65. Gupta GP, Massague J. Cancer metastasis: building a framework. // Cell. 2006 Vol. 127, P.679-95.

66. Hamerman JA, Lanier LL. Inhibition of immune responses by ITAM-bearing receptors. // Sci STKE. 2006 Jan 31;2006(320):network relise

67. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. // Cell. 2000 Vol. 100, P. 57-70.

68. Hege KM, Jooss K, Pardoll D. GM-CSF gene-modified cancer cell immunotherapies: of mice and men. // Int Rev Immunol. 2006 Vol. 25, P.321-52.

69. Hilleman, M.R. Six decades of vaccine development a personal history. // Nature Med. 2004 Vol. 4, P.507-514.

70. Hombach A, Kohler H, Rappl G, Abken H. Human CD4+ T cells lyse target cells via granzyme/perforin upon circumvention of MHC class II restriction by an antibody-like immunoreceptor. // J Immunol. 2006 Oct Vol. 177, P.5668-75.

71. Hsu FJ, Benike C, Fagnoni F, Liles TM, Czerwinski D, Taidi B, Engleman EG, Levy R. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. // Nat. Med. 1996 Vol. 2, P.52-58.

72. Huang AY, Golumbek P, Ahmadzadeh M, Jaffee E, Pardoll D, Levitsky H. Role of bone marrow-derived cells in presenting MHC class I-restricted tumor antigens. // Science 1994 Vol. 264, P.961-965.

73. Hurwitz AA, Yu TF, Leach DR, Allison JP. CTLA-4 blockade synergizes with tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor for treatment of an experimental mammary carcinoma. // Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Vol. 95, P. 1006771.

74. Ibe S, Qin Z, Schuler T, Preiss S, Blankenstein T. Tumor rejection by disturbing tumor stroma cell interactions // J. Exp. Med. 2001 Vol. 194, P. 1549-1559.

75. Jaffee EM, Pardoll DM. Considerations for the clinical development of cytokine gene-transduced tumor cell vaccines. // Methods. 1997 Vol. 12, P. 143-53.

76. Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. // Annu Rev Immunol. 2002 Vol. 20, P. 197-216.

77. Janeway CA., Travers P., Walport M., Shlomchik M. Immunobiology 5th ed. Garland Science; 2001.

78. Kabelitz D, Wesch D, He W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. // Cancer Res. 2007 Vol. 67, P.5-8.

79. Kabelitz D, Wesch D. Features and functions of gamma delta T lymphocytes: focus on chemokines and their receptors. // Crit Rev Immunol. 2003 Vol. 23, P.339-70.

80. Karin M, Greten FR. NF-kappaB: linking inflammation and immunity to cancer development and progression. // Nat Rev Immunol. 2005 Vol. 10, P.749-59.

81. Kayaga J, Souberbielle BE, Sheikh N, Morrow WJ, Scott-Taylor T, Vile R, Chong H, Dalgleish AG. Anti-tumour activity against B16-F10 melanoma with a GM-CSF secreting allogeneic tumour cell vaccine. // Gene Ther. 1999 Vol. 6, P.1475-81.

82. Kircheis, R., Kupcu, Z., Wallner, G, Wagner, E. Cytokine gene-modified tumor cells for prophylactic and therapeutic vaccination: IL-2, INF-y, or combination IL-2 + INF-y. // Cytokines, Cel. Mol. Ther. 1998 Vol. 4, P.95-103.

83. Kiselev, S.L., Kustikova, O.S., Korobko, E.V., Prokhortchouk, E.B., Kabishev, A.A., Lukanidin, E.M., Georgiev, G.P. Molecular cloning and characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine. J. Biol. Chem. 1998 Vol. 273, P.18633-18639.

84. Knuth A, Wolfel T, Meyer zum Buschenfelde KH. Cellular and humoral immune responses against cancer: implications for cancer vaccines. // Curr Opin Immunol. 1991 Vol. 3, P.659-64.

85. Kopnin B. Genetic events responsible for colorectal tumorigenesis: achievements and challenges. //Tumori. 1993 Vol. 79, P.235-43.

86. Kretschmer K, Apostolou I, Jaeckel E, Khazaie K, von Boehmer H. Making regulatory T cells with defined antigen specificity: role in autoimmunity and cancer. // Immunol Rev. 2006 Vol.212, P. 163-9.

87. Larin SS, Georgiev GP, Kiselev SL. Gene transfer approaches in cancer immunotherapy. // Gene Ther. 2004 Vol. 11, S. 18-25

88. Leach, D.R., Krummel, M.F., Allison, J.P. Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. // Science 1996 Vol. 271, P.1734-1736.

89. Leibson PJ. The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptors. // Curr Opin Immunol. 2004 Vol. 16, P.328-36.

90. Logunova NN, Viret C, Pobezinsky LA, Miller SA, Kazansky DB, Sundberg JP, Chervonsky AV. Restricted МНС-peptide repertoire predisposes to autoimmunity. // J Exp Med. 2005 Vol. 202, P.73-84.

91. Lupu R, Lippman ME. William L. McGuire Memorial Symposium. The role of erbB2 signal transduction pathways in human breast cancer. // Breast Cancer Res Treat. 1993 Vol. 27, P.83-93.

92. Maker AV, Attia P, Rosenberg SA. Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA-4 blockade. // J Immunol. 2005 Vol. 175, P.7746-54.

93. Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. // Trends Immunol. 2002 Vol. 23, P.549-55.

94. Markiewicz MA, Kast WM. Progress in the development of immunotherapy of cancer using ex vivo-generated dendritic cells expressing multiple tumor antigen epitopes. // Cancer Invest. 2004 Vol. 22, P.417-34.

95. Markowicz S, Engleman EG. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promotes differentiation and survival of human peripheral blood dendritic cells in vitro. // Journal of Clinical Investigation 1990 Vol. 85, P.955-61.

96. Marsman M, Jordens I, Griekspoor A, Neefjes J. Chaperoning antigen presentation by MHC class II molecules and their role in oncogenesis. // Adv Cancer Res. 2005 Vol. 93P. 129-58.

97. Martin GS. Cell signaling and cancer. // Cancer Cell. 2003 Vol. 4, P. 167-74.

98. Martinez FO, Gordon S, Locati M, Mantovani A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: new molecules and patterns of gene expression. // J Immunol. 2006 Vol. 177, P.7303-11.

99. Merlo LM, Pepper JW, Reid BJ, Maley CC. Cancer as an evolutionary and ecological process. // Nat Rev Cancer. 2006 Vol. 12, P.924-35.

100. Minko T, Pakunlu RI, Wang Y, Khandare JJ, Saad M. New generation of liposomal drugs for cancer. // Anticancer Agents Med Chem. 2006 Vol. 6, P.537-52.

101. Morel Y, Truneh A, Sweet RW, Olive D, Costello RT. The TNF superfamily members LIGHT and CD 154 (CD40 ligand) costimulate induction of dendritic cell maturation and elicit specific CTL activity. //J Immunol. 2001 Vol. 167, P.2479-86.

102. Nair S, McLaughlin C, Weizer A, Su Z, Boczkowski D, Dannull J, Vieweg J, Gilboa E. Injection of immature dendritic cells into adjuvant-treated skin obviates the need for ex vivo maturation. // J Immunol. 2003 Vol. 171, P.6275-82.

103. Nouri-Shirazi M, Banchereau J, Bell D, Burkeholder S, Kraus ET, Davoust J, Palucka KA. Dendritic cells capture killed tumor cells and present their antigens to elicit tumor-specific immune responses. //J Immunol. 2000 Vol. 165, P.3797-803.

104. Ohm JE, Carbone DP. VEGF as a mediator of tumor-associated immunodeficiency. // Immunol Res. 2001 Vol. 23, P.263-72.

105. Ohnmacht GA, Wang E, Mocellin S, Abati A, Filie A, Fetsch P, Riker AI, Kammula US, Rosenberg SA, Marincola FM. Short-term kinetics of tumor antigen expression in response to vaccination. // J Immunol. 2001 Vol. 167, P. 1809-20.

106. Pao W, Miller VA, Politi KA, Riely GJ, Somwar R, Zakowski MF, Kris MG, Varmus H. Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. // PLoS Med. 2005 Vol. 3, E.73.

107. Pardoll D. Stress, Ж Receptors, and Immune Surveillance. // Science 2003 Vol. 294, P. 534-538.

108. Pardoll D.M. Spinning Molecular immunology into successful immunotherapy. // Nature Reviews Immunology 2002 Vol. 2, P.227-238.

109. Park D, Lapteva N, Seethammagari M, Slawin KM, Spencer DM. An essential role for Aktl in dendritic cell function and tumor immunotherapy. Nat Biotechnol. 2006 Vol. 24, P.1581-90.

110. Peter I, Mezzacasa A, LeDonne P, Dummer R, Hemmi S. Comparative analysis of immunocritical melanoma markers in the mouse melanoma cell lines B16, K1735 and S91-M3.//Melanoma Res. 2001 Vol. 11, P. 21-30.

111. Prell RA, Li B, Lin JM, VanRoey M, Jooss K. Administration of IFN-alpha enhances the efficacy of a granulocyte macrophage colony stimulating factor-secreting tumor cell vaccine. // Cancer Res. 2005 Vol. 65, P.2449-56.

112. Prigione I, Corrias MV, Airoldi I, Raffaghello L, Morandi F, Bocca P, Cocco C, Ferrone S, Pistoia V. Immunogenicity of human neuroblastoma. // Ann N Y Acad Sci. 2004 Vol. 1028, P.69-80.

113. Raffaghello L, Pistoia V. Immunotherapy of neuroblastoma: present, past and future. // Expert Rev Neurother. 2006 Vol. 6, P.509-18.

114. Robinson B. W., R.A. Lake, D.J. Nelson, B.A. Scott and A.L. Marzo. Cross-presentation of tumour antigens: Evaluation of threshold, duration, distribution and regulation. // Immunology and Cell Biology 1999 Vol. 77, P.552.

115. Rosenberg SA, Yang JC, Restifo NP. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. //Nat Med. 2004 Vol. 10, P.909-15.

116. Sansom DM, Walker LS. The role of CD28 and cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) in regulatory T-cell biology. // Immunol Rev. 2006 Vol. 212, P. 131-48.

117. Sanz L, Alvarez-Vallina L. Antibody-based antiangiogenic cancer therapy. // Expert Opin Ther Targets. 2005 Vol. 9, P. 1235-45.

118. Schmidt W, Schweighoffer T, Herbst E, Maass G, Berger M, Schilcher F, Schaffner G, Birnstiel ML. Cancer vaccines: the interleukin 2 dosage effect. // Proceeding of the National Academy of Science USA 1995 Vol. 92, P.4711-4.

119. Seliger B. Strategies of tumor immune evasion. // BioDrugs. 2005 Vol. 19, P.347-54.

120. Shepard HM, Lewis GD, Sarup JC, Fendly BM, Maneval D, Mordenti J, Figari I, Kotts CE, Palladino MA Jr, Ullrich A. Monoclonal antibody therapy of human cancer: taking the HER2 protooncogene to the clinic. // J Clin Immunol. 1991 Vol. 11, P. 117-27.

121. Slingluff CL Jr, Engelhard VH, Ferrone S. Peptide and dendritic cell vaccines. // Clin Cancer Res. 2006 Vol. 12, S.2342-2345.

122. Smyth LA, Herrera OB, Golshayan D, Lombardi G, Lechler RI. A novel pathway of antigen presentation by dendritic and endothelial cells: Implications for allorecognition and infectious diseases. // Transplantation. 2006 Vol. 82, S.15-8.

123. Snyder AR, Morgan WF. Gene expression profiling after irradiation: clues to understanding acute and persistent responses? // Cancer Metastasis Rev. 2004 Vol. 23, P.259-68.

124. Soloski, M.J. Recognition of tumor cells by the innate immune system. // Curr. Opin. Immunol. 2001 Vol. 13, P.154-162.

125. Souberbielle BE, Westby M, Ganz S, Kayaga J, Mendes R, Morrow WJ, Dalgleish AG. Comparison of four strategies for tumour vaccination in the B16-F10 melanoma model. // Gene Ther. 1998 Vol. 5, P.1447-54.

126. Spiotto MT, Rowley DA, Schreiber H. Bystander elimination of antigen loss variants in established tumors. // Nature Medicine 2004 Vol. 10, P.294-8.

127. Stagg J, Wu JH, Bouganim N, Galipeau J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-2 fusion cDNA for cancer gene immunotherapy. // Cancer Res. 2004 Vol. 64, P.8795-9.

128. Steinman R. M. The dendritic cell and its role in immunogenicity system. // Annual Review Immunology 1991 Vol. 9, P.271-96

129. Stewart TJ, Fernando GJ, Frazer IH, Leggatt GR. Tumour susceptibility to innate and adaptive immunotherapy changes during tumour maturation. // Immunol Cell Biol. 2004 Vol. 82, P.455-61.

130. Stoler DL, Chen N, Basik M, Kahlenberg MS, Rodriguez-Bigas MA, Petrelli NJ, Anderson GR. The onset and extent of genomic instability in sporadic colorectal tumor progression. // Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Vol. 96, P. 15121-6.

131. Sumimoto H, Tani K, Nakazaki Y, Tanabe T, Hibino H, Hamada H, Azuma M, Asano S. GM-CSF and B7-1 (CD80) co-stimulatory signals co-operate in the induction of effective anti-tumor immunity in syngeneic mice. // Int J Cancer. 1997 Vol. 73, P.556-61.

132. Thomas DA, Massague J. TGF-beta directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance. // Cancer Cell. 2005 Vol. 8, P.369-80.

133. Thomas MC, Greten TF, Pardoll DM, Jaffee EM. Enhanced tumor protection by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expression at the site of an allogeneic vaccine. // Hum Gene Ther. 1998 Vol. 9, P.835-843.

134. Toes RE, Blom RJ, van der Voort E, Offringa R, Melief CJ, Kast WM. Protective antitumor immunity induced by immunization with completely allogeneic tumor cells. // Cancer Res. 1996 Vol. 56, P.3782-3787.

135. Toubi E, Shoenfeld Y. Protective autoimmunity in cancer. // Oncol Rep. 2007 Vol. 17, P.245-51.

136. Tsung K, Dolan JP, Tsung YL, Norton JA. Macrophages as effector cells in interleukin 12-induced T cell-dependent tumor rejection. // Cancer Res. 2002 Vol. 62, P.5069-75.

137. Vetter CS, Straten PT, Terheyden P, Zeuthen J, Brocker EB, Becker JC. Expression of CD94/NKG2 subtypes on tumor-infiltrating lymphocytes in primary and metastatic melanoma. // J Invest Dermatol. 2000 Vol. 114, P.941-7.

138. Villinger F. Cytokines as clinical adjuvants: how far are we? Expert Rev Vaccines. 2003 Vol.2, P.317-26.

139. Wakimoto H, Abe J, Tsunoda R, Aoyagi M, Hirakawa K, Hamada H. Intensified antitumor immunity by a cancer vaccine that produces granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4. // Cancer Res. 1996 Vol. 56, P. 1828-33.124

140. Welsh RM, Selin LK, Szomolanyi-Tsuda E. Immunological memory to viral infections. I I Annu Rev Immunol. 2004 Vol. 22, P.711-43.

141. Wortzel, R.D., Philipps, C., Schreiber, H. Multiple tumour-specific antigens expressed on a single tumour cell. // Nature 1983 Vol. 304, P.165-167.

142. Wright SC, Bonavida B. YAC-1 variant clones selected for resistance to natural killer cytotoxic factors are also resistant to natural killer cell-mediated cytotoxicity. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983 Vol. 80, P.1688-92.

143. Wu, J., Song, Y., Bakker, A.B., Bauer, S., Spies, Т., Lanier, L.L., Phillips, J.H. An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP 10. // Science 1999 Vol. 285 P.730-732.

144. Yanagawa Y, Iijima N, Iwabuchi К, Опое K. Activation of extracellular signal-related kinase by TNF-alpha controls the maturation and function of murine dendritic cells. // J Leukoc Biol. 2002 Vol. 71, P. 125-32.

145. Zhalgasbayeva GT, Deichman GI. Specific simian virus 40 (SV40)-induced immunity against transplantable SV40 tumor in Syrian hamsters: abrogation by BCG vaccination. // J Natl Cancer Inst. 1977 Vol. 58, P.l 121-4.

146. Zinkernagel RM, Hengartner H. On immunity against infections and vaccines: credo 2004. // Scand J Immunol. 2004 Vol. 60, P.9-13.

147. Zou Y, Bresnahan W, Taylor RT, Stastny P. Effect of human cytomegalovirus on expression of MHC class I-related chains A. // J Immunol. 2005 Vol. 174, P.3098-104.

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин

Оглавление диссертации Бережной, Алексей Евгеньевич :: 2007 :: Москва

Введение диссертации по теме "Онкология", Бережной, Алексей Евгеньевич, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2007 года, Бережной, Алексей Евгеньевич

Похожие научные работы

Каталог диссертаций