Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Иммунологическая эффективность противоопухолевых вакцин

На правах рукец

БАРМАШОВ АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН

14.01.12 — онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 М.

2014

Москва - 2014

005546395

005546395

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (Директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научный руководитель

Доктор медицинских наук, профессор

Барышников Анатолий Юрьевич

Официальные оппоненты

Голенков Анатолий Константинович, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского,

Новиков Виктор Владимирович, доктор биологических наук, профессор, директор НИИ молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского

Ведущая организация

ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства Здравоохранения РФ

заседании диссертационного coi , >ГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина»

РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Защита диссертации состоится

2014 года в

часов на

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационно™ д.м.н., профессор

Шишкин Юрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Важной проблемой медицины является разработка новых методов борьбы со злокачественными новообразованиями у людей. Одно из направлений этой работы - биотерапия, где при лечении больных используются различные цитокины, интерфероны, моноклональные антитела, а также разные противоопухолевые вакцины. В онкологической клинике проходят испытания цельноклеточные, пептидные, генномодифицированные и дентритноклеточные вакцины. В ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН созданы и прошли I и II фазы клинических испытаний генномодифицированная и дендритноклеточная вакцины. Генномодифицированная вакцина Мелавак получена путем стабильной трансфекции меланомных клеток mel Kor геном ГМ-КСФ. Дендритноклеточная вакцина получена на основе аутологичных дендритных клеток, праймированных аллогенным опухолевым лизатом. Эти вакцины были оценены по объективным клиническим результатам, тогда как оценка иммунологических ответов проводилась не в полном объеме.

По данным литературы клинический и иммунологический ответы на вакцинотерапию неоднозначны (Draube А. et al., 2011). Иммунологические ответы проявляются в большем проценте случаев, чем ответы клинические. В основном определяют Т-клеточный ответ на вакцинотерапию, а гуморальный ответ не исследуется. Однако вакцинотерапия может вызывать как активацию Т-хелперов 1 типа, ответственных за Т-клеточный иммунный ответ, так и II типа, отвечающих за гуморальный ответ. Эти вопросы не были решены во время проведения I и П фаз клинического исследования вакцин.

Определение взаимосвязи между звеньями иммунитета и клиническими показателями, равно как и степени выраженности иммунного ответа при использовании противоопухолевых вакцин является актуальной проблемой онкологии.

Цель исследования

Оценить иммунологическую эффективность дендритноклеточной вакцины и вакцины «Мелавак».

Задачи

1. Оценить Т-клеточный противоопухолевый иммунитет методом ЕПБРОТ у больных меланомой, получающих вакцинотерапию.

2. Оценить гуморальный противоопухолевый иммунитет у больных меланомой по образованию антител к опухолеассоциированным антигенам в процессе вакцинотерапии.

3. Изучить корреляцию между степенью иммунного ответа и клиническими параметрами у вакцинированных больных меланомой.

4. Определить прогностическую значимость иммунологического ответа у больных меланомой, получающих вакцинотерапию, на течение заболевания.

Научная новизна

Впервые одновременно оценены гуморальный и клеточный иммунный ответы у больных меланомой, получивших дендритноклеточную вакцину и вакцину Мелавак. Т-клеточный противоопухолевый иммунитет изучен методом БОБ РОТ, а гуморальный противоопухолевый иммунитет -по образованию антител к опухолеассоциированным антигенам. Изучена корреляция между степенью иммунного ответа и клиническими параметрами у вакцинированных больных меланомой. Определена прогностическая значимость иммунологического ответа у вакинированных больных меланомой.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты являются основанием для применения противоопухолевых цельноклеточных вакцин в клинической практике. Применение метода ЕЫБРОТ позволяет прогнозировать течение онкологических заболеваний на фоне вакцинотерапии.

4

Апробация работы

Апробация диссертационной работы проведена на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории биомаркеров и механизмов ангиогенеза, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории медицинской химии, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ ЭДиТО и отделения биотерапии опухолей НИИ Клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН, состоявшейся 27 декабря 2012 года.

Публикация

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ в журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора

Автор начал работать над диссертацией в 2009 г. Самостоятельно проводил адаптацию методик, всю обработку и анализ материала. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах работы: от постановки задач и их реализации до обсуждения полученных данных в научных публикациях и докладах. Результаты работы опубликованы в материалах Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» в 2011 и 2013 гг., а также на VIII Всероссийском съезде онкологов в 2013 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, вюпо-

чая библиографию и иллюстрации. Состоит из введения, литературного обзора, общей характеристики материалов и методов исследования, главы описания собственных исследований, главы обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 200 источников, в том числе 169 публикаций зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и сопровождается 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Всего в исследование были включены 74 больных меланомой кожи из отделения биотерапии НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, из которых 44 пациента были иммунизированы дендритноклеточной вакциной, 21 пациент — вакциной Мелавак и 9 больным меланомой не проводили вакцинотерапию. Контрольная группа состояла из 6 здоровых доноров. Материалом для постановки экспериментов служили мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) и сыворотка крови пациентов и доноров.

Для оценки развития клеточного иммунного ответа, выражающегося в изменении числа клеток, секретирующих интерферон-у (ИФН-у), применяли метод ЕЫБРОТ у 18 больных, иммунизированных дендритноклеточной вакциной, и у 12 больных, получавших Мелавак. У больных на разных этапах вакцинации (условно обозначенных «точками») проводился забор крови, из которой получали лейкоциты. Активатором для лимфоцитов при постановке ЕЫБРОТ служил лизат опухолевых клеток.

Развитие гуморального иммунного ответа определяли по появлению антител к поверхностным и цитоплазматическим антигенам меланомных клеток. Антитела в сыворотке крови определяли непрямой реакцией иммунофлуоресценции (РИФ) и флуоресцентным иммуноцитохимическим методом (ФИЦХ) соответственно. В данное исследование были включены 34 больных, получавших дендритноклеточную вакцину, 9 больных, получавших

б

вакцину Мелавак, 9 неиммунизированных пациентов и 6 здоровых доноров. Клетки 8 пациентов, получивших дентритную вакцину, также использовали и при постановке ELISPOT.

При проведении РИФ и ФИЦХ применялись клеточные линии меланомы человека mel Ког и mel Ibr, отличающиеся друг от друга наличием молекул главного комплекса гистосовместимости I и II класса, и линия рака молочной железы человека SK-BR-3, служившая контролем. При постановке этих методов использовали поликлональные антитела против человеческих IgG, конъюгированные с FITC, и IgM, конъюгированные с фикоэритрином (РЕ) («Serotec», США).

Для определения уровня белка S-100 в сыворотке крови пациентов применялся иммуноферментный анализ с использованием диагностической системы CanAg Diagnostics.

Статистический анализ данных проводили с помощью пакета программ SPSS 20.0. Изменения в числе клеток, активирующихся в ответ на стимуляцию опухолевым антигеном у больных, получавших вакцинацию, анализировали с помощью t-критерия Стьюдента. Связь между наличием иммунного ответа и реакцией ГЗТ, режимом вакцинации, а также между наличием иммунного ответа при активации лимфоцитов с помощью ФГА и опухолевого лизата анализировали с помощью углового преобразования Фишера. Связь между наличием иммунного ответа и изменением маркера меланомы S-100 анализировали с помощью критерия у?. Расчет времени до прогрессировали! заболевания проводили методом Каплана-Мейера. Сравнение двух кривых времени до прогрессировала проводили с помощью логрангового критерия. Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости Р < 0,05.

Результаты доследования

Оценка Т-клеточного иммунного ответа методом ELISPOT у больных меланомой, получавгцих дендритноклеточную противоопухолевую вакцину

Оценка Т-клеточного иммунного ответа проведена у 18 больных меланомой, получавших дентритноклеточную вакцину (рис.1 и 2). На рис. 1 представлено изменение среднего значения ИФН-у-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации МПК с опухолевым лизатом. В процессе вакцинотерапии у 10 пациентов число исследуемых клеток увеличилось. В эту группу вошли больные T.A.B., Т.О.В., У.Р.В., С.А.Б., Б .A.B., С.Н.М., C.JI.B., M.A.B., Г.С.Л. и Ш.Е.Н. Однако у четырех больных (С.Р.В., П.Н.А., Д.Ф.А. и Г.С.Д.) обнаружили статистически значимое снижение ИФН-у-продуцирующих Т-лимфоцитов, а у остальных четырех пациентов результаты остались на том же уровне. Минимальное увеличение в числе ИФН-у-продуцирующих клеток зафиксировано у пациента M.A.B, (ко 2-й точке) и составило 2,6 клеток, максимальное — 39 клеток у больной C.JI.B. (к 3-й точке). В наибольшее количество раз (в 23,7) исследуемый показатель увеличился у больного M.A.B, (к 3-й точке).

Таким образом, дендритноклеточная вакцина вызывает стимуляцию противоопухолевого иммунитета у 55,6% пациентов и только у 22,2% — ингибирование.

На рис. 2 представлено изменение числа ИФН-у-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеарных клеток с ФГА (по средним значениям) у больных, получавших дендритноклеточную вакцину. Число исследуемых клеток при стимуляции лейкоцитов ФГА увеличивалось у 8 пациентов: С.Н.М., С.Л.В., М.А.В., Г.С.Л., П.А.В., Д.Ф.А., Б A.B. и У.Р.В. У других восьми больных (T.O.B., Т.А.В., П.Н.А., С.Р.В., Г.С.Д., С.А.Б., Ш.Е.Н. и К.М.Н.) число ИФН-у-продуцирующих клеток стати-

■ Точка 1 НИ Точка 2 _ Ш Точка 3 □ Точка 4

Т.А.В. Т.О.В. УР.В. С.А.Б. Б.А.В. С.Н.М. С.Л.В.

Пациенты

Рисунок 1 (начало) - Изменение числа ИФН-у-продуцирующих клеток в процессе вакцинации дентритноклеточной вакциной. Мононуклеарные клетки инкубированы с лизатом опухолевых клеток. * достоверное различие по сравнению с 1-й точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-й и предшествующей точками.

■ Точка 1 ШТочка 2

□ Точка 3

□ Точка 4

М.А.В.

Г.С.Л.

Ш.Е.Н.

Д.Ф.А. Пациенты

П.Н.А.

С.Р.В.

Г.с.д.

Рисунок 1 (окончание) - Изменение числа ИФН-у-продуцирукяцих клеток в процессе вакцинации дентритноклеточной

вакциной. Мононуклеарные клетки инкубированы с лизатом опухолевых клеток. * достоверное различие по сравнению с 1-й точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-й и предшествующей точками.

и

0 си

01

о, <и И

500

450

400

350

300

а

о

н 2Ь0

о

й

200

150

100

50

0

■ Точка 1 ШТочка 2 0 Точка 3 □ Точка 4

С.Н.М.

С.Л.В. М.А.В.

Г.С.Л. П.А.В. Пациенты

Т.О.В. Д.Ф.А. Б.А.В.

Рисунок 2 (начало) - Изменение числа ИФН-у-продуцирующих клеток в процессе вакцинации дентритноклеточной

вакциной. Мононуклеарные клетки инкубированы с ФГА. * достоверное различие по сравнению с 1-й точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-й и предшествующей точками.

■ Точка 1 ШТочка 2 И Точка 3 □ Точка 4

УР.В.

Т.А.В.

П.Н.А.

С.Р.В. Г.С.Д. Пациенты

С.А.Б.

Ш.Е.Н. К.М.Н.

Рисунок 2 (окончание) - Изменение числа ИФН-у-продуцирующих клеток в процессе вакцинации дентритноклеточной

вакциной. Мононуклеарные клетки инкубированы с ФГА. * достоверное различие по сравнению с 1-й точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-й и предшествующей точками.

стически значимо снижалось. У оставшихся двух человек не было изменений числа ИФН-у-продуцирующих клеток по отношению к 1-й точке в процессе вакцинации. Минимальное увеличение в числе ИФН-у-продуцирующих клеток зафиксировано у пациента П.A.B. и составило 60,7 клеток. Максимальное - 387,3 клеток (у больной С.Н.М. к 3-й точке). Таким образом, о неспецифической активации Т-клеточного иммунитета в процессе иммунизации дендритноклеточной вакциной можно говорить у 44,4% пациентов, и у стольких же больных замечено ингибирование активности Т-клеток по изучаемому показателю.

При сопоставлении уровня иммунного ответа при стимуляции лимфоцитов опухолевым лизатом и ФГА выявить взаимосвязи не удалось (Р>0,05): иммунный ответ при активации лейкоцитов опухолевым лизатом, как правило, наблюдался у одних пациентов, а при активации лейкоцитов ФГА - у других. Это может быть вызвано как активацией специфического (в ответ на опухолевый лизат, который содержит антигены опухоли), так и неспецифического (на ФГА) иммунитета при лечении дендритноклеточной вакциной.

Было сопоставлено наличие иммунного ответа и реакции ГЗТ у вакцинированных больных. Взаимосвязи между этими двумя показателями обнаружено не было (Р>0,05).

Оценка Т-клеточного иммунного ответа методом ELISPOT у больных

:

меланомой, получивших вакцину Мелавак

При инкубации МПК больных, получивших вакцину Мелавак, с опухолевым лизатом у 3-х больных (25%) обнаружили уменьшение исследуемого показателя либо по сравнению с первой точкой, либо с предшествующей (пациенты K.M.B., Ф.Р.С., Д.А.А.), у одной (8,3%) -увеличение (больная З.И.Б.).

к.м.в.

И.Е.Г.

Ф.Р.С. Пациенты

Б.Г.А.

З.И.Б.

Точка 1 Точка 2

□ Точка 3

□ Точка 4

Рисунок 3 (начало) - Изменение числа ИФН-у-продуцирующих клеток в процессе иммунизации вакциной Мелавак при

инкубации МПК с ФГА.

* достоверное различие по сравнению с 1-й точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-й и предшествующей точками.

Х.Л.И. К.Е.В. П.А.С. УО.В. Д.А.А. С.А.В.

Пациенты

Рисунок 3 (окончание) - Изменение числа ИФН-у-продуцирующих клеток в процессе иммунизации вакциной Мелавак

при инкубации МПК с ФГА.

* достоверное различие по сравнению с 1-й точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-й и предшествующей точками.

В качестве положительного контроля исследовали активацию ИФН-у-продуцирующих клеток в ответ на ФГА (рис. 3). Как следует из рис. 3, у 9 пациентов (75%) исследуемый показатель в ответ на стимуляцию ФГА изменялся в процессе вакцинотерапии. У К.М.В. и И.Е.Г. число изучаемых клеток сначала уменьшалось (на 3-й и 2-й точках соответственно), а затем достоверно увеличивалось (на 4-й и 3-й точках соответственно). У больных Б.Г.А., З.И.Б., Ф.Р.С., Х.Л.И., К.Е.В., П.А.С. замечено статистически значимое увеличение интерферон-у-продуцирующих клеток; у У.О.В. -уменьшение.

Таким образом, как видно из исследования по активации лимфоцитов опухолевым лизатом и ФГА, вакцина Мелавак стимулирует лишь неспецифический иммунный ответ. Но поскольку не выявлено целенаправленного увеличения ИНФ-у-продуцирующих клеток от точки к точке, и при объединенном сравнении точек по всем больным нет статистически значимого различия, данная стимуляция может рассматриваться только на уровне тенденции.

Оценка гуморального иммунного ответа у больных меланомой, получивших противоопухолевые вакцины

В процессе вакцинации больных, помимо Т-клеточного иммунного ответа, также исследовали наличие гуморального иммунного ответа. Для выполнения этой задачи на разных этапах вакцинации у больных забиралась кровь, сыворотка которой хранилась при -20°С. Затем с помощью проточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимического метода анализировали наличие антител к опухолеассоциированным или трансплантационным антигенам в процессе иммунизации той или иной вакциной.

Методом флуоресцентного иммуноцитохимического анализа (ФИЦХ) определяли IgM- и ^в-антитела к цитоплазматическим опухолеассоциированным антигенам меланомы в сыворотке крови больных меланомой и здоровых доноров (табл. 1, табл. 2). Для этих целей

16

использовали клетки меланомной линий mel Kor, не экспрессирующей антигены главного комплекса гистосовместимости I и II класса, и mel Ibr, имеющей эти антигены.

Как видно из результатов представленных в таблицах 1 и 2, иммуноглобулины класса IgG и IgM к опухолеассоциированным антигенам у больных, получающих дендритноклеточную вакцину, отсутствовали.

У больных, получающих вакцину Мелавак, в сыворотке крови обнаружили антитела IgM и IgG класса, реагирующие с цитоплазмой обеих клеточных линий. До начала вакцинации антитела IgM класса обнаружили у 7 из 9 больных. Процент антиген-положительных клеток, определяемый с помощью этих сывороток, к концу вакцинации увеличился. Отсутствовала реакция с клетками линии SK-BR-3 рака молочной железы. В сыворотках от не вакцинированных больных и здоровых доноров реакции антител IgM класса выявлено не было. Реакция с клетками mel Kor, не имеющими трансплантационных антигенов, указывает на то, что сыворотки выявляют опухолеассоциированные меланомные антигены.

До начала вакцинации реакцию антител IgG класса с клетками mel Kor обнаружили в сыворотках 4 из 9 больных. К концу вакцинации процент выявляемых антиген-положительных клеток увеличился с 20 до 40%. В контрольной группе не вакцинированных больных меланомой выявили реакцию у 2 из 9 обследованных больных. У здоровых доноров этих антител не было. С клетками mel Ibr у больных до вакцинации иммуноглобулины сыворотки не реагировали. Однако к концу вакцинации у 1 из 9 пациентов появились антитела IgG, выявляющие 30% антиген-положительных клеток.

Была проведена оценка наличия IgM- и IgG-антител к поверхностным опухолеассоциированным антигенам меланомы в сыворотке крови от больных и здоровых доноров методом непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции. Экспрессию антигенов на поверхности клеток определяли на проточном цитофлуориметре. Специфических IgM и IgG-

Таблица 1 — Результаты определения специфических в сыворотке крови больных меланомой методом флуоресцентного иммуноцитохимического анализа в процессе вакцинотерапии: «+++» -высокая интенсивность окрашивания клеток; «++» — средняя интенсивность окрашивания клеток; «+» — низкая интенсивность окрашивания клеток; «—» — отсутствие окрашивания.

Группы пациентов Интенсивность окрашивания и % антиген-положительных клеток в клетках линия меланомы человека mel Kor Интенсивность окрашивания и % антиген-положительных клеток в клетках линии меланомы человека те11Ьг

до лечения в ходе лечения до лечения в ходе лечения

1. Дендритно-клеточная вакцина (п=34) (0/34) (0/34) (0/34) (0/34)

2.Вакцина Мелавак (п=9) ++, 40% (7/9) -Н-, 70% (7/9) ++, 40% (7/9) ++-, 60% (7/9)

3. Контрольная группа больных меланомой без вакцинотерапии (п=9) (0/9) (0/9)

4. Контрольная группа здоровых доноров (п=6) (0/6) (0/6)

Таблица 2 — Результаты определения специфических в сыворотке крови больных меланомой методом флуоресцентного иммуноцитохимического анализа в процессе вакцинотерапии: «+++» -высокая интенсивность окрашивания клеток; «++» — средняя интенсивность окрашивания клеток; «+» — низкая интенсивность окрашивания клеток; «—» — отсутствие окрашивания.

Группы пациентов Интенсивность окрашивания и % антигеп-положительных клеток в клетках линии меланомы человека ше1Ког,(%) Интенсивность окрашивания и % антиген-положительных клеток в клетках линии меланомы человека те1 1Ьг, (%)

до лечения в ходе лечения до лечения в ходе лечения

1.Дендритно-клеточная вакцина (п=34) (0/34) (0/34) (0/34) (0/34)

2.Вакцина Мелавак (п=9) +, 20% (4/9) +, 40% (4/9) (0/9) +, 30% (1/9)

3. Контрольная группа больных меланомой без вакцинотерапии (п=9) +, 20% (2/9) (0/9)

4. Контрольная группа здоровых доноров (п=6) (0/6) (0/6)

антител в крови больных, получающих вакцину Мелавак и дендритноклеточную, выявлено не было.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии иммуноглобулинов обоих классов к поверхностным опухолеассоциированным антигенам у больных, получающих вакцины Мелавак и дендритноклеточную, а также о наличии антител к цитоплазматическим антигенам у больных, иммунизированных вакциной Мелавак. Факт их увеличения в процессе вакцинации у данной группы пациентов дает основание говорить о стимуляции гуморального иммунного ответа на иммунизацию вакциной Мелавак.

Сравнение Т-клеточного иммунного ответа у больных, получавших дендритноклеточную вакцину, с некоторыми клиническими показателями

Была проведена оценка наличия зависимости между иммунологическим ответом у вакцинированных больных и некоторыми клиническими параметрами.

При сравнении наличия иммунного ответа с уровнем белка Б-100, проведенном у 8 больных, была обнаружена обратная зависимость, которая в силу невысокой выборки может рассматриваться только на уровне тенденции.

Было определена взаимосвязь между временем до прогрессирования заболевания и противоопухолевым иммунным ответом у 12 пациентов, получавших дендритноклеточную вакцину. Результаты представлены на рис. 4.

Р = 0,038 (логранговый критерий)

—— Иммунный ответ есть

_ ■ -Иммунного

ответа нет

Время (мес.)

Рисунок 4 - Время до прогрессирования в зависимости от противоопухолевого иммунного ответа (п=12) у больных, получавших дендритноклеточную вакцину.

Исходя из них, можно заключить, что при повышении Т-клеточного иммунного ответа, выражающегося увеличением числа ИФН-у-продуцирующих клеток, становится более длительным время до прогрессирования заболевания у пациентов.

выводы

1. Иммунизация дендритноклеточной вакциной вызывает стимуляцию Т-клеточного иммунного ответа у 55,6% больных меланомой кожи. Количество интерферон-у-продуцирующих клеток, оцененных методом ЕЫЯРОТ, увеличивалось в процессе вакцинации до 24 раз.

2. Иммунизация вакциной Мелавак вызывает стимуляцию Т-клеточного иммунного ответа у 8,3% больных меланомой кожи.

3. Вакцина Мелавак индуцирует появление антител к цитоплазматическим антигенам меланомных клеток в сыворотке крови больных меланомой. Антитела к поверхностным антигенам клеток меланомы отсутствовали.

4. В сыворотке крови больных меланомой, получавших дендритноклеточную вакцину, не обнаружены антитела к поверхностным и цитоплазматическим антигенам клеточных линий меланомы.

5. Наличие Т-клеточного противоопухолевого иммунитета у больных меланомой кожи, получавших дендритноклеточную вакцину, прямо пропорционально времени до прогрессирования заболевания (Р=0,038).

6. Применение метода ЕЫБРОТ позволяет прогнозировать течение онкологических заболеваний при вакцинотерапии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Бармашов, А.Е. Оценка специфического противоопухолевого иммунитета методом ELISPOT у больных, получающих вакцину «Мелавак» / А.Е. Бармашов, К.Д. Никитин, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, А.Н. Иншаков, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9. -№3,-С. 37-40.

2. Голубцова, Н.В. Определение специфических противоопухолевых антител у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии / Н.В. Голубцова, Е.В. Степанова, А.Е. Бармашов, О.С. Бурова, К.А. Барышников, И.Н. Григорьева, М.А. Барышникова, М.В. Огородникова, Г.З. Чкадуа, П.К. Иванов, И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т.П. -№3. - С.25-28.

3. Бармашов, А.Е. Оценка противоопухолевого иммунитета методом ELISPOT у больных, получающих дендритноклеточную вакцину / А.Е. Бармашов, Г.З. Чкадуа, И.Н. Михайлова, З.А. Соколова, М.В. Огородникова, Л.Ф. Морозова, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11,-№3. - С.47-51.

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

1. Бармашов, А.Е. Оценка противоопухолевого иммунитета методом ELISPOT у больных, получающих вакцину «Мелавак» / А.Е. Бармашов, К.Д. Никитин, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, А.Н. Иншаков, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2011. -Т.10. - №1. - С.7.

2. Голубцова, Н.В. Выявление специфических противоопухолевых антител в сыворотке крови вакцинированных больных с меланомой / Н.В. Голубцова, Е.В. Степанова, И.Н. Михайлова, О. С. Бурова, К.А. Барышников, П.К. Иванов, М.А. Барышникова, А.Е. Бармашов, Г.З. Чкадуа, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы VIII Всероссийского съезда онкологов. Вопросы онкологии. — 2013. — Т. 3. — №3 (приложение).-С. 1158-1159.

3. Бармашов, А.Е. Иммунологическая эффективность вакцины Мелавак / А.Е. Бармашов, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Н.В. Голубцова, Г.З. Чкадуа, З А. Соколова, М.В. Огородникова, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12. - №2. - С.7.

4. Бармашов, А.Е. Иммунологическая эффективность аутологичной дендритноклеточной вакцины / А.Е. Бармашов, Г.З. Чкадуа, И.Н. Михайлова, Н.В. Голубцова, О.С. Бурова, З А. Соколова, М.В. Огородникова, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. -2013. — Т. 12. - №2. - С.8.

Перечень сокращений, условных обозначений, символов и терминов

ГЗТ Гиперчувствительность замедленного типа

ИФН-у Интерферон-гамма

МПК Мононуклеарные клетки периферической крови

РИФ Реакция иммунофлуоресценции

ФГА Фитогемагтлютинин

ФИЦХ Флуоресцентный иммуноцитохимический анализ

ELISPOT Enzyme-Linked ImmunoSpot - твердофазная модификация метода иммуноферментного анализа

FITC Флуоресцеинизсггиоцианат

HLA Человеческий лейкоцитарный антиген

Ig Иммуноглобулин

Подписано в печать 30.01.14 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 66 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24