Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Биологические свойства рекомбинантных белков ИЛ-18, ИЛ-18СБ и трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека

На правах рукописи

ЛОПАТНИКОВА ЮЛИЯ АНАТОЛЬЕВНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ИЛ-18, ИЛ-18СБ И ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ DAUCUS CAROTA L., НЕСУЩЕГО ГЕН ИЛ-18 ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2006

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук,

профессор Сенников Сергей Витальевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Козлов Иван Генрихович

доктор медицинских наук Кожевников Владимир Сергеевич

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится <<, _» дысСьЩ^Л-_2006 г. в /jf¿£0_ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан << >> 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Одно из достижений современной медицины состоит в разработке новых лекарственных средств, полученных с помощью генной инженерии человеческих рекомбинантных белков-цитокинов. Цитокинотерапия - это современное, стремительно развивающееся направление, открывающее новые возможности в лечении различных заболеваний. В настоящее время известно несколько сотен цитокинов [Oppenheim, 2003]. Некоторые из них используются в клинической практике с диагностической целью, для профилактики и терапии различных заболеваний.

Перспективным препаратом для создания на его основе лекарственного средства является интерлейкин-18. ИЛ-18- это цитокин, участвующий в функционировании иммунокомпетентных клеток, в том числе и в регуляции экспрессии и продукции многих других цитокинов. ИЛ-18 стимулирует пролиферативную активность Т-лимфоцитов, повышает литическую активность НК-клеток, увеличивает продукцию ИФНу, ГМ-КСФ [Udagawa N.. 1997; Dinarello CA., 1999], ФНО-сс (Fehniger ТА., 1999; Moller В., 2001], ИЛ-2 [Kohno К., 1997; Micallef MJ., 1996], ИЛ-5, ИЛ-6 [Ogura T., 2001; Rodriguez-Galan MC., 2005] ИЛ-8 и ИЛ-lß (Puren AJ., 1998; Wang W., 2001], PGE2 [Kashiwamura S., 2002; Futani H., 2002] активированными T-, B-, НК-клетками. Кроме того, в экспериментах in vitro показано, что ИЛ-18 способен стимулировать экспрессию молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM) [Merendino RA., 2003; Morel JC., 2002]. Еще одной из особенностей ИЛ-18 является конститутивная экспрессия клетоками различных систем организма. Это отличает его от многих других иммуномодулирующих цитокинов, которые являются индуцибельными. Описанные иммунорегулирующие свойства ИЛ-18 позволяют исследовать и использовать его в качестве терапевтического препарата в ситуациях, когда требуется активировать ответ Тхелперов 1 типа или НК клеток, то есть противоинфекционная и противоопухолевая защита организма.

Обладая обширным спектром биологических эффектов, ИЛ-18 участвует в патогенезе некоторых заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалением и деструкцией тканей, например, при ревматоидном артрите [Olee Т., 1999; Liew В., 2002], диабете [Rothe H., 1998] и болезни Крона [Monteleone G., 1999; Pizzaro P., 1999]. В связи с этим блокатор ИЛ-18, представляющий собой физиологическую ловушку-рецептор, может являться перспективным фактором для отмены побочных действий ИЛ-18. ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ), являющийся циркулирующим антагонистом ИЛ-18, конститутивно экспрессируется сплено-цитами и относится к суперсемейству иммуноглобулинов. ИЛ-18СБ связывает ИЛ-18 путем формирования высоко аффинного комплекса (Kd=400pM) и тем самым нейтрализует эффекторные функции цитокина ИЛ-18 [Novick D., 1999].

Данные о значительной роли ИЛ-18 в регуляции большого числа иммунных реакций позволяют предположить, что в ближайшем будущем ИЛ-18 и ИЛ-18СБ займут свое достойное место в арсенале препаратов для борьбы с множеством патологических состояний человека.

В качестве продуцентов для получения белков-цитокинов медицинского назначения в настоящее время широко используются клетки бактерий, дрожжей и

млекопитающих. Однако такие системы имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансляционная модификация и фол-динг полипептидных цепей многих эукариотических белков. Клетки дрожжей и млекопитающих лишены подобных недостатков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков [Russel С., 1999]. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения, как продуценты иммунорегуляторных белков, имеют ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего, необходимо отметить, что в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. Исследования в этой области идут в направлении создания трансгенных растений несущих опухолевые, инфекционные антигены или иммунорегуляторные цитокины с целью моделирования специфических иммунных реакций. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. [Daniell Н., 2001]. В настоящее время с различной эффективностью трансфекции подвергнуты: картофель, кукуруза, салат, люцерна, морковь, томаты, огурцы, табак и некоторые другие [Wigdorovitz А., 1999; Giddings G., 2000; Richter L., 2000; Streatfield S., 2000; Tuboly Т., 2000; Tacket C., 2000].

Таким образом, представлялось актуальным и значимым изучить биологические специфические свойства рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ, полученных по оригинальной методике из продуцента E.coli, в различных экспериментальных моделях, и оценить эффекты перорального введения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

Цель работы: Охарактеризовать биологическую активность рекомбинантных белков ИЛ-18 и ИЛ-18СБ, полученных по оригинальной методике из клеток-продуцентов Escherichia coli, а также иммуномодулирующие эффекты трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека, при перо-ральном применении.

Задачи исследования:

1. Изучить рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ, полученные из продуцентов E.coli по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа по связыванию со специфическими антителами.

2. Изучить способность рчИЛ-18 стимулировать продукцию ФНОа, ИФНу мононуклеарными клетками периферической крови человека.

3. Изучить влияние рчИЛ-18 на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей, а также противоопухолевую активность в экспериментальной модели на мышах.

4. Изучить биологическую активность ИЛ-18СБ по отмене специфического

иммунорегуляторного эффекта ИЛ-18 на МНК ПК человека.

5. Исследовать активность ИЛ- 18СБ в эксперименте in vivo по отмене ЛПС-индуцированной летальности и его противоопухолевое действие в мышиной модели меланомы.

6. Исследовать иммунорегуляторные эффекты перорального введения трансгенной по ИЛ-18 моркови Daucus carota L. на показатели гуморального и клеточного иммунного ответа, на продукцию иммунокомпетентными клетками ИФНу, а также противоопухолевую активность в модели уретан индуцированной аденокарциномы легких.

Научная новизна. Впервые показано стимулирующее влияние рчИЛ-18 на реакцию ГЗТ при внутривенном введении интактным животным. Показано противоопухолевое действие рчИЛ-18 в модели солидной ортотопической меланомы В16. Впервые продемонстрировано, что эндогенный ИЛ-18 играет ключевую роль в КонА-индуцированной продукции ФНОальфа, что подтверждено в эксперименте с отменой этого эффекта с помощью ИЛ-18СБ. На модели гематогенного метастазирования меланомы В16 показан антиметастатический эффект введения рчИЛ-18 СБ.

Впервые показано, что трансгенные растения Daucus carota L., несущие ген ИЛ-18 человека, обладают иммуномодулирующей активностью при перораль-ном применении экспериментальными животными. Впервые продемонстрированы противоопухолевые свойства трансгенной моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении в экспериментальной модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

Практическая и теоретическая значимость

Показанная специфическая иммунохимическая и биологическая активность in vitro и in vivo ИЛ-18 и ИЛ-18СБ свидетельствует, что рекомбинантные препараты ИЛ-18 и ИЛ-18СБ, полученные по оригинальной методике, могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов их действия и в перспективе для создания на их основе лекарственных препаратов. В результате исследования оптимизирована тест-система для количественного определения ИЛ-18 и ИЛ-18СБ в биологических жидкостях. Представленные результаты о биологической активности in vitro и in vivo рчИЛ-18 и ИЛ-18СБ расширяют представление о иммунорегуляторных свойствах этих белков и вносят существенный вклад в понимание системы этих медиаторов в противоопухолевом иммунитете. Экспериментальные данные по пероральному применению трансгенного растения, несущего ген ИЛ-18, и показанные иммуномодулирующие эффекты являются основой для дальнейшего развития технологий получения трансгенных растений, экспрессирующих иммунорегуляторные медиаторы человека , и их использования с целью профилактики, и возможно, лечения иммунопатологических состояний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рекомбинантные человеческие ИЛ-18 и ИЛ-18СБ, полученные по оригинальной методике из продуцента E.coli, обладают специфической биологической и противоопухолевой активностью.

2. Трансгенное растение Daucus carota L., несущее ген ИЛ-18 человека, обладает иммуномодулирующими свойствами и противоопухолевой активностью.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 2) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г.), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.), 5) «Технология й онкология» Санкт-петербург 2005г, 6) 4-ая конференция иммунологов Урала (Уфа, 2005), 7) Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет» (Новосибирск 2005г), 8) Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск 2005), 9) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва 2006), 10) «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 1 статья в центральной и 3 в зарубежной печати.

Объем и структура работы. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 127 страницах машинописного текста, включающего 15 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 249 литературных источника, в том числе 244 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объекты исследования:

1. Лабораторные животные. В работе использовались мыши (самки) линии С57В1/6, BALB/c и гибриды (CBAxC57Bl/6)Fl- (CBF1) в возрасте 3-6 месяцев (600 голов). Мыши получены из питомника лабораторных животных СО РАМН (пос. Нижняя Ельцовка г. Новосибирска) и НИЛ ЭВМ Томского Научного Центра СО РАМН.

2. Мононуклеарные клетки периферической крови условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет. Результаты, представленные в данной работе, получены при обследовании 30 человек.

Рекомбинантные белки и трансгенное растение

В Новосибирском ИХБФМ СО РАН был осуществлен химико-ферментативный синтез гена IL-18 человека и осуществлена экспрессия рекомбинантного IL-18 в клетках E.coli штамма BL21(DE3). В Новосибирском институте ХБФМ СО РАН также был получен ИЛ-18 связывающий белок из штамма E.coli BL21(DE3) с помощью плазмиды рЕТ. На базе Института цитологии и генетики СО РАН совместно с Новосибирским институтом ХБФМ СО РАН было получено трансгенное растение морковь -Daucus carota L - продуцент ИЛ-18 человека. Непосредственно агробактериальную трансформацию растений проводили на базе ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур РАСХН (Москва).

Экспериментальные модели.

1 .Мышиная меланома. .....

Для данной экспериментальной модели использовалась перевиваемая клеточная линия мышиной меланомы В16. Клетки вводились подкожно в район холки [Pardini RS., 1984; Papermaster BW., 1980], либо внутривенно [Kolber DL., 1995] в количестве 2 х 105 на мышь. На 23 день, после прививки опухоли, измерялся вес солидной опухоли при подкожном введении. Опухолевый процесс при внутривенном введении оценивали, подсчитывая число и измеряя средний диметр метастазов при помощи бинокулярной лупы при ее собственном увеличении х2 и окуляром х7 со стандартной окулярной линейкой.

2. Мышиная аденокарцинома легких

Индукция опухоли проводилась на мышах линии BALB/c . Раствор уретана 10% вводился внутрибрюшинно, из расчета 0,7мг уретана на 1 гр. веса мыши, 8 раз с интервалом в 3 дня. Опухолевый процесс оценивали путем подсчета количества и измерения диаметра аденоматозных образований у каждого животного при помощи бинокулярной лупы при ее собственном увеличении х2 и окуляром х7 со стандартной окулярной линейкой. [Ложкин И.Н., 1996].

3.Липополисахарид индуцированная летальность.

Опыт проводился на мышах линии BALB/c. Животным внутрибрюшинно вводили ИЛ-18СБ в дозе 5мг/кг, и через 10 минут внутрибрюшинно ЛПС (E.coli 0111:В4) в дозе 15мг/кг. Выживаемость оценивали в течении недели ежедневно [Faggioni R., 2001].

Гистологическое исследование меланомы. Солидную опухоль фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин. Срезы толщиной 5-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. В тестовом поле определяли частоту встречаемости митозов опухолевых клеток, оценивали инфильтрацию окружающих тканей, определяли размер некроза, оценивали ангиогенез опухоли.

Пероральное введение Daucas carota L.

Мыши получали дополнительно к стандартному рациону, в течение определенного времени, морковь обычную или несущую ген ИЛ-18, в дозе 1,7-2гр/мышь ежедневно.

Методы выделения и культивирования клеток человека и животных

1. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови человека осуществляли согласно [Boyum А., 1968].

2.Получение спленоцитов мышей проводили по методике описанной [Гольд-берг Д.А., 1992].

3.Культивирование клеток (1*10бкл/мл) проводили в среде RPMI-1640 (содержащей 10% ЭТС, 80мкг/мл гентамицина, 2мМ L-глутамина, 5x10 s меркапто-этанола) 24, 48 и 72 часа при 37°С во влажной атмосфере с 5% С02.

Оценка пролиферативной активности клеток.

Интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа по включению Н3-тимидина в нуклеопротеидные фракции клеток. Н3-тимидин вносили по 1 мкО/лунка за 16 часов до конца культивирования, клетки осаждали на фильтры (Flow) с помощью прибора Ceil Harvester (Flow Labs).

Определение количественного содержания цитокинов электрохемилюми-несцентным методом

В проведенной работе использовались меченные биотином и рутением антитела против человеческих цитокинов: ФНОа, ИФНу, ИЛ-18СБ (R&D System, UK), ИЛ-18 (PeproTech), а также рекомбинантные цитокины ФНОа (PharMingen, USA), ИФНу (Thomae, Biberach, Germany) и ИЛ-18 (PeproTech) для создания калибровочного стандарта. Для создания наборов рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ получали поликлональные кроличьи антитела по стандартной схеме [Иммунология Методы, под ред. Лефковитса. 1983]. Подготовку реактивов и определение каждого цитокина проводили, как описано ранее [Sennikov S.V. 2000].

Оценка клеточного ответа на Т-зависимый антиген (эритроциты барана ЭБ) Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Yoshikai Y., 1979].

Определение уровня первичного гуморального ответа (IgM АОК) на Тзависимый антиген (ЭБ). Способность мышей к гуморальному иммунному ответу на ЭБ оценивали на пике ответа на пятые сутки по количеству локальных зон гемолиза [Cunningham A.J., 1965].

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка результатов производилась при помощи программы «Statistica 5.0». При нормальном распределении выборки, для статистической проверки использовался t-критерий Стьюдента, данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней (М±т). Если исследуемые выборки не подчинялись нормальному распределению, использовались непараметрические критерии Манн-Уитни и Уилкоксона, данные представлены в виде медианы (Me) и размаха квартилей. Для оценки выживаемости использовали тест log-rank.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика рекомбинантного человеческого Интерлейкина 18.

На первом этапе проведенной работы нами был оптимизирован протокол для определения рчИЛ-18 методом ЭХЛ, который включал в себя кроличьи поликлональные антитела меченные биотином и моноклональные антитела фирмы PeproTech меченные рутениевой меткой, в соотношении 1:1, а также определенный протокол анализа на приборе ORIGEN(USA). Данный набор использовался для подбора условий получения и хранения рекомбинантного препарата.

Биологические специфические свойства рчИЛ-18 in vitro.

Следующим этапом исследования рекомбинантного белка стало изучение биологической активности рчИЛ-18 по влиянию на пролиферативную активность МНК ПК человека в культуре и продукцию ими иммунорегуляторных цитокинов ИФНу и ФНОа. Оценка пролиферации иммунокомпетентных клеток, не показала достоверного влияния исследуемого препарата рчИЛ-18 на популяцию МНК ПК (данные не представлены). При исследовании продукции иммунорегуляторных цитокинов, нами было выявлено достоверное повышение продукции ИФНу в ответ на моностимуляцию рчИЛ-18 в дозе 40нг/мл. Также в нашем эксперименте показано, что рчИЛ-18 способен самостоятельно без дополнительной стимуляции увеличивать продукцию ФНОа МНК ПК по сравнению со спонтанной продукцией (рисунок 1).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что рекомбинантный белок, полученный из продуцента E.coli, обладает специфической биологической активностью в тестах in vitro на популяцию МНК ПК.

ФНОа

3000 -

2500 -

с.

2000 -

с

1500 -

1000 -

500 -

0

-+-Г

!■ i ■=

спонтанная

КонА

ИЛ-18

КонА+ИЛ-18

ИФНг

25000 с; 20000

5

= 15000 10000 5000 0

ж

спонтанная

КонА

ИЛ-18 КонА+ИЛ-18

Рис.1. Эффект рчИЛ-18 на продукцию ФНОа и ИФНу в культуре МНК ПК человека. Клетки культивировали 24 и 48 часов соответственно в присутствии Коиканавалина А(5 мкг/мл) и рчИЛ-18(40нг/мл). Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0.05.

Для дальнейшего исследования рекомбинантного белка ИЛ-18 человека было необходимо оценить биологическую активность не только in vitro, но и in vivo

Влияние рчИЛ-18 на формирование иммунного ответа в экспериментальных моделях in vivo.

По литературным данным известно, что ИЛ-18 в различных экспериментальных моделях стимулирует показатели клеточного иммунитета [Kawakami К., 2000; Kitching AR., 2000]. Наш опыт мы проводили при системном - внутривенном введении препарата рчИЛ-18 в дозе 1мкг/мышь 5-кратно через день интакт-ным животным. На мышах линии CBF1 мы оценивали гуморальный и клеточный иммунный ответ по антителообразованию и выраженности реакции ГЗТ соответственно. По количеству АОК IgM к эритроцитам барана не выявлено достоверного влияния ИЛ-18 на формирование первичного гуморального иммунного ответа. Изучение клеточного иммунного ответа показало, что рчИЛ-18 в дозе 1мкг/мышь стимулирует реакцию ГЗТ (рисунок 2), что согласуется с данными полученными рядом авторов в других экспериментальных моделях, и говорит о том, что полученный препарат рчИЛ-18 обладает специфической активностью и способен сдвигать баланс иммунного ответа у интактных животных в сторону клеточного иммунного ответа.

Рис.2. Влияние внутривенного введения рчИЛ-18 на показа- . тели клеточного иммунного ответа. ИЛ-18 (1мкг/мышь) или физ. раствор вводились мышам линии CBF1 5-кратно в/в через день. (М ±т) На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0.05.

Полученные результаты по изучению биологических свойств in vitro и in vivo свидетельствуют, что препарат рчИЛ-18 обладает иммуномодулирующими свойствами, которые предполагают его участие в противоопухолевой защите организма. Так как терапия злокачественных новообразований одно из приоритетных направлений для возможного использования рчИЛ-18, поэтому на следующем этапе нашего исследования мы изучили рекомбинантный препарат ИЛ-18 в экспериментальной модели меланомы.

Противоопухолевая активность рчИЛ-18.

По литературным данным известно, что механизмы противоопухолевой активности ИЛ-18 включают в себя: усиление экспрессии FasL на НК и Т-клетках [Tsutui, 1996], увеличение цитотоксической активности НК и Т клеток [Ushio S, 1996], ингибирование ангиогенеза [Coughlin СМ., 1998], а также стимуляцию продукции ИФНу, который сам обладает рядом противоопухолевых свойств [Okamura Н, Nagata К, 1995]. Данные механизмы предполагают прямое и опосредованное влияние ИЛ-18 на солидную опухоль, исходя из этого, мы исследовали рекомбинантный препарат ИЛ-18 в опыте с ортотопической мышиной ме-ланомой В-16. Показано, что внутривенное введение мышам рчИЛ-18 приводит к снижению веса солидной меланомы В16 , причем вес опухоли был обратно пропорционален кратности введения цитокина (рисунок 3). Качественное гистологическое исследование подтвердило полученные результаты, показав, что исследуемый препарат подавляет митотическую активность опухолевых клеток, усиливает дегенеративные процессы, уменьшает васкуляризацию опухоли и повышает ее инфильтрацию лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками.

Продолжительность жизни экспериментальных животных при 1-, 2- и 3-кратном введении статистически достоверно увеличивалась в сравнении с контрольной группой. Значимого влияния кратности введения препарата на вес и выживаемость экспериментальных животных не обнаружено.

Таким образом, мы можем утверждать, что исследуемый нами препарат обладает противоопухолевой активностью в модели солидной ортотопической меланомы В16.

'•t ¿i

ВЫЖИВАЕМОСТЬ

70 60 50 40 -30 -20 -10 О

ЯГ

ОЩ

Sii- ifS sw

1ЩЩЯ ..

вес ортотопическои меланомы Рис 3> Влияние внутривенного

введения рчИЛ-18 на вес солидной опухоли и выживаемость мышей. Клетки меланомы В16 вводились п/к в район холки в количестве 200тыс/мышь мышам линии С57В16. ИЛ-18 в дозе 1мкг/мышь или физ. раствор вводились в/в через день. Взвешивание опухоли проводили на 23 день. Выживаемость оценивалась ежедневно до последней мыши. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены достоверные различия при р< 0.05. Группы:

1- интактная

2- конроль 3-кратно (физ. рас твор)

3- рчИЛ-18 1-кратно

4- рчИЛ-18 2-кратно

5- рчИЛ-18 3-кратно

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый препарат рчИЛ-18, полученный по оригинальной методике из продуцента E.coli, определяется иммунохимически и обладает специфической биологической активностью, увеличивая продукцию ИФНу, ФНОа МНК ПК человека и стимулируя клеточный иммунный ответ. А также проявляет противоопухолевую активность в модели ортотопической меланомы В16, увеличивая выживаемость и снижая вес солидной опухоли.

Характеристика рекомбинантного человеческого ИЛ-18СБ.

После изучения биологических свойств рчИЛ-18,следующим этапом нашей работы стало изучение ИЛ-18СБ и его способности блокировать эффекты экзо- и эндогенного ИЛ-18 в различных моделях. Рекомбинантный белок ИЛ-18СБ был получен в ИХБФМ СО РАН по оригинальной методике из продуцента E.coli несущего плазмиду рЕТ с геном ИЛ-18СБ человека. В совместной работе, с помощью оптимизированного протокола ЭХЛ, была отработана методика получения рчИЛ-18СБ с заданными характеристиками, который сохранял свою способность связываться со специфическими антителами при хранении. Для дальнейшего исследования рекомбинантного белка необходимо было определить его функциональную активность в экспериментальных моделях.

Изучение биологической активностирч11Л-18СБ in vitro.

ИЛ-18СБ, который проявляет свое действие, блокируя эффекты ИЛ-18, был исследован в эксперименте по влиянию на продукцию ФНОа культурой МНК ПК человека. Полученные нами данные свидетельствуют, что ИЛ-18СБ статистически достоверно отменяет стимулированную рчИЛ-18 продукцию ФНОа культурой мононуклеарных клеток человека. Следует отметить, что при отмене стиму-

лирующего действия Конканавалина А с помощью ИЛ-18СБ, продукция ФНОа снижается до спонтанного уровня, что свидетельствует о значительном участии эндогенного ИЛ-18 в Кон А-стимулированной продукции ФНОа (рисунок 4).

Продукция ФНОа

пг/мл

А-►

спонтанная КонА ИЛ-18 КонА+ИЛ-18 ИЛ-18СБ ИЛ-18 + ИЛ- КонА + ИЛ- КонА +ИЛ-18

(5мкг/мл) (40нг/мл) (80мкг/мл) 18СБ 18СБ + ИЛ-18СБ

Рис. 4. Эффект рчИЛ-18СБ на продукцию ФНОа в культуре МНК ПК человека. Клетки культивировали 24 в присутствии различных стимуляторов. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0.05. п= 8

После подтверждения активности рчИЛ-18СБ in vi tro, следующий этап работы был посвящен оценке действия исследуемого препарата in vivo.

Исследование биологической активности рчИЛ-18СБ in vivo.

Для исследования биологической активности рчИЛ-18СБ in vivo была использована модель ЛПС-индуцированной летальности мышей, предложенная Faggioni R [Faggioni R 2001]. В этой модели повреждение печени зависит от индукции экспрессии FasL на местных Т и НК клетках. Fas/FasL система является центральной в патогенезе воспаления печени, которое встречается в клинике различных гепатитов [Hayashi N., 1999; Ryo К., 2000]. В нашем опыте рчИЛ-18СБ (5мг/кг), введенный внутрибрюшинно за 10 минут до инъекции ЛПС (в дозе 15 мг/кг, LD90), достоверно увеличивал выживаемость мышей по сравнению с контрольной группой (рисунок 5). Поскольку в этой модели ИЛ-18 СБ показал себя блокатором летальности мышей, мы можем утверждать, что эндогенный ИЛ-18 является одним из центральных медиаторов, запускающих весь кас-

Рис.5. Эффект ИЛ-18СБ на ЛПС-индуцированную летальность мышей. Мышам линии BALB/c за десять минут до инъекции ЛПС (0111:В4 в дозе 15мг/кг), вводился рчИЛ-18СБ (5мг/кг). Мониторинг выживаемости проводился в течение 7 дней. n=20, log-rank test: р=0,00191.

кад реакции после введения липополисахарвд

Влияние рчИП-18СБ на ЛПС-индуцированную летальность у мылей

_ 100

л

о 60

¡8 40

1 ?0

л

0

-ИЛ-18СБ -контроль

4 Дни

Таким образом, проверив биологические специфические свойства рчИЛ-18СБ мы определили, что он отменяет стимулирующие действие ИЛ-18 на продукцию ФНОа в культуре МНК ПК, a также ингибирует действие эндогенного ИЛ-18 in vivo, отменяя липополисахарид индуцированную летальность мышей. Следующим этапом работы стало изучение противоопухолевой активности.

Противоопухолевая активность рчИЛ-18СБ.

Несмотря на то, что ИЛ-18 активно участвует в противоопухолевой защите организма, некоторые его свойства могут проявлять двойственную активность. Например, стимулируя экспрессию молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1, ИЛ-18 может способствовать инфильтрации опухоли иммунокомпетентными клетками [Yamada Т., 2005], однако это же качество может являться патогенетическим фактором при метастазировании злокачественных новообразований [Vidal-Vanaclocha F., 2000]. Исходя из этого рчИЛ-18СБ как блокатор эффектов ИЛ-18, и в том числе как ингибитор экспрессии молекул адгезии [Carrascal МТ., 2003], был исследован в гематогенной модели мышиной меланомы В16. В этой модели опухолевые клетки, введенные внутривенно через полые вены, попадают в правое предсердие и затем через малый круг кровообращения оседают в легких.

В нашем опыте мы оценивали выраженность опухолевого процесса путем подсчета количества опухолевых узлов и измерения их диаметра. Были использованы различные обработки рчИЛ-18СБ, как то: пред-, пост-, и пред+пост обработка. В качестве контроля использовалась группа с пред+пост обработкой физиологическим раствором. Нами получены следующие результаты: ИЛ-18СБ проявляет свое противоопухолевое действие через снижение количества метастазов, но не влияет на их диаметр (рисунок 6).

Рис. 6. Влияние внутрибрюшинного введения рчИЛ-18СБ на опухолевый процесс в гематоге-ной метастатической модели В16. Клетки мышиной меланомы В16 вводились в/в 200тыс/мышь, ИЛ-18СБ (20мкг/мышь) или физ. раствор вводились в/бр. Предобработка включала в себя введения за 24, и за 3 часа до прививки опухоли, постобработка включала в себя введения через 24, 48 п 72 часа после прививки опухоли. На 20 день, легкие фиксировали в формалине и проводили подсчет количества и измерение диаметра метастазов, при помощи бинокулярной лупы при ее собственном увеличении х2 и окуляром х7 со стандартной окулярной линейкой. Данные представлены как медиана и размах квартилей. 11а рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0.05. Группы:

1- интактная,

2- контроль- пред+постобработка физ. раствором,

3- предобработка рчИЛ-18СК

4- постобработка рчИЛ-18СБ

5- пред+постобработка рчИЛ-18СБ

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что рчИЛ-18СБ, полученный из продуцента Е. coli, обладает биологической активностью,

Диаметр опухолевых узлов

1 2 3 4 5

Количество опухолевых узлов

1 2 3 4 5

выражающейся в отмене специфического действия ИЛ-18, как в моделях in vitro, так и in vivo, и, кроме того, обладает противоопухолевой активностью, снижая число метастазов в модели гематогеной меланомы В16.

Полученные в совместной работе рекомбинантные белки рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ были выделены из продуцента E.coli, несущего плазмиду с определенным геном. Это наиболее широко используемый способ наработки рекомбинантного продукта, однако, он имеет свои недостатки, поэтому в последние годы активно развивается направление по получению и использованию белков, продуцирующихся в трансгенных растениях. В своей работе мы исследовали растение Deutens carota L. (морковь обыкновенная) трансфецированную цитокином ИЛ-18 человека, предварительно оценив его биологические свойства in vitro и in vivo. Биологическая характеристика трансгенного растения Daucus carota L. несущего ген рчИЛ-18 человека.

Трансформация и получение растений Daucus carota L. была осуществлена при сотрудничестве трех институтов: ИХБФМ СО РАН, ИЦиГ СО РАН, ВНИИС-СОК РАСХН. В ИХБФМ СО РАН было подтверждено наличие гена Ил-18 человека в ДНК растений методом ПЦР, а также наличие белка ИЛ-18 в экстракте корнеплодов поколения ТЗ методом иммуноблота.

Влияние перорального введения траясгенной моркови несущей гея чИЛ-18 на функигюналъные свойства спленоцитов мышей.

На первом этапе исследования мы определили влияние перорального введения моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, на пролиферативную активность и продукцию ИФНу спленоцитами мышей. Экспериментальные животные содержались на стандартном рационе (интактная группа), либо с добавлением трансгенной (опытная группа), или обычной моркови того же сорта и выращенной в тех же условиях (контрольная группа). Установлено, что прием в пищу трансгенной моркови, в течение 16 дней не влияет на спонтанную и митоген-индуцированную пролиферативную активность спленоцитов. Функциональные свойства спленоцитов мышей, получавших трансгенную морковь, оценивали по способности к продукции ими иммунорегуляторного цитокина ИФНу. Было показано, что пероральное применение трансгенной моркови увеличивает спонтанную продукцию ИФНу спленоцитами мышей опытной и контрольной группы по сравнению с интактной группой. Стимулированная продукция ИФНу спленоцитами была достоверно выше у мышей опытной группы по сравнению с интакт-

Рис. 7. Влияние перорального применения трансгенной IIJI-18 моркови на продукцию ИФНу спленоцитами мышей. Мыши CBF1 получали к стандартному рациону трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь в течение 16 дней. Клетки селезенки выделялись и культивировались без и в присутствии Конканавалина А (5м кг/мл) 48 часов, ИФНу определяли в супернатантах методом ЭХЛ. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0.05.

ной и контрольной группами (рисунок 7).

14000

12000

10000

"Ь 8000

х еооо в

s 4000 2000 о

□ интактная

■ контрольная

■ опытная

спонтанная

КонА стимулированная

Полученные результаты свидетельствует о наличии специфических иммуномо-дулирующих свойств трансгенной по гену чИЛ-18 моркови при пероральном применении.

Влияние пероральиого применения трансгенной моркови на формирование иммунного ответа в экспериментальной модели на мышах.

Предыдущие опыты показали, что введение мышам рчИЛ-18 стимулирует клеточный иммунный ответ, в форме увеличения реакции ГЗТ. Соответственно, было целесообразно изучить, будет ли ИЛ-18 человека, продуцирующийся в трансгенной моркови, оказывать подобное действие на формирование иммунных реакций у мышей in vivo. Было установлено, что добавление в пищу трансгенной моркови в указанной дозе в течение 16 дней достоверно стимулирует формирование клеточного иммунного ответа у мышей опытной группы по сравнению с интактной и контрольной группами (рисунок 8). При изучении формирования гуморального иммунного ответа не было выявлено достоверного влияния пероральиого применения трансгенной моркови с ИЛ-18 на уровень первичного ответа (IgM АОК) на Т зависимый антиген (данные не представлены).

Рис.8. Влияние пероральиого применения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18, на выраженность реакции ГЗТ. Мыши CBF1 получали к стандартному рациону трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь в течение 16 дней. (М±т) На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0.05.

Противоопухолевая активность перорачъного применения трансгенного растения несупиего ген ИЛ-18.

Для изучения противоопухолевых свойств трансгенного растения несущего ген чИЛ-18 использовалась модель уретан-индуцированной аденокарциномы легких на мышах линии BALB/c. В данной модели, как показано [Bentel J.M. 1989] через 4 месяца после начала обработки уретаном у 100% мышей в легких обнаруживаются множественные опухолевые узлы с морфологией аденом. В наших опытах показано, что употребление в пищу моркови, несущей ген чИЛ-18, приводит к достоверному уменьшению числа аденоматозных узлов у опытной группы по сравнению с контрольной и интактной группами, а также снижению среднего диаметра аденом у опытной и контрольной группами по сравнению с интактной (рисунок 9).

Рис. 9.Влияние перорального применения трансгенной моркови на опухолевый процесс в модели уретан-индуцированной аденокар-циномы легких. Мыши линии BALB/c получали трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь 16 дней ежедневно, и 2 месяца по 3 раза в неделю. Через 4 месяца легкие фиксировали в 10% формалине и проводили подсчет количества и измерение диаметра аденоматозных образований, при помощи бинокулярной лупы при ее собственном увеличении х2 и окуляром х7 со стандартной окулярной линейкой. п=36 Данные представлены как медиана и размах квартилей.. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия пои в<0.05.

Поскольку данная модель аденомы легких является истинной опухолью и может служить моделью доброкачественного и злокачественного процесса [Bentel J.M. 1989], мы предполагаем, что ИЛ-18 человека, продуцирующийся в клетках трансгенного растения, может оказывать противоопухолевое действие через механизмы, описанные в литературе, а именно стимуляцию экспрессии FasL, увеличение цитотоксичности Т- и НК-клеток, ингибирование ангиогенеза, стимуляцию продукции иммунорегуляторных цитокинов и др.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что трансгенная морковь, несущая,ген ИЛ-18 человека, обладает активностью, схожей с реком-бинантным белком, в частности, стимулирует продукцию ИФНу спленоцитами мышей и реакцию ГЗТ, а также проявляет противоопухолевую активность в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких. На основании проделанной работы были сделаны следующие выводы. ВЫВОДЫ.

1. Рекомбинантный белок ИЛ-18 человека, полученный по оригинальной методике из клеток продуцентов E.coli, обладает специфическими для этого белка иммунохимическими и биологическими свойствами: он связывается со специфическими антителами в реакции иммуноанализа и стимулирует продукцию ИФНу и ФНОа МНК ПК человека.

2. Полученный рекомбинантный ИЛ-18 человека обладает биологической активностью in vivo, так как стимулирует при введении мышам реакцию гиперчувствительности замедленного типа и проявляет противоопухолевую активность в модели ортотопической солидной меланомы, увеличивая продолжительность жизни мышей и снижая вес опухоли.

3. Рекомбинантный человеческий ИЛ-18 связывающий белок, полученный по

Количество аденоматозных образований

количество О СП о

■ & ■ V'C.*»

5

0

интактная

д

"•V.'.-SK

контрольная

£

-2. 16 I 12

Диаметр аденоматозных образований

л

интактная

контрольная

оригинальной методике из клеток продуцентов E.coli, обладает специфическими для этого белка иммунохимическими и биологическими свойствами: он связывается со специфическими антителами в реакции иммуноанализа и отменяет специфические эффекты рчИЛ-18 в тестах in vitro.

4. Полученный рекомбинантный человеческий ИЛ-18 связывающий белок обладает биологической активностью in vivo: отменяет ЛПС-индуцированную летальность экспериментальных животных и проявляет противоопухолевую активность, снижая число метастазов в гематогенной модели мышиной ме-ланомы

5. Пероральное введение трансгенной по гену ИЛ-18 моркови Daiicus carota L. оказывает биологическое специфическое влияние: стимулирует продукцию ИФНу спленоцитами мышей, стимулирует клеточный иммунный ответ у экспериментальных животных, в форме увеличения реакции ГЗТ, и ингиби-рует опухолевый процесс в уретан-индуцированной модели аденокарциномы легких у мышей.

6. Рекомбинантные белки ИЛ-18, ИЛ-18СБ человека, полученные из продуцента E.coli, и трансгенное растение Dauern carota L. , несущее ген ИЛ-18 человека, обладают рядом специфических биологических эффектов и противоопухолевыми свойствами.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Якушенко Е.В.. Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков

A.П., Ведина Л.А., Филипенко М.Л., Сенников C.B., Власов В.В., Козлов

B.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого интерлей-кина-18. // Иммунология, иммуногенетика, иммунопатология. Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН.Новосибирск, 2003. Стр.256-258.

2. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Ведина Л.А., Филипенко М.Л., Сенников C.B., Власов В.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого интерлейкина-18. Материалы 7 Всероссийского научного Форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 2003, И Медицинская иммунологя, 2003, т.5, №3-4, стр. 429.

3. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Балданов Н.В., Жеребцо-ва Н.О., Филипенко М.Л., Сенников C.B., Козлов В.А. Интерлейкин-18: противоопухолевая активность. Тезисы доклада объединенного иммунологического форума. Екатеринбург 31 мая- 4 июня 2004. Russian Journal of Immunology 2004, V9, Supplement 1, p.49.

4. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A, FilipenkoM.L., Pustoshilova N.M., Zakabunin A.I, Sennikov S.V., Kozlov V.A. Biological and specific activity of recombinant human Interleukin-18. // In "Immunology 2004.Cytokine Network, and Regulatory Cells, Signaling, and Apoptosis" 2004, Medimond, In-ernational proceedings, p.423-428.

5. Якушенко E.B., Лопатникова Ю.А., Храпов E.A., Филипенко М.Л., Пусто-шилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников C.B., Козлов В.А. Получение ре-комбинантных цитокинов ИЛ-18 и ИЛ-18 связывающего протеина и исследование их биологической активности. // Материалы VIII Всероссий-

ского научного форума с международным участием имени В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге., 2004 том 6, №3-5, стр. 263-264.

6. Сенников C.B., Филипенко M.JL, Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Лопатнико-ва Ю.А., Дейнеко Е.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А. ИЛ-18 как стимулятор клеточного иммунитета. // Сборник тезисов 1 Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» Санкт-Петербург 29-31 мая 2005.Стр.35.

7. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А, Задорожный A.B., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина E.H., Сенников C.B., Козлов В.А.. Экспрессия ИЛ-18 связывающего белка человека в клетках E.Coli. И изучение биологической активности рекомбинантного белка. // Сборник тезисов 1 Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» Санкт-Петербург 29-31 мая, 2005. Стр.146-147.

8. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Дейнеко Е.В., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Сенников C.B., Шумный В.К., Козлов В.А. Изучение иммунорегуляторных эффектов перорального применения трансгенной моркови несущей ген ИЛ-18. // Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», 2005, т.4, №2,стр.119.

9. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Пустошилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников C.B., Козлов В.А. Исследование биологической активности рекомбинантных ИЛ-18 и ИЛ-18 связывающего белка. // Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», 2005, т.4, №2, стр.120.

10. Храпов Е.А., Воронина E.H., Закабунин А.И., Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников C.B., Пустошилова Н.М., Козлов В.А., Филипенко М.Л. Получение рекомбинантного интерлейкина-18 человека в клетках E.coli. // Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», 2005, т.4, №2, стр.125.

11. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А, Сенников C.B. Характеристики интерлейкина-18 и его роль в иммунном ответе. // Медицинская иммунология. 2005, том 7, №4, стр.355-364

12. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина E.H., Сенников C.B.i Филиппенко М.Л., Е.В.Дейнеко, Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А. ИЛ-18: биологические свойства и противоопухолевая активность рекомбинантного белка и трансгенного растения Daucus carota L. II Дни иммунологии в Сибири, Красноярск, 2005, Стр.134-136.

13. Храпов Е.А., Задорожный A.B., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Козлова Ю.Н., Литовченко Л.Л., Канынина A.B., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников C.B., Козлов В.А. Получение и изучение биологической активности рекомбинантного ИЛ-18 связывающего белка// Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные науки-медицине», 2005, Новосибирск, стр.105.

14. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников C.B., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко MJL, Дейнеко Е.В., Филипенко Е.А., Пухначева H.A., Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A., Шумный В.К., Козлов В.А. "Трансгенная

морковь, экспрессирующая ИЛ-18 и ее иммуномодулирующие свойства." «Иммунология Урала», 2005, №1(4), стр. 140-141.

15. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Сенников C.B., Власов В.В., Козлов В.А. "Рекомбинантный человеческий интерлейкин-18: биологическая активность и противоопухолевые свойства." «Иммунология Урала»,

2005, №1(4), стр. 162-163.

16. Е.В.Якушенко, Ю.А.Лопатникова, Ю.Н Козлова, Н.М. Пустошилова, М.Л.Филипенко, Е.А.Храпов, С.В.Сенников, В.А.Козлов. Получение ре-комбинантного интерлейкин-18 связывающего белка, изучение его биоло-гичекой активности и антиметастатичекого действия. Московская международная конференция «Биотехнология и медицина» Москва 2006, стр 150.

17. Khrapov Е.А., Lopatnikova J.A., Voronina E.N., Yakushenko E.V., Zakabunin A.I., Sennikov S.V., Pustoshilova N.M., Kozlov V.A., Filipenko M.L. Expression of human IL-18 in E.coli and biological activity of recombinant protein. In «Biotechnology in biology and medicine. Editors: A.M. Egorov and G. Zaikov,

2006, Nova Science Publishers, Inc., New York, p. 19-25.

18. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Deineko E.V., Filipenko M.L., Voronina E.N., Turchinovich A.A., Filipenko E.A., Pukhnatcheva N.A., Schmikova N.A., Shumny V.K., Sennikov S.V., Kozlov V.A.. Use of transgenic carrot plants producing human interleukin-18 for modulation of mouse immune response. In «Biotechnology in biology and medicine. Editors: A.M. Egorov and G. Zaikov, 2006, Nova Science Publishers, Inc., New York, p.74-81.

19. Лопатникова Ю.А., Якушенко E.B., Храпов E.A., Воронина E.H., Сенников C.B., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Козлов В.А. ИЛ-18: биологические свойства и противоопухолевая активность рекомбинантного белка и трансгенного растения Daucus carota L. несущего ген ИЛ-18 человека. Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека :от эксперимента к клинике. Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН, Новосибирск 2006, стр 61-67

20. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников C.B., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Козлова Ю.Н., Пустошилова Н.М., Козлов В.А. Получение рекомбинантного интерлейкин-18 связывающего белка и исследование его биологической и специфической активности. Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН, Новосибирск 2006, стр 94-98

Подписано в печать 15.11.06 г. Формат 60 х 84/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Изд. № 126п/06. Заказ № 447п

Отпечатано в типографии НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4. Тел.: (383) 225-24-29

Актуальность

Одно из достижений современной медицины состоит в разработке новых лекарственных средств, полученных с помощью генной инженерии человеческих рекомбинантных цитокинов. Цитокины - это белковые или полипептидные продукты, которые являются медиаторами межклеточных коммуникаций и служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма [5]. В настоящее время известно несколько сотен цитокинов, некоторые из них используются в клинической практике с диагностической целью, для профилактики и терапии различных заболеваний [152].

Перспективным препаратом для создания на его основе лекарственного средства является-интерлейкин-18. ИЛ-18-это цитокин, участвующий в функционировании иммунокомпетентных клеток, в том числе и в регуляции экспрессии и продукции многих других цитокинов. ИЛ-18 стимулирует пролифе-ративную активность Т-лимфоцитов, повышает литическую активность НК-клеток, увеличивает продукцию ИФНу, ГМ-КСФ [41, 223], ФНО-а [49, 125], ИЛ-2 [97, 121], ИЛ-5, ИЛ-6 [78, 144, 176], ИЛ-8 и ИЛ-10 [170, 228], PGE2 [54, 86] активированными T-, В-, НК-клетками. ИЛ-18 проявляет противоопухолевую активность через стимуляцию продукции ИФНу, оксида азота N0 [94, 79, 224], снижение ангиогенеза [33, 205], повышение активности НК-клеток и ци-тотоксических Т-лимфоцитов [122], повышение экспрессии апоптогенного фактора Fas -ligand [59, 64]. В экспериментах in vitro также показано, что ИЛ-18 способен стимулировать экспрессию молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM) [120, 129]. Еще одной из особенностей ИЛ-18 является конститутивная экспрессия многими типами клеток различных систем организма. Это отличает его от многих других иммуномодулирующих цитокинов, которым свойственна индуцибельная экспрессия.

Обладая обширным спектром биологических эффектов, ИЛ-18 участвует в патогенезе некоторых заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалением и деструкцией тканей, например, при ревматоидном артрите [109, 150], диабете [179,180] и болезни Крона [127,166]. В связи с этим, блокатор ИЛ-18, представляющий собой физиологическую ловушку-рецептор, может являться перспективным фактором для отмены побочных действий ИЛ-18. ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ), являющийся циркулирующим антагонистом ИЛ-18, конститутивно экспрессируется спленоцитами и относится к суперсемейству иммуноглобулинов. ИЛ-18СБ связывает ИЛ-18 путем формирования высоко аффинного комплекса (Кс1=400рМ) и тем самым нейтрализует эффекторные функции цитокина ИЛ-18 [141].

Данные о значительной роли ИЛ-18 в регуляции большого числа иммунных реакций позволяют предположить, что в ближайшем будущем ИЛ-18 и ИЛ-18 СБ займут свое достойное место в арсенале препаратов для борьбы с множеством патологических состояний человека.

В качестве продуцентов для получения белков-цитокинов медицинского назначения, в настоящее время широко используются клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих. Однако такие системы имеют определенные недостатки. В клетках прокариот не происходят посттрансляционная модификация и фолдинг многих эукариотических белков. Использование клеток дрожжей и млекопитающих ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков [181]. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии, растения, как продуценты иммунорегуляторных белков, имеют ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего, необходимо отметить, что в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковыми в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата. Исследования в этой области идут в направлении создания трансгенных растений несущих опухолевые, инфекционные антигены или иммунорегуляторные цитокины, с целью моделирования специфических иммунных реакций. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. [36]. В настоящее время с различной эффективностью трансфекции подвергнуты: картофель, кукуруза, салат, люцерна, морковь, томаты, огурцы, табак и некоторые другие [58, 174, 196, 203, 222, 232]. Данная технология относится к социально значимым для России и найдет широкое применение для лечения вторичных иммунодефицитов, воспалительных и аутоиммунных заболеваний.

Таким образом, принимая во внимание уникальность любых рекомби-нантных продуктов, основанную на особенностях продуцентов, методов выделения, очистки и хранения полученных препаратов, мы решили изучить биологические специфические свойства рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ, полученных по оригинальной методике из продуцента E.coli, в различных экспериментальных моделях. Поскольку существуют данные по эффективности перорального введения антигенов и цитокинов, а также есть полученные в последние годы результаты по использованию трансгенных растений, нам представлялось актуальным в данной работе оценить эффекты перорального введения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

Цель работы:

Охарактеризовать биологическую активность рекомбинантных белков ИЛ-18 и ИЛ-18СБ, полученных по оригинальной методике из клеток-продуцентов Escherichia coli, а также иммуномодулирующие эффекты трансгенного растения Daucus carota L, несущего ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении.

В соответствие с целью были поставлены следующие задачи.

Задачи исследования: 1. Изучить рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ, полученные из продуцентов E.coli по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа по связыванию со специфическими антителами.

2. Изучить способность рчИЛ-18 стимулировать продукцию ФНОа, ИФНу мо-нонуклеарными клетками периферической крови человека.

3. Изучить влияние рчИЛ-18 на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей, а также противоопухолевую активность в экспериментальной модели на мышах.

4. Изучить биологическую активность ИЛ-18СБ по отмене специфического иммунорегуляторного эффекта ИЛ-18 на МНК ПК человека.

5. Исследовать активность ИЛ- 18СБ в эксперименте in vivo по отмене ЛПС-индуцированной летальности и его противоопухолевое действие в мышиной модели меланомы.

6. Исследовать иммунорегуляторные эффекты перорального введения трансгенной по ИЛ-18 моркови Daucus carota L. на показатели гуморального и клеточного иммунного ответа, на продукцию иммунокомпетентными клетками ИФНу, а также противоопухолевую активность в модели уретан индуцированной аденокарциномы легких.

Научная новизна: Впервые показано стимулирующее влияние рчИЛ-18 на реакцию ГЗТ при внутривенном введении интактным животным. Показано противоопухолевое действие рчИЛ-18 в модели солидной ортотопической меланомы В16. Впервые продемонстрировано, что эндогенный ИЛ-18 играет ключевую роль в КонА-индуцированной продукции ФНОальфа, что подтверждено в эксперименте с отменой этого эффекта с помощью ИЛ-18СБ. На модели гематогенного мета-стазирования клеток меланомы В16 показан антиметастатической эффект введения рчИЛ-18СБ.

Впервые показано, что трансгенные растения Daucus carota L., несущие ген ИЛ-18 человека, обладают иммуномодулирующей активностью при перораль-ном применении экспериментальными животными. Впервые продемонстрированы противоопухолевые свойства трансгенной моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении в экспериментальной модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

Практическая и теоретическая значимость:

Показанная специфическая иммунохимическая и биологическая активность in vitro и in vivo ИЛ-18 и ИЛ-18СБ свидетельствует, что рекомбинантные препараты ИЛ-18 и ИЛ-18СБ, полученные по оригинальной методике, могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов их действия и в перспективе для создания на их основе лекарственных препаратов. В результате исследования оптимизирована тест-система для количественного определения ИЛ-18 и ИЛ-18СБ в биологических жидкостях. Представленные результаты о биологической активности in vitro и in vivo рчИЛ-18 и ИЛ-18СБ расширяют представление о иммунорегуляторных свойствах этих белков и вносят существенный вклад в понимание системы этих медиаторов в противоопухолевом иммунитете. Экспериментальные данные по пероральному применению трансгенного растения, несущего ген ИЛ-18, и показанные иммуномодулирующие эффекты являются основой для дальнейшего развития технологий получения трансгенных растений, экспрессирующих иммунорегуляторные медиаторы человека, и их использования с целью профилактики и, возможно, лечения иммунопатологических состояний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рекомбинантные человеческие ИЛ-18 и ИЛ-18СБ, полученные по оригинальной методике из продуцента E.coli, обладают специфической биологической и противоопухолевой активностью.

2. Трансгенное растение Daucus carota L., несущее ген ИЛ-18 человека, обладает иммуномодулирующими свойствами и противоопухолевой активностью.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 2) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г.), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.), 5) «Технология и онкология» Санкт-Петербург 2005г, 6) 4-ой конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005), 7) Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет» (Новосибирск 2005г), 8) Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск 2005), 9) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва 2006), 10) «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск 2006).

САМОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕННОЙ РАБОТЫ.

Создание генетических конструкций и модификация бактериальных клеток (Е. coli) проводилась сотрудниками группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск (руководитель к.б.н. М.Л. Филипенко). Получение и очистка рекомбинантных белков проводилась сотрудниками ООО «Центр инженерной иммунологии» г. Новосибирск (руководитель к.м.н. Н.М. Пустошило-ва). Трансфекция растения моркови Daucus carota L. проводилась в ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур РАСХН (Москва).

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН.

Большую признательность автор выражает научному руководителю работы профессору, д.м.н. С.В. Сенникову за подробное конструктивное обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.

выводы.

1. Рекомбинантный белок ИЛ-18 человека, полученный по оригинальной методике из клеток продуцентов E.coli, обладает специфическими для этого белка иммунохимическими и биологическими свойствами: он связывается со специфическими антителами в реакции иммуноанализа и стимулирует продукцию ИФНу и ФНОа МНК ПК человека.

2. Полученный рекомбинантный ИЛ-18 человека обладает биологической активность in vivo, так как стимулирует при введении мышам реакцию гиперчувствительности замедленного типа и проявляет противоопухолевую активность в модели ортотопической солидной меланомы, увеличивая продолжительность жизни мышей и снижая вес опухоли.

3. Рекомбинантный человеческий ИЛ-18 связывающий белок, полученный по оригинальной методике из клеток продуцентов E.coli, обладает специфическими для этого белка иммунохимическими и биологическими свойствами: он связывается со специфическими антителами в реакции иммуноанализа и отменяет специфические эффекты рчИЛ-18 в тестах in vitro.

4. Полученный рекомбинантный человеческий ИЛ-18 связывающий белок обладает биологической активностью in vivo: отменяет ЛПС-индуцированную летальность экспериментальных животных и проявляет противоопухолевую активность, снижая число метастазов в гематогенной модели мышиной меланомы.

5. Пероральное введение трансгенной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. оказывает биологическое специфическое влияние: стимулирует продукцию ИФНу спленоцитами мышей, стимулирует клеточный иммунный ответ у экспериментальных животных, в форме увеличения реакции ГЗТ, и ингибирует опухолевый процесс в уретан-индуцированной модели аде-нокарциномы легких у мышей.

6. Рекомбинантные белки ИЛ-18, ИЛ-18СБ человека, полученные из продуцента E.coli, и трансгенное растение Daucus carota L., несущее ген ИЛ-18 человека, обладают рядом специфических биологических эффектов и противоопухолевыми свойствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая результаты, можно заключить, что полученный в совместной работе с ИХБФМ СО РАН рекомбинантный белок рчИЛ-18 определяется иммунохимически, связываясь со специфическими антителами в тесте имму-ноанализа, стабилен при хранении и калибруется в этой системе при разведении, обладая при этом специфической биологической активностью. А именно, рчИЛ-18 стимулирует продукцию ИФНу и ФНОа МНК ПК человека. При изучении влияния рчИЛ-18 на формирование иммунного ответа установлено, что в экспериментальной модели на мышах исследуемый препарат увеличивает выраженность реакции ГЗТ, сдвигая баланс в сторону клеточного иммунного ответа, при этом стимуляции гуморального ответа в форме увеличения антителообразующих клеток IgM обнаружено не было.

Рекомбинантный ИЛ-18СБ, полученный по оригинальной методике из продуцента E.coli, проявляет иммунохимическую активность в тесте имму-ноанализа, связываясь со специфическими антителами, и сохраняет эту способность при хранении. Как растворимый рецептор ИЛ-18, ИЛ-18СБ блокирует его действие, отменяя стимулированную экзо- и эндогенным ИЛ-18 продукцию ФНОа. Нужно отметить, что продукция ФНОа в ответ на Конка-навалинА зависит главным образом от эндогенного ИЛ-18, поскольку добавление в культуру его блокатора - ИЛ-18СБ снижает КонА-стимулированную продукцию ФНОа до спонтанного уровня.

Данные, полученные при исследовании биологической активности ИЛ-18СБ in vivo, свидетельствуют о том, что рекомбинантный препарат отменяет ЛПС-индуцированную летальность мышей, опосредованную главным образом последовательной индукцией продукции ИЛ-18, ИФНу и FasL гепато-цитами.

Также показано, что оба препарата рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ обладают противоопухолевой активностью в разных моделях, что связано с различными механизмами их противоопухолевого действия. ИЛ-18 через ингибирова-ние ангиогенеза, стимуляцию продукции ФНОа и ИФНу, увеличение цитотоксичности НК и Т клеток влияет на вес и выживаемость экспериментальных животных в модели ортотопической меланомы В16. ИЛ-18СБ подавляет экспрессию молекул адгезии, стимулированную эндогенным ИЛ-18, и, таким образом, ингибирует процесс метастазирования в гематогенной метастатической модели мышиной меланомы В16.

Трансгенное растение Daucus carota L., несущее ген ИЛ-18 человека, было получено при сотрудничестве трех институтов: ИХБФМ СО РАН, ИЦиГ СО РАН, ВНИИССОК РАСХН. Исследование биологической активности трансгенных растений при пероральном применении в экспериментальных моделях на мышах показало, что ИЛ-18, экспрессирующийся и продуцирующийся в растительных клетках, обладает теми же свойствами что и ре-комбинантный белок. Установлено, что пероральное употребление трансгенной моркови несущей ген ИЛ-18 человека, в течение 16 дней увеличивает продукцию ИФНу спленоцитами мышей, а также стимулирует клеточный иммунный ответ в форме увеличения реакции ГЗТ. Противоопухолевая активность трансгенного растения исследовалась в модели длительно развивающейся уретан-индуцированной аденокарциномы легких. Полученные данные свидетельствуют о том, что ИЛ-18, продуцирующийся в трансгенной моркови, ингибирует опухолевый процесс в данной экспериментальной модели на мышах.

Исходя из представленных выше результатов, мы делаем вывод, что полученные по оригинальной методике рекомбинантные белки ИЛ-18 и ИЛ-18СБ человека стабильны при хранении и обладают специфической биологической активностью, и, кроме того, оказывают противоопухолевое действие в различных экспериментальных моделях. Полученное трансгенное растение -морковь Daucus carota L., при пероральном применении обладает специфическими биологическими свойствами аналогичными рекомбинантному белку ИЛ-18, а также противоопухолевой активностью. Таким образом, все полученные препараты обладают специфической биологической активностью, что позволяет продолжить разработки по созданию на их основе лекарственных средств.