Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Значение активности иммунорегуляторных T-лимфоцитов и естественных киллерных клеток в противоопухолевом иммунном ответе у больных хроническим лимфолейкозом

На правах рукописи

УДК: 616. 155.392.2-036. 12:612.017. 1+616. 15-09,7

АКИНФИЕВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ЗНАЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ И ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ

14.01.21 - гематология и переливание крови 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Санкт-Петербург 2011

4847

83

4847183

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Бубнова Людмила Николаевна Бессмельцев Станислав Семенович

Афанасьев Борис Владимирович Сесь Татьяна Павловна

Ведущая организация: ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится «_» _2011 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д-208.074.01 ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» (293024, Санкт-Петербург, ул. 2-ая Советская, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «_»_2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Глазанова Татьяна Валентиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Хронический лимфолейкоз (XJIJI) является наиболее распространенным видом лейкоза среди всех неопластических заболеваний кроветворной и лимфатической ткани (Лебедев В.Н., 1972). В настоящее время морфологическое строение и клинические проявления XJIJI описаны достаточно подробно и детально, однако патофизиологические характеристики этой формы лейкоза окончательно не уточнены и являются предметом многих исследований (Akbari О. et al., 2003). При XJIJI иммунологическая недостаточность обусловлена опухолевым поражением лимфоидной ткани, а также воздействием химиотерапии на гемопоэз, в результате чего происходит угнетение клеточного и гуморального звена (Волкова М.А., 2001). Показано, что при XJIJI происходит изменение физиологической активности важнейших эффекторных клеток как системы естественной резистентности организма - естественных киллерных клеток (NK-клеток), нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов, макрофагов, так и системы адаптивного иммунитета - CD3+CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), функционирующих в режиме иммунологического надзора над опухолевым процессом (Тотолян А.А., 2000). В последние годы все больше внимания исследователей уделяется изучению минорных субпопуляций иммунорегуляторных Т-лимфоцитов - CD3+/CD16/56+ NKT-клеток (natural killer T-cells) и CD3+CD4+CD25h,sh+ естественных регуляторных Т-лимфоцитов (naturally occurring regulatory T-cells, ТГС8-клсток), - играющих, несмотря на малочисленность, ключевую роль в регуляции противоопухолевого иммунного ответа (Skold М. et al., 2003). Установлено, что NKT-клетки стимулируют реакции противоопухолевого иммунитета, тогда как Trcg-клетки, напротив, подавляют активность эффекторных Т-лимфоцитов и способствуют опухолевому росту (Chatila Т.А., 2005). В последние годы была доказана эффективность клеточной терапии, основанной на активации NKT-клеток и ингибировании Treg-клеток в организме пациентов с солидными злокачественными

новообразованиями (ЬЫка^'а Е. й а1., 2005). Несмотря на возрастающий интерес исследователей к особенностям функциональной активности 1ЧКТ-клеток и Тге„-лимфоцитов и их участию в противоопухолевом иммунном ответе, на данный момент количество и динамика этих минорных субпопуляций Т-клеток в организме пациентов с онкогематологическими заболеваниями практически не изучены. Учитывая вышеизложенное, изучение взаимосвязи уровня ЫКТ-клеток и Тге„-лимфоцитов с различными показателями клеточного и гуморального звена иммунитета, а также исследование регуляции этими клетками иммунного ответа при ХЛЛ являются актуальными в настоящее время.

Целью настоящего исследования явилось установление роли иммунорегуляторных Т-лимфоцитов и естественных киллерных клеток в патогенезе ХЛЛ, и значимости их определения для прогнозирования течения заболевания и оценки эффективности терапии.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание ЫК-, ИКТ-клеток и Тгев-лимфоцитов в периферической крови и костном мозге пациентов с симптоматической и асимптоматической формами впервые выявленного ХЛЛ, с рецидивом заболевания и достигших ремиссии.

2. Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и костного мозга больных и оценить активность гуморального звена иммунитета.

3. Исследовать влияние содержания иммунорегуляторных Т-лимфоцитов на функциональную активность №С-клеток, нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов периферической крови больных.

4. Исследовать апоптотическую активность клеток опухолевого клона и установить ее взаимосвязь с уровнем иммунорегуляторных Т-клеток для прогнозирования течения заболевания и оценки эффективности терапии.

Научная новизна исследования. Впервые проведен анализ уровня иммунорегуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови и костном мозге у больных ХЛЛ в ходе опухолевой прогрессии и в зависимости от варианта

течения заболевания, позволивший доказать определяющую роль №СТ-клеток в активации противоопухолевого иммунного ответа у больных ХЛЛ и влияние ТГС8-клеток на супрессию противоопухолевого иммунитета при данном заболевании.

Установлено влияние иммунорегуляторных Т-лимфоцитов на функциональную активность важнейших факторов противоопухолевого иммунного ответа - N К-клеток, нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов - на разных этапах опухолевой прогрессии и при различных формах течения ХЛЛ.

Впервые полученные новые сведения об изменении продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами в динамике опухолевого процесса у пациентов с ХЛЛ свидетельствуют о модифицирующем воздействии опухолевых клеток на периферические иммунные клетки, приводящем к смене противоопухолевой активности нейтрофилов на проопухолевую и избыточной продукции нейтрофилами АФК, обладающих канцерогенным действием.

Показана прямая зависимость спонтанной апоптотической активности опухолевого клона В-лимфоцитов больных ХЛЛ от содержания 1ЧК- и ИКТ-клеток и от активности МК-клеток в периферической крови больных.

На основе всестороннего анализа полученных результатов исследований установлено значение уровня ЭДК- и МКТ-клеток как прогностического фактора течения заболевания.

Практическая значимость. Предложен новый прогностический критерий для определения характера клинического течения ХЛЛ. Доказана значимость определения содержания иммунорегуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови больных ХЛЛ для прогнозирования течения заболевания.

Показана зависимость глубины дисфункции основных звеньев иммунитета от фазы ХЛЛ, а также от варианта течения заболевания, что имеет значение для определения терапевтической тактики у больных ХЛЛ на ранних стадиях заболевания.

Внедрены методы исследования функциональной активности N К-клеток, нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов периферической крови с

использованием двух- и трехпараметрической проточной цитофлуориметрии.

Данные методы позволяют проводить высокоинформативную оценку клеточного

звена иммунной системы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровень важнейших активаторов противоопухолевого иммунного ответа -]\1К- и 1МКТ-клеток - резко снижен у больных с впервые выявленным ХЛЛ и с рецидивом заболевания, тогда как при достижении ремиссии содержание этих клеток значительно повышается. У пациентов с асимптоматической формой впервые выявленного заболевания содержание 1\'КТ-клеток в периферической крови значительно выше, а ТГС8-лимфоцитов существенно ниже, чем у больных с симптоматической формой ХЛЛ как в периферической крови, так и в костном мозге. Наиболее высокое соотношение НКТ:Тгев установлено у больных в ремиссии и с асимптоматической формой ХЛЛ, а наиболее низкое - в рецидиве заболевания, что свидетельствует о значимости соотношения данных клеток для поддержания активного состояния противоопухолевого иммунитета.

2. У больных с пониженным уровнем №С- и МКТ-клеток выявлено угнетение клеточного и гуморального звена иммунного ответа, тогда как у пациентов с повышенным содержанием этих клеток показано восстановление функциональной активности факторов противоопухолевого иммунитета.

3. Эффективность индуцированного специфической терапией апоптоза опухолевого клона зависит от уровня и ТМКТ-клеток и от активности МК-клеток в периферической крови больных ХЛЛ: низкая спонтанная апоптотическая активность сочетается с более высоким уровнем 1ЧК- и ЫКТ-клеток и более высокой функциональной активностью МК-клеток, что является прогностическим фактором положительного ответа на терапию.

4. Установленный дисбаланс содержания Т-хелперов и ЦТЛ у пациентов в ремиссии, заключающийся в значительном увеличении уровня С03+/С08' Т-клеток и снижении количества С03+/С04+ Т-лимфоцитов, свидетельствует

об активации противоопухолевого иммунного ответа и превалированию процесса апоптоза трансформированных клеток над пролиферацией. Апробация и внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные осложнения при иммунодепрессиях» (2010г., СПб); на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (2010г., СПб); на 4-м Международном Симпозиуме по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток памяти P.M. Горбачевой (2010г., СПб); на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (2011г., СПб).

В работу лаборатории иммуногематологии РосНИИГТ внедрен способ оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов с помощью метода определения фагоцитоза частиц латекса, меченных флуорохромом FJTC, и метод исследования цитотоксической активности NK-клеток периферической крови с использованием флуоресцентного красителя CFSE с помощью проточной цитометрии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 304 источника. Диссертация иллюстрирована 31 рисунком и 22 таблицами.

Личный вклад автора. Автором лично выполнены все исследования по изучению уровня иммунорегуляторных Т-лимфоцитов и основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и костного мозга, состоянию гуморального звена иммунитета, определению цитотоксической активности NK-клеток, функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, а также

апоптотической активности опухолевых клеток у всех обследованных больных и доноров. Проведен клинико-лабораторный анализ, статистическая обработка и обобщение полученных результатов исследования.

ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных больных. Под нашим наблюдением находились 310 больных ХЛЛ в возрасте от 48 до 84 лет, среди них - 166 мужчин и 144 женщины. Все они проходили обследование и лечение в гематологической клинике и поликлиническом отделении РосНИИГТ в период с 2009 по 2011 гг. Диагноз ХЛЛ был подтвержден данными клинического анализа крови, миелограммы, иммунофенотипирования лимфоидных элементов периферической крови и костного мозга, гистологического исследования костного мозга при трепанобиопсии задней ости подвздошной кости, гистологического исследования лимфоузлов с иммуногистохимией, иммунологического исследования сыворотки крови.

Среди обследованных больных 77 — с впервые выявленным ХЛЛ до начала проведения специфической или первично-сдерживающей терапии, из них у 21 пациента (6,7%) была диагностирована симптоматическая форма ХЛЛ и у 56 больных (18,1%) - асимптоматическая форма заболевания (НаИек М. й а!., 2008). Больные с симптоматической формой ХЛЛ (стадии В с наличием симптомов и С по классификации Вте11989) имели показания к незамедлительному началу специфической терапии, длительность их заболевания до начала лечения не превышала 1 года. Пациенты с асимптоматической формой ХЛЛ (стадия А) не нуждались в лечении и находились на амбулаторном наблюдении, длительность их заболевания составляла, как правило, от 5 до 10 лет. У 120 больных (38,7%) был верифицирован рецидив заболевания, и у 113 (36,5%) - подтвержденная ремиссия. Стадию констатировали на момент установления диагноза.

Всем больным, за исключением пациентов с асимптоматической формой ХЛЛ, проводилась индукционная или противорецидивная терапия по

программам СОР, CHOP, FC, FCD, R-FC, R-FCD, Flu-Cam, также использовалась сопроводительная терапия, включавшая противовирусные,

противобактериальные, гепатопротекторные и другие препараты. Оценка эффективности лечения больных осуществлялась с использованием критериев, разработанных на Международном рабочем совещании по хроническому лимфолейкозу в 1989г. (Волкова М.А., 2001).

Группу сравнения составили 62 кадровых донора крови и 22 донора костного мозга.

Материал исследования. В качестве материала исследования использовали МНК периферической крови, цельную венозную кровь и МНК костного мозга, полученного путем стернальной пункции, и стабилизированные антикоагулянтом (гепарин натрия, 25 Ед/мл). МНК выделяли методом градиентного центрифугирования с использованием среды для разделения клеток Lympholyte-Н («Cederlane», Canada). Также исследовали сыворотку периферической крови больных.

Для решения поставленных задач были использованы следующие методы исследования:

Определение иммунофенотипических характеристик МНК периферической крови и костного мозга проводили с помощью двух- и трехпараметрического анализа на проточном лазерном цитофлуориметре «Cytomics FC 500» («Beckman Coulter», США) с использованием панели моноклональных антител (МоАТ) («Beckman Coulter», США), меченных флуоресцирующими красителями — флуоресцфлуоресцеинизотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (РЕ) и тандемным красителем фикоэритрином-техасским красным (PE-Texas Red, ECD), - к дифференцировочным антигенам, позволяющим идентифицировать следующие популяции клеток: CD3 ' - зрелые Т-лимфоциты, CD3+/ CD4+ - Т-хелперы, CD37 CD8+- цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), CD19+ и HLA-DR+ - В-лимфоциты, CD37CD16/56+-МК-клетки, CD37CD16/56+-ЖТ-клетки и CD3+/ CD4+/CD25high+-Tjeg-лимфоциты. Клетки опухолевого клона определяли по экспрессии ими CD 19,

CD5, CD23, слабой экспрессии CD20 и CD79b, отсутствию CD 10 и FMC7, а также рестрикции легких цепей иммуноглобулинов - к или X.

Содержание сывороточных иммуноглобулинов (Ig) классов G, А, М определяли стандартным турбидиметрическим методом с использованием автоматического биохимического анализатора «Микролаб 300».

Исследование фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов (рис.!) проводили с помощью метода определения фагоцитоза частиц латекса, меченных флуорохромом FITC, с использованием проточного цитофлуориметра. В качестве объекта фагоцитоза использовали 1% суспензию полистирольного латекса («ЛабТек», Санкт-Петербург) с размером частиц 0,3 мкм, меченного флуорохромом FITC. Ввиду малочисленности популяции моноцитов для подтверждения принадлежности объекта исследования к данной популяции использовали специфические MoAT (aHTH-CD14-PE) для их идентификации. Определяли фагоцитарный индекс (ФИ,%) и фагоцитарное число (ФЧ).

CDU-РЕ РГГС FrtC

Рис.1. А - точечная гистограмма CD 14 PE/SS Lin (А-гранулоциты, В-моноциты, С-лимфоциты). В -линейная гистограмма FL1 поглощения FITC-латекса гранулоцитами, загейтированная по региону гранулоцитов (А); H - ФИ,%, G - ФЧ. С - двухмерная точечная гистограмма, загейтированная по региону моноцитов (В): J1 - нефагоцитировавшие моноциты, J2 - фагоцитировавшие моноциты.

Изучение ферментативной активности нейтрофильных гранулоцитов по определению генерации данными клетками активных форм кислорода (супероксид-аниона) проводили с помощью НСТ-теста (метод Маянского А.Н. и Пикузы О.И., 1993). С целью объективизации результатов использовали

планшетный спектрофотометр «Dynatech ELISA Reader», с помощью которого измеряли оптическую плотность исследуемых образцов при длине волны 540 нм. Вычисляли среднюю оптическую плотность для контроля и для опыта, и индекс активации (ИА) по соотношению результатов опыта и контроля.

Цитотоксическую активность NK-клеток (естественную цитотоксичность, ЕЦТ) исследовали с помощью проточной цитометрии по их способности лизировать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562 (рис.2). Для идентификации клеток-мишеней К-562, их предварительно инкубировали с флуоресцентным красителем CFSE (5-,6-карбоксифлуоресцеин диацетат-N-сукцинимидил эфир). Окрашенные клетки-мишени смешивали с клетками-эффекторами (МНК) в различных соотношениях (1:100, 1:50, 1:25, 1:12,5 и 1:6,25) и инкубировали в течение 4 часов. Затем клеточную суспензию окрашивали витальным красителем 7-AAD (7-аминоактиномицин D) для определения убитых в ходе реакции мишеней. По количеству убитых К-562 определяли NK-активность данного образца.

{ccl:s!FLIÜ>g/FU Log-ADC

(«IIS ШО О] fU Loj'FLl Leg - ACIC

31 0% 32 25,4%

S3 0% р4'- si:.:' 74,6%

Рис.2. А - точечная гистограмма СР8Е/7-ААО с изображением клеток-эффекторов (Н) и клеток-мишеней (О). В - двухмерная точечная гистограмма, загейтироваиная по региону клеток-мишеней: 04 - живые клетки культуры К-562; С2 - убитые клетки-мишени.

Апоптотическую активность опухолевого клона В-лимфоцитов периферической крови определяли по выявлению одной из основных морфологических характеристик апоптоза: потере асимметричности клеточной мембраны за счет перестройки ее фосфолипидных компонентов. Появление

фосфатидилсерина (ФС) на наружной поверхности плазматической мембраны клетки выявляли при связывании рекомбинантного, конъюгированного с флорохромом протеина аннексина V (35-36 kDa) с отрицательно заряженными молекулами фосфолипида, что позволяло визуализировать клетки, находящиеся в раннем апоптозе. В исследовании использовали набор реагентов «Annexin V Kit» (Beckman Coulter, США), для идентификации опухолевого клона В-лимфоцитов использовали МоАТ к антигену CD19: aHra-CD19-ECD (Beckman Coulter, США), учет результатов проводили на проточном цитофлуориметре.

Апоптотическая активность опухолевых В-клеток периферической крови была изучена у больных XJIJI с активной фазой заболевания (с прогрессирующей формой впервые выявленного XJIJI и с рецидивом), когда в периферической крови больных содержание CD19+ клеток составляло от 23,5% до 96,7%. Исследование апоптоза опухолевого клона В-лимфоцитов проводили до начала специфической терапии больных XJIJI (спонтанный апоптоз) и после проведения курса лечения (индуцированный апоптоз).

Статистический анализ полученных результатов исследований проводили с использованием t-критерия Стьюдента для нормальных распределений. Результаты в большинстве таблиц представлены в виде средней арифметической (М), ее стандартной ошибки (а) и процентного распределения (%). При отсутствии нормальности распределения применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни для независимых переменных из пакета программы Statistica 6.0 (Statistica Inc., США). Уровень доверительности р<0,05 рассматривали как статистически значимый.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточный, гуморальный иммунитет и цитотоксическая активность естественных киллерных клеток у больных ХЛЛ

При исследовании субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови установлено, что относительное содержание зрелых CD3+ Т-лимфоцитов у

пациентов как с впервые выявленным заболеванием, так и с рецидивом резко снижено (рис.3,А). У пациентов в ремиссии уровень СОЗ' Т-лимфоцитов практически не отличается от нормы, однако у них нарушено соотношение С047С08 Т-клеток за счет значительного повышения содержания С03 /С08' ЦТЛ и снижения С03+/С04+ Т-хелперов, что приводит к инверсии ИРИ (С04+/С08+), составившего 0,7±0,1 при норме 1,9±0,2. Известно, что ЦТЛ являются антигеннаправленными индукторами апоптоза в клетках-мишенях. Установленная инверсия ИРИ у больных в ремиссии свидетельствует об активации апоптоза клеток опухолевого клона и превалированию процесса апоптоза над пролиферацией.

А В

50,0 40,0 30,0

ш

¡ыа

□ норма о симптом, форма 0 асимптом. форма

■ рецидив □ ремиссия

100,0 90,0 80,0 70,0

го,о

20,0 10,0

ма симптом, асимптом. рецидив ремиссия форма форма

I аСР19+/тА-РЙ+ ВСР19+/Ш.А-РИ-~|

Рис.З. А - содержание Т-лимфоцитов в периферической крови больных ХЛЛ. В - фенотипическая характеристика В-лимфоцитов периферической крови больных ХЛЛ.

При исследовании опухолевого клона установлено, что у больных ХЛЛ как с впервые диагностированным заболеванием, так и с рецидивом резко увеличено содержание С019+ В-лимфоцитов, при этом более чем у половины СО!9+ В-клеток отсутствует экспрессия маркера НЬА-ОЯ, что свидетельствует о том, что опухолевые В-лимфоциты являются функционально неполноценными (рис.3,В). У больных в период ремиссии уровень СО 19 В-лимфоцитов ниже по сравнению с нормой, однако все СО 19' В-лимфоциты у этих пациентов также позитивны и по антигену НЬА-ОЯ.

Самый низкий уровень естественных киллерных клеток установлен в группе пациентов с рецидивом заболевания: содержание МК-клеток у этих больных более чем в 7 раз ниже, чем в контрольной группе. Уровень >Ж-клеток также снижен у больных с впервые выявленным заболеванием, при этом у пациентов с асимптоматической формой содержание этих клеток в 1,5 раза выше, чем у больных с симтоматической формой, что свидетельствует о более высокой активности противоопухолевого иммунитета у пациентов с асимптоматической формой ХЛЛ. При достижении ремиссии уровень ИК-клеток у больных резко повышается (рис.4,А).

А В

20.0 18,0 16,0 14,0 12,0 % ю.о 4— 8,0 — 6,0 4,0

X

Тгед-клетки

□ норма о симптом, форма ра а

л. форма ■ рецидив □ ремиссия

г

1

у Щ 1

0 Шу

норма симптом, асимптом. рецидив ремиссия форма форма

Рис.4. А - содержание иммунорегуляторных Т-лимфоцитов и ЫК-клеток в периферической крови больных ХЛЛ. В - соотношение МКТ-кл:Тгее-кл в периферической крови больных ХЛЛ.

Содержание МКТ-клеток снижено более чем в 2 раза по сравнению с нормой у пациентов с симптоматической формой впервые диагностированного ХЛЛ и резко редуцировано у лиц с рецидивом заболевания (более чем в 6 раз по сравнению с контрольной группой), тогда как у больных в ремиссии уровень ЫКТ-клеток резко повышается. У пациентов с асимптоматической формой заболевания содержание этих лимфоцитов значимо выше, чем у больных с симптоматической формой ХЛЛ (рис.4,А).

Установлено, что содержание Т^-кл снижено у всех больных, при этом в наибольшей степени их уровень понижен у больных с асимтоматической формой ХЛЛ (0,6±0,2% при норме 3,7±0,3%) (рис.4,А).

Изучение соотношения МКТ-кл:Тгев-кл в периферической крови больных позволило выявить, что в отличие от данного соотношения в норме, при котором оно составляет 1:1, у больных в ремиссии оно равняется 4:1, а у больных с асимптоматической формой ХЛЛ 7:1, т.е. у этих пациентов содержание ИКТ-клеток значительно превалирует над Тгее-клетками, что свидетельствует об активации у них противоопухолевого иммунитета. У пациентов в рецидиве это | соотношение меньше 1, т.е. изменено в сторону повышения уровня Тге8.клеток (рис.4,В).

Анализ изменений содержания всех основных субпопуляций лимфоцитов у изучаемых групп пациентов в костном мозге показал, что они аналогичны выявленным изменениям в периферической крови.

Исследование содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови больных показало, что у пациентов с симптоматической формой ХЛЛ продукция ^А и 1§М почти в 2 раза ниже, чем у больных с асимптоматической формой 1 заболевания. Наиболее значительное снижение уровня ^С и наблюдается у пациентов с рецидивом заболевания. У больных в ремиссии уровень иммуноглобулинов не отличается от нормы (рис.5).

□ норма

Ш симптом, форма

□ асимптом. форма а рецидив

□ ремиссия

з-й:-л

|0М

Рис.5. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови больных ХЛЛ.

Исследование функциональной активности 1ЧК-клеток больных позволило установить резкое угнетение цитолитической активности этих клеток как у пациентов с впервые выявленным заболеванием, так и с рецидивом. У больных в

ремиссии при низких и средних концентрациях 1ЧК-клеток в исследуемой системе (соотношения эффектор:мишень 6,25:1, 12,5:1 и 25:1) цитолитическая активность естественных киллеров не отличается от таковой у здоровых доноров, однако при высоких концентрациях ИК-клеток (50:1 и 100:1) их активность возрастает в значимо меньшей степени, чем у лиц контрольной группы, что свидетельствует о неполном восстановлении функциональной активности 1ЧК-клеток у больных в ремиссии (рис.6).

45,0 40,0 35,0 30,0 * 25,0 & 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0

норма симптом, форма асимптом. форма

"♦"рецидив ремиссия

.............

: ------ НН ; - ■

6,25/1 12,5/1 25/1 50/1 100/1

соотношение Э:М

Рис.6. Цитотоксическая активность ЫК-клеток у больных ХЛЛ.

Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов у

больных ХЛЛ

В результате изучения фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у больных установлено глубокое угнетение показателей фагоцитоза этих клеток у пациентов с впервые выявленным ХЛЛ и с рецидивом заболевания (рис.7,А). У больных в ремиссии количество фагоцитирующих нейтрофилов и их поглотительная функция восстанавливаются и практически не отличаются от нормы (рис.7,А). Выявлено резкое снижение показателей функциональной активности моноцитов у пациентов с рецидивом заболевания и их полное восстановление в ремиссии (рис.7,В).

А

В

норма симптом, асимптом. рецидив ремиссия форма форма

| Ш ФИ,% -«-ФЧ [

18,0 1С,О 14,0 12,0

10,0 ФЧ 8,0 6,0 4,0 2.0 0,0

Рис.7- А - Показатели фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у больных ХЛЛ. В -показатели фагоцитарной активности моноцитов у больных ХЛЛ.

Исследование ферментативной активности нейтрофилов больных позволило выявить значительное угнетение активности NADPH-oкcидaзы этих клеток у пациентов с впервые диагностированным ХЛЛ. У больных с рецидивом индекс активации ферментативной активности клеток (ИА) более чем в 2 раза превышает эти же показатели в группах больных с впервые выявленным ХЛЛ, более того, превышает тот же показатель в группе здоровых доноров. У пациентов в ремиссии продукция АФК нейтрофилами значимо ниже, чем у больных с рецидивом и в контрольной группе (рис.8).

ид

в индекс активации ферментативной активности нейтрофилов

асимптом. рецидив ремиссия форма

симгттом. форма

норма

Рис.8. Ферментативная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных ХЛЛ.

Эти впервые полученные нами новые сведения об изменении продукции активных форм кислорода нейтрофильными гранулоцитами в динамике опухолевого процесса у пациентов с ХЛЛ, вероятно, свидетельствуют о

60,0 50,0 40,0

ФИ, %

30,0 20,0 10,0 0,0

12,0 10,0 8,0

ФЧ

6,0 4,0 2,0 0,0

норма симптом, асимптом. рецидив ремиссия форма форма

модифицирующем влиянии опухолевых клеток на периферические иммунные клетки, приводящем к избыточной продукции нейтрофилами АФК, которые обладают канцерогенным действием, активируюя пролиферацию и ангиогенез опухолевой ткани и метастазирование. Данные результаты существенно расширяют представление о взаимоотношениях между клетками иммунной системы и трансформированными клетками в ходе опухолевой прогрессии.

Особенности апоптотической активности опухолевых клеток периферической крови больных ХЛЛ

При исследовании апоптотической активности опухолевого клона В-лимфоцитов периферической крови у больных с симптоматической формой впервые выявленного ХЛЛ и с рецидивом заболевания все пациенты были разделены на 2 группы - с низким и высоким уровнем апоптотической активности по сравнению со средним уровнем в целом по группе. Установлено, что у пациентов с исходно низким содержанием находящихся в апоптозе клеток происходило возрастание их уровня в 6 раз после проведения курса лечения и, напротив, у больных с высоким показателем спонтанного апоптоза не выявлено значимого возрастания индуцированного апоптоза В-лимфоцитов после проведенного курса терапии (рис.9).

Рис.9. Динамика апоптотической активности опухолевых СБ19+ В-лимфоцитов у больных ХЛЛ.

Больные с низким уровнем спонтанного апоптоза активно отвечали на терапию: после первого курса ПХТ у данных пациентов отмечали

18

положительную клинико-гематологическую динамику, которая выражалась в снижении содержания С0191 В-лимфоцитов в периферической крови до уровня менее 20%. Напротив, у больных с высоким уровнем спонтанного апоптоза содержание опухолевого клона СО 19' В-клеток в периферической крови после курса терапии значимо не отличалось от начального уровня. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективность терапии больных хроническим лимфолейкозом при различных фазах заболевания зависит от исходной апоптотической активности клеток опухолевого клона СО 19 В-лимфоцитов и позволяет заранее определить больных с положительным и отрицательным ответом на проводимое лечение.

Установлено, что между исходной апоптотической активностью клеток опухолевого клона СО 19" В-лимфоцитов и содержанием ИК-клеток и МКТ-лимфоцитов в периферической крови больных существует обратная корреляционная зависимость - у больных с низким уровнем спонтанного апоптоза содержание №0- и 1ЧКТ-клеток более чем в 2 раза превышает данные показатели у пациентов с высоким уровнем спонтанного апоптоза (рис.10, А).

А В

□ больные с низким уровнем спонтанного апоптоза 3 больные с высоким уровнем спонтанного апоптеза

Рис.10. А - содержание иммунорегуляторных Т-лимфоцитов и ЫК-клеток у больных ХЛЛ с высоким и низким уровнем спонтанного апоптоза. В - взаимосвязь цитотоксической активности ЫК-клеток со спонтанным апоптозом у больных ХЛЛ.

Э:М (12.5:1)

Э:М(25:1) Э:М(25:1) Э:М (100:1)

ЬЖ-клетки ИКТ-кпетки

При изучении цитотоксической активности МК-клеток у больных с низким и высоким уровнем спонтанного апоптоза выявлена та же закономерность -

функциональная активность естестественных киллерных клеток у больных с низким уровнем спонтанного апоптоза значительно превышает эти же показатели у пациентов с высоким уровнем спонтанного апоптоза (рис. 10,В).

Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что исходный уровень 1ЧК- и 1ЧКТ-клеток, а также цитотоксическая активность ЫК-клеток в периферической крови больных при различных фазах заболевания влияют на эффективность терапии пациентов, следовательно, данные показатели могут быть использованы в качестве прогностических критериев течения заболевания.

Таким образом, нами впервые проведено исследование влияния уровня важнейших регуляторов противоопухолевого иммунного ответа -иммунорегуляторных Т-лимфоцитов и МК-клеток - на различные факторы клеточного и гуморального иммунитета у больных ХЛЛ. Установлено, что у больных с пониженным уровнем №С- и МКТ-клеток функциональная активность 1ЧК-клеток, нейтрофилов, моноцитов, продукция иммуноглобулинов и индуцируемая терапией апоптотическая активность В-лимфоцитов опухолевого клона значимо ниже тех же параметров, установленных у пациентов с повышенным уровнем МС- и МКТ-клеток. Вместе с тем, в результате исследования показано, что наибольшее значение в эффективной реализации противоопухолевого иммунного ответа имеет соотношение МКТ-клеток к Тгев-клеткам, наиболее высокие значения которого установлены у пациентов в ремиссии и с асимптоматической формой ХЛЛ. Вероятно, именно значительное превышение содержания МКТ-клеток над Т,С8-клеткам и является одним из факторов, позволяющих больным с асимптоматической формой сдерживать рост клеток опухолевого клона.

Выводы

1. Уровень важнейших активаторов противоопухолевого иммунного ответа - №С-и МКТ-клеток — в периферической крови и костном мозге многократно снижен у больных с впервые выявленным ХЛЛ и с рецидивом заболевания, тогда как при достижении ремиссии содержание этих клеток в несколько раз превосходит

нормальные значения. У пациентов с асимптоматической формой впервые выявленного ХЛЛ содержание ЫКТ-клеток в периферической крови в 2 раза выше, а ТГС8-лимфоцитов и в периферической крови, и в костном мозге в 2 раза ниже, чем у больных с симптоматической формой заболевания.

2. Наиболее высокое соотношение клеток ЫКТ:Тге„ установлено у больных в ремиссии (4:1) и с асимптоматической формой ХЛЛ (7:1), и наиболее низкое - в рецидиве заболевания (меньше 1), что свидетельствует о значимости соотношения данных клеток для эффективной реализации противоопухолевого иммунитета.

3. У пациентов в ремиссии инверсия иммунорегуляторного индекса, составившего 0,7±0,1 при норме 1,9±0,2, свидетельствует об активации апоптоза опухолевого клона В-лимфоцитов и превалированию процесса апоптоза над пролиферацией.

4. У больных с впервые выявленным ХЛЛ и с рецидивом уровень МК- и ЫКТ-клеток которых в периферической крови и костном мозге значительно снижен, выявлено угнетение клеточного и гуморального звена иммунного ответа. У пациентов в ремиссии содержание ЫК- и МКТ-клеток повышено, что сопровождается восстановлением функциональной активности факторов противоопухолевого иммунитета.

5. У больных ХЛЛ в ходе опухолевой прогрессии установлено модифицирующее действие опухолевых клеток на ферментативную активность нейтрофильных гранулоцитов, выражающееся в стимуляции продукции нейтрофилами активных форм кислорода. У пациентов в ремиссии ферментативная активность нейтрофилов не достигает нормальных значений.

6. Установлено, что у больных с низким уровнем спонтанного апоптоза опухолевых клеток специфическая терапия эффективна, при этом индуцированная апоптотическая активность повышается в 6 раз по сравнению с исходной. У больных с высоким показателем спонтанного апоптоза под

воздействием индукционной терапии увеличение апоптотической активности отсутствует.

7. Уровень ЫК- и МСТ-клеток и активность естественных киллерных клеток коррелируют с апоптотической активностью опухолевого клона В-лимфоцитов периферической крови больных ХЛЛ и позволяют оценить эффективность проводимой терапии и прогнозировать течение заболевания.

Практические рекомендации

1. Соотношение клеток ТЧКТ:Тгев может быть использовано в качестве критерия прогноза и оценки эффективности лечения. Соотношение 1\1КТ:ТГС(, меньше 1 является неблагоприятным прогностическим признаком.

2. Изучение характера апоптотической активности опухолевого клона В-лимфоцитов периферической крови следует проводить при поступлении больных в стационар и в процессе проведения специфической терапии с целью своевременного выявления резистентности.

Список публикаций

1. Розанова О.Е. Динамика популяции NKT-клеток в процессе становления ремиссии у больных с В-клеточными лимфопролиферативными заболеваниями / О.Е. Розанова, Ж.В. Чубукина, Т.В. Глазанова, И.Е. Павлова, О.В. Акинфиева, Л.Н. Бубнова // Медицинская иммунология. - 2009. -Т.11, № 4-5. - С. 433.

2. Акинфиева О.В. Динамика активированных Т-лимфоцитов периферической крови в процессе становления ремиссии у больных В-клеточными лимфопролиферативными заболеваниями / О.В. Акинфиева, О.Е. Розанова, Ж.В. Чубукина, Т.В. Глазанова, И.Е. Павлова, Л.Н. Бубнова // Вестник гематологии. - 2009. - T.V, № 2. - С.5-6.

3. Акинфиева О.В. Применение проточной цитофлуорометрии для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека / О.В. Акинфиева, Л.Н. Бубнова // Вестник гематологии. - 2010. - Т. VI, №1. - С. 11.

4. Акинфиева О.В. Динамика NKT клеток и С04+С025+-регуляторных Т-лимфоцитов периферической крови у больных хроническим лимфолейкозом / О.В. Акинфиева, Л.Н. Бубнова, С.С. Бессмельцев // Вестник гематологии. — 2010.-Т. VI, №2.-С. 8-9.

5. Akinfieva О. The dynamics of immunoregulatory T cells in peripheral blood and bone marrow in patients with chronic lymphocytic leukemia / O. Akinfieva, L.

Bubnova, S. Bessmeltsev // Cellular therapy and transplantation. - 2010. - Vol. 3, № 9.-P. 35.

6. Акинфиева O.B. Роль субпопуляции естественных регуляторных CD4+CD25+T-клеток в норме и при патологии / О.В. Акинфиева, JI.H. Бубнова // Медицинский Академический Журнал. - 2010. - Т. 10, №2. - С. 5-16.

7. Акинфиева O.B. NKT клетки: характерные свойства и функциональная значимость для регуляции иммунного ответа / О.В. Акинфиева, Л.Н. Бубнова, С.С. Бессмельцев // Онкогематология. - 2010. - №4. - С. 39-47.

8. Акинфиева О.В. Уровень NKT клеток и фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови у больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ) / О.В. Акинфиева // Медицинский Академический Журнал. - 2010. -Т. 10, №5.-С. 133.

9. Акинфиева О.В. Зависимость Функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов периферической крови от уровня иммунорегуляторных Т-лимфоцитов (NKT клеток и ТГС8-клеток) у больных клеточным хроническим лимфолейкозом / О.В. Акинфиева // Вестник гематологии. -2011. -Т. VII, №1. - С. 62-63.

Подписано в печать 22.04.2011г. Формат 60x84/16 П.л. 1,5 Уч.-изд.л 1,5 Тир. 100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38.1огош8е1@таП.] Зак. № 13276 от 22.04.2011г.