Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Трансформированные клетки с различным метастатическим потенциалом: анализ дифференциально экспрессирующегося гена shMDG1

На правах рукописи

Исаченко Надежда Александровна

Трансформированные клетки с различным метастатическим потенциалом: анализ дифференциально экспрессирующегося гена shMDGl

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории регуляции вирусных и клеточных онкогенов НИИ Канцерогенеза ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. Блохина РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

А. Г. Татосян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Н. А. Глушанкова

доктор биологических наук, профессор Д. А. Крамеров

Ведущая организация:

Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова РАМН

Защита диссертации состоится «/. 2005 года в/^ часов на заседании

диссертационного совета (К.001.017.01) в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Автореферат разослан: 2005 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Ю. А. Барсуков

Общая характеристика работы. 1. Актуальность проблемы.

Метастазирование является одной из наиболее актуальных проблем современной онкологии и молекулярной биологии. Для изучения этого явления применяются различные подходы, в том числе основанные на сравнении генов, экспрессиругощихся в клетках с низким и высоким потенциалом метастазирования. В настоящее время с помощью таких методов как дифференциальный дисплей и субстратное вычитание выявлено множество генов, непосредственно участвующих в процессе метастазирования, например, NM23, МКК4, КАП, BRMS1, KiSSl, RHOGDI2, CRSP3 и т.д.

Ведущим направлением в исследовании процесса превращения нормальной клетки в метастазирующую является изучение механизмов трансформации, ассоциированных с ключевыми генами онкогенеза - туе, ras, v-src и т.д. Эти широко известные онкогены играют заметную роль во многих клеточных сигнальных путях, регулирующих пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, клеточную подвижность, ангиогенез. В ряду изучаемых онкогенов тирозиновая киназа v-src является уникальной. В отличие от туе и ras, v-src - единственный онкоген, способный трансформировать эмбриональные фибробласты грызунов без участия других онкогенов.

Крайне перспективным представляется изучение клеточных линий с различным метастатическим потенциалом, полученных при трансформации геном v-src. Одним из генов, дифференциально экспрессирующихся в такой клеточной системе является ген shMDGl, относящийся к молекулярным шаперонам HSP40. Принимая во внимание накапливающиеся данные об участии шаперонов во многих клеточных процессах, таких как поддержание третичной структуры белков, их деградация и сортинг, а также изменение экспрессии шаперонов при онкологических заболеваниях, можно утверждать, что шапероны могут играть заметную роль в канцерогенезе.

В данной работе исследованы различные аспекты влияния гена shMDGl на структурные и функциональные характеристики клеточных линий с различным метастатическим потенциалом. Настоящее исследование позволит расширить наши знания о механизмах канцерогенеза и открывает перспективы в использовании молекулярных шаперонов как маркеров опухолевого роста и агентов генотерапии.

2. Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось изучение участия гена дифференцировки эндотелия 1 - MDG1 (microvascular differentiation gene 1) в реализации метастатического фенотипа клеточных линий (HET-SR и HET-SR1), полученных в результате инфицирования вирусом саркомы Рауса эмбриональных фибробластов сирийского хомячка.

В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи:

1) Получить полноразмерную копию гена дифференцировки эндотелия 1 хомячка -shMDGl (Syrian hamster homologue ofMDG1);

2) Подтвердить дифференциальность экспрессии гена shMDGl в HET-SR и HET-SR1 клеточных линиях;

3) Получить модельную систему клеточных культур, стабильно экспрессирующую кДНК гена shMDGl;

4) Изучить влияние экзогенной экспрессии гена shMDGl на способность клеточных линий образовывать метастазы в легких сингенных животных;

5) Оценить уровень экспрессии человеческого гена ERdj4/MDGl в опухолевых и нормальных тканях.

3. Научная новизна.

В результате данного исследования впервые получена и депонирована под номером AY532644 в GenBank последовательность открытой рамки считывания хомячкового гена дифференцировки эндотелия 1 - shMDGl. Показано, что экспрессия этого гена в низкометастазирующей линии HET-SR повышена и, напротив, понижена в высокометастазной HET-SR1. Получены клеточные культуры HET-SR/shMDGl и НЕТ-SRl/shMDGl, стабильно экспрессирующие кДНК гена shMDGl. При введении данных клеток сингенным животным показано снижение метастатической активности по сравнению с исходными родительскими культурами.

Мы впервые показали, что инъекция ДНК гена shMDGl в опухоль, сформированную клетками с высоким метастатическим потенциалом, снижает метастатическую активность такой опухоли.

Исследовано влияние продукта гена shMDGl на пролиферацию и миграцию клеток с различным метастатическим фенотипом, при этом выявлено, что shMDGl угнетает метастатическую активность изучаемых клеточных линии, а также подавляет Asn-зависимое Р(1,6)-гликозилирование, характеризующие клетки с высоким уровнем метастазирования.

4. Научно-практическая ценность.

Изучение механизмов прогрессии модельных клеточных линий является фундаментальной проблемой современной онкологии и может способствовать разработке новых методов терапии злокачественных новообразований.

В ходе работы сконструирован набор генно-инженерных векторов, содержащих ген вИМБО!, а также получена панель ^""-трансформированных клеточных культур с высокой экзогенной экспрессией данного гена, которые могут быть использованы в дальнейших исследованиях в области экспериментальной онкологии.

Данное теоретическое исследование расширяет сферу знаний об участии шаперонов как в метаболизме нормальных клеток, так и в процессах онкогенеза.

5. Апробация работы.

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, иммунологии онкогенных вирусов, методов скрининга канцерогенов, противоопухолевого иммунитета и молекулярной биологии вирусов НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН 14 октября 2004 года. Материалы работы докладывались и представлялись на 8-ой международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2000); на 4-ой международной конференции по изучению сигнальных путей организованной Федерацией европейских биохимических обществ (Дубровник, 2004); на международной конференции Вю8с1епсе2004 (Глазго, 2004). Результаты диссертации опубликованы в 3 научных работах.

6. Объем и структура работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографии. Материалы диссертации изложены на 94 страницах машинописного текста, включают 8 таблиц и 21 рисунок. Библиография включает 146 литературных источников.

Основное содержание работы. 1. Обзор литературы.

Обзор литературы состоит из двух глав, первая из которых посвящена стадиям и механизмам прогрессии опухолей, а вторая - характеристике и классификации молекулярных шаперонов, а также освещению их роли в процессе канцерогенеза, включая подробное рассмотрение кошаперонов класса Hsp40.

2. Материалы и методы.

В работе использованы следующие методы исследования: культивирование и анализ культур клеток млекопитающих, трансформация бактериальных клеток, выделение ДНК и РНК, электрофорез нуклеиновых кислот, получение радиоктивно-меченых зондов, блот-гибридизация по Нозерну, молекулярное клонирование, полимеразная цепная реакция (ПЦР), получение лентивирусных стоков, трансфекция и инфицирование клеток млекопитающих, определение метастатической активности, трансфекция in vivo, мечение клеток лектином, проточная цитофлуорометрия.

В работе были использованы вектор pLV, любезно предоставленный д.б.н. П.М. Чумаковым, и pCR2.1 фирмы «Invitrogen», а также клеточные линии HET-SR, HET-SR1, HET-SR-2SC-MLN полученные в лаборатории противоопухолевого иммунитета РОНЦ РАМН (проф., д.м.н. Г.И. Дейчман). Для получения вирусных частиц использовалась упаковочная линия эпителиальных клеток А293Т, любезно предоставленная д.б.н. П.М. Чумаковым.

3. Результаты.

3.1. Предпосылки проводимого исследования.

Ранее в лаборатории регуляции вирусных и клеточных онкогенов НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина с целью поиска генетических детерминант метастазирования методом дифференциального дисплея было проведено сравнение генов, экспрессирующихся в клетках с низкой (HET-SR) и высокой (HET-SR1) метастатической активностью при подкожном введении подопытным животным. Клеточные линии HET-SR и HET-SR 1 получены инфицированием эмбриональных фибробластов сирийского хомячка (Mesocricetus auratus Waterh) штаммом Шмидт-Руппин D вируса саркомы Рауса (RSV). Использование двух различных изолятов вируса с мутациями в онкогене v-src определило метастатический потенциал полученных клеточных культур.

б

В результате проведенного дифференциального дисплея данных клеточных линий были получены фрагменты кДНК генов, экспрессирующиеся в низкометастазной HET-SR или в высокометастазной HET-SR1 линиях.

Один из фрагментов, длиной в 365 нуклеотидов, выделенный из клеток HET-SR, выявил гомологию с 5'-областью гена дифференцировки эпителия 1 - MDG1 (microvascular differentiation gene 1), относящегося к 40-му классу белков теплового шока (Hsp40). Экспрессия этого фрагмента была значительно повышена в низкометастазирующей линии HET-SR по сравнению с высокометастазирующей HET-SR1. Функции MDG1 в клетке и его роль в канцерогенезе до настоящего времени оставались невыясненными.

3.2. Анализ нуклеотидной последовательности одного из фрагментов кДНК, полученных из нпзкометастазирующей клеточной линии HET-SR методом дифференциального дисплея.

Анализ последовательностей в банке данных NCBI показал, что фрагмент, длиной в 365 н.п., экспрессирующийся в низкометастатической линии HET-SR, обнаружил гомологию с группой генов дифференцировки эндотелия - MDG1, которая включает гены: человека - ERdj4/MDGl, мыши - mDj7, крысы - Mdgl/rnDjl (рис. 1). При сравнении генов выявлено, что последовательность, включающая 54 нуклеотида в 5'-области изучаемого фрагмента на 94%, 87% и 94% гомологична данной области в человеческом, крысином и мышином генах, соответственно. Эти 54 нуклеотида представляли собой открытую рамку считывания и транслировались в полипептид длиной в 17 аминокислот, а 18-ый триплет представлял собой стоп-кодон. Остальные 312 нуклеотидов в 3' нетранслируемой области демонстрировали менее высокую гомологию - 59%, 68% и 65%, соответственно с человеческим, крысиным и мышиным генами. Таким образом, изучаемый фрагмент в 365 нуклеотидов представлял собой часть ранее неизвестного хомячкового гена, принадлежащего, с высокой долей вероятности, группе MDG1 (рис. 1). Мы назвали этот ген shMDGl (Syrian hamster homologue of MDG1). Нуклеотидная последовательность гена shMDGl депонирована в GenBank и доступна под номером AY532644.

Рис. 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов группы MDG1.

1 ™

аЪМОС1 ----мудс СТАСТССАСА СТСАСТТТТС СТСТТТССАА ТТТССАТТТТ ААТвАТЛАСС СААТТААТСС

г (М<!д1) ТТАОАААТДЗ СААСТССАСА СТСАвТТТТС СТСТТТСССА ТСТССАТТСТ ААТСАТААСА СААТТААТСС ■ (тО}7) ТТАРАААТ<К СТАСТССАСА ОТСАОТТТТС бТСТТТССЛА ТСТОСАТТТТ ААТСАТААСА вААТТААТСС Ь (Ейс^ 4) ТТАОАААТаЗ СТАСТССССА СТСААТТТТС АТСТАТССАА ТСИЗСАТТТГ ААТвАТААСА вААТТААТТС Сопзепзиз ЬЬааАААТСС СЪАСТССаСА СТСАдТТТТС дТСТИССаА ТсТССАТТСТ ААТвАТААСа СААТТААТСС АААТЦд СТАСТССАСА вТС

Л нм1(1-з(яг1 140

•ЪМОв1 ТАСССТСААА САОСТАСТАТ САТАТСТТАО СТСТСССААА АТСТвССТСА САСССАСААА ТСААСААББС

г (>ИдИ ТТСССТСЛАА АААСТАСТАТ ОАТАТСТТАО СТСТ<ЗССААА ЙТСАвССТСА САЯАСАСААА ТСАААААбСС в (|Щ>}7| ТввССТССАА ЛАвСТАСТАТ САТАТСТТАв СТСТвССААА вТСТСССТСА САСССАСААА ТСААЛААбЯС Ь (ЕДсЗ ^ 4) ТЖССТСААА ААОСТАСТАТ ОАТАТСТТАЯ СТСТСССААА АТСОЗСАТСА САСС<5ССААА ТСААвААС(5С Сопзепзиз ТдСССТСаАА аАдСТАСТАТ ОАТАТСТГАЯ СТСТСССААА аТСИЗСсТСА САСсСаСААА ТСААдАА(Х5С

141 210

■МЮС1 СТТТСАСААА ТТАЯССАТвА АСТАССАССС ТИАСААЛААТ ААОАССССТС АТССТСААСС ААААТТСАвА

г (Мс1д1> СТТТСАСААА ТТАвССАТвА АСТАССАССС ТБАТАААААТ ААААССССТб АТССТСААСС ААААТТСАвА т (т011) СТТТСАСААА ТТАвССАТвА АСТАССАССС Т6АСАААААТ ААААССССТС АТССТСААСС ААААТТСАвА Ь (ЕМ} 4) СТТТСАСАА5 ТТ<КССАТОА АСТАССАССС ТИАСААЛААТ ААвАССССОЗ АТССТСААСС ААААТТСАЙА Сопзепзиз СТТТСАСААа ТТаСССАТСА АСТАССАССС ТСАсАААААТ ААдАССС«в АТССТСААСС ААААТТСАСА

211 280 аЬМ>С1 САСАТТСлСАв АА(ЗСАТАТСА ААСАСТСТСА бАТСКТСАТА САСОТАААЕА СТАТСАТАСА АТТССАСАСЯ

г (НЙдИ САвАТТССАб ААССЛТАТСА ААСАСТСТОЗ вАТСССААТА ОАСОТАААСА СТАТЙАТАТА АТТССАСАСА а (тО}7) вАСАТТССАб ААСХСТАТСА ААСАСТСТСв вАТСССААТА вТСввАААбА бТАТСАСАСА АТТОТАСАСА Ь (ЕЯ<)14) вАСАТТССАб ААССАТАТОА ААСАСТСТСА САТССТААТА ОАСвААААОА СТАТСАТАСА СТТЮ5АСАСА Сопзепзиз САСАТТССАС ААБСаТАТБА ААСАСТСТСа БАТБСиАТА СаССдАААСА СТАТСАЪАсА аТТ«;АСАСа

281

аЬИХ31 СТБСТТТТАС ТЛАТСвСАЛА СбАСАААСАС ССАСТвбААб

г (№)д1) ОТССТТТТАС ТААТСССААА ССАСАААОАА ОСМТвСМС а (тО]7) СТССТТТТАС СААТСССААА ССАСАААбАб ССААТС«ЗАС Ь <ЕМ;Н> вТССТТТТАС ТАСТБСТААА СЯАСАААСАС ОТАОТЙСААа Сопзепзиз дТССТТТТАС ЬАаТОСсААА СБАСАААБАд Б АдТСБаАг

350

ТССТТТТСАв САСТСТТТТА АСТТСААТТТ ТССТТТТСАв САСТСАТТТА АСТТСААТТТ ТССТТГГСАА САСТСАТТТА АСТТСААТТТ ТТСТТТТСАв САСТСАТТТА АСТТСААТТТ ТоСТТТТСАд САСТСаТТТА АСТТСААТТТ

351 420

•ИМ>61 ТСАТСАСТТА ТТТАААвАСТ ТТААТСТГГТ ТССССАСААС СААААСАСТС СвТСТААЙАА ССАТТТТСАА

I (МйдП ТСАТСАСТТА ТТТАААвАСТ ТТААТТТСТТ ТССТСАвААС САСААСАСТС (ЗбТСТААСАА ОСАТТТТвАА > (ИЮЯ) ТОАТБАСТТА ТТТАААОАСТ ТТААТТТТТТ ТбСТСАвААС СААААСАСТС ЕвТТТААЯАА ОСАГГТТОАА Ь (ЕН(1]4) ТБАТСАСТТА ТТТАААОАСТ ТТОССТТТТТ ТвСТСАЛААС СААААСАСТС БАТССААСАА СССТПТСАА Сопзепэиз твлтвкттл ТТТАААвАСТ ТТааЪМИТ ТС^САдААС САаААСАСТе СдТсЬААСАА сСаТТТТОАА

421 490

»ЬИХ31 ААТСАСТТСС АвАСАСАССА вСАТССТ---ТССААТАвАС АААСССАТСА ТТТССАССАО ТТТТСТТТТО

г (Н<3д1) ААТСАСТТСС АвАСАСвССА «5АТС1гТ---ТССАвТАвАС АААвССАТСА СТТССАвСАв ТТТТСТТГГС

в (ШО^ 7) ААССАСТТСС АСАСАСОССА СеАТ<ЗвТ---ТТТАвГАСАС АЛАЖСАТСА СТТССАОСАС ТТТТСТТТТЯ

Ь (ЕМ}4) ААТСАТТТСС АвАСАСвССА. СвАТСвТССТ ТССАвТАСАС АААСССАТСА ТТТССААСАА ТТТТСТТТТС Сопэспзиз ААЬСАеТТСС АдАСАСдССА ввАТСдТ... ТссАдТАвАС АААввСАТСА СТТССАдЯАд ТТТТСТТТТС

491 560

•ЬМОв1 (ЗССбТССАТТ вТТТСАТСА» ЛТЙТТТСАдд АТАТбСАСАА ААТбТТТТСТ ТТТАСТ013СТ ТТвАТАСССС

г (Мс1д1) САССТОвАТТ ОТТОАТвАТ АТСТГГСААС АСАТЯСАСАА САТСТТТТСТ ТТТАСТСССТ ТТСАТАвСАС ш <тО}1) САйССССЛТТ СТТТСАТйАТ АТОТТТСААО АСАТвСАСАА ААТвТТТТСТ ТТТАСТСССТ ТТвАТАССАС Ь (Ея<114) САСвТИЗАТТ АТТТСАТвАС АТСТГГСААС АТАТСбАСАА ААТСТТТТСТ ТТТА<ЗТССТТ ТТСАСТСТАС Сопзепзиз СавСЬССАТТ дТТТвАТОАк АТСТТТСААС АЬАТССАвАА аАТСТТТТСТ ТТТАСТССоТ TTGAtaceaC

5в1 630

>ЬМ)в1 САСТСОАСАС АСАСТАСАбА СТСААААТАг АТТТСАТвСА ТСТАЯТААОС АСТССАСБАС ТСТС^ТСА^

г (над1) СААТСвАСБС АСАЯТАСАвА СТСААААТАО АТТТСАТССА ТССАвСААСС АСТССАСвАС ССТСАСТСАв я <тО;)7> САЛТСвАСАС АСАвТАСАвА СТСААААТАС АТТТСАТССА ТСТАССААвС АСТССАСвАС ТСТСАСТСАА Ь (ЕЯ(114) СААТСАвСАТ АСАСТАСАвА СТбААААТАС АТТТСАТввА ТСТАвСААСС АСТССАСБАС ТСТСАСТСАА сопзепзиз САаТСдаСас АСАОТАСАСА СТвААДАТАС АТТТСАТССА ТСЬАСсААвС АСТБСАССАС ЪСТСАСТСАд

631

100

•мов1

г (1Мд1) » (тО)7) И (ЕЯ<1)4) Сопзепзиз

СОЗАСАССОА АТАТЯСТТАС ТАССТАСАСС САСТСТТСАС САСАСЦ^ТТ ОвАТСТТТТС СТвТСТССАС ССААБАССАА АТАТввТТАС ТАСАТАСАСТ вАТТвТТСАС САСААТАСТТ вААТСТТТТС СТОТТТССАС

СБААСАССАА АТАТТСТТАС ТАСАТАСАСТ вАСТСТТСАС САСАСЦЗТТ----СТТАТТ СТАТТСТСАС

ССаАСАСваА АТАТССТТАС ТАСаТАСАСк ОАсТСТТСАС СаСАаТА<уТТ дд КТТ«. СТдТЬ1ссАС

701

770

•ЬИОв1 г (Мс)д1) в |пФЯ> Ь (ЕВЙ1<) Сопзепзиз

ТААвСССАСС ТАСТТТАСТС ТТССТСАСТА ТвТСТЙАТ-О ААААА-АСТТ ТТСТСТСААС ТАСТТТвС— ТААвСССАСС ТАСТТТАТТС ТТССТТАСТА ТОТСТСАТ-в ААААА-АвТТ ТТСТСТСААС ТАТТТТвСТА ТАААТССААС ТТСТТвАСТС ТТССТСАТТА ТСТГГОАТ-С СТАААСААТТ ТТСТСТСААС ТАТТТТОАСА ТААдсССАсо ТаЯТТЪА.ТС ТТсСТсАоТА ТдТеТСАТ О ааААА Аа1Ъ ТТСТСТСААС ТаОТТдаса

Примечания: сравнение нуклеотидной последовательности гена сирийского хомячка shMDGl с человеческим (к) ЕЯс1/4, мышиным (т) тД/7и крысиным гомологами (г) Mdgl. Кодоны инициации и окончания транскрипции (А TG/TAG)oдчenкнvmы. Щ}Щвыделен фрагмент длиной 365п.н., полученный при помощи дифференциального дисплея. Праймеры и направление синтеза показано на схеме соответствующих 5'и 3'районах гена. Группировка последовательностей проводилось с использованием программы Ж1ш1аШ (http://srs.ebiac.uk).

33. Получение транслируемой области гена shMDGl.

Следующим этапом работы явилось получение полноразмерной транслируемой области гена shMDGl, которое осуществлялось методом ОТ-ПЦР.

Реакция амплификации транслируемой области гена проводилась с использованием в качестве матрицы кДНК клеточной линии HET-SR и праймеров mdgl-start и mdgl-anti (рис. 1). Праймер mdgl-anti синтезировался на известный 3'-район фрагмента длиной в 365 нуклеотидов, полученный методом дифференциального дисплея. Синтез праймера на неизвестную 5'-область гена shMDGl проводился после анализа 5'-областей открытых рамок считывания гомологичных генов (рис. 1).

Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор pCR2.1. Последующее лигирование проводилось по стандартной методике фирмы-изготовителя (Invitrogen). Проведенное секвенирование клонированного продукта ПЦР показало, что полученный вектор pCR2.1 /shMDGl содержит полную транслируемую область хомячкового гена shMDGl длиной в 669 нуклеотидов, которая гомологична соответствующей области в человеческом, крысином (и мышином) аналогах на 73% и 78%, соответственно (рис. 1).

Сравнение аминокислотных последовательностей генов группы MDG1 выявило, что представители данной группы являются высококонсервативными генами (рис. 2.). Так, гомология между продуктом хомячкового гена shMDGl и человеческим аналогом ERdj4 составляет 92%, а между мышиным и крысиным - 94% и 95%.

Дальнейший анализ аминокислотных последовательностей группы генов MDG1 с помощью программы NClustalW(http //srs.ebi ac.uk) выявил, что данные гены содержат J-домен и, соответственно, относятся к семейству молекулярных шаперонов HSP40.

Рис 2. Сравнение аминокислотных последовательностей генов группы MDG1.

Сигнальный

1 пептид J-домен so

•hMDGl HATPQSVFVF AICILMITEL ILASKSYYDI LGVPKSASER QIKKAFHKLA MKYHPDKHKS PDAEAKFREI AEAYETLSDA

r (Mdgl) HATPQSVFVF AICILMITEL ILASl|YYDI LGVPKSASEP QIWAFHKLA HKYHPDKNKS PDAEAKFPEI AEAYETLSDA

■ <«DJ7) HATPQSVFVF AICILMITEL ILASKSYYDI LGVPKSASER QIKKAFHKLA MKYHPDKHKS PDAEAKFREI AEAYETLSDA

h (ERdj4) MATPQS|F|F AICILMITEL ILASKSYYDI LGVPKSASER QIKKAFHKLA MKYHPDKHKS PDAEAKFPEI AEAYETLSDA

ei Глицин/фенилаланнн-богатый домен 160

■hmxsi |rrkeydtig haafthgkgq rg|gspfeqs fhfnfddlfk dfhIfgqnqh trskkhfehh fqt|qd|-s| rqrhhfqefs

r (Hdgl) NPPl.EYDIIG HSAFTNGKGQ RBgSPFEQS FHFNFDDLFK DFN|FGQHQN TRSKKHFEHH FQTRQDG-SS RQRHHFQEFS m (»Dj7) H|RKEYDTIG HSAFTNGKGQ RGlGSPFEQS FHFNFDDLFK DFmFGQNQN tr|kkhfenh [JTRQDGJS RQRHHFQEFS h (Eftdj4) NRPKEYDT|3 HSAFTNGKGQ rg|gs|FEQS FHFNFDDLFK Df||fGQHQN t|skkrfenh fqtrqdg|ss RQRHHFQEFS

161 223

•hMDGl FGGGLFDDMF EDMEKMFSFS GFoBiKHTV QTEHRFHGSS KHCRTVTQRR GHMVTTYTDC SGQ r (Mdgl) FGGGLFDDMF EDMEKMFSFS GFdItNRJtV QTEHRFHGSS KHCRTVTQRR GNMVTTYTDC SGQ Ш <«Dj7) FGGGLFDDMF EDMEKMFSFS GFDITHRHTV QTEHRFHGSS KHCRTVTQRR GHMVTTYTDC SGQ h (CRd]4) FGGGLFDDMF EDMEKMFSFS GFD|TH|HTV QTEHRFHGSS KHCRTVTQRR GHMVTTYTDC SGQ

Примечания • замены аминокислот ЩЦ. Мотив HPD в J-домене подчеркнут

3.4. Изучение экспрессии гена shMDGl в клеточных линиях HET-SR и HET-SR1.

Подтверждение дифференциальности экспрессии мРНК гена вИМБО! в линиях хомячковых фибробластов с различным метастатическим потенциалом проводилось с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР и Нозерн-блот анализа.

Выделение тотальной клеточной РНК из линий ЫЕТ-8К и ЫЕТ-8К1 проводилось с применением Tгi-Reagent. Далее, полученная РНК использовалась в ОТ-ПЦР и Нозерн-блот гибридизации. В ПЦР применялись те же праймеры, что и при клонировании гена вИМБО! (mdgl-staгt и mdgl-anti) (рис. 1). Для того, чтобы проконтролировать качество синтезированной кДНК, мы проводили дополнительную реакцию с использованием праймеров, специфичных для амплификации гена ОАРБЫ, постоянно экспрессирующегося в широком спектре тканей. Линейная амплификация изучаемого фрагмента кДНК и фрагмента гена ОАРБЫ в подобранных нами условиях ПЦР происходила в пределах с 20 по 25 цикл и с 22 по 26 цикл ПЦР, соответственно.

На рис. ЗА представлены результаты анализа уровня экспрессии мРНК гена вИМБО! с помощью полуколичественной ПЦР в клеточных линиях сирийского хомячка. Для

количественной оценки уровня экспрессии мРНК гена shMDGl фотографии результатов электрофоретического разделения сканировались и анализировались при помощи компьютерной программы Image Quant. Данный подход позволил нам обнаружить высокий уровень экспрессии гена shMDGl в низкометастазирующей линии HET-SR. По сравнению с высокометастазирующими клетками HET-SR1, экспрессия гена shMDGl в HET-SR повышена в 2,7 раза (см. рис. ЗА).

Рис. 3. Экспрессия гена shMDGl в HET-SR и линиях.

А. Результаты анализа методом ОТ-ПЦР. Б. Результаты анализа методом гибридизациипо Нозерну

Далее, определение экспрессии изучаемого гена в клеточных линиях ЫЕТ-8К и ЫЕТ-8К1 проводилось методом Нозерн-гибридизации (рис. ЗБ). Следует отметить, что для получения адекватного сигнала экспонирование блота с рентгеновской пленкой проводилось в течение довольно длительного времени - 30 суток. Выявлено, что в низкометастазирующей линии ЫЕТ-8Я интенсивность сигнала, соответствующая транскрипту вИМБО!, больше в 2,7 раза по сравнению с таковой в высокометастазирующей линии ЫИТ-БМ, что подтверждает результаты, полученные методом ОТ-ПЦР.

Таким образом, тремя независимыми методами - дифференциальный дисплей, гибридизация по Нозерну и ОТ-ПЦР - было показано, что эндогенная экспрессия гена вИМБО! увеличена в 2,7 раза в низкометастазирующей линии клеток ЫЕТ-8Я по сравнению с высокометастазирующей ЫЕТ-8К1.

3.5. Получение клеточных культур HET-SR и HET-SR1 с повышенной экспрессией гена shMDGl.

Наиболее адекватным методом изучения влияния гена вИМБО! на метастатический потенциал клеток ЫЕТ-8Я и ЫЕТ-8К1 является трансфекция гена вИМБО! в эти клеточные линии с целью достижения высокого уровня его экспрессии.

Одним из наиболее эффективных способов доставки генетического материала в клетку и получения стабильно трансфицированных клеточных линий являются лентивирусные векторы. В нашей работе мы использовали вектор pLV-neo. Субклонирование транслируемой области гена shMDG из вектора pCR2.1/shMDGl в вектор pLV-neo осуществлялось по сайтам EcoRI и Apal.

Упаковка вирусных частиц, содержащих ген shMDGl, производилась с использованием клеточной линии А293Т. Вирусные стоки объединялись и использовались для инфекции клеточных линий HET-SR и HET-SR1. Через 24 часа в питательную среду добавлялся селективный антибиотик (неомицин G418). Отбор тотальной клеточной популяции, инфицированной вирусом, экспрессирующим shMDGl, проводился в течение 10 дней. Таким образом, были получены две клеточные линии -HET-SR/shMDGl и HET-SR1/shMDGl. В качестве контроля эффективности трансфекции использовался вирус pLV-neo/GFP. Детекция экспрессии контрольного гена GFP осуществлялась с помощью мониторинга зеленого свечения клеточных линий НЕТ-SR/GFP и HET-SR1/GFP. Уровень свечения не изменялся при продолжительном пассировании этих клеточных линий.

Уровень экзогенной экспрессии гена shMDGl в линиях HET-SR/shMDGl, HET-SR1 /shMDGl, HET-SR/GFP и HET-SR1/GFP исследовался методом Нозерн-гибридизации (рис. 4). Зондом служила меченная [а32Р] кДНК гена shMDGl, которая была выделена из вектора pLy/shMDGl после обработки рестриктазами EcoRI и Apal. Для контроля качества выделения РНК мы провели гибридизацию блота с зондом, содержащим последовательность, гомологичную гену GAPDH.

Рис. 4. Экзогенная экспрессия гена shMDGl в изучаемых клеточных линиях.

Анализ экзогенной экспрессии методом гибридизации по Нозерну в клеточных линиях HET-SR/shMDGl и HET-SRl/shMDGl выявил высокий уровень экзогенной экспрессии гена shMDGl. Следует отметить, что при изучении экзогенного уровня экспрессии гена

shMDGl экспонирование рентгеновской пленки проводилось только 24 часа, тогда как при изучении эндогенного уровня - 30 суток.

3.6. Анализ пролиферативной активности клеточных линий HET-SR, HET-SR1, HET-SR/shMDGl и HET-SRl/shMDGl.

Наиболее важным свойством опухолевых клеток является их активная пролиферация, поэтому, прежде всего, мы сравнили скорость роста родительских HET-SR и HET-SR1 с полученными клеточными линиями HET-SR/shMDGl и HET-SRl/shMDGl. Ежедневный подсчет количества клеток в камере Горяева в течение недели не выявил значительных отличий в скорости роста клеточных культур в логарифмической зоне роста (2- 4дня) (рис. 5).

Рис. 5. Кинетика пролиферации клеточных линий HET-SR, HET-SR1, HET-SR/shMDGl и SRl/shMDGl.

Более того, одинаковая способность к образованию колоний в исследуемых парах линий подтвердила данные, полученные по измерению кинетики пролиферации Клеточная линия HET-SR не отличалась по количеству и скорости образования колоний от линии HET-SR/shMDGl Также не обнаружено отличий в паре HET-SR1 и HET-SRl/shMDGl (рис. 6).

Рис. 6. Образование колоний клеточными линиями HET-SR, HET-SR1, HET-SR/shMDGl и HET-SRl/shMDGl.

3.7. Изучение влияния экзогенной экспрессии гена shMDGl на способность образования первичных опухолей и метастазов у экспериментальных животных.

Для изучения действия shMDGl in vivo, клетки, гиперэкспрессирующие этот ген, вводились хомякам внутриорбитально (тест ЭМА) и подкожно (тест СМА). Оценка туморогенности проводилась в количественном трансплантационном тесте. Для этого каждому из десяти подопытных животных подкожно инъецировалось 4 дозы исследуемых клеток - 2-101, 2102, 2103 и 2104. Затем в течение двух месяцев еженедельно штангенциркулем измерялись пальпируемые опухолевые узлы. Контрольным животным вводились клетки, инфицированные контрольным вектором (pLV-neo/GFP).

Исследование экспериментальной метастатической активности (ЭМА) клеток линии HET-SR, трансфицированных контрольным вектором pLV-neo/GFP, выявили, что данная линия индуцирует образование от 30 до 100 метастазов у 70% животных (7/10); у 30% - более 100 метастазов (3/10). Кроме того, 20% животных пали до окончания срока эксперимента (2/10). После внутривенного введения высокометастазирующей клеточной линии HET-SR1, содержащей контрольный вектор pLV-neo/GFP, у половины животных в легких формировалось от 100 до 200 метастазов (5/10), а у остальных более 200 метастазов (5/10). Смертность в течение месяца наблюдения составила в этой группе 40% (4/10) (рис. 7 и табл. 1). Эти данные согласуются с полученными ранее при исследовании родительских культур - HET-SR и HET-SR1 [Deichman et al., 1998].

Клетки HET-SR, гиперэкспрессирующие shMDGl, формировали не более 10 метастазов в 70% случаев (7/10) и не приводили к гибели животных в течение двух месяцев наблюдений; в 30% случаев не обнаружено ни одного метастаза (3/10). Гиперэкспрессия shMDGl в клеточной линии HET-SR1, так же, как и в HET-SR, повысила выживаемость животных, в то же время значительного снижения уровня метастатического поражения не обнаружено. Так, только у 1 из 10 животных сформировалось меньше 50 метастазов. В 60% случаев (6/10) в легких животных найдено от 100 до 200 метастазов и в 30% (3/10) - более 200 метастазов (рис. 7 и табл. 1).

Таким образом, с помощью ЭМА-теста показано, что гиперэкспрессия shMDGl вызывает статистически достоверное (р=О.ООО36) понижение среднего количества метастазов в легких подопытных животных при внутривенном введении клеточной линии HET-SR в 55 раз. Метастатический потенциал клеточной линии HET-SR1 также снизился, однако это понижение статистически недостоверно. Более того, оказалось, что экспрессия shMDGl коррелирует со сроками жизни подопытных животных (рис. 7 и табл. 1).

Рис. 7. Образование легочных метастазов при внутриорбиталыгом введении клеток HET-SR, HET-SR1, HET-SR/shMDGl и HET-SRl/shMDGl (ЭМА тест).

Табл. 1. Распределение метастазов у животных в ЭМА тесте.

Примечания, каждая точка соответствует одному исследованному животному Горизонтальной чертой показано среднее значение кочичества образовавшихся метастазов для каждой группы животных. Животные, которые пали до окончания срока эксперимента, отмечены серым

р=000036при сравнении с контрольной группой (HET-SR)

Количественный трансплантационный тест показал, что клеточные линии НЕТ-SR/GFP и HET-SR1/GFP у 100% (10/10) животных образуют первичные опухоли после подкожного введения 2102, 2103 и 2104 клеток. Доза 2101 клеток HET-SR/GFP прививается у 7 животных из 10 (70%), в то же время клетки HET-SR1/GFP прививаются в 90% случаев (9/10), как и в экспериментах, проведенных раннее при исследование клеток HET-SR и HET-SR1 РеюЬтап et а!., 1998]. Таким образом, клеточные линии HET-SR/GFP и HET-SR1/GFP являются высокотуморогенными, т.к. для формирования опухоли у животного достаточно ввести подкожно 20 клеток (табл. 2).

Гиперэкспрессия shMDGl в HET-SR и HET-SR1 клетках вызывает снижение их туморогенности. Так, доза в 2-Ю1 клеток линий HET-SR/shMDGl и HET-SR1/shMDGl в 100% случаев (10/10) не прививается, а доза в 2102 клеток прививается только у 20% животных. Доза в 2-103 клеток линии HET-SR/shMDGl прививается в 70% случаев, а линии HET-SRl/shMDGl - в 100%. Доза в 2104 клеток линий HET-SR/shMDGl и НЕТ-SRl/shMDGl образует опухоли у всех животных (10/10) (табл. 2).

Введение всех четырех доз клеток при изучении спонтанной метастатической активности линии HET-SR/GFP индуцировало у половины животных формирование до 10 метастазов в легких. У остальных 50% животных метастазы не обнаруживаются. В то же время, линия HET-SR1/GFP индуцировала образование у 80% животных от 100 до 300 метастазов, у 20% животных формируются до 100 метастазов, причём 40% животных к моменту вскрытия умирают. Таким образом, линия HET-SR/GFP является низкометастазной, а линия HET-SR1/GFP высокометастазной, что полностью согласуется с раннее полученными данными по изучению метастатического потенциала родительских линий HET-SR и HET-SR1 РеюЬтап et а1., 1998]. Таким образом, было показано, что ген GFP не оказывает влияния на метастатическую активность изучаемых клеточных линий и поэтому использовался нами в качестве контроля при изучении гена shMDGl (рис. 8).

Повышенная экспрессия гена shMDGl в низкометастазной линии HET-SR вызвала снижение метастатического потенциала. Так, клетки линии HET-SR/shMDGl индуцируют формирование до 5 метастазов в легких у 40% животных. У остальных 60% животных не наблюдалось ни одного метастаза (рис. 8).

Также гиперэкспрессия shMDGl понизила потенциал метастазирования HET-SR1 линии: только у 30% животных было обнаружено более 100 метастазов, в то время как у остальных количество метастазов не превышало 50, и лишь 1 животное пало. Данные результаты являются статистически значимы (р=0.02) (рис. 8).

Рис. 8. Образование легочных метастазов при подкожном введении клеток НЕТ-SR, HET-SR1, HET-SR/shMDGl и HET-SUl/shMDGl (CMA тест).

Табл. 2. Распределения метастазов у животных в СМА тесте. Примечания: см. примечания к рисунку 7. Доза клеток, стимулирующая развитие пальпируемой опухоли, обозначена в таблице знаком «+», а не вызывавшая рост опухоли -«-». р=0.02при сравнении с контрольной группой (HET-SRI).

Таким образом, гиперэкспрессия shMDGl индуцирует статистически значимое понижение среднего количества метастазов при индукции в легких животных клеточной линией HET-SR1. Обнаружено, что гиперэкспрессия shMDGl вызывает снижение туморогенности опухолевых клеток обоих линий и повышает выживаемость животных после прививания исследуемых клеточных линий (рис. 8 и табл. 2).

3.8. Изучение влияния in vivo инъекции ДНК гена shMDGl на способность опухоли метастазировать.

Влияние продукции гена shMDGl на метастатическую активность исследовалось в эксперименте по инъекции in vivo плазмидной ДНК, содержащей ген shMDGl непосредственно в сформировавшуюся опухоль. В этом эксперименте для подкожного введения использовались клетки высокометастазной линии HET-SR-2SC-MLN, полученной ранее в результате селекции in vivo низкометастазной линии HET-SR. Выбор данной линии объясняется необходимостью протестировать способность продукта гена shMDGl подавлять метастазирование вне зависимости от действия мутантов v-src. Клеточная линия HET-SR-2SC-MLN, после введения 1*10Л клеток подкожно, индуцирует формирование у 100% животных (10/10) от 50 до 100 и более легочных метастазов.

В данном опыте 40 сирийским хомячкам подкожно вводилось 1-10Л клеток линии HET-SR-2SC-MLN. Затем опытные животные разбивались на четыре группы, по десять в каждой (рис. 9 и табл. 3). Первая группа состояла из животных, которые служили контролем при оценке развития опухолей. Животным, составляющим остальные три группы, на 14-ый день после подкожного введения клеток HET-SR-2SC-MLN, формирующих опухолевый узел, инъецировались водные растворы ДНК плазмид. Так, во второй группе животным в опухоль вводился 1 мкг ДНК плазмиды pLV, содержащей только контрольный ген GFP. Третья и четвертая группа животных использовались для введения 0,1 мкг и 1 мкг ДНК плазмиды pLV/shMDGl, соответственно. Скорость роста первичной опухоли в опытных группах изменилась незначительно (рис. 10).

Через два месяца животные усыплялись и вскрывались для подсчета легочных метастазов. Инъекция в опухоль размером от 0,2 см до 0,4 см 1мкг ДНК контрольной плазмиды pLV/GFP практически не изменила характер метастазирования (см рис. 9 и табл. 3). Совершенно другая картина наблюдалась при инъекции в опухоль ДНК pLV/shMDGl. В легких 9 из 10 животных, в опухоли которых инъецировалось 0,1 мкг pLV/shMDGl, формировалось от 10 до 25 метастазов, и только у двух животных образовалось 43 и 59 метастазов. Увеличение дозы pLV/shMDGl до 1 мкг фактически не изменило частоту метастатического поражения легких животных (рис. 9 и табл. 3).

Рис. 9. Образование легочных метастазов после инъекции ДНК в опухоль, индуцированную клеточной линией HET-SR-2SC-MLN.

200"

100-

6040 -30 " 2010-

□

DD

□

□ □

□ о

□

114

о а

а

0 112.1

р=0.005*

°Во

о о

24.3

24

□СП □

кол-во метастазов ж I кол-во метастазов посла инъекции „ 1мкг pLVÍGFP | * опухоль кол-во метастазов после инъекции . O.tMnr pLV/ehMOG | а опухоль кол-во метастазов после инъекции „ 1 мкг pLV/ahMDO | в опухоль

1 (52) 1 (37) 1 (11> 1 (10)

2 (58) 2 <«1) 2 (11) 2 (12)

3 (59) 3 (42) 3 (18) 3 (13)

4 (62) 4 (48) 4 (17) 4 (19)

5 (75) 5 (59) 5 (18) 5 (21)

« (83) « (54) 6 (19) в (22)

7 |150) 7 (150) 7 (24) 7 (22)

8 (151) 1 (200) 8 (25) 8 (34)

I (200) 9 (230) 9 (43) 9 (38)

10 (250) 10 (250) 10 (59) 10 (49)

Таб 3. Распределение метастазов у животных в трансфекцнн in vivo. Примечания: см. примечания к рисунку 7. р=0.005 при сравнении с группой животных, в опухоль которых инъецировалась ДНК плазмиды pLV/GFP.

Рис. 10. Скорость роста первичной опухоли после введения ДНК.

Среднее количество метастазов, сформированное первичной опухолью, индуцированной клеточной линией ЫЕТ-8К-28С-МЬК при инъецировании ДНК рЬУ/кИМБО! статистически значимо снизилось в 4,7 раз (р=0.005) по сравнению с исходной родительской клеточной линией. Таким образом, инъекция плазмидной ДНК, содержащей ген вИМБО, отчетливо снижает метастатический потенциал первичной опухоли (рис. 9).

3.9. Экспрессия поверхностных Р(1,6)-разветвлённых Лвп-связанных олигосахаридов в изучаемых клеточных линиях.

Известно, что опухолевые, и особенно метастазирующие клетки, часто проявляют повышенную экспрессию Р(1,6)-К-гликозилированных белков клеточной поверхности. Для оценки Р(1,6)-Н-гликозилирования клеток изучаемых линий было проведено мечение клеток РГГС-связанным РЫЛ-Ь лектином, который специфически взаимодействует с Р(1,6)-М-гликозидами. Анализ 1-1** клеток с помощью проточной цитофлуорометрии выявил существенную разницу в уровне гликозилирования между ЫЕТ-8К и ЫЕТ-8К1 линиями (рис. 11). Показано, что 40% клеток высокометастазной линии ЫЕТ-БШ демонстрируют повышенную экспрессию поверхностных Р(1,6)-разветвлённых Лп-связанных олигосахаридов. В низкометастазной линии ЫЕТ-8Я таких клеток не выявлено.

С учётом полученных данных было интересно выяснить, сопровождается ли подавление метастатической активности, вызванное гиперэкспрессией вИМБО^ изменением статуса гликозилирования клеток. Мечение клеток РГГС-связанным лектином показало, что клетки линии ЫЕТ-8И/8ИМБО1 действительно теряют р(1,6)-Лп-специфическое гликозилирование клеточной поверхности, приобретая статус, аналогичный низкометастазной линии ЫЕТ^К. Таким образом, экспрессия йЬМБО1 подавляет образование Р(1,6)-разветвлённых Лзп-связанных олигосахаридов.

Рис 11. Связывание ФИТЦ-меченого лектина PHA-L клетками линий HET-SR1, HET-SR и HET-SRl/shMDGl.

3.10. Сравнение уровня экспрессии мРНК человеческого аналога гена shMDGl (ЫЭ01) в опухолевых и нормальных тканях.

Феномен дифференцированной экспрессии гена зНЫВО!, обнаруженный на модельной системе клеточных линий фибробластов сирийских хомячков с различным метастатическим потенциалом, послужил основанием для проведения первичного скрининга опухолей человека различного гистогенеза в отношении активности данного гена. Исследовались образцы тканей от 30 пациентов с различными типами опухолей (табл. 4).

Табл. 4. Исследованные

Тип опухоли Количество пациентов

Рак желудка 6

Рак кишки 8

Рак молочной железы 4

Рак кожи 4

Рак яичка 3

Рак почки 2

Рак надпочечников 2

типы опухолей.

Изучение уровня экспрессии мРНК гена ЫБ01 в образцах нормальных и опухолевых тканей проводилось с помощью полуколичественной ПЦР с системой праймеров, амплифицирующих человеческий ген ERdj4/MDGl. В качестве матрицы для синтеза кДНК мы использовали РНК, выделенную из нормальной тканей человека, а

также из тканей первичных и вторичных опухолей (метастазов) различной этиологии. Качество РНК проверялось посредством электрофоретического разделения.

Для количественной оценки уровня экспрессии мРНК гена MDG1 фотографии результатов электрофоретического разделения анализировались при помощи компьютерной программы Image Quant.

Экспрессия гена MDG1 фиксировалась на низком уровне, и нам не удалось выявить изменения транскрипции гена MDG1 в условно нормальных и опухолевых тканях человека в случаях рака кишки, кожи, яичка, почки и надпочечников. Возможно, это связано с небольшой выборкой. Единственным исключением являются опухоли желудка. Было исследовано 6 пациентов, от которых получено 14 образцов условно нормальных и опухолевых тканей, а также метастатических узлов (рис. 12).

Обнаружено, что в 3 из 4 случаев происходит понижение экспрессии мРНК гена MDG1 в тканях опухоли по сравнению с нормальной тканью. В одном случае снижение экспрессии было не столь выражено. В тканях метастатического узла по сравнению с нормальной тканью в двух исследуемых случаях, где нормальная ткань была доступна, наблюдалось понижение экспрессии мРНК изучаемого гена в среднем на 50%. Также во всех исследованных случаях (4/4) снижение экспрессии мРНК гена MDG1 отмечается в соответствующих тканях метастатического узла, по сравнению с опухолевой тканью, причем в половине случаев экспрессия снижалась на порядок.

Таким образом, в опухолях желудка экспрессия мРНК гена MDG1 имеет тенденцию понижаться в процессе прогрессии.

20

25

Рис. 12. Количественный анализ уровня экспрессии мРНК гена MDG1 в образцах опухолях желудка.

О О

s

о

<

Примечание: исследовано б пациентов, из которых только от двух был получен полный набор образцов, т е. условно нормальной ткани (Ы), опухолевой ткани (Г), а также ткани метастатического

узла (Mts)

NTMsNTMsTMsTMsNT NT

Выводы.

1. Впервые получена полноразмерная копия гена дифференцировки эндотелия хомячка - shMDGl (зарегистрирована в GenBank под номером AY532644).

2. С использованием двух независимых методов (Нозерн-блот гибридизация, ОТ-ПЦР) показано, что эндогенная экспрессия гена shMDGl повышена в низкометастазной клеточной линии HET-SR по сравнению с высокометастазной линией HET-SR1.

3. Получены клеточные культуры, стабильно экспрессирующие продукт гена shMDGl.

4. Впервые показано, что экзогенная экспрессия гена shMDGl подавляет туморогенность и метастатическую активность клеточных линий HET-SR и НЕТ-SR1.

5. shMDGl не влияет на пролиферацию и миграцию клеток in vitro.

6. Показано, что в высокометастазной линии HET-SR 1 уровень экспрессии Р(1,6) гликозилированных белков повышен, а в низкометастазных клеточных линиях HET-SR и HET-SRl/shMDGl она практически отсутствует.

7. Первичный скрининг опухолей человека различного гистогенеза в отношении активности человеческого гомолога гена shMDGl показал снижение его экспрессии в ряду норма-опухоль-метастаз при раке желудка.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Чепурных Т.В., Штутман М.С., Мартынюк А.В., Исаченко Н.А., Быкова А.В., Янушевич Ю.Г, Татосян А.Г. Ген везкулярного транспорта Betl дифференциально экспрессируется в клетках, трансформированных вирусом саркомы Рауса. Русский журнал «Вич/СПИД и родственные проблемы». (2000) Т.4, №1.С24.

2. Isachenko N., Aushev V., Tatosyan A. Chaperone shMDGI is associated with decrease in metastatic activity of highly metastatic RSV-transformed cell line. FEBS Lecture Course on Cellular Signaling & 4th Dubrovnik Signaling Conference, May 21-27, 2004, Dubrovnik, Croatia.

3. Isachenko N., Aushev V. Isoform of v-src oncoprotein isolated from low metastatic cell line is unable to activate N-acetylglucosaminyltransferase V. BioScience2004 - from molecules to organisms, 18-22 July 2004, SECC, Glasgow, UK

4. Isachenko N., Dyakova N., Chepurnyh Т., Tatosyan A. shMDGI gene, isolated from HET-SR cell line, decreases metastatic activity of highly metastatic HET-SR1 cell line, [в печати]

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н.Н. Бяохнна РАМН Подписано в печать 1 2.05.05 Заки№ 268 Тираж 100 экз

11 mu 7005 ;.

Несмотря на огромные успехи в исследовании механизмов канцерогенеза, на сегодняшний день мстастазирование изучено далеко не полностью. Одним из наиболее значимых методом при изучении канцерогенеза является анализ клеточных линий, полученных из клеток опухолей или трансформацией in vitro. Метод трансформации клеточных культур вот уже 50 лет считается одним из самых действенных в отношении поиска генов, вовлеченных в канцерогенез. В изучении процесса метастазирования в физиологических условиях значимые результаты могут быть получены при введении полученных клеточных линий сингенным животным или бестимусным мышам. Для этой цели животному ортотопично вводится исследуемая клеточная линия. При моделировании поздних стадий метастазирования клетки вводятся непосредственно в кровеносное русло. Данные методы классифицируются как анализ спонтанного и экспериментального метастазирования, соответственно.

Наиболее адекватное исследование метастазирования включает введение подопытным животным пары клеточных линий, отличающихся по метастатическому потенциалу, но близких по остальным биологическим характеристикам, например, клеточных линий, полученных из опухолей схожей этиологии, но отличающихся по уровню метастазирования.

Одной из самых перспективных клеточных моделей для изучения метастазирования является система клеточных линий, полученных в результате инфицирования первичных эмбриональных фибробластов сирийского хомячка (HEF) различными изолятами штамма Schmidt-Rupin D (SR-D) вируса саркомы Рауса (RSV) в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН под руководством д.б.н. Галины Исааковны Дейчман. Все полученные линии имеют типично трансформированный фенотип и являются высокотуморогеннымн для сингенпых животных. При внутривенном введении взрослым хомячкам, клетки всех линий проявляют высокую экспериментальную метастатическую активность (ЭМА). Значительные отличия выявлены при исследовании спонтанной метастатической активности (С\1А) при подкожном введении исследуемых клеточных культур. Следует отметить, что условия СМА-теста более приближены к естественным процессам метастазирования, чем тест ЭМА.

В представленной работе использовались две линии этой серии - иизкометастазная HET-SR и высокометастазная HET-SR1, согласно тесту СМА. Линии HET-SR и HET-SR1 отличаются по последовательности v-src, введенного при инфекции различными изолятами RSV-SR-D. Клеточная линия HET-SR содержит низкометастазный вариант vsrcLM (low metastasis), а высокометастазная линия HET-SRl - v-srcHM (high metastasis). При подкожном введении животным опухолевых клеток HET-SR, метастазы либо не формировались вообще (50% случаев), либо образовывались в количестве 1-20 у одного животного. Клетки линии HET-SR1 формировали от 30 до 300 метастазов в легких животных.

Для сравнения экспрессии генов в клетках с различным метастатическим потенциалом в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза использовали метод дифференциального дисплея, с помощью которого получены фрагменты кДНК генов, высоко экспрессирующиеся в низкометастазной HET-SR или в высокометастазной HET-SRI линиях. Один из фрагментов, длиной в 365 пуклеотидов, выделенный из линии HET-SR, проявил гомологию с геном дифференцировки эндотелия 1 -MDG1 (microvascular differentiation gene 1), относящимся к 40-му классу белков теплового шока (Hsp40).

Целью данной работы являлось изучение участия гена дифференцировки эндотелия 1 в реализации метастатического фенотипа различных клеточных линий. В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи:

1) Получить полноразмерную копию хомячкового гена дифференцировки эндотелия 1- shMDGl (Syrian hamster homologue of MDG1);

2) Подтвердить диффсренциальность экспрессии гена shMDGl в клеточных линиях HET-SR и HET-SRl; г

3) Получить модельную систему клеточных культур, стабильно экспрессирующую кДНК гена shMDGl;

4) Изучить влияние экзогенной экспрессии гена shMDGl на способность клеточных линий образовывать метастазы в легких сингенныч животных;

5) Оценить уровень экспрессии человеческого гена ERdj4/MDGl в опухолевых и нормальных тканях.

В результате исследований впервые получена и депонирована в GenBank последовательность открытой рамки считывания хомячкового гена дифференцировки эндотелия 1 - shMDGl. Показано, что экспрессия гена shMDGl повышена в иизкометастазирующей линии HET-SR по сравнению с высокометастазирующсй HET-SRl. Методом трансформации получены клеточные культуры, стабильно экспрессирующие кДНК гена shMDGl. При введении последних сингенным животным , показано снижение метастатической активности исходных родительских культур. Более того, мы впервые показали, что инъекция ДНК гена shMDGl в опухоль, сформированную i высокометастатической клеточной линией, снижает её метастатическую активность.

Изучено влияние продукта гена $ЬМ001 на пролиферацию клеток с различным метастатическим фенотипом. Также впервые показано негативное влияние экспрессии этого гена на Аэп-зависимое Р(1,6)-гликозилироваиие, характеризующие клетки с высоким уровнем метастазирования.

Изучение механизмов профессии модельных клеточных линий является фундаментальной проблемой современной онкологии и может способствовать разработке новых методов терапии злокачественных новообразований. В ходе работы сконструирован набор генно-инженерных векторов, содержащих ген зЫШХМ, а также получена панель ЯБУ-трансформированных клеточных культур с высокой экзогенной экспрессией данного гена, которые могут быть использованы в дальнейших исследованиях в области экспериментальной онкологии.

Обзор литературы.

На сегодняшний день принято считать, что для образования злокачественной и активно метастазирующей опухоли у человека, клеткам необходимо накопить не менее 6-10 генетических нарушений определенного спектра [Hanahan et al., 2000].

В ходе развития первичной опухоли отдельные клетки приобретают способность к отрыву от неё и образованию новых колоний в другом микроокружении, т.е. метастазированию. Rene Bernards и Robert Weinberg выдвинули гипотезу о появлении метастатических детерминант не только в процессе профессии, но и на самых ранних стадиях канцерогенеза [Bernards et al., 2002].

Таким образом, во-первых, объясняется тенденция некоторых опухолей метастазировать достаточно рано в процессе канцерогенеза (например, рак молочной железы). Во-вторых, не существует генов, ответственных исключительно за метастазирование, а ряд нарушений онкогенов и генов-супрессоров ассоциированы не только с трансформацией, но и с дальнейшим озлокачествлением клеток. Наиболее ярким подтверждением этой гипотезы является анализ ДНК опухолей с помощью технологии микрочипов. Kang и van't Veer продемонстрировали, что экспрессия генов в первичной опухоли и в произошедших от неё метастазах практически идентична [van't Veer et al., 2002; Kang et al., 2003]. Безусловным подтверждением гипотезы являются также изучение индукции метастазирования онкогенами ras, туе, sre в клеточных линиях грызунов. В частности, в представленной работе исследуется генная экспрессия двух клеточных линий с различной метастатической активностью, полученных введением двух мутантов онкогена v-sre.

Первая глава данного литературного обзора посвящена краткому описанию признаков, необходимых для формирования метастатического фенотипа. Во второй главе обзора обобщены данные по изучению роли молекулярных шаперонов в канцерогенезе и, в частности, в процессах метастазирования.

Выводы.

1) Впервые получена полноразмерная копия микроваскулярного гена дифференциации 1 хомячка - shMDGl (зарегистрирована в GenBank под номером AY532644).

2) С использованием двух независимых методов (Нозсрн-блот гибридизация, RT-PCR) показано, что эндогенная экспрессия гена shMDGl повышена в низкометастазной клеточной линии HET-SR по сравнению с высокометастазной линией HET-SR 1.

3) Получены клеточные культуры, стабильно экспрессирующие продукт гена shMDGl.

4) Обнаружено подавление способности клеточных линий HET-SR и HET-SR1 образовывать метастазы в легких сингенных животных под действием экзогенной экспрессии гена shMDGl.

5) shMDG не влияет на пролиферацию и миграцию клеток in vitro

6) Показано, что экспрессия Р(1,6)-гликозилированных белков коррелирует с метастатическим потенциалом - в высокометастазной линии HET-SR 1 наблюдается повышенная экспрессия Р-(1,6)-гликозилированных белков, а в низкометастазных клеточных линиях HET-SR и HET-SRl/shMDGl она практически не наблюдается;

7) Первичный скрининг опухолей человека различного гистогенеза в отношении активности человеческого гомолога гена shMDGl показал снижение его экспрессии в ряду норма-опухоль-метастаз при раке желудка.

Заключение.

Молекулярные шапероны являются типом клеточных белков, участвующих во всех клеточных процессах - от синтеза белка до дифференциации клетки. В настоящее время » накопилось достаточно фактов, демонстрирующих вовлеченность шаперонов в процессы канцерогенеза и метастазирования. Шапероны препятствуют запуску программы клеточной смерти и способствуют проведению митогенного сигнала. Повышенная экспрессия отдельных представителей классов Hsp70, Hsp90 наблюдается во многих типах опухолей. Более того, такие опухолевые клетки становятся резистентными к хемотерапевтическим лекарствам.

Перспективным направлением в данной области является изучение механизма подавления опухолевыми клетками апоптотической программы в результате индукции деградации ЭПР белков (ERAD).

Нами впервые выделен и охарактеризован представитель генов дифференцировки эндотелия хомячка - shMDGl, относящийся к семейству молекулярных шаперонов Hsp40, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме. Двумя независимыми методами (Нозерн-блот гибридизация, RT-PCR) мы показали, что экспрессия гена shMDGl повышена в низкометастатической клеточной линии HET-SR по сравнению с , высокометастатической линией HET-SR1. Более того, экзогенная экспрессия данного гена в изучаемых клеточных линиях HET-SR и HET-SR1 снижает их метастатический потенциал при внутривенном и подкожном введении сингенным животным.

Кроме того, в данной работе была предпринята попытка ДНК-вакцинации с использованием плазмиднои конструкции, несущей ген shMDGl. Данный эксперимент является незавершенным, и многое остается невыясненным, однако полученные результаты о снижении метастазирования в легких подопытных животных, на наш взгляд, свидетельствуют о целесообразности ведения дальнейшей разработки генотерапевтических подходов к лечению таких опухолей человека, как рак желудка. Это подтверждается проведенным нами первичным скринингом условно нормальных, опухолевых и метастатических тканей, взятых у пациентов, страдающих раком желудка.

Способность подавлять метастатическую активность является впервые охарактеризованным свойством не только для данного класса молекулярных шаперонов, но и для системы деградации белков эндоплазматического ретикулума, в котором, по-видимому, участвует shMDGl.