Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ белков системы передачи сигнала в клетках, трансформированных онкогеном v-src с различным метастатическим потенциалом

На правах рукописи

РГБ ОД

ЗУЕВА ЭЛИНА ШАЛВОВНА 2 С !'''.]/;">?

АНАЛИЗ БЕЛКОВ СИСТЕМЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА В КЛЕТКАХ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ОНКОГЕНОМ С РАЗЛИЧНЫМ МЕТАСТАТИЧЕСКИМ ПОТЕНЦИАЛОМ

14.00Л4 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в НИИ Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, А.Г. Татосяй

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Д.А. Крамеров доктор биологических наук H.H. Мазуренко

Ведущая организация: Медико-генетический Центр РАМН

Защита состоится

LUOluJ.

2002 года в *'& часов на заседании диссертационного совета (К.001.017.01) РОНЦ им H.H. Блохина РАМН (115478 Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан " 11" . 2002 года.

Ученый секретарь

специализированного диссертационного совета доктор медицинских наук, Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность темы

В настоящее время достигнут большой прогресс в понимании механизмов опухолевой трансформации клеток. Обнаружено значительное количество генов, регулирующих этот процесс. Гораздо меньше известно о генетических факторах, участвующих в реализации метастатической активности опухолевой клетки. В то же время наибольшая опасность злокачественных новообразований связана с их способностью к формированию метастазов. Выявление молекулярно-биологической специфики и механизмов опухолевой прогрессии является безусловно важным для поиска новых методов лечения агрессивных опухолей. Одним из наиболее продуктивных подходов к изучению и выявлению генов, ассоциированных с метастазированием, является исследование клеточных линий одного происхождения, отличающихся по метастатической активности. Подобные экспериментальные модели получают, в частности, путем введения в клетки исследуемых генетических агентов, продукты которых, различным образом изменяя звенья в цепи передачи сигналов, влияют на их функциональное состояние. Сравнение молекулярно-биолоппеских различий таких клеточных линий является одним из способов идентификации новых генетических маркеров метастазирования. Число экспериментальных модельных систем клеточных линий со стабильно различающимися уровнями метастазирования ограничено. Поэтому получение и исследование подобных систем представляет значительный интерес.

2. Цели п задачи работы

Цель работы заключается в идентификации молекулярных факторов, значимых для реализации метастатического потенциала трансформированной клетки. В частности, выявление мутаций новых изоформ трансформирующего онкогена вируса саркомы Рауса (ЯБУ), важных для метастазирования клеток-реципиентов, а также идентификация белков, ответственных за модуляцию метастазирования под действием экзогенных факторов.

В соответствии с поставленной целью сформулировали следующие экспериментальные задачи: »

1. Трансфекция вариантов онкогена \-src, клонированных из высоко- и иизкометастазирующнх линий фибробластов хомячка в низкометастатазирующие спонтанно трансформированные фибробласты хомячка и последующий анализ биологических свойств трансфектантов т

vivo с целью изучения действия этих изоформ на клетки, не содержащие вирусного онкогена.

2. Конструирование экспрессирующихся векторов, содержащих различит зоны двух новых изоформ онкогена v-src, а также низкометастазирующш x-src с искусственно генерированными специфическими мутациями.

3. Трансфекция полученных векторов в клетки низкометастазирующей RSV-трансформированной линии с целью идентификации мутаций i изоформах v-src, значимых для их метастатических характеристик Анализ биологических свойств полученных трансфектантов in vivo.

4. Получение новых линий, несущих ген DAP-киназы, путем егс трансфекции в различные линии RSV-трансформированных и спонтаннс трансформированных фибробластов.

5. Анализ биологических свойств и молекулярно-биологическая характеристика полученных трансфектантов.

3. Научная новизна

При исследовании структуры онкогена v-src в рамках данной работы были впервые установлены мутации в С-концевой области его новых изоформ, важные для подавления метастатической активности трансформированных клеток-реципиентов. Впервые получена модельная система RSV-трансформированных клеток с активной экзогенной DAP-киназой. Выявлены новые гены, потенциально вовлеченные в процесс метастазирования. Установлен тип функционирования некоторых сигнальных молекул в v-í/r-трансформированных фибробластах, отличающихся уровнем метастазирования. В частности показано, что при подавлении метастатической активности RSV-трансформированных фибробластов активируются сигнальные молекулы центрального митогенного Ras-MAP-киназного каскада (ERK1/2), стимулируется фосфорилирование киназы фокальных контактов (FAK) и подавляется фосфорилирование адапторного белка She.

4. Научно-практическая ценность

Работа носит теоретический характер. Сконструирован набор генно-инженерных векторов, несущих различные элементы новых изоформ онкогена v-sre, которые могут быть использованы в экспериментах по внрус-индуцированному канцерогенезу. Получена панель RSV-трансформированных клеточных культур с активной DAP-киназой. Значительное снижение метастатической активности клеток, в которые вводили этот ген, позволяет причислить его к потенциально

значимому в клиническом отношении фактору, с помощью которого можно будет снижать метастатическую активность злокачественных опухолей.

5. Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместной конференции лабораторий молекулярной биологии вирусов, регуляции вирусных и клеточных онкогенов, вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов и противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН. Материалы работы докладывались на Русско-Французском Симпозиуме по молекулярной онкологии, Москва, 1999, Европейской Онкологической Конференции ECCOII, Лиссабон 2001.

СОДЕРЖА НПЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы, включающем 10 разделов, представлены различные группы генов, вовлеченные в процесс метастазирования опухолевых клеток. Разбираются возможные механизмы участия этих генов в опухолевой профессии. В частности, дано подробное описание возможного участия онкогена хгс в формировании метастатического фенотипа клетки. Описаны структура и функции гена DAP-киназы, известного как ингибитор опухолевого роста и метастазирования.

2. Материалы п методы

В работе были использованы следующие методы исследования: <ультивирование и анализ культур клеток млекопитающих, трансфекция клеток млекопитающих, выделение ДНК и РНК из клеток млекопитающих, получение )адиоактивно меченых зондов, электрофорез нуклеиновых кислот, блог-ибридизацня нуклеиновых кислот, трансформация бактериальных клеток, ¡ыделенне плазмндной ДНК, молекулярное клонирование в плазмидных векторах, 1ыделение и анализ белковой фракции клеток (иммунопреципитация и шмуноблотинг), получение меченой кДНК. '

В работе были использованы клеточные линии спонтанно расформированных и трансформированных вирусом саркомы Рауса (RSY) рибробластов сирийского хомячка, полученные в лаборатории противоопухолевого [ммунитета РОНЦ РАМН [Deichman G.I. et al., 1989]. Для трансфекции клеток и юлучения новых векторов использовались плазмиды, содержащие

последовательности новых изоформ онкогена v-src и гена DAP-киназы [Tatosyan А et al., 1996. Cohen О, et al., 1997].

3. Результаты

3.1 Обоснование проведенного исследования

С целью поиска генетических детерминант метастазирования в работе использовали две экпериментальные модельные системы клеток родственны> линий, отличающихся по метастатической активности in vivo. Основной модельной системой служили линии эмбриональных фибробластов хомячка, трансформированные in vitro вирусом саркомы Рауса. Одновременно в работу взяли две линии спонтанно трансформированных фибробластов, также обладающих разным метастатическим фенотипом in vivo. Все линии использовали в качестве реципиентных для исследуемых генов.

Ранее неизвестные изоформы онкогена \-src были получены в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов из геномных библиотек высоко- и низкометастазирующих RSV-трансформнрованных линий и названы v-.srcHM (high metastatic) и v-.s/rLM (low metastatic) соответственно. [Tatosyan Л., et al., 1996].

ins T>A F>L

U I

SH

SH2 - ATP

KINASE - С

jL

V>M

v-SrcHM

ins T>N A>T

M

SH -

SH2

ATP

D>E E>A V>del

KINASE -

v-SrcLM

Рис. 1 Положение мутаций в белках v-Src-HM и v-SrcLM

ins - вставка, del - делеция, стрелками указаны основные мутации. М - домен меристилирования, unique - уникальный домен, SH2 и SH3 - лгс-гомологичные домены, ATP/KINASE - АТФ-связывающий и киназный участки каталитического домена, С - С-концевой v-irt-специфичныи домен.

классического v-Src кодируемые ими белки отличаются набором идентичных гаций и 20-аминокислотиой вставкой в уникальном домене. В свою очередь, обе >формы онкобелков отличаются друг от друга различными мутациями, 1ЫШШСТВО из которых приходится на уникальный домен и С-концевую часть собелков (рис.1). При трансфекции v-.v/cHM в низкометастазирующую линию TSR ее метастатический потенциал заметно повышался, в то время как при .нсфекции v-v/x'LM в ту же линию никакого эффекта не наблюдалось.

На основании этих данных заключили, что специфические структурные »енения вирусного онкогена могут быть значимыми для проявления гастатической активности трансформированных им клеток. В настоящей работе с 1ыо выявления биологически значимых мутаций сконструировали векторы с шчными частями v-.vrcHM и v-.stt'LM и изучали их эффекты на моделях RSV-шсформированных и спонтанно трансформированных клеточных линий.

Другим экзогенным генетическим материалом, используемым в данной юте, был недавно открытый ген DAP-кииазы (Death associated protein kinase -■Pk). DAP-кнназа является одним из наиболее интересных белков, вовлеченных в )цесс прогрессии трансформированной клетки. Она представляет собой серин-ониновую Са27кальмодулин-регулируемую киназу, функционирующую как ¡итивный медиатор апоптоза.

Конструирование химерных плазмидных векторов, содержащих

последовательности v-srcHM н v-srcLM

Для локализации мутаций в LM- и НМ-вариантах v-src, вовлеченных в лизацию метастатического фенотипа клеток-реципиентов, сконструировали :циальные химерные плазмиды.

МЫ Mini МЫ Mini

v-srcIIMLM

v-ircLMIIM

:. 2 Схема получения экспрессирующих векторов с химерными генами v-.svc.

Учитывая, что мутации, которые отличают две новых изоформы друг друга, расположены в правой и левой частях, путем реципрокного лигирова! взаимозаменяемых фрагментов получили гены, содержащие различные их регио (рис.2). Химерные гены перевели в экспрессирующий вектор р1С и получеш варианты назвали рКХМНМ и р1СНМЬМ соответственно.

3.3 Конструирование плазмидиого вектора, содержащего

мутаптный вариант у-бгсЬМ

Помимо векторов, несущих химерные варианты новых изоформ V-.« сконструировали вектор, содержащий вариант v-.fn.LM, частично преобразованы в вариант у-л/гНМ путем элиминации ЬМ-специфнчных мутаций на 3'-конце ге Вектор экспрессирует онкобелок-ЬМ, в С-концевой области которого имеет ме( обратная реверсия аланина на глутамин (позиция 542, рис.1) и восстановлена утр, валииа (позиция 543 рис.1). Однако в нем сохранены Ы-концевые мутации мутация в киназном домене белка у-БгсЬМ. Этот вектор получили при помо техники последовательных полимеразных цепных реакций со специаль подобранными праймерами. Целью его создания является оценка биологичесь роли искусственно утраченных аминокислот. Вектор, несущий ревертант со все икусственно индуцированными мутациями, был обозначен как р1С ЮЬМ*.

3.4 Трансфекция клеток НЕТвИ векторами р1С10-НМЬМ,

рЮЮ-ЬМНМ п р1С10-ЬМ*

Для анализа биологических функций сконструированные векторы р1С' НМЬМ, р1С10-ЬМНМ и р!С10-ЬМ* вводили путем трансфекции низкометас газирующую линию ЯЗУ-трансформированных фибробластов - НЕТ5 В предварительных экспериментах по трансфекции двух новых изоформ у-лгс клетки спонтанно трансформированных хомячковых фибробластов было показа! что у-бссИМ повышает 1гх метастатический потенциал. Этот эффект однако был столь ярко выражен, как после трансфекции того же вектора в К трансформированную низкометастазирующую линию НЕТБЛ. Поэтому р дальнейшего анализа в качестве реципиентной выбрали эту же лини Трансфекциго проводили стандартным методом кальций-фосфатной преципитащ После получения неомицин-устойчивых клонов и анализа интеграции экзогеннс вектора в геном для дальнейших исследований выбрали по 2 клона каждс варианта: НЕТЗЛ-НМЬМ кл. 11 и 22, НЕТБЯ-ЬМНМ, кл. 6 и 25 и НЕТБЛ-ЬМ* кл и 3. Анализы биологических свойств (динамики роста и зависимости от ростов!

факторов) не выявили различии между клетками-трансфектантов и родительской культурой.

3.5 Метастатическая активность трансфектантов in vivo

Метастатическую активность трансфектантов анализировали при помощи теста СМА (спонтанная метастатическая активность). Хомячкам подкожно вводили клетки исследуемых линий, и через две недели в месте укола вырастала прививаемая опухоль, клетки которой спонтанно метастазировалн в легкие. Через 8 недель после инъекции подсчитывали количество легочных метастазов. На рис. 3 представлено графическое изображение распределения метастазов в легких опытных животных.

Метастатическая активность опухолевых клеток, получивших HMLM-вариант трансфектантов, сопоставима с исходной линией HETSR. В тот же время у клеток, несущих LMHM-варнант и мутантнын LM-вариант вирусного онкогена, метастатическая активность ощутимо возросла. Количество безметастазных животных резко снизилось и произошел явный сдвиг активности клеток в высокометастазнрующую область (рис 3). Если опухолевые клетки исходной липни не генерируют более 50 легочных метастазов, то из клеток двух наиболее показательных клонов LMHM-варианта ЬМ*-варианта в 40-55% случаев их формируется более 100.

На основе анализа биологических эффектов новых конструкций можно ;делать вывод о нейтральности N-концевых мутаций новых вариантов онкобелка v-;гс. LM-специфичные мутации С-концевой зоны очевидно ослабляют исходно шсокометастатическую активность онкобелка, так как в их отсутствие ревертант /-.srcLM* демонстрирует высокометастатическую активность. Значение С-концевой эбласти онкобелка v-src до настоящего времени, не прояснено. По некоторым тайным эта область способствует ассоциации прОтеинкиназы Src с субстратом. Зозможно мутации, обнаруженные в LM-варнанте v-src, ослабляют его ;убстратную специфичность.

«

IIETSR

0-10 10-50 30-100 100-200 >200 количество метастазов

IIETSR-IIMLM кл.22

S s

О 0-10 10-50 S0-I00 100-200 >200 количество метастазов

HETSR-LMIIM кл.6

■ lu I

0 1-10 10-S0 50-100 100-200 >200

количество метастазов HETSR-LM* Ю1.2

0 1-10 10-50 50-100 100-200 >200 количество метастазов

IIETSR-IIMLM кл.11

О 0-10 10-50 50-100 100-200 >200

количество метастазов IIETSR-LMIIM кл.25

О 0-10 10-50 50-100 100-21X1 >200

количество метастазов 1IETSR-LM* клЗ

S 2

0-10 10-50 50-100 100-200 >200

количество метастазов

РисЗ Распределение метастазов в легких хомячков через 2 месяца после подкож» введения клеток.

1.6 Траисфекция гена БАР-кнназы в линии клеток НЕТБК и НЕТвГМ

Для изучения новых факторов, вовлеченных в метастазирование опухолевой тетки, метастатическую активность двух КБУ-трансформированных линий (шпко-I высокометастазирующих) модулировали геном ОАР-киназы. В предварительных 1кспериментах проверили экспрессию эндогенного гена ОАР-киназы в линиях, 1ыбранных в качестве реципиентных. Обе линии, как высокометастазируюншя шния НЕТ5Я-1, так и ннзкометастазирующая НЕТ5Я, не экспрессируют шдогенный ген ОАР-киназы (рис. 4, дорожки 1-2). Этот результат закономерен, так сак известно, что в высокотуморогенных и активно диссеминирующих опухолях репрессия ОАР-киназы подавлена [КппсЫ А 1998]. Несмотря на то, что клежи ШТБЯ обладают низкой СМА, их способность метастазнровать при попадании [епосредственно в кровоток была высока и сравнима с НЕТ8Я-1.

Активность ОАР-киназы в клетках НЕТБЛ и НЕТ5Г1-1 индуцировали пу1ем грансфекцин в них интактного гена ОАР-киназы человека в составе жспресснрующегося вектора. Для контроля влияния самого лектора на иетастазирование одну из линий (НЕТЯЯ-1) трансфицировалн также «пустым» зектором рСОМАЗ, не содержащим гена ОАР-киназы. После селекции кеомицпн-^стончивых клеток получили тотальные популяции каждого варианта. Культуры грансфектантов обозначили как: НЕТ511-Ок, НЕТ5Я-1-Ок (культуры, несущие зектор с ОАР-киназой) и НЕТ511-1-контроль (культура, несущая «пустой вектор», 5ез ОАР-киназы).

Рис. 4 Иммуноблот анализа продукции белка ОАР-киназы в исследуемых клетках.

1 - НЕТ511, 2 - 1ТЕТ5Я-1, 3 - 1ХС-АР9 (линия клеток мышиной карциномы Льюиса

с активной ОАР-киназой), 4 - НЕТ51*-Ок, 5 - НЕТ811-1-Ок, 6 - НЕТ8Я-1-контрол1.

»

Продукцию экзогенной ОАР-киназы в трансфектантах анализировали четодом иммуноблотннга с использованием антител, специфичных к ОАР-кишпе рис 4, дорожки 4 и 5).

Таким образом, были получены новые культуры клеток, активно тродуцирующне ОАР-киназу. В этих культурах был проанализирован ряд молекулярно-биологическнх параметров.

3.7 Сравнение ннвазнвиости траисфектантов н исходных культу

путем анализа их коллагеназных активностей

Для анализа ннвазнвиости полученных культур сравнили активност секретируемой клетками коллагеназы IV типа, известной еще как желатиназа В фермента, расщепляющего коллагеновые суперструктуры внеклеточног пространства. По активности ее секреции можно оценить способност трансформированной клетки инвазировать. На рис.5 представле желатинсодержащий гель, на котором видны зоны, расщепленные коллагеназо исследуемых клеток.

1 2 3

Рис 5 Сравнение коллагеназных активностей исследуемых клеток.

1 - HETSR-1,2 - HETSR-1-контроль, 3 - IIETSR-1-Dk.

Активности коллагеназ, секретируемых родительсксм

высокометастазирующей культурой (рис. 5, дорожка 1) и соответствующил контрольным трансфектантом, несущим пустой вектор (дорожка 2), высоки i сопоставимы. В то же время коллагеназа, секретмруемая клетками траисфектантов несущих DAP-киназу, расщепляет в геле в 7 раз меньшую по площади зон; (дорожка 3). Это является свидетельством снижения инвазивности клеток i присутствии активной DAP-киназы.

3.8 Метастатическая активность DAP-k-трансфектантов in vivo

Биологические свойства полученных траисфектантов исследовали щ животных. Анализ спонтанной метастатической активности (СМА) исследуемых культур проводили стандартным, описанным выше образом, вводя исследуемые клетки животным подкожно. Следует отметить, что доза прививаемых клеток с DAP-киназой на 1-2 порядка повысилась по сравнению с родительскими клетками (102-103 вместо 101).

£ * 40

Е 3

I 5 30

£ £ 20

X |50

ё Р

п> озо

I о 20

V* I " 10

НЕТвК-

.1.1.

О 0-10 1 0-30 50-100 -200 -300

количество метастазов НЕТБ1М-контроль

I в I

О 0-10 10-50 30-100 200 -300

количество метастазов

НЕТ81Ы-Ок

0-10 10-50 50-100 -200

количество метастазов

НЕТвИ

60

50 Р9

§ Ж 2 Я 40 1 И

Е о в 30 1 Ш

Ш и 5 20 1 ¡1 V.;

£ I 10 Р

ш % ш

0 0-10 1 0-5 0 50-100 г-200 300

количество метастазов

НЕТвК-Бк

II

О 0-10 10-50 50-100 200 »и

количество метастазов

не. 6 Распределение количества метастазов в легких хомячков через 2 месяца

после подкожного введения клеток.

Эти данные подтвержает также тест на экспериментальную метастатическую ктивность (ЭМА), т.е. способность клеток метастазировать при попадании епосредствешго в кровоток животного. Транфектанты с ОАР-кинязой

метастазировали значительно хуже, чем высокие по ЭМА родительские культу])! (как НЕТБЯ, так и НЕТ8Я-1), что свидетельствует об снижении их туморогенности Клетки прививаемых опухолей НЕТ811-1 и НЕТ8Я-1-контроль индуцировал формирование в легких животных всегда более 50 метастазов, причем в 60/ случаев количество метастазов было настолько велико, что не поддавалос подсчету (более 300) (рис. 6). Как и ожидалось, метастатический потенциа. НЕТ8Я-Ок практически не изменился по сравнению с низкометастазирующей т СМА родительской линией (рис. 6).

Метастатическая же активность клеток трансфектанта НЕТБЛ-ЬО! настолько сильно снизилась, что у 40% животных не было обнаружено вообще ш одного метастаза, а в остальных случаях их количество не превышало 50. (рис. 6).

Из полученных данных следует вывод о том, что экспрессия ОАР-киназь связана со снижением туморогенности и подавлением метастазированш прививаемой опухолевой массы.

3.9 Продукция и фосфорплнрование белка Бтс в исследуемых клетках

Сравнительный анализ синтеза первоначального индуктора трансформации фибробластов - онкобелка 5гс - проводили с использованием антител, специфичных к белку Бтс и к фосфорилированному в положении 416 активному Бгс, соответственно. Различия в молекулярной массе исследуемых изоформ вирусного онкобелка (следствие 20-аминокислотной вставки) и клеточного Бгс позволяет отличать их друг от друга.

Рис. 7 Сравнительный анализ белка Бгс в исследуемых клетках. А. Продукция

белка Бгс I- НЕТБИ, 2 - НЕТБЯ-Ок, 3 - НЕТБК-1 -контроль, 4 - НЕТЭК-ЬОк. В. Фосфорилирование белка 8гс по тирозину. У- НЕТБК, 2 - НЕТБИ-Ок, 3 -НЕТБа-Ьконтроль, 4- НЕТ8Я-1-Ок.

Анализ показал, что продукция белка Бгс (рис. 7А, дорожки 1-2 и 3-4) и ею эсфорилирование (т.е. уровень активной формы) (рис. 7В, дорожки 1-2 и 3-4) в 1ансфектантах мало отличаются от аналогичных показателей у исходных линий [еток (верхние полосы на представленных иммуноблотах).

На основании этих данных можно сделать предварительные выводы о том, о а) ингибирующий эффект ЭАР-киназы не влияет на первоначальные этапы адукции опухоли (трансформация, рост), б) мишенями действия этой киназы 1ляются факторы, вовлеченные в более поздние стадии опухолевой прогрессии, в) элекуляршле механизмы трансформации клетки не обязательно отвечают ча (следующие этапы прогрессии опухолей.

10 Сравнительный анализ продукции некоторых сигнальных белков в ОАРк-трансфектантах н соответствующих контрольных культурах

С целью выявления звеньев в путях передачи сигналов, работа которых |ррелирует с сильнейшим подавлением метастатического потенциала клеток па )не экспресии БАР-киназы, провели анализ продукции активных форм некоторых точевых сигнальных молекул. Наибольшее внимание в качестве потенциальных терминант метастазирования привлекают молекулы КаБ-МАР-киназного ггогенного каскада, аккумулирующего сигналы регуляции многих основных юцессов клеточной жизнедеятельности, а также сигнальных путей, вовлеченных в гуляцию пролиферации, выживания и подвижности клетки (к ним относятся, в стности, белки фокальных контактов и молекулы, проводящие сигналы :еточной пролиферации).

В исследуемых клетках проанализировали уровень тирозннового >сфорилирования адапторного белка фокальных контактов паксилина и киназы жальной адгезии (РАК). Для этого паксилин и ИАК преципитировали ответствующими специфичными антителами и полученные иммунные мплексы анализировали методом иммуноблотинга с использованием антител к >сфо-тирозину.

Как показал анализ, продукция активного паксилина в ОАР-к-ансфектантах не изменилась по сравнению с контрольными клетками (рис. 8Л. еки 1-2 и 3-4). В то же время уровень фосфорилированной (активной) РАК в них высился в 2-2.5-раза (рис. 8В, сравните треки 1-2, и 3-4).

Рис 8 А. Продукция фосфорилированного паксилина в исследуемых клетках.

В. Продукция фосфорилированной FAK в исследуемых клетках. 1 - HETSR, 2 -

HETSR-Dk, 3 - HETSR-1-контроль, 4 - HETSR-1-Dk

Такое повышение незначительно, но тем не менее свидетельствует о активации FAK в присутствии DAP-киназы. Возможно это является следствие; формирования дополнительных фокальных контактов на поверхности DAPk содержащих клеток, что вызывает разницу в фосфорилировании основной компонента этих адгезивных структур.

Сигнал с рецепторов интегринов раздваивается. Помимо FAK-паксилин сигнальной цепи он активирует адапторную молекулу She, соединяющуи интегриновые рецепторы с тирозин-киназами Ras-MAPK-каскадного сигнальноп пути. Активированный белок She проводит к внутриклеточным каскадным схемаи сигналы регуляции профессии клеточного цикла. Для исследования активное™ белка She провели сравнительный анализ продукции его фосфорилированно! формы в родительской культуре HETSR-1 и соответствующем трансфектант( HETSR-1-Dk. Для этого She преципитировали из тотальных белковых лизато! антителами, специфичными к трем изоформам - Shc46, Shc52 и Shc60, после чегс методом иммуноблотинга с использованием фосфо-тирозин-специфичных антито исследовали уровни активных изоформ She.

Оказалось, что в DAP-k-трансфектанте (рис.9, трек 2), несмотря нг неизменный уровень экспрессии She (данные не представлены) продукция все> активных изоформ She снизилась в 5 раз по сравнению с исходной культурой (трек 1).

— 60plu>spho-Shc

— 52phospho-She

— 46 phospho-Shc

lie. 9 Продукция фосфорилированных нзоформ She культурах

HETSR-1 и HETSR-1-Dk. 1 - HETSR-1,2- HETSR-1 -Dk

Это позволило предположить, что активность сигнала, идущего через гцепторы интегринов на She (рис. 9) в клетках, несущих DAP-киназу, подавлена, го свидетельствует об изменениях, произошедших в регуляторных механизмах рогрессии клеточного цикла.

Одними из основных проводящих молекул Ras-MAP-киназного сигнального аскада являются мнтогенактивируемые протеинкиназы (МАР-киназы), роводящие сигналы клеточной пролиферации, дифференцнровки и смерти. В исло МАР-кииаз входят, в частности, две родственные киназы - ERK1 и ERK2, отенциально вовлеченные в канцерогенез.

Продукцию активных ERK1 и ERK2 исследовали путем анализа уровня их юсфорилированных по тирозину форм. Для этого тотальные клеточные лпзагы гстнруемых культур анализировали методом иммуноблотинга с использованием нтител, специф!гчных к активным ERK! и ERK2 (рис. 10).

Как показал анализ, в культуре HETSR и соответствующем DAF'k-рансфектанте уровни активных ERK1 и ERK2 сопоставимы (рис.10, треки 1 и 2). 1о сравнению с ними, в клетках HETSR-1 продукция фосфо-форм ERK1/2 ниже, ричем в случае ERK1 это снижение выражено намного сильнее (трек 3). Однако в оответствующем трансфектанте HETSR- 1-Dk уровни фocфo-ERK!/2 повышаются, ричем в случае ERK1 - в 8 раз. (трек 4). Учитывая важную роль ERKI/2 в роведении различных сигналов можно сказать, что изменение их активности вляется серьезным молекулярно-биологическим событием, ассоциированным с кспрессией DAP-киназы.

1 2

12 3 4

— р1юзр1ю-Е11К 1 —рЬозрЬо-Е11К2

Рис.10 Продукция фосфорилированных форм ЕЯК1 м ЕЯК2 в исследуемых клетк;

I - НЕТЗЯ, 2 -НЕТБЯ-Ок, 3 -НЕТ511-1-контроль, 4 - НЕТ8Я-1-0к.

Объяснить факт активации Е11К1/2 в низкометастазирующих линиях дшик модели довольно сложно. Многие злокачественные опухоли позитивны 1 экспрессии ЕГ1К.1 и Е1<К2. При анализе результатов имеет смысл сопоставить тага две исходные у-лтс-трансформированные линии. Можно сказать, ч низкометастазирующая НЕТБЛ отличается от высокометастазирующей НЕТ5Я гнперфосфорилированием Е11К1. После трансфекции гена ОАР-киназы в НЕТБЛ снижается метастатический потенциал клеток, а ЕЯК1 начина! фосфорилироваться намного активнее. Во всех трех ннзкометастазньгх лиши (НЕТБЛ, НЕТБЯ-Ок, НЕТ811-1-Ок) ЕЯК1 гнперактивирована, в отличие ( высокометастазной НЕТ5Я-1. Очевидно, подобный тип функционирования ЕЯК1 низкометастазирующих клетках объясняется специфическими особенностями у-л-п зависимой метастатической активности фнбробластов.

Также провели сравнительный анализ. экспрессии фактора рост кровеносных сосудов УЕОЕ, который является специфическим митогено эндотелиальных клеток, потенциальным индуктором проницаемости сосудов.

1 2 3 4

Рис. 11 Секреция УЕвР в исследуемых клетках.

1 - НЕТБЛ, 2- НЕТЗЛ-Ок, 3 - НЕТ5Я-1, 4 - НЕТ5Я-1-Пк

Секрецшо УЕОР анализировали методом иммуноблотинга белко> кондиционированной среды клеток с антителами, специфичными к УЕвЕ.

рис. И видно, что продукции двух родственных изоформ VEGF в парах шниваемых культур практически одинаковы (рис. 11, треки 1-2 и 3-4).

Клетки HETSR-модели секретируют VEGF намного активнее, чем клетки дели HETSR-1 (сравните треки 1-2 и 3-4). В данном случае мы не наблюдаем шой корреляции экспрессии этого фактора роста с агрессивностью клеток, но ь очевидная разница его экспрессии в культурах HETSR- и HETSR-1-моделей, ) вероятно отражает независимость их происхождения.

1 Сравнительный анализ аккумуляции р53 и экспрессии MDM2 в стрессовых п нормальных условиях в культурах HETSR-1 и HETSR-1-Dk

Недавно на основании данных, полученных в серии специальных опытов, ла предложена гипотетическая схема участия DAP-киназы в путях передачи ■нала. Предполагается, что DAP-киназа вовлечена в р53/р19АКР-сигнальную цепь, шулнруя его в ответ на гиперэкспрессию онкогенов туе и E2F [Raveh Т, et al., 31]. Её функции заключаются в индукции белка pl9ARF, который, став активным, бывает и инактивнрует белок MDM2. В связанном состоянии MDM2 нкционально неактивен и не способен стимулировать убиквитинирование белка !. В норме время полужизни р53 в клетке крайне ограничено из-за его :тоянной деградации. Поэтому при инактивации MDM2 р53 стабилизируется и апливается в ядре, индуцируя р53/р19АКР-зависимый апоптоз.

Ранее статус гена р53 в клетках базовой модельной системы не исследовался, .г провели сравнительный анализ уровня р53 в клетках высокометастазирующей гаи HETSR-1 и ее трансфектанта, несущего активную DAP-киназу, в норме и в 1ессовьгх условиях, вызванных воздействием на клетки генотоксического агента шметансульфоната (EMS) и УФ-излучения (UV). В качестве положительного ггроля выбрали клетки линии карциномы толстого кишечника человека SW480, фессирующие мутантный тип р53 (рис. 12А, трек 7).

Параллельно анализировали экспрессию белка MDM2, которая, как правило, фелирует с внутриклеточным уровнем белка р53 при условии, что последний юсится к дикому типу.

Как показал эксперимент, в норме уровень р53 в родительских клетках TSR-1 очень низок (рис. 12А, дорожка 1). Однако под воздействием стресс-нтов происходит стабилизация белка и повышение его уровня (дорожки 2 и 3). и этом в присутствии активной DAP-киназы исходный уровень р53 в клетках [нсфектантов значительно выше и также модулируется в ответ на стресс.

Параллельно увеличению уровня р53 в обеих культурах повышается экспре изоформы МОМг90"71'1 (рис. 12В дорожки 2-3 и 5-6).

HETSR-I HETSR-l-DAP-k SW480

EMS 5П Г~ Eiis ÖF1

12 3 4 5 6 7

-MDM2 100 Юа

- MDM2 90 kDa

Рис. 12 А. Анализ уровня р53. В. Анализ экспрессии MDM2. /- HETSR-1, HETSR-1, экспозиция 1мкг/мл EMS (24 часа), 3 - HETSR-1, 24 часа пс экспозиции UV (10 мин), 4 - HETSR-1-Dk, 5 - HETSR-1-Dk экспозиц» мкг/мл EMS (24 часа), б - HETSR-1-Dk 24 часа после экспозиции UV мин), 7 - SW-480 - линия клеток карциномы толстого кишечник! мутантным типом р53 (положительный контроль).

Это значит, что клетки данной экспериментальной системы несут р53 дик< типа. Повышенный в норме уровень р53 вероятно является свидетельств большей чувствительности клеток с активной DAP-киназой к апоптотнческ стимуляции, что объясняет отчасти их ослабленную способность выживать кровотоке организма-хозяина. Об усилении чувствительности клеток к апоптс свидетельствуют также данные экспериментов, проведенных в рамках настоят работы, по трансфекции гена DAP-киназы в высокометастазнрующую лиш спонтанно трансформированных фибробластов. Их метастатическая активность viva на фоне активности DAP-киназы также снизилась. Клетки трансфектант однако, в отличие от v-j/r-трансформированных, оказались нежизнеспособными через 2 месяца после неомициновой селекции гибли от массового апоптоза.

HETSR-1 HbTSR-1-PAP-k SW480

Jus (Ж~1 Г— шП

12 3 4 5 6 7

3.12 Анализ генной экспрессии в линиях IIETSR, HETSR-I п

HETSR-1-Dk методом дифференциальной гибридизации

В последние годы появились новые методы, позволяющие исследовать транскрипцию большого количества генов в интересующих клетках. Одним из таких методов является гибридизация меченой кДНК исследуемых линий с мембранами, на которых иммобилизованы фрагменты известных генов, вовлеченных в различные процессы клеточной жизнедеятельности (Alias-hybridization). Такой подход особенно эффективен при сравнивании генной транскрипции в линиях одного происхождения, отличающихся какими-нибудь характеристиками, например уровнем метастазнрования. Сравнительную гибридизацию проводили на фильтрах CLONTECII Mouse Cancer 1.2., несущих более 1000 мышиных генов, потенциально вовлеченных в канцерогенез. Анализ проводили совместно с сотрудниками Университета Иллинойс (США, Чикаго). Для анализа выбрали три линии. Две исходных - низкометастазнрующую HETSR и высокометастазирующюю HETSR-1, а также производную последней трансфектант HETSR-1 с DAP-киназон.

В результате анализа выявлена группа генов с различным уровнем транскрипции в клетках, отличающихся по метастатической активности (табл.1). Гены были отобраны в результате двух независимых экспериментов, включающих все этапы опыта, а именно: независимое выделение РНК из клеток, последующий синтез кДНК и гибридизация.

В настоящее время преждевременно делать какие-либо заключения о роли отобранных генов в индукции биологических свойств этих клеток. Не исключено, что некоторые из различий отражают факт независимого происхождения исходных линий клеток: HETSR и HETSR-1, а также деривата последней - HETSR-1-Dk. Это соображение относится, в первую очередь к экспрессии GM-CSF, кластерина и 1LK. В то же время спектр экспрессии генов ran и ibea дает основания для надежды, что их активность ассоциирована с биологическими свойствами исследуемых культур.

Однозначный ответ на вопрос о роли всех выявленных генов может дать лишь детальный анализ этих факторов на широком спектре экспериментальных "ннии и природных опухолей.

Суммируя все полученные в этой части работы данные можно предположить, что экспрессия DAP-кнназы ассоциирована со следующими изменениями в биологии клетки: повышением чувствительности клетки к про-апоптотической стимуляции, ухудшением пролнферативных характеристик, увеличением зависимости от ростовых факторов, повышением чувствительности в отношении

антиростовых факторов, нормализацией уровня бета-тубулина, ведущего, в частности, к ригидности клетки, митотическим нарушениям, снижением общей жизнеспособности клетки и т.д. Иными словами, клетка, экспрессирующая ОАР-кииазу, становится во многих отношениях менее трансформированной.

Табл. 1. Гены, дифференциально экспрессирующиеся в исследуемых культурах

Ген Клеточные липни Функции гена

НЕТБИ-! НЕТвК НЕТ511-1-1>1<

СМ-вЗР-пльфа + ++++ - Ннзкоаффпнныи рецептор гранулоцит-макрофаг-колониестпмулирующего фактор Проводит сигналы созревания кроветворш. клеток.

Кластерин - ++++ + Трансмембранныи гликопротеин. Участвуе в регуляции тканевой дифференцировкн, клеточного цикла и апоптоза.

ПЖ - ++++ + Протеникиназа. Сигнальный белок. Регуляция внеклеточного матрнкса, клеточной адгезии, роста и выживания клетки.

1*ап-ТС4 + ++++++ ++++ Малый О-белок. Участвует в двунапраленном ядерно-цитоплазматнческом транспорте белков и рибонуклеопротеинов. Вовлечен в регуляцию митоза.

И»са ++++++ + ++ Шаперон бета-тубулина Участвует в процессе укладки полипептида. бета-тубулина

Выводы

5 результате генно-инженерных операций получен набор векторных инструкций, содержащих различные фрагменты новых изоформ онкогена v-.v/r, 1 также специфические мутации 3'- области.

Остановлены мутации в С-концевой области онкобелка v-Src, влияющие па гетастатичсскин потенциал трансформированных им клеток.

1олучеиа новая модельная система клеток, трансформированных вирусом Гаркомы Рауса и несущих экзогенный ген DAP-киназы.

"¡оказано, что продукция DAP-киназы коррелирует с утратой -расформированными клетками метастатической активности.

1оказано, что с экспрессией гена DAP-киназы коррелирует модуляция ikthbhocth некоторых ключевых сигнальных белков: усиливается [юсфорилирование киназы фокальных контактов и МАР-кииаз ERKI/2; •нижается фосфорнл!фование адапторного белка She.

1оказано, что белок р53 дикого типа в клетках с активной экзогенной DAP-ашазой стабилиз1фуется, что является свидетельством повышения их [увствительности к апоптотическим стимулам.

Z помощью метода сравнительного скрининга транскрипционной активности Atlas-hybridization) отобран ряд генов с дифференциальным уровнем экспрессии I клетках с различным метастатическим потенциалом. К генам, потенциально ювлеченным в процесс метастазирования относятся ran, кодирующий щтоплазматический транспортный белок и tbca, кодирующий шаперон ¡ета-тубулина. *

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Э. Зуева. Н. Киселева, М. Штутмаи, А. Татосян. Клетки, трансформирован»!

генами v-src и активированным N-ras. Международная конференция СПИ рак и родственные проблемы. Тезисы, Т.1, стр. 200. Санкт-Петербург. 199

2. A. Tatosyan, В. Yatsulo, C.Shtutman, Е. Moinova, I. Kaverina, К. Leskov, О.

Mizenina, E.Zueva. G. Calothy, Ph. Dezelee.Two novel variants of the v-src oncogene isolated from low and high metastatic RSV-transformed hamster cell: Virology, v.216,347-356,1996.

3. N. Kisseljova, E.Zueva. V. Pevzner, A. Grachev, F. Kisseljov.De novo methylatioi

selective CpG dinucletide clusters in transformed cells mediated by an activatec ras. Intrn. J. of Oncology, v.12,203-209, 1998.

4. А. Татосян, Е.Зуева. Механизмы активации онкогенов. Клиническая

онкогематология. Издательство Медицина, стр. 16-26, Москва, 2001.

5. Е. Zueva. A. Kimchi, A. Tatosyan. Modulation of metastatic potential of v-src

transformed cells as a result of exogenous DAP-kinase activity. European Journ; of Cancer, v. 37, 122,2001.

6. Зуева Э.. E.M. Чевкина, А. Кимхи, А. Татосян. Подавление метастатического

потенциала клеток, трансформированных онкогеном \-src, как результат активности экзогенной DAP-киназы. Молекулярная биология, том 36, стр. 8,2002.

Озлокачествление клетки происходит вследствие нарушений основных процессов её нормальной жизнедеятельности. Генетические детерминанты этих нарушений подвергаются интенсивному изучению. К настоящему моменту накоплен большой объем информации относительно молекулярно-биологических событий, сопровождающих клеточную трансформацию. Гораздо меньше известно о внутриклеточных изменениях, от которых зависит метастатическая активность опухолевых клеток. Выявление новых факторов, вовлеченных в опухолевую прогрессию, является безусловно важным для поиска новых методов лечения агрессивных опухолей.

Одним из наиболее продуктивных подходов к изучению и выявлению генов, ассоциированных с метастазированием, является исследование клеточных линий одного происхождения, но отличающихся по своей метастатической активности.

Подобные экспериментальные модели получают, в частности, путем введения исследуемых генетических агентов, продукты которых, различным образом изменяя звенья в цепи передачи сигналов, влияют на функциональное состояние клеток. Сравнение молекулярно-биологических различий таких клеточных линий является одним из способов идентификации новых генетических маркеров метастазирования.

Одной из таких экспериментальных моделей является система линий RSV-трансформированных хомячьих фибробластов, отличающихся по метастатической активности. Эта система была получена в Лаборатории противоопухолевого иммунитета РОНЦ РАМН и биологические и некоторые генетические характеристики клеточных линий были исследованы и описаны [Deichman G.I et al., 1989. Deichman G.I et al., 1992].

RSV-трансформированные фибробласты получили путем инфекции первичных эмбриональных фибробластов сирийского хомячка разными изолятами штамма Schmidt-Ruppin D (SR-D) вируса саркомы Рауса (RSV). Все полученные линии имели типично трансформированный фенотип и были высокотуморогенны в тестах на животных [.Deichman G.I et al., 1989]. При внутривенном введении взрослым хомячкам клетки всех линий демонстрировали высокую экспериментальную метастатическую активность (ЭМА). Значительные отличия были обнаружены при исследовании спонтанной метастатической активности полученных линий (СМА). Следует отметить, что тест ЭМА представляет собой анализ способности трансформированных клеток, введенных в кровеносную систему животного, образовывать метастатические узелки в легких. При помощи же теста СМА оценивают метастазирование клеток опухолевой массы, сформировавшейся после их подкожного введения. Таким образом, тест ЭМА отражает уровень выживаемости клеток в условиях противоопухолевой активности организма и их туморогенность, тогда как тест СМА это анализ способности клеток первичной опухоли инвазировать через стенки сосудов организма и образовывать очаги вторичного опухолевого роста. Условия данного теста приближены к естественным и отражают процесс истинного метастазирования опухолевых клеток.

В представленной работе в качестве исходных использовали две линии этой серии -низкометастазную по СМА HETSR и высокометастазную по СМА HETSR-1. Опухолевые клетки HETSR во время СМА-тестирования в половине случаев не метастазировали, а в остальных случаях количество метастазов варьировало в пределах от 10 до 50. В то же время опухолевые клетки высокометастазной линии HETSR-1 формировали от 30 до 300 метастатических узелков в легких животных [Tatosyan А., et al., 1996].

Из геномных библиотек высоко- и низкометастазных линий в лаборатории регуляции вирусных и клеточных онкогенов РОНЦ РАМН были клонированы полноразмерные гены v-5гсНМ (высокометастазный v-src) и v-srcLM (низкометастазный v-src) [Tatosyan A., et al., 1996]. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что это два новых варианта онкогена v-src. В уникальном регионе обеих изоформ был обнаружен GC-богатый фрагмент длиной в 60 нуклеотидов, отсутствующий в классическом варианте гена v-src. Это является причиной нестандартного молекулярного веса белков, кодируемых генами v-.srcHM и v-srcLM - 62 кДа вместо 60 кДа. Оба онкобелка содержат по 10 идентичных аминокислотных замен, также отличающих их от известной последовательности v-Src вируса саркомы Рауса, штамма SR-D. В свою очередь, обе изоформы отличаются друг от друга различными мутациями, большинство из которых приходится на уникальный домен и С-концевую часть онкобелков.

При трансфекции v-v/rHM в низкометастазную линию HETSR, ее метастатический потенциал заметно повышался, в то время как при трансфекции v-smbM в ту же линию никакого эффекта не наблюдалось [Tatosyan A., et al., 1996]. На основании этих данных заключили, что специфические структурные изменения вирусного онкогена могут быть значимыми для проявления метастатической активности трансформированных им клеток. Эти предположения легли в основу одного из направлений данной работы, целью которого является выявление значимых мутаций путем изучения биологических эффектов специальным образом сконструированных векторов, содержащих различные зоны новых изоформ v-src.

Второй экпериментальной базовой системой клеток, используемых в данной работе, были две линии спонтанно трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомячка (HETR), также полученных в Лаборатории противоопухолевого иммунитета РОНЦ РАМН. Высокометастазная линия HETR75/18 и низкометастазная HETR162 являются производными культуры HETR, полученными в результате различных этапов рекультивации опухолей и метастазов, сформировавшихся после инъекции её клеток животным. [Deichman G.I., et al., 1989]. Эти линии того же происхождения, что и RSV-трансформированные, однако не содержат экзогенного трансформирующего агента и поэтому были использованы в данной работе в качестве вспомогательных.

Линии обеих моделей использовали в работе в качестве реципиентных для генов, чьи эффекты представляли интерес с исследовательской точки зрения. К этим генам относятся, в частности, химерные конструкты новых изоформ v-src, а также ген DAP-киназы, с чьей помощью модулировали метастатический фенотип клеток.

Недавно открытая DAP-киназа (Death associated protein) является одним из наиболее интересных белков, вовлеченных в процесс прогрессии трансформированной клетки [Inbcil В., et al., 1997]. Она представляет собой серин-треониновую Са2+-кальмодулин-регулируемую киназу, функционирующую в качестве позитивного медиатора апоптоза [Cohen О, et al., 1997]. Экспрессия мРНК и белка DAP-киназы утрачена многими линиями злокачественных опухолей человека, что обусловлено его метилированием. [Kimchi А. 1998].

Цель работы двояка. Во-первых, выявление структурных особенностей новых изоформ трансформирующего онкогена вируса саркомы Рауса - v-src, значимых для метастазирования клеток реципиентов. И во-вторых, поиск механизмов процесса метастазирования в RSV-трансформированных клетках с различным уровнем метастатической активности.

В соответствии с поставленной целью и предсуществующими данными сформулировали следующие экспериментальные задачи:

1. Трансфекция вариантов v-src, клонированных из высоко- и низкометастазных линий в низкометастазные спонтанно трансформированные фибробласты и последующий анализ биологических свойств трансфектантов in vivo с целью изучения действия этих изоформ на клетки, не содержащие вирусного онкогена.

2. Конструирование экспрессирующихся векторов, содержащих различные зоны двух новых изоформ онкогена v-src, а также низкометастазный v-src с искусственно генерированными специфическими мутациями.

3. Трансфекция полученных векторов в клетки низкометастазной RSV-трансформированной линии с целью локализации мутаций в изоформах v-src, значимых для их метастатических характеристик. Анализ биологических свойств полученных трансфектантов in vivo.

4. Получение новых линий, несущих ген DAP-киназы, путем его трансфекции в различные линии RSV-трансформированных и спонтанно трансформированных фибробластов.

5. Анализ биологических свойств и молекулярно-биологическая характеристика полученных трансфектантов.

В результате проведенных исследований локализованы мутации, значимые для проявления метастатической активности новых изоформ онкогена v-src, клонированных из низкометастазных и высокометастазных линий RSV-трансформированных фибробластов.

Показано, что экспрессия экзогенной DAP-киназы ассоциирована со значительным снижением экспериментальной и спонтанной метастатических активностей клеток-реципиентов.

Показано, что в клетках с активной экзогенной DAP-киназой не происходит изменений синтеза и фосфорилирования вирусного онкобелка v-Src. При этом изменяются активности некоторых сигнальных проводниковых молекул, например She, FAK, ERK1/2, а также снижается коллагеназная активность трансфектантов. Активность экзогенной DAP-киназы в клетках спонтанно трансформированных высокометастазных фибробластов также ассоциирована со снижением их метастатического потенциала, однако довольно быстро вызывает массовый апоптоз, что является причиной нежизнеспособности таких культур. 5

Показано, что исследуемые культуры клеток содержат ген р53 дикого типа. Активность экзогенной DAP-киназы ассоциирована со стабилизацией уровня белка р53 в клетках-реципиентах.

Методом дифференциальной гибридизации выявлены новые гены, вовлеченные в метастазирование RSV-трансформированных фибробластов, в том числе несущих активную DAP-киназу.

Таким образом, получены уникальные модельные системы клеточных культур, несущих различные экзогенные последовательности и отличающиеся метастатическим фенотипом. Дальнейшие эксперименты с полученными линиями позволят пролить свет на механизм реализации v-src-и DAPk-опосредованной модуляции метастазирования в клетках RSV-трансформированных фибробластов. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

J Л Введение

Очевидные факты указывают на то, что онкогенез процесс многоступенчатый, обусловленный генетическими и эпигенетическими изменениями, вызывающими прогрессирующую трансформацию нормальной клетки в высокомалигнизированную. В самом деле, при анализе различных онкологических заболеваний в человеческой популяции выявляется от четырех до семи лимитирующих случайных событий, определяющих опухолевую прогрессию [Renan M.,J., 1993]. Патологоанатомический анализ пораженных органов подтверждает наличие промежуточных стадий превращения нормальной клетки в инвазивную опухолевую через стадию премалигнизации [Foulds, L. 1954]. Трансформация клеточных культур также многостадийный процесс. Так, для приобретения туморогенного потенциала крысиным клеткам требуется как минимум два искусственно вызванных генетических изменения. Ещё сложнее трансформировать in vitro человеческие линии [Hahn ИГ., et al. 1999].

Можно сказать, что онкогенез протекает подобно дарвиновской теории эволюции, т.е. «полезные» генетические изменения, дающие обычной клетке те или иные ростовые преимущества, ведут к прогрессирующему превращению ее в опухолевую.

Все без исключения злокачественные неопластические процессы характеризуются одним общим признаком - во время опухолевой прогрессии происходят изменения в нескольких регуляторных механизмах. К ним относятся: поддержание баланса между жизнью клетки и ее запрограммированной смертью (апоптозом), нормализация межклеточных коммуникаций, поддержание структурированности внеклеточного матрикса, регуляция ангиогенеза. При должном контроле за этими процессами клетка остается нормальной и не озлокачествляется. Более того, трансформирующаяся или метастазирующая клетка может быть элиминирована любой из этих регуляторных систем.

Очевидно, что для преодоления регулировочных барьеров, стоящих на пути трансформации клетки, ее физиология должна быть «отредактирована». В самом деле, опухолевая клетка отличается от нормальной шестью основными характеристиками злокачественности. Ими являются: автономия в отношении сигналов роста, нечувствительность к антипролиферативным сигналам, блокировка запрограммированной клеточной смерти (апоптоза), неограниченный репликативный потенциал, непрерывная индукция ангиогенеза, тканевая инвазия и метастазирование.

Однако, несмотря на общность злокачественных характеристик, опухолевые клетки обладают разной агрессивностью в отношении организма. И здесь уместнее говорить об уровне злокачественности клетки, подразумевая степень выраженности у неё вышеперечисленных признаков. Агрессивность опухоли в отношении организма заключается в метастатической активности её клеток. Из двух метастазирующих клеток успешней будет та, которая сумеет оторваться от опухолевой массы, инвазировать ткани организма-«хозяина», не погибнуть в кровотоке от апоптотических сигналов, посылаемых организмом, прикрепиться в новом месте и в условиях дефицита питательных веществ сформировать колонию-метастаз. У такой клетки все признаки злокачественности должны быть настолько выраженными, чтобы давать преимущества перед другими опухолевыми клетками, не сумевшими преодолеть регулировочных барьеров, выставленных организмом. Очевидно, эти преимущества должны быть следствием специфических генетических изменений, сопровождающих опухолевую прогрессию.

В настоящее время накоплено достаточно большое количество данных, касающихся генетических детерминант опухолевой трансформации. Намного меньше известно об генетических и биохимических факторах, связанных с метастатической агрессивностью опухолей, т.е. со стадийностью опухолевой прогрессии. Сейчас известно много групп генов, вовлеченных в формирование метастатического фенотипа злокачественной клетки. Данный обзор посвящен обобщенному описанию молекулярно-биологических аспектов метастазирования, известных к настоящему моменту.

К ВЫВОДЫ

1. В результате генно-инженерных операций получен набор векторных конструкций, содержащих различные фрагменты новых изоформ онкогена v-src, а также специфические мутации 3'- области.

2. Установлены мутации в С-концевой области онкобелка v-Src, влияющие на метастатический потенциал трансформированных им клеток.

3. Получена новая модельная система клеток, трансформированных вирусом Саркомы Рауса и несущих экзогенный ген DAP-киназы.

4. Показано, что продукция DAP-киназы коррелирует с утратой трансформированными клетками метастатической активности.

5. Показано, что с экспрессией гена DAP-киназы коррелирует модуляция активности некоторых ключевых сигнальных белков: усиливается фосфорилирование киназы фокальных контактов и МАР-киназ ERK1/2; снижается фосфорилирование адапторного белка She.

6. Показано, что белок р53 дикого типа в клетках с активной экзогенной DAP-киназой стабилизируется, что является свидетельством повышения их чувствительности к апоптотическим стимулам.

7. С помощью метода сравнительного скрининга транскрипционной активности (Atlas-hybridization) отобран ряд генов с дифференциальным уровнем экспрессии в клетках с различным метастатическим потенциалом. К генам, потенциально вовлеченным в процесс метастазирования, относятся ran, кодирующий цитоплазматический транспортный белок, и tbca, кодирующий шаперон бета-тубулина.