Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Новые изоформы онкогена v-src трансформированных клеток хомячка, отличающихся по уровню метастатической активности

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

ШТУТМАН МИХАИЛ СОЛОМОНОВИЧ

НОВЫЕ ИЗОФОРМЫ ОНКОГЕНА у-вгс ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ХОМЯЧКА, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО УРОВНЮ МЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

(Специальность 14.00.14 - Онкология)

На правах рукописи УДК 610.14-006-002.0

АВТОРЕФЕРАТ

•диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 1096

Работа выполнена о лаборатории регуляции оирусных и клоточных

онкогенов (руководитель - доктор биологических наук А.Г.Татосян)

Онкологического научного центра РАМН (директор • академик РАМН Н.Н.Трапазников).

Научный руководитель:

доктор биологических Наук А.Г.Татосян Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б. П. Копнин

доктор биологических наук Д А. Крамеров

Ведущее учренодение: НИИ Онкологии им. Н.Н.Петрова МЗ РСФСР

Защита состоится"

__ 1996 г.

на заседании специализированного Ученого совета (К.001.17.01) Онкологического научного центра РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе. 24).

С диссертацией можно ознакомиться о библиотеке ОНЦ РАМН. Автореферат разослан " ^ 100а г

Ученый секретарь специализированного Ученого совета доктор мед. наук, профессор В.С.Турусов

Общал характеристика работы

1 Актуальность проблемы

В настоящее время достигнут большой прогресс в понимании механизмов опухолевой трансформации. Обнаружено значительное количество генов, регулирующих трансформацию (онкогенов и антионкогенов). Показано, что многие из продуктов этих генов участвуют в путях передачи сигналов, регулирующих пролиферацию клеток и ответственных за рост опухоли. Значительно меньше исследованы гены, регулирующие метастатическую активность опухолей. Хотя роль онкогенов в активации метастазирования показана уже давно, механизмы этого процесса также изучены очень мало. Однако, наибольшая опасность злокачественных новообразований связана именно с их способностью к метастазированию. Поэтому как поиск новых генов, ассоциированных с метастазированием, так и исследование "метастатических" • свойств известных генов представляет значительный интерес.

Наиболее продуктивным подходом, в результате которого было выявлено и изучено большинство "генов метастазирования", является анализ близких по биологическим свойствам клеточных линий, отличающихся по способности к метастазированию. В результата такого анализа были клонированы новые гены, вовлеченные в процесс метастазирования, такие как пт 23, т(з 1 м некоторые другие, изучены различия в структура и уровнях экспрессии известных генов в высоко и низкометастатичоских клетках. Следует отметить, что в настоящее время известно офоничонноо число модельных систем клеточных линий со стабильно различающимися уровнями метастазирования, поэтому исследование новых систем представляет значительный интерес для понимания процессов метастазирования.

2 Цели и задачи работы

Целью данной работы являлось исследование возможных различий в структуре и уровнях экспрессии провируса, интегрированного в геном высоко и низкометастатических клеток хомячка, трансформированных вирусом саркомы Рауса (ЯБУ). Изучение возможного влияния этих различий на регуляцию метастатической активностм в трансформированных ЯвУ клетках.'

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить методом рестриктного картирования структуру провирусов, интегрированных в геном высоко и низкометастатических линий, сравнить уровни экспрессии провирусов в этих линиях.

2. Клонировать участки провирусов, в том числе и трансформирующий онкоген у-згс, из генома этих линий.

3. Определить нуклеотидную последовательность клонированных участков провируса, провести компьютерный анализ полученных сиквенсов.

4. Получить векторы, экспрессирующие онкоген у-агс из геномов высоко и низкометастатических линий. Получить стабильные клеточные линии, экспрессирующие эти векторы.

5. Изучить основные биологические свойства полученных клеточных линий, исследовать их тумурогенность, метастатическую активность и структуру внеклеточного матрикса, продуцируемого этими линиями.

3 Научная новизна.

В данной работе молекулярно биологически она :изировались низкометастатические (НЕТ-БЯ) и высокоме~зстатические (НЕТ-ЭРМ, НЕТ-БЯ-в, НЕТ-ЗМО) линии хомячковых эмбриональных фибробластов, трансформированных вирусом саркомы Рауса, которые были получены в лаборатории противоопухолевого иммунитета ОНЦ РАМН (рук. Г.И.Дейчман). Впервые было показано отличие рестриктной карты

интегрированного провируса в геномах высоко и низкометастатических линий. Клонированы две новые изоформы онкогена у-эгс. Показано отлично этих вариантов друг от друга и от всех исслодооанных в настоящее время вариантов онкогена у-згс. Впервые обнаружено вставка размером 60 н.л в уникальном домено клонированных у-згс вариантов. Клонированы и определена первичная нуклеотидная последовательность нотранслируемых областей РЭУ из генома низко и высокометастатических линий. В результата наших исследований показано, что трансфекция и последующая стабильная экспрессия варианта у-згс из высокометастатичоской линии (эгсНМ) приводит к активации метастатической активности реципиентной линии НЕТ-БР; исходно проявлявшей низкий уровень метастазирования; экспрессия эгс1.М (клонированного из генома низкометастатических линий) на влияет на уровень метастазирования этой линии. Следовательно, нами впервые показано, влияние структуры онкоболка у-згс на метастатическую активность опухолевых клеток.

4 НаучнО'Практичоскзп ценность работы.

Теоретическая значимость заключается в клонировании новых изоформ онкогена у-бгс, выявление зависимости между структурой онкогена у-бгс и метастатической активностью опухолевых клеток. Клонированные нами варианты онкогена у-згс позволят выявить роль С-концевпго домена у-згс в индукции трансформации этим геном, позволят определить новые механизмы активации метастазирования. Выявить новые клеточные субстраты згс-киназы, ассоциированные с метастатической активностью.

5 Апробация работы.

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместной конференции лабораторий регуляции вирусных и клеточных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза,

противоопухолевого иммунитета и цитогенетики НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Материалы работы докладовались и представлялись на 6 Международном симпозиуме по онкогенам (Ботезда 1990); на 2 Всесоюзном симпозиуме "Метастазирование злокачественных опухолей: новые подходы (Киев 1991); на XIX Европейской конференции по онкогенным вирусам (Майнц 1991);.на 3 конференции ААСЯ и ХА (Гавайи 1995); на Международной школе по регуляции клеточного цикла (Иерусалим 1995). По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

взобьем и структура работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 143 страницах машинописи и содержит 19 рисунков, 6 таблиц, 5 схем вг приложении и список литературы из 140 источников.

Содержание работы

1 Обзор литературы.

В обзоре литературы, включающем семь разделов, освещена роль факторов роста, внеклеточного матрикса и рецепторов, протеаз, онкогенов в регуляции метастатической активности опухолевых клеток. Описаны гены, специфические регуляторы метастатической активности.

2 Материалы и методы.

В работе были использованы следующие методы исследования: выделение плазмидной ДНК, ДНК бактериофагов, выделение геномной ДНК и РНК из клеток млекопитающих, электрофорез нуклеиновых кислот, блот-гибридиэация нуклеиновых кислот, получение радиоактивно меченных зондов, скрининг гене 1ных библиотек, молекулярное клонироеа. ие,

полимеразная цепная реакция, секвенированиэ нуклеиновых кислот, компьютерный анализ нукпеотидных последовательностей, трансфекция клеток млекопитающих, ' компьютерная морфометрия,

иммунофлуоресцентный анализ, определение туМорогенности и спонтанной метастатической активности опухолевых клеток.

В работе были использованы клетки сирийских хомячков, трансформированные > ЯБУ, полученные в лаборатории противоопухолевого иммунитета ОНЦ РАМН, отличающиеся по уровню метастатической активности. В качестве молекулярных зондов используются плэзмиды, несущие различные области генома ИЭУ.

3 Результаты

3.1 Анализ структуры и экспрессии интегрированных прооирусов е трансформированных клотках.

Для анализа интегрированного провируса геномную ДНК подвергали рестрикции эндонуклеазой ЕсоЯ! с последующей гибридизацией с плазмидой рАТ\/8, содержащей полный геном РЭУ. и ИИ-пробой. При гибридизации с плазмидой рАТ\/8 во всех анализированных линиях выявляются фрагменты 3.8 т.н.п, 3.1 т.н.п. и 2.4 т.н.п (см Рис. 1). Наличие этих фрагментов соответствует классической рестриктной карте ЯБУ и свидетельствует об интактности провируса как в высоко так и в низко метастатических линиях. Гибридизация с ИИ-пробой выявляет в каждой линии не болео четырех фрагментов. Вирусоспецифические фрагменты 2.4 и 3.1 т.н.п. выявляются во всех культурах.. Кроме того, во всех анализируемых линиях клеток было выявлено по два интегративных фрагмента. Поскольку каждой копии интегрированного провируса должно соответствовать два интегративных фрагмента, полученные данные позволяют предположить, что в геноме всех исследованных линий содержится по одной копии интактного интегрированного провируса ЯБУ.

Анализ провируса также проводили путем рестрикции эндонуклеазой ВатН1 и гибридизацией с ИЯ- и у-бгс пробами. Гибридизация с ИР-зондом выявляет в каждой линии по два фрагмента, специфичных для каждой культуры (см. Рис. 1 и Рис. 2). Наличие двух фрагментов подтверждает, что в геномах содержится по одной копии провируса. Специфичность размеров выявляемых интегративных фрагментов для каждой линии клеток указывает, что в исследованных линиях интегрирован в различные локусы генома клетки.

Структура интегрированного провируса

|LTR | 8'8 | pol [ cnv |

sic

ltr

t 1 tt t t t. t

ebbe в e de

При рестрикции геномной ДНК рестриктазой EcoR I (Е) образуются: три внутренних фрагмента - 3.6, 3.1, 2 4 т.н.п. два интегративных фрагмента.

При рестрикции геномной ДНК рестриктазой BamH I (В) образуются: два интегративных фрагмента в низкометастатической линии HET-SR два внутренних фрагмента -1.8,1.4 т.н.п.

в высокометастатических линииях HET-SR-1, HET-SR-8, HET-SR-10 tjjh внутренних фрагмента-4.3,1.8,1.4

В - дополнительный Вам Н I сайт, выявленный в высокометастатических линиях

Рис. 1 Структура интегрированного провируса в геноме низко и высоко метастатических линий

Гибридизация с у-згс-зондом в низкометастатической линии НЕТ-БЯ выявляет интегративный фрагмент 8 т.н.п, обнаруженный так же п.^и-гибридизации с ИЯ-пробой (см. Рис. 2). В тоже время пробой "-вгс, во всех высокометастатических линиях выявляется общий фрагмент 4.3 т.н.п. При гибридизации ИЯ-пробой данный фрагмент не обнаружен. Полученные данные. указывают на наличие в 3' конце генома провирусов, интегрированных в высокометастазирующие ли"ии, дополнительного ВатН! сайта (см. Рис. I). В 3' концевой части генома всех извбсгиых

штаммов РЭУ, а также в провируса, интегрированном □ геном линии НЕТ-Ват- Н1 сайт отсутствует. Таким образом, в результате рестриктного картирование нами были выявлены различия между провирусами, интегрированными в геном высоко и низкометастатических клеток.

А Б

1 2 3 4 1 2 3 4 ;

« I 23 I ? 4 I ■ ■ ■ ■■ ,>. |

— 23 I V*-* «— 0.6

\ «-9.4

\ ■'■й ¡ Ж .^ьГл) — 6.8 ««—4.4

4.3—► ^ ^ В

«—2.3 < * . ■ !. ''' ' -»-2.3 «— 2.0

■«—2.0 1 1 !

Рестрикция эндонуклеазой ВатН 1

1. НЕТ-Б!* 2. НЕТ-вМ А- Гибридизация с пробой У-ЭГС

3. НЕТ-вР-Ю 4. НЕТ-БР-в Б- Гибридизация с пробой ПК РЭУ

Рис. 2 Анализ структуры интегрированного провируса

Для точной локализации, обнаруженного ВатН! сайта, нами были амплифицированы и частично секвенированы участки 3' концов генома провирусов. Было показано, что дополнительный ВатН1 сайт локализован в 3" конце у-згс гена провируса, интегрированного в геном высокометастатических линий.

Экспрессия гена у-бгс анализировалась методом РНК-блоттинга и гибридизацией с у-егс-прабой. Количество РНК в пробах нормализовали по уровню экспрессии гена САРЭН. Анализ уровней экспрессии показал, что мРНК гена у-бгс в высокометастазирующих линиях НЕТ-БМ, НЕТ-БРИО несколько больше (в 1.2 и 1.7 раз), а в линии НЕТ-БЯ-в меньше в 1.2 раза, чем в низкометастазируюшей линии НЕТ-БР. Отсутствие корреляций между экспрессией гена у-эгс и метастатическим статусом исследуемых клеточных линий позволило нам предположить, что их метастатический потенциал, скорее всего, не связан с количественными различиями в экспрессии у-эгс генов.

Данные по рестриктному картированию и частичному сиквенсу 3' конца генома 1Ч8\/, показывают, что в геном высокометастатических линий интегрирован вариант РЭУ отличный от вируса, интегрированного в геном низкометастатической линии. Эти результаты дали основание предположить, что различия фенотипа изучаемых линий связаны с различиями в структуре онкогенов у-бгс. Анализ экспрессии гона у-егс в этих линиях, косвенно подтверждает данное предположэнио.

Следующим этапом нашей работы было клонирование генов у-бгс из ЯБУ-НМ (провируса ЯБУ, интегрированного в геном высокометастатических линий) Р?3\/-1_М (провируса (ЧБУ интегрированного" в геном низкометастатических линий), определение первичной нуклеотидной последовательности клонирс анных генов и последующий анализ этих последовательностей.

3.2 Конструироаанио и скринина геномных библиотек.

ДНК клеток линий HET-SR-8 и HET-SR были использованы для создания двух геномных библиотек.по сайту EcoRI, на основе вектора ЛдИО. В качестве зонда для скрининга использовался фрагмент гена v-sre. При скрининге библиотек HET-SR-8 и HET-SR было выделено по одному кпону, содержащему провирусные последовательности. Рестриктный анализ ферментом EcoRI полученных клонов и последующая гибридизация показали, что клоны содержат фрагмент размером 3.1 т.н.п, гмбридизующийся с v-src-пробой, что соответствовала фрагменту EcoRI провирусного генома, содержащему З'-конец гена env, v-вгс и большую часть U3 LTR (см Рис. 1)

Полученные участки провируса были субклонированы по EcoRI сайту в плазмиду pBluescript KS+. Плазмидные клоны в дальнейшем использовались для определения нуклеотидной последовательности клонированных участков генома провирусов..

Параллельно были создана также геномная библиотека HET-SR по EcoRI сайту на основе фазмидиого векгора pSL5.[40] Она скринировались пробой, содержащей LTR RSV. Из библиотеки HET-SR был выделен клон, содержащий EcoRI фрагмент размером 2.4 т.н.п. и гибридизующийся с LTR и gag пробами, что соответствовало фрагменту EcoRI провирусного генома, содержащему З'-конец U3 и U5 левого LTR, лидерную область и часть гена

gag-

Полученный фрагмент был субклонирован по EcoRI сайту в плазмиду pUC18.

Нуклоотидные последовательности НМ и LM вариантов онкогена v-sre были определены А.Г. Татосяном и Б.В.Яцулой. Сиквенсы гена gag и нетранслируемых областей RSV были получены нами.

3 3 Анализ первичной последовательности ненов у-ягс 1.М и НМ -вариантов

Нами было проведено сравнение полученных нуклеотидных последовательностей у-згс 1.М и НМ - вариантов как друг с другом, так и с v-&гс Я3\/ штамма БсЬггиси-Яиррт О. Этот штамм был выбран в качестве базового, так как особенности рестриктной карты провируса как 1-М и НМ -вариантов позволяли предположить, что они принадлежат или близки к штамму БЯ-О.

Сравнение последовательностей генов у-эгс-ЬМ и у-згс-НМ выявило, 18 различающихся нуклеотидных пар. Эти различия ведут к появлению 8 аминокислотных замен в кодируемых этими генами онкобелках. (см. Рис. 3).

Четыре из них локализованы в уникальном домене гена у-эгс. Это замены ТЬг-73 на аланин и РЬе-81 на лейцин НМ варианте, и замена ТИг-76 на аспарагин и А1а-98 на треонин в 1_М-варианте.

В киназном домене обнаруживается замена Азр-522 на глутаминовую кислоту в варианте 1.М.

1 100

àVr

200

300

M

unique

SH3

SH2

ATP

ins T>N A>T

"h VJ

5ГСНМ

M

unique

SH3

SH2

ATP

srcLM

400

I

500 V>M

J..JL

Kinase

D>E E>AV>de

Kinase

/

Рис. 3 Положение мутаций в белке srcLM и srcHM (ins - вставка 20 аминокислот, i - основные мутации, различающие srcLM и srcHM, del -делеция аминокислоты) На рисунке обозначены домены рр60,<гс: М -меристилируемый, unique - уникальный, SH2, SH3, АТР и Kinase - АТФ

связывающий и киназный участки каталитического домена, С - С-концнвой у-бгс специфичный домен.

Остальные замены были выявлены в у-эгс специфичном С-концевом домене. Это замена одного нуклеотида и делеция трех следующих за ним в 1.М варианте, что приводит к замена С1и-543 на аланин и делеции \/а1-544. Замена в на А в НМ варианте приводит к замене \/а1-541 на Ме1-541.

Интересно отметить, что в том же сайте, где выявлена нуклеотидная замена приведшая к возникновению дополнительного ВатН 1 сайта в НМ варианте (С на Т), есть замена и в ЬМ варианте (С на А). Эти нуклеотмдные • замены ведут к появлению аминокислотных различий только в варианте эгс1.М.

В четырех случаях из восьми различающиеся в НМ и 1.М вариантах аминокислоты принадлежат к одной группе (по матрице гомологии аминокислот) и поэтому вероятно не влияют на функции у-бгс белка (позиции 76, 81, 522, 541). Остальные различия более существенны и их влияние на различие в биологических свойствах у-эгс вариантов более вероятно. Это замены треонина 73 на аланин и аланина 98 на треонин в ( уникальных доменах НМ и 1М вариантов соответственно. Замена глютаминовой кислоты 543 на аланин и делеция валина 544 в 1.М варианте (см Рис. 3).

Наиболее интересными нам представляются мутации в С-концевом доменб, так как этот регион консервативен у всех известных в настоящее время вариантов у-вгс. Треонин - аланиновые замены в уникальном районе могут привести к изменению фоссЬорилирования у-эгс. Однако :ужно отметить, что замещенные треонины не принадлежат к известным сайтам фосфорилирования (Т1тг 34, 46).

Нами также были обнаружены мутации, общие для НМ и 1.М вариантов и отличающие их не только от РЭУ ЗсЬггнсК-Рирр1п О но и от всех секвенированных в настоящее время генов у-эгс.

Наиболее интересной особенностью обоих вариантов у-згс явилось присутствие в последовательности, соответствующей уникальному домену Бгс ОС-богатой вставки длиной 60 н.п, дающей в рамко.считывания у-огс 20 аминокислот, в основном, аргинина, аланина, сорина и пролина (см. Рис. 4). Интересно, что данный аминокислотный мотив содержит консенсусный сайт фосфорилирования протеинкиназы С. Нуклеотидная вставка содержит на концах короткие инвертированные (ЭСССС - ССССС) и прямые (вСОССС - вСОССС) повторы, что. по всей видимости, позволяет отнести её к микротранспозонам Происхождение вставки остается неясным, хотя сходные последовательности, по данным гибридизации, встречаются в геноме кур. Компьютерный анализ выявил гомологию последовательности вставки с нетранслируемой зоной гена Ьсг, однако эта гомология может объясняться обогащением ОС парами этих участков.

ВстШа _^8ГС!

«С9 Thr

■«ф

усд ccg ctc ecc gccgcg ccccgc age t eg eye cgc ccg ccg get tet cagcaccgcgcc MaProI.euThijAlaA) a Pro Arg Set S«r AtgAtg ProProAleSeijGlnHlaArgAla

Сайт фосфорилироаамил протеиюшазы С Вставка

8ГС -——-, г-----—=4*. его

дел Ма

acGjGCGCcgctca сасс

н-—* '

tgCCSGSgogagt gtgg

-' Инвертирований повтор Í_Прямой повтор

Рис. 4 Структура вставки в v■src

Нами было выявлено 16 нуклеотидных гаман, идентичных в обоих вариантах и отличающих их от v-src штамма RSV-SR-D. В десяти случаях эти мутации оодут к аминокислотным заменам.

В уникальном домено это замены Glu 62 (ere SR-D) Gly 82 (arc HM и LM) и Gly 87 на аргинин 97.

Одна аминокислотная замена обнаруживается d SH2 домена о обоих вариантах: Glu-160 заменой на глицин 180. Влияние данной замены на функцию SH2 домона неясно, хотя известно, что далоции у v-erc а.о. 155157 и 161-163, окружающих сайт Glu-160, ослабляют эффективность трансформации куриных эмбриональных фибробластов.

Насколько аминокислотных замен обнаруживается о киназном домэно. Это Gin 318 на аргинин 338, Аар-348 на асларагин 388, Val-399 на глутаминовую кислоту 419, Ио-426 на аланин 448 (в результате дьийной замены в одном кодонэ - АТС на GCC,), А1а-434 на глицин 454 и Met 481 на валин 481. Указанные мутации не затрагивают функционально важных консервативных последовательностей, крома зомены в сайта 428, рядом с которым расположен мотив Ala-Pro-Glu (положения 430-432) консервативный в протаинкиназах. как тирозиновой, так и серии-троонинооой специфичности.

Как видно из проведенного оыша анализа v-erc НМ и LM значительно отличаются от "классического" RSV-SR-D. Поэтому нам интересно было определить филогенетическое положение клонированных гоноз. Для этого был проводен кластерный анализ как клонирооанных оариантоа онкогена v-егс, так и . йотранслируомых областей RSV. Частота мутаций нотранслируомых областей выше чем v-src, поэтому их анализ позвопяет точнео определить систематическое положение изучаемых провирусов.

3.4 Класторный анализ томов vsre.

Дня выяснения эволюционного положения выделенных вариантов о семействе известных штаммов RSV произведено множественное

выравнивание онкогенов v-src,. Для этого из EMBL-банка были взяты последовательности RSV кластера Schmidt-Ruppin (SR): SR-A вариант San-Francisco (SRA-SF), SR-A вариант Mew-York (SRA-NY), SR-B (SRB), SR-Btd ((дефектный по трансформации) (SRBtd), SR-D (SRD), SR-E (SRE), rASVtd1441 (возвратный мутант дефектного no трансформации td1441, производного штамма SR-A вариант New-York), куриный c-src без интронов; кроме того, были взяты последовательности штаммов кластера Pragüe: Рг-А (PRA) и Pr-c (PRC); а также штаммов Bryan high titer (ВН), Bratislava 77 (В77) и RSV-29.

С помощью программы "Multiple Alignement with Hierarchical Clustering" построено множестве! чое выравнивание имеющихся последовательностей разных вариантов RSV. На основе полученного выравнивания был произведен кластерный анализ методом кладистической парсимонии. Результаты кластерного анализа представлены на дендрограмме (Рис. 5).

Как видно из Рис. 5., анализируемые LM и НМ варианты v-sro по наличию четырех весьма характерных мутаций, две из которых находятся в одном кодоне (они отсутствуют у SRA(SF)), можно однозначно отнести к "нью-йоркскому" кластеру штамма SR, включающему изоляты SRA(NY), SRD, SRE, причем наиболее близок к LM и НМ оказывается SRD. Очень большое количество мутаций, уникальных для LM и НМ, очевидно говорит о том, что они претерпели гораздо большее число пассажей после точки расхождения, чем остальные вирусы этого кластера. Дендрограмма no v-src весьма сходна с аналогичной, составленной S.Reddy et al.(1990).

Предпринятый анализ показывает, что выделенные варианты прсвирусов относятся к кластеру штамма Shmidt-Ruppin.

■ РЯА

19

■ РЯС

■ В77

20

«—— ЭИЕ

•ВН

6

13

эисим

10

■висш

9

Рис. 5 Кластерный анализ генов у-эгс разных штаммов методом парсимонии. Цифры соответствуют числу отличающихся мутаций. Индекс соответствия 96%.

Вывод о принадлежности исследуемых вариантов к кластеру штамма ЗИтМ-Яиррт подтверждается результатами кладистического анализа натранслируемых областей РЭУ, фланкирующих у-згс, а также из часто

Как мы уже писали выше, анализ последовательностей у-згс НМ и ЦИ выявил мутации, отличающих эти белки друг от друга. В четырех случаях различающиеся аминокислоты принадлежат к разным группам и, возможно, могут влиять на биологические свойства онкобелков, в том числе и на метастатическую активность трансформированных этими генами клеток (подробнее см. Рис. 3). Для проверки данного предположения было необходимо исследовать биологическую активность клонированных генов. Нами были сконструированы векторы, экспрессирующие агсНМ и згс!_М. .Этими векторы были грансфицирооаны в низкометастатическую линию НЕТ--Я, были отобраны клоны, содержащие эгсНМ или 8Гс|_М

соответственно. Далее было необходимо определить биологические свойства полученных культур.

А рВ1иеэкг1рМЗ

ENV

LTR IC10

——

SA

SRC

pBluoskrlptKS ф

из

ti 11 EcoRI Neo I Мае I Neo I

1 t t (BamHI)Uaal

EeoRI

SA

SRC

1 1 Xbal Ncol

] I

(BamHI) Xbal

plC10

SA

Neor

LTR

--- IC10

1 П 1

ЕеoR I BemH I Xba I Neo I

pBiuescriptKS

SA - сллайс-акцепторный сайт

(BamH I) сайт рестриктазы BamH I есть только в arc НМ варианте

' 1

EcoR I \

pBiuescriptKS

Рис. 6 Схема получения экспрессирующих векторов.

3.5 Получения жспроссирующих оокторов.

Для анализа биологических свойств клонированных v-src вариантов нами были получены экспрессирующие векторы на основе плазмиды р1С10

Из плазМид pBS НМ и pBS LM, рестриктазой Мае I был выделен фрагмент 2.2 т.н.п., содержащий ген v-src и 3' конец гена env,(cM. Рис. 6). Липкие концы были "затуплены" фрагментом Кленова ДНК полимеразы I, затом к ним были пришиты линкеры для рестриктазы ХЬа I. Полученный фрагмент был обработан рестриктазой Xba I и клонирован □ вектор рЮЮ, обработанный той же рестриктазой. Ориентацию клонированных последовательностей определяли расщеплением рестриктазой Neo I. В клонах с правильной ориентацией выявлялся-Neo I фоагмент 2.5 т.н.п.

З.в Получение src-трансфоктантаа.

В экспериментах по трансфекции в качестве реципиентной линии была использована низкомвтастазирующая линия HET-SR. Векторы р1С10-LM и р1С10-НМ, содержащие v-srcLM и v-srcHM соответственно, ток же как "пустой" вектор, содержащий только ген пво, были трансфицировены в клетки с помощью стандартной методики кальций фосфатной трансфекции.

После трансфекции нами был отобран ряд клонов, в которых была проанализирована структура интегрированного в геном вектора. В дальнейшем анализе использовались клоны, содержащие интактный интегрированный вектор. Это линии HET-LM-7, 8, 11, 14; и НЕТ-НМ-11, 12, 13; содержащие интактные копии plC10 LM и plC10 НМ соответственно. В качестве контрольных культур использовали линии HET-IC-14 и 16, в которые был введен вектор р1С10 без вставки

3.7 Анализ биологических свойств кг "точных линий In vitro.

Для отобранных клеточных линий были определен ряд биологичаских свойств, которые, возможно, коррелируют с метастазированием in vitro.

Анализ таких биологических свойств, как время удвоения клеток, зависимость роста от сыворотки, колониеобразующая, активность, способность к росту в полужидком агаре не выявил различий меноду высоко и низко метастазирующими линиями. Как высоко так и низко метастазирующие линии сильно туморогенны, поэтому отсутствие различий по этим тестам неудивительно.

Изменения в внеклеточном матриксе, и, в частности, уменьшение количества фибронектина часто коррелирует с метастатическими характеристиками клеток. С другой стороны, известно, что трансформированные клетки обычно утрачивают фибронектин. Поэтому мы исследовали полученные клонг по этому параметру. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ, с помощью кроличьих поликлональныи антител к фибронектину, в родительских и дочерних линиях показал, что все клоны практически не образуют фибронектиновых фибрил в разреженных культурах. Однако мы обнаружили стабильны^ различия в количестве и структуре фибронектина в конфлюентном монослое культур. В исходной низкометастазирующей культуре НЕТ-БИ фибронектин присутствует в большом количестве и образует множество тонких длинных фибрилл, уложенных в редкую, но структурированную сеть под большинством клеток. Его количество значительно уменьшается в ягсЬМ-трансфицированных линиях, но примерно под 50% клеток сеть остайтся структурированной. В исходной высокометастазирующей линии и згсНМ-трансфицированных клонах фибронектин обнаруживается в виде редких коротких фибрилл под очень небольшим количеством клеток.

Таким образом, из полученных данных следует, что эффект исчезновения фибронектина связанный с трансфекцией у-бгсНМ в линию НЕТ-БИ , и такого исчезновения не происходит при трансфекции у-згс1-М в эту же культуру, т.е. пол»ченные различия, вероятно ассоциированы с различиями в изоформах у-бгс .

4 Анализ мэтастатичоской активности культур.

Исходные оысоко - и низкометастазирующие культуры, также как и некоторые из полученных НЕТ-1.М и НЕТ-НМ клоноа анализировались на наличие спонтанной метастатической активности. Каждая культура вводилась 10 - 15 сирийским хомячкам. Результаты эксперимента приведены на Рис. 7

. Клеточные линии, содержащие эгсНМ (НЕТ-НМ-11 и НЕТ-НМ-13) проявляют большую метастатическую активность, чем исходная линия НЕТ-БЯ. У половины инъецированных животных через два месяца посла появления первых опухолей было обнаружено болеё 50 метастазов а легких. Кроме того, у 30-35 % животных было обнаружено 100-200 метастазов в легких. И только у 20% животных выявлено менее 10 метастазов в легких, (см Рис. 7)

В то же время у 60 - 100% животных, которым были введены клеточные линии содержащие вгсЬМ (НЕТ-1М-7, НЕТ-1.М-14), было обнаружено 10 и менее метастазов в легких.

Данные результаты показывают, что метастатическая активность клеточных линий, содержащих згсНМ существенно выше, чем у родительской линии НЕТ-БР и линий содержащих эгсЬМ.

Таким образом, полученные результаты подтверждают наша предположение о влиянии выявленных различий меяоду у-згсНМ и у-згс1.М на метастатическую активность трансформированных этими генами клеток.

В заключении следует отметить, что в результата наших исследований получена клеточная система хомячковых эмбриональных фибробластов, различающихся по уровню метастазирования. Впервые для подобных систем показано, что уровень метастатической активности коррелирует со структурой онкогена у-эгс.

воч вон

404

204 оон

HET-SR

60«

- 40«

M 10«

Л Г7-1 ,.

100% воч воч 404

204 Ü04

HET-SR-8

40«

еоч

i

100«) воч воч 40» 204 004

1004,

воч воч

404

204 004

HETLM-7

904 30%

^ 204

I—, 104 10«

■ILJimmmn -

HF.TLM-14

20«

1004, В04 604 404 204 ООН

1004 ВОЧ 604 404 204 00%

НЕТНМ-13

90« 254

Г" I нет метастазов ЩЩ|[] 51-100 метастазов КЗ 1-10 метастазов flRil 101-200 метастазов

11-50 метастазов ИИ болев чем 200 метастазов

Рис. 7 Анализ метастатической активности трансформированных клеточных линий

Выводы

1. Описаны новые июформы онкогена у-згс в состава провирусоа, интегрированных в геном высоко и низкометастазирующих клеток сирийского хомячка, трансформированных вирусом саркомы Рауса^БУ).

2. Получены гонноинженерные клоны, содержащие 3' концы генома провирусов, определена нуклеотидная последовательность нетранслируемых участков.

3. Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей новых вариантоо гона у-згс и нетранслируемых областей генома РЭУ. Выявлены уникальные различия между генами у-егс, клонированными из ДНК высоко и низкометастатических линий клеток (згаНМ и огс! М), и онкобелками, кодируемыми этими генами

4. В результате трансфекции векторов, содержащих агсНМ и агс1М, в низкометастазирующие клетки НЕТ-БР получен ряд клональных вариантов клеток, экспрессирующйх указанные гены.

5. Спонтанная метастатическая активность линий, экспрессирующих егсНМ значительно выше, чем линий, экспрессирующих вариант онкогена у-вге, зонированный из интефированного в геном низкометостетической линии провируса ЯЭУ (егс1.М)

0. Линии, экспрессирующие егсНМ, продуцируют значительно меньще внеклеточного фиброноктина, чем вгс1М экспрессирующие линии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. TatosyanA, Topol L., Deichman G., Kisseljova N.. Shtutman M., Musatkina E., Kisseljov F., Papas T. "RSV transformation hamster cells: interaction between exogeneous oncogene." Sixth Annual Meeting on oncogenes. 6,394,1990

2. Штутман M.C., Мусаткина E.A., Татосян А.Г. Сайты интефации вируса саркомы Рауса в геноме трансформированных клеток хомяка с различной метастатической активностью. Материалы II всесоюзного симпозиума:. Метастазирование злокачественных' опухолей: новые подходы. Киев, 1991, стр 124.

3 Shtutman M.S., Musatkina Е.А., Tatosyan A.G. Integration sites of Rous sarcoma virus genome in high and low metastatic transformed humster cell8.Abst.XIX Meeting European tumo, virus group. Mainz.,1991, p.2S9

4. Kisseljova N.P., Shtutman M.S., Musatkina E.A., Topol L.Z., Tatosyan A.G.-Supression of viral genome expression after N-ras transfection into RSV transformed humster cells. Abst.XIX Meeting Europoan tumor virus group, Mainz.,1991, p.200-201

5. Topol L., Kisseljova N.. Gutierres L., Deichman G., Musatkinp E„ Shtu .nan M., Zakamaldina Т., Blair D., Tatosyan A. Modulation of pp60v-src and pp60c-src expression in RSV transformed hamster fibroblast transfected with activated N-ras. Molecular Carcinogenesis, 1993, v 8, p167-176.

6. Shtutman M., Yatsula В., Moinova E., Kaverina I., Dezelee Ph., Calothy G., Tatosyan A.. New isoformsof v-src oncogene, isolated from high and low metastatic cells:comparative analysis of structure and activity. Clinical^ Experimental metastasis, v 12, 59-60,1994

7. Красильников M.A., Шатская B.A., Штутман M.C. Регуляция цикла обращения фосфолипидов в фибробластах хомяка, трансформированных онкогенами v-src и N-ras. Биохимия, 1994, т 59, вып 11, стр 1766-1773

8. Tatosyan A G, Shtutman М, Musatkina Е, Kaverina I, Mizenina О, Calothy G. New isoforms of v-src oncogene isolated from low and high metastatic cell" structure and activity. Third Congress of AACR and JCA, Mol.Biol of Cancer, Hawaii 1995, 21-22

9. Tatosyan A.G, Yatsulo B, Shtutman M, Moinova E, Kaverina I, Musarkina E, Leskov K, Mizenina O, Calothy G, Dezelee Ph. Two novel variants of v-src oncogene isolated from low and hiah metastatic RSV-transformed hamster cells. Virology, 1996 (r v 216, p 347-456