Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Значение экспрессии аденовирусных онкогенов в поддержании злокачественного фенотипа клеток

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при транефекции клеток линии NIH/3T3 онкогеном обезьянего аденовируса SA7 [263 так же, как и при транефекции культуры эмбриональных фибробластов интактной ДНК этого вируса С 253, происходит полная трансформация клеток. Клетки, трансформированные онкогеном вируса SA7 - линия G11 - приобретают ряд фенотипически независимых признаков в культуре, типичных для аденовирусной трансформации. При сравнении с исходной линией MIH/3T3, в полученной линии 611 отмечены: а) морфологические изменения, в результате которых клетки из фибробластоподобных стали эпителиоидными, приобретя округлую форму; б) увеличение плотности роста и возникновение очагов многослойного роста, что свидетельстует об отсутствии контактного тормо

НМл\ в) появление способности расти в полужидких средах,, что указывает на утрату потребности в прикреплении и распластывании на твердой поверхности; г) появление способности к размножению в среде с низким содержанием ростовых факторов.

По степени злокачественной трансформации клетки G11 можно, согласно классификации A. Lewis и J.Cook [1183, отнести к четвертой группе - их введение приводит к появлению опухолей у новорожденных и взрослых аллогенных (мыши линии А) и ксеногенных (крысы) реципиентов.- Следует, однако, отметить, что у всех взрослых мышей опухоли, индуцированные клетками 011, регрессировали.

Опухоли• вызванные введением клеток S11 крысам, метастазирова

- 96 ли в 10 -75% случаев, в зависимости от возраста реципиентов и количества инокулированных клеток. По данным экспериментального метастазирования, частота в популяции -G11 клеток с метастатическим потенциалом составляет bxio w .

Изучение фенотипичееких характеристик, позволяющих судить о чувствительности клеток к различным зффекторным механизмам противоопухолевой резистентности организма, показало., что при трансформации онкогеном вируса SA7 эти характеристики изменяются неоднозначно, Так, клетки 011 не индуцируют ЦТЛ ни при аллогенной, ни' при ксеногенной трансплантации. По-видимому, в этих клетках, как и при трасформации. .Ад12. [80, 1653, происходит подавление экспрессии антигенов класса I ГКГС, обусловленное функционированием области НА вирусного генома,

Клетки G11 высоко, резистентны к цитотоксическому действию ЕКК, действие на эти мишени ЛАКК зависит от продолжительности инкубации последних с интерлейкином-2. К ЛАКК^ клетки G11 высоко резистентны так же,, как и к ЕКК), к действию ЛАККд - чувствительны, но, в то же время, эта чувствительность ниш, чем у клеток контрольных линий: К562, SH2-1 и L929, Различия результатов, полученных с ЛШЦ и ЛАНКй , по-видимому, связаны с гетерогенностью популяции лимфокинактивированных клеток. Известно, что на ранних стадиях активации ИЛ-2 эффекторными клетками, ответственными за лизис чувствительных клеток-мишеней, являются ЕКК, а при более длительном культивировании с ИЛ-2 цитотоксичность ЛАКК опосредуется ЦТЛ [63,

По чувствительности к действию гранулярных цитотоксических белков субпопуляций ЛАКК [283 клетки 811 существенно не отличаются от контрольных клеток-мишеней, аналогичных. названным выше. Отсутс

- 97 теуют такт достоверные различия между клетками 811 и иммортализо-ванными фибробластами SH2-1 по чувствительности к дитотоксическому фактору макрофагов.

Ив литературы известно, что при трансформации онкогенным аденовирусом из другой группы - Ад12 (или его онкогеном) подавляется экспрессия антигенов класса I главного комплекса гистосовместимости 171I трансформированные клетки приобретают устойчивость к ЕКК и резидентным макрофагам, однако эффективно лизируются ЛАК-клетками и активированными макрофагами [70, 108],

Сравнение этих данных с полученной нами характеристикой клеток линии G11 показывает, что фенотипические свойства опухолеродных клеток, определяющие чувствительность к специфическим и неспецифическим противоопухолевым реакциям, при трансформации онкогенными аденовирусами разных групп принципиально совпадают.

Механизмы формирования таких свойств, степень участия при этом вирусных и клеточных генов требуют дальнейшего изучения, Тем не менее, на основании уже имеющихся данных можно полагать, что при трансформации как Ад12, так и SA7 для развития устойчивости трансформированных клеток к противоопухолевым реакциям организма достаточно интеграции и функционирования области Е1, Учитывая сведения об основных ранних белках, кодируемых этой областью генома, следует, видимо, согласиться с мнением, что анализируемый фенотип реализуется при экспрессии Т-антигенов аденовирусов С1171 за счет их ре-гуляторной активности в отношении клеточных генов и/или посттранскрипционных механизмов контроля [41, 177]. Целесообразно отметить,, что в опухолеродных клетках, трансформированных обоими онкогенными аденовирусами, более существенно изменяются мембранос

- 98 вязанные характеристики (реакция "клетка на клетку"), чем внутриклеточные (реакции "цитотоксический фактор на клетку").

Оценки значения описываемых феноменов для онкогенности аденовирусов противоречивы. По данным одних авторов [143, 165], низкий уровень экспрессии антигенов класса I ГКГС в трансформированных Ад12 клетках мышей вносит определяющий вклад в их способность индуцировать опухоли у сингенных и аллогенных иммунокомпетентных животных. По данным других авторов С 71, 140, 1451, основное значение для онкогенности Ад12 имеет уровень чувствительности трансформированных им клеток к ЕКК-и макрофагам. Полученные нами данные о фенотипичес-ких свойствах клеток линии G11 и особенностях опухолевого процесса, индуцированного этими клетками у реципиентов разных групп, свиде-тельстует в пользу второй точки зрения.

Учитывая, что снижение экспрессии- антигенов класса I ГКГС (хоть не столь регулярное и выраженное) и/или чувствительности инфицированных клеток к ЦТЛ описано не' только для онкогенных аденовирусов, но и для вирусов других групп и семейств [29, 111 3, способных формировать персистентную инфекцию, можно предположить, что этот Феномен не связан специфически со злокачественной трансформацией, но обеспечивает сохранение зараженных клеток (персистенцию вируса) в организме хозяина. Для проявления опухолеродности и метастатической активности трансформированных вирусами клеток значима, видимо, в основном (как и при спонтанной трансформации) чувствительность к действию факторов естественной резистентности организма.

Ревертантная линия А5, полученная [24] .в результате обработки клеток:. 611 полиалкилирующими производными коротких однотяжевнх по-линуклеотидов, комплементарных области 11 (онкогеннаправленного му

- 99 тагенеза in vivo), характеризуется частичной реверсией культураль-ных признаков трансформации, изменением ряда основных параметров роста при перевивке животным и фенотипических свойств, определяющих чувствительность к противоопухолевым реакциям организма.

Клетки А5 сохранили иммортализованный фенотип, однако по сравнению с линией Gil их культуральные свойства изменились, В частности, . наряду с зпйтеджшдными в линии А5 встречаются фибробластопо-добные клетки, отсутствуют очаги многослойного роста, снижены плотность роста и способность к росту без прикрепления к субстрату, В отличие от клеток G11, клетки А5 нуждаются в сывороточных факторах роста и адгезии, Клетки А5 по ростовым характеристиками in vitro занимают промежуточное положение между фибробластами NIH/3T3 и полностью трансформированными клетками Q11.

Несмотря на реверсию ряда ростовых характеристик, клетки А5 сохранили опухолеродную активность. Однако по большинству параметров роста in vivo они менее злокачественны, чем клетки G11, Значительно (в 5-25 раз) возрастает 0МДргП для аналогичных групп реципиентов, Увеличивается частота регрессии опухолей: 100% у мышей (независимо от возраста реципиентов), 35,3-50,0% у взрослых крыс, Существенно снижается метастатическая активность. Спонтанные метастазы опухолей, индуцированных клетками А5, наблюдали не только суя ирственно реже (у 30% взрослых крыс, инокулированных по 10й клеток), но и в достоверно более поздние сроки (на 61,7- 3,0 сут, в аналогичной группе животных, индуцированных клетками G11 - на 23,30,3 сут), По данным экспериментального метастазирования, частота клеток с метастатическим потенциалом в популяции А5 в 20 раз ниш, чем в популяции G11,

- 100

У клеток А5 наблюдается также реверсия фенотипических свойств, определяющих чувствительность к противоопухолевым реакциям организма, В отличие от клеток 011, клетки А5 способны индуцировать ЦТЛ Очевидно, подавление экспрессии адёноонкогена привело к нормализации экспрессии антигенов класса I FKPC.

Кроме того, клетки А5 достоверно более чувствительны к цитотоксическому действию ЕКК, ЛАКК1 и ЛШЦ , чем клетки 811. Чувствительность к действию щтотокснческих факторов ЛАМ и макрофагов существенно не изменилась.

Таким образом, онкогеннаправленный мутагенез in vivo клеток, трансформированных онкогеном аденовируса SA7, привел к реверсии основных культуральных признаков, изменению ряда основных параметров роста при перевивке животным, а также к реверсии части фенотипических свойств клеток, определяющих чувствительность к противоопухолевым реакциям организма. Из последних ревертировали именно те, которые являются наиболее характерными для трансформации высошонкогенными аденовирусами: резистентность к ЕКК и их производным СЛАКК^ ) и отсутствие индукции ЦТЛ, связанное со снижением экспрессии антигенов класса I ГКГС.

В то же время, как и при спонтанной реверсии клеток, трансформированных .аденовирусами [79, 110], полная нормализация фенотипа отсутствовала, что суммарно проявилось в сохранении опухолеродной активности.

Полученные данные показывают, что для сохранения далеко не всех свойств трансформированных клеток требуется постоянная экспрессия интегрированных вирусных последовательностей. Злокачественный фенотип (или программа его реализации), очевидно, может сохра

- 101 няться за счет изменения функционирования клеточных генов,

Учитывая, что подобные наблюднения сделаны и на клетках, трансформированных другими онкогенными вирусами, включая клетки, где продемонстрировано полное исчезновение вирусных последовательностей, инициировавших трансформацию [89, 111, 1553, можно предположить, что вирусная этиология злокачественных новообразований встречается, по-видимому, чаще, чем это можно выявить доступными сегодня методами,

Отдельного анализа заслуживают результаты изучения особенностей опухолевого процесса, индуцированного клетками G11 и Ао у животных разного возраста и вида, Поскольку было показано, что клетки G11 не индуцируют ЦТЛ, т, е, не способны вызывать специфический иммунный ответ организма, большее внимание следует уделить возрастным и видовым особенностям естественных противоопухолевых реакций исследованных нами реципиентов (крыс и мышей),

Известно, что у новорожденных животных обоих видов (возраст до 1 недели) практически отсутствует активность естественных киллеров, активность макрофагов низка [30, 31, 122, 1453, Функционирование обоих зффекторных механизмов существенно повышается на третьей неделе жизни, достигая максимума к концу первого месяца [30, 122, 1453.

Исследованиями, проведенными в кашей лаборатории, выявлена аналогичная возрастная динамика активации лимфоцитов мышей ИЛ-2 и продукции мышиными ЛАКК цитотоксических факторов, У крыс, независимо от возраста, индукция ЛАКК и, соответственно, продукция ими цитотоксических факторов крайне низки, что является видовой особенностью этих животных. Таким образом, при трансплантации -1 no

J. U&j трансформированных клеток у взрослых мышей могут реализоваться специфические иммунные реакции и полный спектр реакций естественной противоопухолевой резистентности; у крыс реакции естественной резистентности дефектны - отсутствует индукция ЖКК - клеток, которые, как известно, могут лизировать даже мишени, резистентные к ЕКК С 30].

Сопоставление спектров противоопухолевых реакций у мышей и крыс, динамики опухолевого роста, индуцированного у зтих животных клетками G11 или А5, и, наконец, фенотипических свойств этих клеток, показывает, что "ранняя" регрессия опухолей, индуцированных клетками G11 у-взрослых мышей, обусловлена, очевидно, . действием ЛАЕК и их цитотоксйческнх факторов. Дефектность по этому механизму (крысы) приводит к прогрессивному опухолевому росту. Феномен регрессии опухолей, индуцированных клетками А5, может обусловливаться разными механизмами, "Ранняя" регрессия у мышей связана, видимо, с действием преимущественно естественных факторов противоопухолевой резистентности; в "поздней" регрессии у крыс, очевидно, более значима роль специфического иммунного ответа.

Прогрессивный рост опухолей, индуцированных клетками Q11, у новорожденных реципиентов обоих видов обусловлен недостаточностью противоопухолевых реакций, имеющей возрастной характер,

Известно, что'при некоторых условиях взаимодействие между системой противоопухолевой резистентности животного-реципиента и трансформированными клетками может привести к селекции последних и формированию высокозлокачественного клона С 9], Анализируя данные о характере роста in vivo клеток Gil и А5, можно заключить, что в тех случаях, когда реципиентами являлись животные со сниженными проти

- 103 воопухолевыми реакциями (новорожденные мыши, крысы и часть половозрелых крыс), селекция злокачественных вариантов трансформированных клеток была незначительной. Ба это указывает тот факт, что все эти животные погибали от первичных опухолей при отсутствии метастазиро-вания. В случае, если реципиентами являлись животные, ,способные развивать реакции, являющиеся фактором отбора (крысы в возрасте более одного месяца), происходит селекция, которая проявляется в появлении у таких животных спонтанных метастазов.

Существование такой селекции показано и прямым образом при исследовании культур клеток, зксплантированных из организма-опухоле-носителя. При эксплантации клеток из организма животного, у которого противоопухолевые реакции еще не полностью сформированы (на 19 сутки жизни) и, следовательно, не могут оказывать селективное действие, фенотип таких клеток не отличается от исходного фенотипа клеток, вызвавших опухолевый рост, В случаях, когда опухоли были зкс-плантированы из иммунокомпетентных организмов, их клетки оказывались селектированы по такому признаку, как резистентность к перекиси водорода. Более того, в результате селекции эксплантиро-ванные клетки приобретают более злокачественный фенотип, как было показано в опытах in vivo.

Сопоставление приведенных результатов показывает, что: . 1. Бри многостадийной трансформации (а трансформация, вызван ная аденовирусами и преобладающим большинством канцерогенных факторов различной природы, является имеено такой) клетки трансформированного клона имеют перспективу роста in vivo, если совпадают чувствительность клеток к определенному (определенным) эффекторному механизму естественной противоопухолевовй резистентности организма

-. 104 и недостаточная эффективность именно этого механизма в организме- хозяине,

2. При реализации противоопухолевых реакций организма действие отдельных эффекторных механизмов является взаимозаменяемым, • и элиминация трансформированных клеток может быть обеспечена и при действии отдельных факторов. Аналогичная закономерность имеет место и-в реализации резистентности организма к инфекционным заболеваниям [351,

3. В возникновении в трансформированном клоне клеток с метастатической активностью важную роль играет селективное давление со стороны системы естественной резистентности организма.

- 105