Автореферат и диссертация по медицине (14.03.11) на тему:Токсикологическая характеристика новых стимуляторов роста растений павстима и экостима

ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ и токсикологии АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК УКРАИНЫ

На правах рукописи УДК 615.9:632+576.3

СТРАТУЛАТ Татьяна Григорьевна

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ СТИМУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ ПАВСТИМА И ЭКОСТИМА

14.03.11 - Токсикология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев -1996

Работа выполнена в Государственном научно-практическом Центре Гигиены и Эпидемиологии МЗ Республики Молдова

Научный руководитель - кандидат медицинских наук,

с.н.с. А.Ф.Василос

Научный консультант -, доктор медицинских наук,

профессор К.И.Спыну

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук профессор Максимов Юрий Николаевич

- кандидат медицинских наук

с.н.с. Кирсенко Виктор Владимирович

Ведущая организация - Институт здоровья им. Л.И.Медведя

МЗ Украины

. Защита состоится "¿6' И^ерЯ 1996 г. в * ''^часов на заседании специализированного'Ученого совета Д.01.44.01. при Институте фармакологии и токсикологии АМН Украины (252057, г.Киев -57, ул. Эжена Потье, 14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фармакологии и токсикологии АМН Украины

Автореферат разослан У^' /У/^З^и7 1996г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Данова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время в сельскохоз V ственной практике зедется интенсивный поиск новых, экологически безопасных средств, используемых для • повышения устойчивости культурных растении к болезням и неблагоприятным факторам окружающей среды, и способствующих, соответственю, увеличению урожайности.

Широкое применение в качестве регуляторов роста растений нашли вещества терпеноидной природы - фитогормоны гибберелин и абсцизовая кислота и их производные ( Л.Н. Рощаховская, 1985; Т.М.Косогова, 1986). Наряду с соединениями ретардантного типа действия в сельском хозяйстве определенное место занимают регуляторы роста, применяемые для предпосевного смачивания* семян: К этой группе относятся павстим и экостим - "стероидные гли-козиды ряда фуростанолозых, разработанные и предложенные Институтом Генетики Академии Наук Республики Молдова (проф. П.К.Кинтя).

Стероидные гликозиды, относящиеся к классу тритерпеноидов, это низкомолекулярные соединения, производные циклопентзнпер-гидрофенантрена. В зависимости от химического строения они проявляют широкий спектр физиологического и медико-биологического действия. Применительно к данной группе веществ можно выделить их антимикробную и антивирусную активность, ингибирую-щее действие на рост грибов. Стероидные гликозиды обладают ги-похолестеринемической и гиполипидемической активностью, иммуностимулирующими и иммуномодулирующими свойствами. Стероидные гликозиды. по аналогии с гормональными веществами, с которыми они находятся в биологическом родстве, широко используются в качестве добавок в корма для различных сельскохозяйственных животных с целью стимуляции их роста и развития.

2

Вещества, полученные из натурального сырья ( павстим - из листьев наперстянки пурпурной, экостим - из семян томатов), как правило, относятся к малотоксичным соединениям и не представляют опасности в плане загрязнения окружающей среды и отрицательного влияния на организм теплокровных. Вместе с тем, по данным отечественной и зарубежной литературы, известно, что диапазон токсичности стероидных гликозидов очень широк: от 10 мкг/мл для соединения Е из Yucca aloifolia (100%-ный летальный исход в.опыте на виноградной улитке) до нескольких тысяч мг/кг массы тела для диаспонина и полиспонина в опытах на крысах (Л.Н.Соколова,1970; Kishor Navin et al.,1971). Близость стероидных гликозидов по своей химической структуре к гормонам также диктует необходимость всесторонней токсикологической экспертизы вновь разработанных и предлагаемых к промышленному производ-ству-препаратов, имея в виду в первую очередь отдаленные последствия их воздействия на организм теплокровных. Исходя из сказанного, цель настоящего исследования - дать токсикологическую характеристику павстима и экостима, изучить их влияние на репродуктивную функцию организма животных и клеток in vivo , и in vitro, разработать гигиенические нормативы содержания указанных соединений в объектах окружающей среды.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- определить основные токсикометрические параметры павстима и экостима при остром и хроническом воздействии на организм экспериментальных животных;

- изучить влияние павстима и экостима на репродуктивную функцию животных, определить их мутагенные свойства;

- изучить характер влияния павстима и экостима на соматические клетки in vivo и in vitro;

- разработать гигиенические нормативы их содержания в

3

объектах окружающей среды.

Научная новизна работы состоит в том, что :

- впервые проведена комплексная токсиколого-гигиеническая экспертиза новых стимуляторов роста растений павстима и экости-ма, разработаны предельно допустимые концентрации (ПДК) препаратов для воды открытых водоемов, рассчитаны и обоснованы допустимые среднесуточные дозы (ДСД) для человека и ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ) для атмосферного воздуха;

- установлено, что павстим и экостим не оказывают специфического гонадотоксического, эмбриотоксического, тератогенного и мутагенного действия, обладают антимутагенным эффектом при длительном воздействии низких доз, что проявляется в достоверном снижении спонтанного уровня патологических форм митоза в клетках эпителия крипт тонкого кишечника;

- впервые раскрыт механизм действия стимуляторов роста растений на соматические клетки in vivo и in vitro, заключающийся в активации пролиферативных процессов и повышении синтеза ДНК;

- совокупность полученных результатов открывает перспективы дальнейших исследований павстима и экостима с целью расширения спектра их использования в биологии и медицине.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований обоснованы предельно допустимые концентрации павстима и экостима в воде открытых водоемов, рассчитаны и обоснованы ДСД для человека. Полученные данные послужили основанием для включения павстима и экостима в "Список химических и биологических средств защиты растений и регуляторов роста, разрешенных для применения в сельском и лесном хозяйствах Республики

Молдова" (Кишинев, 1994). Материалы по токсикологической оценке

i

экостима использованы Фармкомитетом МЗ РМ при решении вопроса о его клиническом испытании в качестве антивирусного

4

препарата. Разработана оригинальная технология культивирования клеток человпка и животных в питательной среде, содержащей в качестве добавки пазстим (патент на изобретение по заявке N94030310/13 (030321), 28.5.96).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции, посвященной 20-летию высшего ветеринарного образования (лл.иинев, 1994) и на XXIX сессии Института гигиены и общественного здоровья, 28-30 июня, 1995, г.Яссы, Румыния; на заседаниях Ученого совета ГНПЦГиЭ (декабрь, 1993 и апрель 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных статьи.

Объем и структура работы. Диссертация построена по классическому образцу. Объем диссертации составляет /¿^ страниц машинописи. Работа иллюстрирована таблицами

ло тексту изложения. Список использованной литературы включает 228 публикаций отечественных и зарубежных авторов.

Положения, выносимые на защиту:

1. -Павстим и экостим относятся к малотоксичным соединениям (IV класс опасности согласно ГОСТ 12.1.007-88); не обладают раздражающим и кумулятивным действием; павстим обладает слабым кожно-резорбтивным действием; оба препарата не раздражают конъюнктиву глаз; не обладают специфической гонадо-, эмбриотокси-ческой, тератогенной и мутагенной активностями.

2. Оба препарата влияют на органолептические свойства воды санитарный режим водоемов; павстим относится к стойким, а зко-стим - к умеренно стойким в воде веществам; на основании установленных пороговых уровней рассчитаны и гигиенически обоснованы нормативы содержания павстима и ^костима в объектах окружающей среды.

3. На примере экостима доказано стимулирующее действие исследуемых препаратов на соматические клетки in vivo и in vitro, проявляющееся увеличением индекса митотической активности, корением прохождения клетками стадий клеточного цикла, усилением синтеза ДНК. При длительном воздействии низких доз павстиМа И экостима происходит существенное снижение спонтанного уровня патологии митоза в органах животных, что свидетельствует о наличии у них определенных антимутагенных свойств. Паастим и экос-тим стимулируют прирост массы тёла, особенно новорожденных и молодых животных.

Объект и методы исследования.

Павстим и экостим - препараты растительного происхождения, относятся к классу стероидных гликозидов ряда фуростаноловых, предложены в качестве высокоэффективных регуляторов роста растений для предпосевной обработки семян ряда овощных и технических культур. Для решения поставленных задач был использован комплекс токсикологических, "биохимических, цитогенетических, цитологических, патоморфологических, радиоизотопных, санитарно-гигиенически. и статистических методов исследования.

В эксперименте всего использовано : в опытах in vivo - 900 крыс линии Вистар, 150 беспородных белых мышей, 9 кроликов; в опытах in vitro - 1800 флаконов культур клеток НЕр-2 и фибробла-стов эмбрионов человека (ФЭЧ).

Схема организации исследования представлена на рисунке 1.

Изучение острой, подострой и хроничной токсичности павсти-ма и экостима проводили в соответствии с "Методическими указаниями по оценке новых пестицидов" (Киев, 1988). Препараты вводили внутрижелудочно. Для изучения кумулятивных свойств в подост-ром эксперименте препараты вводили в количестве 500 и 1000 мг/ кг массы тела (1/20 и 1/10 от доз, испытанных при однократном

6

введении). При определении Lim ch павстим вводили в дозах 5, 50 и 500 мг/кг, а.экостим - 25, 250 и 2500 мг/кг в течение шести месяцев. Выбор показателей для оценки состояния организма животных при воздействии испытуемых препаратов определялся сведениями литературы о харгктере действия стероидных гликозидов и наиболее чувствительных к их влиянию органов и систем. В качестве показателей общетоксического действия препаратов использовали динамику массы тела животных, патоморсЬологические изменения а печени, почках, селезенке, сердце, легких, желудке и тонком кишечнике. В подостром и хроническом эксперименте следили в динамике за гематологическими и рядом биохимических показателей (активность АЛТ, ACT, холинэстеразы, гамма-глютаминтранспепти-дазы, уровень общих липидов, фракций липопротеидов, мочевины и глюкозы в сыворотке крови).

Для оценки цитогенетической активности павстима и экостима проводили анализ аберраций хромосом в клетках костиого мозга мышей на стадии метафазы по методу Форда и Волама (1977) через 24 часа после однократного внутрижелудочного введения препаратов в диапазоне доз от 250 до 10000 мг/кг.

Цитологические исследования включали в себя комплексное изучение митотического режима клеток костного мозга и эпителия крипт тонкого кишечника крыс (in vivo) и клеток культур НЕр-2 и ФЭЧ (in vitro), используя в качестве основных показателей индекс митотической активности, соотношение фаз деления, качественный и количественный анализ патологических форм митоза в соответствии с методическими рекомендациями "Нарушение митоза как показатель общетоксического и цитогенетического действия пестицидов" (Киев,1983). Степень пролифератив-ной активности определяли по числу растущих клеток в монослое на культурах НЕр-2 и ФЭЧ и уровню включения ЗН-тимидиновой метки клетками культуры ФЭЧ в различные сроки инкубации.

8

Влияние длительного поступления а организм павстима и экостима на репродуктивную функцию экспериментальных животных изучали в соответствии с "Методическими указаниями по гигиенической оценке новых пестицидов" (Киев, 1988). Изучение поведения павстима и экостима в модельных водоемах (стойкость, влияние на органолептические свойства воды и санитарный режим водоемов) проводили в соответствии с "Методическими указаниями по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов" (М., 1976). Полученные экспериментальные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента ( I ). Различия между показателями в опытной и контрольной группах считались значимыми при Р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

Проведенными экспериментами доказано, что оба препарата относятся к малотоксичным соединениям. Среднесмертельные дозы при внутрижелудочном введении: для крыс - выше 10000, для мышей - выше 5000 мг/кг массы тела.

Павстим и экостим при однократном нанесении не раздражают неповрежденную кожу крыс и слизистые оболочки глаз кроликов, при многократных аппликациях проявляют слабо выраженное кож-но-резорбтивное действие.

Для определения порога острого действия препаратов использованы биохимические показатели, отражающие функциональное состояние печени, почек, состав периферической крови, изучена морфология внутренних органов. Павстим в дозе ЮООмг/кг существенно угнетает белковый обмен, приводит к умеренному лейкоцитозу, нарастающему с увеличением дозы препара-а. Экостим лишь в максимальной из испытанных доз - 10000 мг/кг достоверно

9

снижает уровень триглицеридов, что может свидетельствовать об усилении синтеза холестерина. Патоморфологические изменения в виде умеренных гемодинамических расстройств отмечались л^ _|ь при действии максимальных доз препаратов.

При внутрижелудочном введении павстима и экостима на протяжении двух месяцев в дозах 500 и 1000 мг/кг гибели животных и внешних признаков интоксикации не наблюдали. Оба препарата не кумулируют в организме. Отмечаемые у экспериментальных животных отклонения отдельных биохимических и гематологических показателей от контрольного уровня связаны с компенсаторной реакцией организма на субхроническое введение сравнительно высоких доз препаратов. В данном эксперименте впервые отмечено выраженное стимулирующее действие павстима и экостима на прирост массы тела подопытных животных.

Этот же эффект наблюдался в течение первых двух месяцев хронического эксперимента (рис. 2, на примере экостима). Самки более чувствительны к стимулирующему действию изучаемых стероидных гликозидов, что, вероятнее, всего, связано с эстрогеноподоб-ной структурой препаратов. В течение первых двух месяцев введения павсти иа и экостима отмечается усиление синтеза белка. Патогистологические изменения со стороны внутренних органов отсутствуют. Эти наблюдения позволяют предположить, что прирост массы тела на фоне введения изучаемых препаратов обусловлеь усилением синтеза белка. Полученные результаты подтзэрждаются данными литературы о проявлении рядом стероидных гликозидов стимулирующего действия на белковый обмен и прирост массы тела, особенно на ранних сроках воздейстзия (Б.М.Федоров, 1989). Кроме отмеченных эффектов следует подчеркнуть наличие гиполи-пидемических свойств у павстима и экостима, максимально выраженных при введении минимальных доз ( 5 и 25 мг/кг, соответственно), что согласуется с данными литературы о присущей многим

10

стероидным гликсзидам гиполипидемической активности ( Ю.М.Ма-мадов, 1990; А.ЕБдиега, 1990).

г 120100806040200-

Самцы

; I

2:

15 30 60

□ Контроль 025 мг/кг Е250 мг/кг

самки

90 сроки.сут В 2500 мг/кг

60

И 250 мг/кг

30 сроки.сут В 2500 мгДг

Рисунок 2. Динамика прироста массы тела животных при хроническом воздейстоии экостима

Результаты морфологических, гематологических и биохимических исследований показывают, что длительное введение изучаемых стимуляторов роста растений не приводит к структурно-функциональным изменениям в организме животных, которые свидетельствовали бы о хронизации токсического процесса.'Одной из за.ич пп<--.-

11

веденного исследования было изучение отдаленных последствий воздействия павстима и э;сстима на организм экспериментальных животных. Установлено, что препараты не оказывают специфического гонадотоксического действия. Однако об определенном влиянии павстима и зкостима на герменативные клетки самок и самцов свидетельствует тенденция к увеличению показателя доимплан-тационной гибели оплодотворенных яйцеклеток и снижению индекса оплодотворения, особенно при дозах 500 и 2500 мг/кг, соответственно. Это подтверждается данными литературы о свойственной некоторым представителям группы стероидных гликозидов контрацептивной активности (В.В.Корхов, 1988; М.Н.Мац, 1990).

Павстим и экостим не оказывают специфического эмбриоток-

сического и тератогенного действия. Повышение уровня портимпла-

»

нтационной гибели плодов при введении максимальных доз препаратов на протяжении всего периода беременности следует расценивать кз'к проявление их общетоксического действия на материнский оргзнизм.

Мутагенные свойства соединений, относящихся к группе регуляторов рост) и развития растений, в литературе специально не освещены. Однако исследованиями последних лет установлено, что существенным моментом в механизме действия регуляторов роста является их влияние на активность генетического аппарата клеток и белоксинтезирующие системы. Для. экспериментальной оценки мутагенной активности химических веществ общепринятым считается метод цитогенетического анализа клеток костного мозга мышей.

Проведенными исследованиями установленно, что при введении павстима и экостима наблюдается тенденция к нарастанию числа аберрантных хромосом при дозах выше 2500 мг/кг массы тела. Это нарастание обусловлено преимущественно такой формой патологии, как парные и одиночные фрагменты. Однако эти дашые статистически не отличаются от показателя контроля, более того,

12

доза 500 мг/кг павстима, подпороговая в хроническом эксперименте, существенно снижает число метафаз с аберрациями.

Важную информацию о цитотоксической и цитогенетической активности химических соединений дает комплексное изучение ми-тотического режима в органах с высокой естественной .пролифера-тивной активностью и в культурах клеток. В качестве наиболее информативных были выбраны следующие показатели: индекс митоти-ческой активности (ИМА), соотношение фаз митоза, качественный и количественный анализ патологических форм деления. Нами изучен митотический режим эпителия крипт тонкого кишечника и костного мозга крыс, вышедших из острого, подострого и хронического экспериментов.

Установлено, что митотическая активность эпителия крипт тонкого кишечника в остром опыте существенно не изменялась даже при введении максимальных доз препаратов. Коэффициент фаз митоза несколько нарастал за счет увеличения относительного числа метафаз при введении 5000 мг/кг павстима и 1000 и 5000 мг/кг экостима. Рост частоты патологий митоза отмечался лишь на фоне действия максимальных доз. Качественный анализ форм патологий показал значительное увеличение числа колхициноподобных митозов, что является следствием токсического действия препаратов на клетку (И.А.Казанцева , 1981).

Подострое введение 500 и 1000 мг/кг павстима и экостима не оказывает токсического воздействия на клетки эпителия тонкого кишечника и костного мозга крыс. Более того, оба препарата значительно стимулировали клеточную пролиферацию, особенно при введении меньшей из доз. Это же заключение можно сделать, исходя из результатов хронического введения различных доз препаратов. Цитостимулирующий эффект выражался в увеличении индекса митотической активности, а так же некотором снижении коэффициента фаз митоза. Длительное повторное введение павстима и

13

экостима не только не вызывало нарастания частоты патологий митоза, но в некоторых случаях при низких уровнях воздействия (5 и 25 мг/кг) значимо снижало этот показатель, что свидетельствует о наличии у исследуемых стероидных гликозидов определенных антимутагенных свойств ( таблица 1, на примере экостима).

Таблица 1. Показатели митотического режима эпителия тонкого кишечника при хроническом воздействии экостима

Сроки наблюдений (сутки)

15 30 90 180

Индекс Патоло Индекс Патсло Индекс Патоло- Индекс Патоло

митоти гичес- МИТОТИ гичес- митоти- гичес- МИТОТИ -гичес-

Доза ческой кие ческой кие ческой кие чсской кио

актив- формы актив- формы актив- формы актив- формы

ности митоза ности митоза ности митоза ности митоза

%о % %о % %о ' % %о %

ГЛ±т М±т М±ш М±т М±т М±т М±т М±т

к 32,79 9,71 33,85 7,86 24.60 6,67 34.44 9,14

±2,50 ±0,75 ±4,36 ±0,74 ±2,20 ±0,62 ±2,40 ±0,79

25 36,81 6,0 *• 33,01 6.0 48,21"* 5,57 35.19 6,66

±2,16 ±0,88 ±5,14 ±1,02 ±1,33 ±0,83 ±2.77 ±1,31

253 37,15 7,33 40,92 3.0 •** 32.36 * 8,29 36,12 : 8,57

±3,63 ±0,93 ±4,33 ±0.58 ±2,29 ±0,86 ±2,97 ±1.13

2500 48,76" 9,83 37,78 5,86 * 38,55" 6,86 35,29 7,0

±3,48 ±0,65 ±4,43 ±0,52 ±3,92 ±0,81 ±1,18 ±0,93

Примечание: * • Р < 0,05 , ** - Р < 0,01 . "* - Р < 0,001.

Делящиеся клетки костного мозга менее чувствительны к действию стероидных гликозидов. Подострое и хроническое введение павсти ма и экостима не оказывало цитотоксического действия, не приво-

14

дило к нарастанию частоты патологий митоза.

Резюмируя материалы комплексного изучения митотического режима при однократном и многократном действии стимуляторов роста, отметим сочетание низкой цитотоксичности высоких доз павстима и экостйма при выраженном цитостимулирующем эффекте низких доз. Эти выводы совпадают с результатами изучения общетоксического и ростстимулирующего действия препаратов на целост ный организм.

В гигиене и токсикологии в последнее десятилетие широкое применение нашли однослойные культуры клеток, являющиеся удобной моделью мля изучения различных аспектов цитофизиологии, цитогенетики и цитотоксикологии прямого воздействия различных химических агентов на клетку.

Определение параметров токсичности для культур НЕр-2 и ФЭЧ на примере экостйма показало, что концентрация препарата выше 10000 мкг/мл приводит к дегенерации клеток монослоя с отделением их от стекла и принята нами за абсолютно токсическую. Доза экостйма 500 мкг/мл по морфологическому тесту деструкции клеток монослоя принята за пороговую. Учет пролиферативного пула клеток НЕр-2 и ФЭЧ при внесении препарата в исходную суспензию клеток в концентрациях выше 500' мкг/мл свидетельствует о резком ингибировании ооста культуры. Дозы ниже 100 мкг/мл стимулировали процесс клеточного деления, который нарастал обратно пропорционально дозам препарата. При концентрациях 1, 5 и 10 мкг/мл эффект максимально выражен (рис. 3).

Комплексное изучение митотического режима культуры ФЭЧ, выращенной на покровных стеклах, показало, что в контрольной культуре митотическая активность на 3-4-е сутки колебалась в пределах 7-9%о. Число патологических митозов составило 5-8% общего количества делящихся клеток.

1-о

35-. 3025 20 15 105 0

□ Контроль □ 1 мкг/мл 05 мкг/мл В10 мкг/мл Й50 мкг/мл

Рисунок 3.Влияние экостима на пролиферативную актионость фибробластов эмбриона человека в культуре

Внесение экостима в исходную клеточную взвесь в количестве 1-10 мкг/мл достоверно повышает индекс митотической активности в 5-10 раз □ первые сутки контакта и в 1,5-1,7 раза на 4-е сутки (рис. 4). Доза же экостима 50 мкг/мл угнетает рост культуры, начиная с третьих суток, приводя к дегенерации монослоя и его отслаиванию от поверхности стекла на 5-е сутки экспозиции. Стимулирующий эффект сопровождается нарастанием относительного числа ана- и телофаз, что выражается в снижении коэффициента фаз в среднем в 1,5 -1,7 раза. Все это свидетельствует об ускорении прохождения клеткой стадий митоза. При этом частота патологических митозов оставалась на уровне контрольных значений (68 %). Полученные результаты совпадают с данными ряда автором о том, что низкие концентрации стероидных гликозидов ( порядка 0,01-1,0 мг/л) статистически достоверно стимулируют рост клеток в культуре (Г.[".Колесникова, 1994).

16

5

9в сооки.час

□ Контроль О1 мкг/мл В 5 мкг/мл В10 мкг/мл

Рисунок 4. Митотическая активность фибробластов эмбриона человека при действии экостима

Изучение влияния различных концентраций экостима на синтез ДНК проведено методом радионуклидного анализа (Фрешни Р.-Н., 1989), учитыващим динамику скорости включения ЗН- тимидино-вой метки культурой ФЭЧ.

Установлено усиление синтеза ДНК через 48 час после внесения в питательную среду 1 и 5 мкг/мл экостима, который достигает максимума через 96 часов - на 60-70% выше контрольного уровня (рис. 5). Полученные результаты свидетельствуют об активной реакции клеток на качественный состав среды. По данным изотопного анализа доза 5"0 мкг/мл экостима через 48 час контакта угнетает синтез ДНК на 30, а через 96 часов - на 80% по сравнению с контролем. Доза 50 мкг/мл принята за пороговую по данному критерию цитотоксичности, что в десять раз меньше таксой, определенной по тесту деструкции клеток монослоя.

Таким образом, наши данные подтверждают сведения о том. что метод морфологической оценки цитотоксичности менее чувствителен и информативен, и отражает глубоко зашедший и необра-

■17

тимый процесс воздействия на клетку. В то же время нарушения" митотического режима и пролиферативного пула клеток в культуре развиваются при действии доз, в несколько раз ниже пороговых по интегральным показателям, и выявляют более тонкие, не вызывающие гибели клеток нарушения ее репродуктивного аппарата. Определение числа клеток в монослое и показателя митотической активности можно рекомендовать в качестве достаточно простых и информативных методов предварительной оценки как токсического, так и цитостимулирующего действия биологически-активных веществ.

%

Имп/мин

Рисунок 5. Включение ЗН-тимидина клетками культуры ФЭЧ при действии экостима

Таким образом, проведенные исследования показывают, что павстим и экостим оказывают стимулирующий эффект на различных иерархических уровнях структурно - функциональной организации биологических систем : клеточном (повышение митотической активности и скорости включения тимидиновой метки клетками In vitro), органном (повышение митотической активности клеток тонко-

18

го кишечника) и организменном (ускорение прироста массы тела животных). Это их свойство, по нашему мнению, является ведущим в механизме стимулирующего действия изучаемых препаратов как на растительные объекты, так и на организм животных.

На заключительном этапе токсикологической экспертизы изучено поведение павстима и экостима в модельном водоеме. Установлено, что пороговой концентрацией павстима по изменению цветности воды является доза 31,25 мг/л, а экостима, по изменению запаха, 32,64 мг/л. Указанные концентрации не влияют на прозрачность и пенообразование воды. Данные пороговые концентрации совпадают с таковыми, установленными по изменению интегральных показателей санитарного режима водоема (БПК, ХПК, окисля-емость, процессы нитрификации), а именно: 31,25 мг/л - для павстима и 32,64 мг/л - для экостима. С учетом результатов экспериментальных исследований на животных обоснованы ПДК препаратов в воде водоемов санитарно-бытового водопользования на уровне 30 мг/л (по органолептическому критерию вредности).

По стабильности в воде согласно общепринятой классификации павстим относится к стойким соединениям ( Т50 - 10 дней), а экостим - к умеренно стойким (Т50 - 4 дня).

С учетом максимально недействующей дозы в хроническом эксперименте и приниипя коэффициент запаса 30, рассчитаны допустимые среднесуточные дозы для человека, которые составляют для павстима 1000 мг/чел (или 15,2 мг/кг массы тела), а для экостима - 5000 мг/чел (или 83,3 мг/кг массы тела). ОБУВ (расчетный) для атмосферного воздуха рекомендованы 0,42 и 0,69 мг/мЗ.

выводы

1. Стимуляторы роста растений павстим и экостим относятся к малотоксичным соединениям ( IV класс опасности согласно ГОСТ 12.1.007-88). Коэффициент кумуляции > 5. Обладают слабым раздражающим и кожно-резорбтивным действием.

2. Длительное внутрижелудочное поступление павстима и эко-стима в дозах 500 и 2500 мг/кг массы тела, соответственно, не приводит к .существенным структурно-функциональным изменениям в организме экспериментальных животных, что, учитывая производственные условия, позволяет считать маловероятной возможность хронической интоксикации человека указанными препаратами.

3. При длительном поступлении а организм беременных и ла-ктирующих самок крыс павстим и экостим не оказывают специфического эмбриотоксического и тератогенного действия, не влияют отрицательно на развитие потомства (III группа опасности по гигиенической'1 классификации!.

4. Павстим и экостим проявляют выраженный стимулирующий эффект на рост массы тела молодых особей и новорожденных крысят, что совпадает с периодом интенсивного синтеза белка. Самки более чувствительны к стимулирующему действию стероидных гли-козидов.

5. Однократное введение павстима и экостима приводит к нарастанию относительного числа патологических митозов и снижению митотической активности в клетках тонкого кишечника и костного мозга крыс. Пороговыми дозами при однократном введении по действию на митотический оежим являются дозы 1000 и 10000 мг/кг для клеток костного мозга и 10000 мг/кг для эпителия крипт тонкого кишечника соответственно.

6. Подострое и хроническое воздействие павстима и экостима в дозах ниже 1000 и 2500 мг/кг , соответственно, стимулирует митотический режим клеток эпителия тонкого кишечника, что выра-

жается в достоверном увеличении числа пролиферирующих клеток и снижении коэффициента фаз деления. Делящиеся клетки костного мозга менее чувствительны к стимулирующему действию препаратов.

7. При хромосомном анализе клеток костного мозга мышей выявлена слабая цитогенетическая активность лавстима и экостима при введении доз выше 5000 мг/кг. Дозы ниже 1000 мг/кг снижают частоту патологических митозов в делящихся клетках тонкого кишечника и костного мозга крыс, что свидетельствует о наличии у данных соединений антимутагенных свойств.

8. Экостим оказывает стимулирующее действие на пролифе-ративные процессы в диплоидных клетках человека in vitro, проявляющееся существенным увеличением числа клеток в монослое и повышением индекса митотической активности. Соотношение фаз деления и частота патологических форм митоза при этом сохраняется на уровне контроля. Максимума эффект достигает при внесении в культуральную среду низких доз препарата (1 и 5 мкг/мл).

9. Введение в культуральную среду экостима в дозах 1 и 5 мкг/мл увеличивает на 150-170% интенсивность включения ЗН-ти-мидина в клетки фибробластов эмбриона человека, что свидетельствует о существенном повышении синтеза ДНК.

10. При изучении токсического процесса in vitro наиболее информативными являются индекс пролиферативной активности клеток (митотическая активность, число клеток в монослое), скорость и степень включения тимидиновой метки, а также уровень патологических форм митоза. Изменения указанных показателей происходили при уровнях воздействия значительно ниже доз, вызывающих морфологические изменения клеток, что позволяет рекомендовать их в качестве критериально значимых при оценке цитотоксичности химических соединений.

11. Исследования в модельном водоеме позволили в качестве ПДК в воде для павстима и экостима рекомендовать концентрацию 30 мг/л. ОБУВ в атмосферном воздухе (расчетный) составляет для павстима 0,42 мг/мЗ, для экостима - 0.S9 мг/мЗ; ДСД -1000 и 5000 мг на человека в сутки соответственно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Влияние экостима на эксплантированные клетки человека //Актуальные вопросы железнодорожной медицины: Сб. науч. работ, посвященный 50-летию железнодорожной медицины. Кишинео, 1995. С.15 (соавт. А.Ф.В.асилос).

2. Токсиколого-гигиеническая оценка экостима //Актуальные вопросы железнодорожной медицины: Сб. науч. работ, посвященный 50-летию железнодорожной медицины. Кишинев, 1995. С. 17. (соавт. А.Ф.Василос, Л.И.Иванова).

3. Токсиколого-гигиеническая оценка нового стимулятора рос-та растений павстима // Curier medical, 1996. N 2. С.25-27.

4. The investigation of antiviral and immunological prospertis of vegital origin // J. de medicine preventive, lasi, 1995. Vol. 3. N1-2. P.92. (соавт. К.И.Спыну, П.Г.Скоферца, А.Ф.Василос).

Резюме

Стратулат Т.Г. Токсиколопчна характеристика нових стимулятора росту рослин павспма та екосл1ма. Дисертац!Я на здобуття нзу-кового ступеня киндидата бюлоп'чних наук. 14.03.11 - токсиколопя, ГНПЦГиЭ, Кишижв, 1996.

Павслм (П) та екосл'м (Е), стероТдн1 глжозиди ряду фуростано-лових. належать до класу малотоксичних сполук, не волод|'ють куму-

22

эмбрютоксичною, тератогеною та мутагеною активнютью. Дослщжу-ван1 препарата проявляють виразний стимулюючий ефект на при-pibT маси Tina, особливо молодк та новонароджених inypie, та на синтез бтка. П та Е активують прол'|феративж процеси в кл¡тинах як in vivo, так i in vitro, що вщзначается збшьшенням ¡ндексу м1тоти-чноТ активности, прискоренням проходження штинами стад» юитин-ного циклу, посиленням синтезу ДНК. Тризале введения низьких доз П i Е значно знижуе спонтаний рщень патологи мтозу в еттели крипт тонкого кишечника, що- можливо свщчить про наявжсть у да-них сполук антимутагених властивостей. Розробпеж ппен1чн> норма-тиви i'x наявност] в об'ектах навколишнього середовшца.

Summary

Stratulat T.G.. Toxicology assessment of new stimulators for the plant growth pavstim and ecostim. Dissertation in manuscript form for the Degree of Candidate of Science (Biologiy) on speciality 14.03.11.-"toxicology", National Research Practical Centre of Hygiene and Epidemiology, Kishineu, 1996.

Pavstim (P) and ecostim (E), steroid furostanol glycosides, belong to the class of minor toxic substences. They don't show cumulative and irritative action, spesifio go'nado-, embriotoxic, teratogenic and mutagenic activity. Investigated preparations display a significant stimulater effect to increase the mass body of neonatal and yonger animals, of proteins syntesis. P and E activate the process of cell proliferation both in vivo and in vitro, which manifeste in the increase of the index of mytotic activity, guicken passing the cellular stages of mytosis, reinforcement of DNA syntesis. P and E in mean doses considerably re-auce the spontaneous level of patological mytosis in the epithelium cripts

of small intestin under chronic influence, which testify that these

f

preparates presence defenite antimutagenic effects. There were elaborated the hygiene standarts of P and E in the environmental units.

23