Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Научные основы оценки опасности и гигиенической регламентации промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

СЕРГЕЮК НАДЕЖДА ПАВЛОВНА

Научные основы оценки опасности и гигиенической регламентации промышленных микроорганизмов

14.00.07-Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Федеральном научном центре гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана Министерства здравоохранения РФ и

Гос НИИ биологического приборостроения Министерства науки и образования РФ Научные консультанты: академик РАМН,

профессор Ракитский Валерий Николаевич

доктор медицинских наук,

профессор Багдасарьян Галина Александровна

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН,

профессор Новиков Юрий Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор Иванов Николай Георгиевич

доктор медицинских наук,

профессор Лакшин Алексей Михайлович

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится « 2004 г. в 12 час на заседании

Диссертационного совета Д.208.107.01 при Федеральном научном центре гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана МЗ РФ по адресу: 141000, Московская область, г. Мытищи, ул. Семашко, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана МЗ РФ.

Авторефератразослан «

2004г.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

В настоящее время в России в связи с распространением химических и биологических загрязнителей окружающей среды сложилось чрезвычайно напряженное положение в сфере обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и здоровья населения (Потапов А.И., 1995; Сидоренко Г.И., 1997; Тутельян ВА, 2000; Потапов А.И., Ракитский В.Н., 2001; Савельев СИ. и соавт., 2002). Причем, если для химических веществ определены критерии выбора оптимального объема исследования в направлении гигиенического регламентирования и подходы к их безопасному обращению (Курляндский БА. и соавт., 1974, 1975, 1977; Курляндский Б.А., 1999,2001), то для биологических веществ, в частности, для промышленных микроорганизмов, существующая система оценки опасности недостаточно отвечает требованиям современной науки и практики.

В то же время, номенклатура продукции биотехнологического производства в нашей стране постоянно расширяется и естественным следствием этого процесса является повышение удельного веса биологического загрязнения, включающего промышленные

микроорганизмы, в объектах производственной и окружающей среды (Багдасарьян Г. А. 1980,1984).

Характерным для промышленных (непатогенных) микроорганизмов при действии их на организм теплокровных животных является, как правило, отсутствие токсического эффекта по критерию гибели даже после введения больших доз (Трахтенберг И.М. и соавт., 1987). Вместе с тем, наличие

большого количества микробов и продуугга» иу жщшжятидьности в воздухе

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

СПетер! 09

и других средах может оказывать воздействие как на реактивность организма человека, так и на стабильность природных экосистем (Мурзакаев Ф.Г., Баширова P.M. и др., 1978).

В экспериментальных и натурных условиях показана длительная выживаемость жизнеспособных микроорганизмов-продуцентов в объектах окружающей среды - почве, водной среде, пыли, снеге, на листьях растений и др. (Трухина Г.М., 1993, Пивоваров Ю.П., Королик Б.В., 1994).

К настоящему времени накоплены многочисленные данные, свидетельствующие об отрицательном влиянии микроорганизмов и продуктов биосинтеза на организм человека (Воробьев А.А.,1987, Зельцер П.Л.,1986, Немыря В.И.,1989, Соседова Л.М., Рукавишникова В.С.,2003 и

др.).

Выявлена значительная аллергизация работающих и населения, проживающего в районах влияния биотехнологических предприятий, ухудшение показателей их иммунного статуса. (Никифоров Ю.Ф. и др., 1980, Селюжицкий Г.В., Белкин А.С., 1979).

По данным Алексеевой О.Г. (1994г.) в период пуска в эксплуатацию заводов БХЗ по производству БВК возникали вспышки аллергозов органов дыхания не только у рабочих, но и у населения селитебных зон. Эти заболевания плохо поддавались лечению вследствие наличия групповых антигенов с белками естественной флоры окружающей среды, которые поддерживали аллергизацию даже после прекращения контакта с кормовыми белками.

Установлено, что снижение иммунного статуса организма у населения отмечается в три раза чаще под воздействием продуцентов, по сравнению с готовым продуктом. Выявлено также потенцирование действия при совместном воздействии живого и неживого компонента биологического загрязнения (Баширова P.M., 1989; Баширова P.M., Мурзакаев Ф.Г., Дольников И.Б., 1984).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что промышленные микроорганизмы могут представлять собой серьезную опасность как для человека, так и для объектов производственной и окружающей среды.

Однако, в настоящее время не только уровень и объем исследований по гигиеническому регламентированию биологических поллютантов отстает от таковых для химических веществ, но и более того -имеются данные о том, что гигиенические нормативы для ряда промышленных микроорганизмов (представителей рода Candida, в частности) не обеспечивают безопасные для организма человека уровни воздействия (Соседова Л.М., Рукавишникова B.C., 2003 г).

Несмотря на постоянно расширяющуюся номенклатуру штаммов, активно использующихся в биотехнологии, в настоящее время не существует гигиенической классификации промышленных микроорганизмов по степени опасности.

В сложившейся ситуации несомненно актуальным является расширение объема исследований по идентификации биомаркеров основных эффектов промышленных микроорганизмов, направленных на повышение надежности разрабатываемых гигиенических нормативов и регламентов -одного из наиболее важных элементов комплекса мероприятий по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Все это послужило основанием для проведения настоящего исследования и определило его цели и задачи. Исследования выполнялись в соответствии с планами научно-исследовательских работ Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана и ГосНИИ биологического приборостроения по отраслевым программам «Эколого-гигиенические проблемы безопасности России и пути их решения», «Системная разработка мероприятий по гигиенической безопасности России». Работа обобщает результаты многолетних исследований, проведенных в соответствии научно-исследовательскими темами: № государственной регистрации - 011005937,

01860003459, 01860003469, 02.2.00 402674; 02.2.00 402665; 02.2.00 402661; 02.2.00 402684.

Цель работы: Научное обоснование критериальной и прогностической значимости гигиенических исследований при оценке потенциальной опасности промышленных микроорганизмов с целью обеспечения профилактических мероприятий по предупреждению их неблагоприятного воздействия на объекты производственной и окружающей среды.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- провести сравнительный анализ концептуальной и методической базы санитарно-гигиенического нормирования химических и биологических веществ;

- определить критериальную значимость комплекса биомаркеров вредных эффектов промышленных микроорганизмов (сенсибилизирующего, иммуномодулирующего и антибактериального);

- изучить показатели неспецифического клеточного ответа респираторного тракта теплокровных животных на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов в условиях хронического эксперимента;

- усовершенствовать схему проведения работ по гигиеническому регламентированию промышленных микроорганизмов;

- разработать классификацию промышленных микроорганизмов по степени опасности;

- создать математическую модель неспецифической клеточной реакции респираторного тракта в ответ на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов;

разработать и обосновать критериальный комплекс гигиенических исследований промышленных микроорганизмов, являющийся

научной основой профилактических мероприятий по охране здоровья населения.

Научная новизна и теоретическая значимость работы состоит в том, что впервые:

- разработана классификация промышленных микроорганизмов по степени опасности;

определен унифицированный критериальный комплекс показателей, характеризующих действие промышленных микроорганизмов на теплокровных при ингаляционном поступлении;

установлена критериально-прогностическая значимость функциональной компетентности пула альвеолярных макрофагов в развитии иммунодепрессивного эффекта;

разработана концепция математического моделирования динамики неспецифического ответа пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов.

установлены дозо-время зависимости развития

дисбиотического, сенсибилизирующего и иммунодепрессивного действия промышленных штаммов при ингаляционном поступлении в организм теплокровных животных;

усовершенствована схема гигиенического регламентирования промышленных микроорганизмов

разработана научная основа профилактических мероприятий по охране здоровья населения от неблагоприятного воздействия промышленных микроорганизмов

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Гигиеническая классификация промышленных микроорганизмов по степени опасности, в основу которой положены: уровни лимитирующего показателя вредного действия; уровни гигиенических нормативов с учетом возможности диссоциации микроорганизмов в условно-патогенную форму;

2. Дозозависимые закономерности формирования основных эффектов различных штаммов промышленных микроорганизмов с определением биомаркеров этих эффектов - гиперчувствительности замедленного и немедленного типа, функциональной активности клеточного звена иммунитета, изменений в микробном пейзаже толстого кишечника, функциональной компетентности пула альвеолярных макрофагов.

3. Закономерности формирования ответа пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов и математическое моделирование этого процесса.

4. Усовершенствованная схема нормирования промышленных микроорганизмов, включающая оценку возможности диссоциации штаммов в условно-патогенную форму, комплекс биомаркеров основных вредных эффектов и определение лимитирующего критерия вредного действия с учетом функционального состояния неспецифической клеточной защиты респираторного тракта.

5. Комплекс профилактических мероприятий, включающий нормативные и методические документы федерального уровня

Практическая значимость работы.

Материалы исследований были использованы при составлении: Руководства «Гигиенические критерии оценки и классификации условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса» Р 2.2.755-99, утвержденного Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации;

Перечня ПДК «Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест» Доп. №2 к ГН 2.1.6.711-98 Гигиенические нормативы ГН 2.1.6.1041-01, утвержденного Главным Государственным врачом Российской Федерации;

Перечня ПДК «Предельно допустимые концентрации микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны» Доп №2 к ГН 2 2 6 709 - 98 ГН 2 2 6 1080-01, утвержденного Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации

Разработанных и утвержденных МЗ РФ гигиенических нормативов промышленных микроорганизмов

28 ПДК в воздухе рабочей зоны ГН 2 2 6 709-98, 28 ПДК в атмосферном воздухе населенных мест ГН 2 1 6 711-98 и доп №2 к ГН2 16 711-98,

препаратов, представляющих собой консорциум промышленных микроорганизмов

3 ПДК в воздухе рабочей зоны Доп № 2 к ГН 2 2 6 709-98, 3 ПДК атмосферном воздухе населенных мест Доп № 2 к ГН 216711-98

Пособия для врачей «Оценка опасности промышленных микроорганизмов», утвержденного секцией «Гигиена» УС МЗ РФ (протокол №4 от 21 04 04)

Пособия для врачей «Усовершенствование методических подходов к гигиеническому регламентированию промышленных микроорганизмов в воздушной среде», утвержденного секцией «Гигиена» УС МЗ РФ (протокол №4 от 21 04 04)

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 1-ой Всероссийской конференции токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии» (С-Петербург, 1995г), 1-ом съезде токсикологов России (Москва, 1998г), Международной конференции Биотехнология-2000 (Пущино, 2000г), Международном семинаре Биотехнология - народному хозяйству 2000 (Москва, 2000г), IX

Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных врачей (Москва, 2001), 2-ом съезде токсикологов России (Москва, 2003г.), VII Международной конференции «Прикладная кибернетика и информатика» (Орландо, Флорида, США, 2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 33 печатных работы, в том числе 4 монографии (издательство РАН).

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения; аналитического обзора литературы; описания объектов, материалов и методов исследования; двух глав собственных экспериментальных исследований, одна из которых посвящена обоснованию гигиенических нормативов. Кроме того, в работе имеется глава, посвященная математическому моделированию; глава, содержащая обсуждение полученных результатов; основные выводы; список литературы и приложения. Текст изложен на 240 страницах, иллюстрирован 38 таблицами, 22 рисунками, имеет приложения. Указатель литературы содержит 184 источника, из них 154 отечественных и 30 иностранных авторов.

Объекты, объем и методы исследования.

В соответствии с поставленными в работе задачами проводились экспериментальные исследования промышленных микроорганизмов в направлении определения основных биомаркеров их действия при различных путях поступления в организм теплокровных животных. Исследования проводились в общем плане работ по гигиеническому регламентированию представителей 10 наиболее востребованных в биотехнологии родов микроорганизмов (28 штаммов) в воздушной среде.

Для проведения исследований были отобраны штаммы-продуценты БВК, антибиотиков, ферментов, аминокислот и т.д., а так же микроорганизмы, которые являются действующим началом готовых форм препаратов, применяемых для силосования кормов, очистки природных систем от нефти и нефтепродуктов и пр. Все штаммы микроорганизмов, представленные в настоящей работе, получены из «диких» (т.е. встречающихся в природе) штаммов. Основные направления работы представлены в таблице 1.

Для определения таксономии и классификации родов ПМ была использована информация, представленная в определителях бактерий и грибов: Ред. Дж.Хоулта «Краткий определитель бактерий Берги», М, 1980;

Дж. Хоулта, Н.Крига, П.Снита и др. «Определитель бактерий Берджи», М., 1997; Д.Саттон, А.Фотергилл, М.Ринальди «Определитель патогенных и условно патогенных грибов», М., 2001г.

Экспериментальные исследования по оценке воздействия промышленных микроорганизмов на организм теплокровных животных проводили на белых беспородных крысах (массой 180-210г), белых беспородных мышах (массой 18-20г), морских свинках-альбиносах (массой 350-450 г). Подбор животных и формирование из них однородных опытных и контрольных групп осуществляли с учетом массы тела, отсутствия различий в поведении, общем состоянии, содержании лейкоцитов в крови и состояния микрофлоры кишечника. Работа проводилась в соответствии с требованиями «Методических указаний по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды» (Алексеева О.Г., Багдасарьян ГА., Зелъцер ПЛ.И др.,1991), а также «Критериев оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза» (Пивоваров Ю.П., Мялина Л.И., Королик В.В., 1992). Оценка антимикробной активности штаммов производилась на основе методических указаний «Постановка

Направления, методы и объемы исследования

Направление исследований Объекты исследований Методы исследований Количество исследований

Токсикологические (острые, подострые, хронические эксперименты) 10 родов промышленных микроорганизмов (28 штаммов) Микробиологические 12100

Лабораторные животные (крысы, мыши, морские свинки кролики) Санитарно-токсикологические 1336

Биосреды (кровь, сыворотка крови, моча внутренние органы и их гомогенаты) физиологические, биохимические, иммунологические, статистические 6300 8520 16303 18600

Гигиенические: 1. обоснование ПДК в воздухе рабочей зоны 2. обоснование ПДК в атмосферном воздухе населенных мест 3. разработка методов контроля за концентрацией ПМ в воздухе Штаммы микроорганизмов Штаммы микроорганизмов Штаммы микроорганизмов гигиенические гигиенические гигиенические 28 28 56

Математическое моделирование Клеточный пул (АМ) Методы прикладной математики 140

исследований для обоснования предельно допустимых концентраций антибиотиков в воздухе рабочей зоны» (Шендеров ВА, Зельцер И.З., и др. 1989).

Исследования иммунотропной активности, иммуногенности и аллергенных свойств микроорганизмов проводили, используя «Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях» (Федосеева В.Н., Порядина Г.В. и др., 1993).

Оценку состояния неспецифической клеточной защиты респираторного тракта проводили на основе методических указаний «Система биохимических, цитологических, цитохимических и электронномикроскопических критериев оценки функционального состояния альвеолярных макрофагов человека и экспериментальных животных при действии факторов окружающей среды» (Ред. Сидоренко Г.И., 1984).

Экспериментальные исследования проводились по следующей

схеме:

I этап - Определение патогенности штаммов.

Использовались тесты по оценке токсичности, токсигенности и инвазивности штаммов. Определяли средневирулентную дозу (БУ50).

II этап - Определение лимитирующего критерия вредного действия исследуемых микроорганизмов при ингаляционном воздействии в хроническом эксперименте; установление пороговой концентрации по лимитирующему показателю.

Использовались тесты по определению сенсибилизирующего (РСАЛ, ППН, ГЗТ по Черноусову А.Д.), иммуномодулирующего действия (тесты розеткообразования, содержание Т и В лимфоцитов в периферической крови, определение титра антител к эритроцитам барана), антибактериального эффекта (изменение соотношения составляющих микрофлоры кишечника), функционального состояния неспецифической

клеточной защиты респираторного тракта (изменение количества AM, процента жизнеспособных AM, а также способности их к адгезии) в зависимости от интенсивности и продолжительности воздействия изучаемых объектов.

Биохимические исследования включали в себя определение общей и неседиментированной активности лизосомальных гидролаз: ß-галактозидазы, ß -глюкозидазы и М-ацетилрО-глюкозаминидазы и

проводились на автоматическом анализаторе фирмы Ciba Cörninq Diaqnoctics Corporation Impact 400E (p N 1447 x 70A SNNK 85583).

III этап - Обоснование ПДК исследуемых микроорганизмов в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе населенных мест.

Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась на персональном компьютере с использованием версии S-плюс 2000 Professional.

Программная реализация математической модели

неспецифического клеточного ответа на ингаляционное поступление ПМ была осуществлена в рамках системы MATLAB 6.1 с использованием программного инструментария MMS V. 5 BETA в среде Delphi.

Личный вклад автора состоит в организации и непосредственном выполнении исследований по всем разделам диссертации, аналитического обзора литературных данных, формулировании цели и задач исследования, определении направлений работы, объема и методов исследований, проведении экспериментов и составляет 90%. В осуществлении анализа и обобщении полученных результатов личный вклад автора составляет 100%. Создание математической модели проводилось совместно со специалистами Московского государственного института электроники и математики (технический университет) при частичной поддержке Royal Society (UK) and the London Mathematical Society и РФФИ (грант 0001 00683).

Результаты исследований

Определение патогенности ПМ.

В настоящем исследовании были изучены представители 10 наиболее активно используемых в биотехнологии родов микроорганизмов (28 штаммов). Поскольку принципиальной основой для квалификации штаммов в качестве промышленных является отсутствие патогенности, на первом этапе работы все они были тестированы по показателям токсичности, токсигенности, вирулентности и инвазивности. В таблице 2 результаты этих исследований представлены на примере микроорганизмов рода Candida.

Таблица 2

Результаты изучения патогенности ПМ (на примере микроорганизмов рода Candida)

Наименование микроорганизмов

Показатели патогенности С. maltosa С. tropicalis С. ethanolica С. lipoidica

DV50, КОЕ/жив. В/бр В/ж >10' > Ю10 >10* >1010 >108 >10'° >108 >10'°

Токсичность * Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Токсигенность* Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Инвазивность (доза максимальная 10* КОЕ/жив.)

Способ введения В/ж В/бр В/ж В/бр В/ж В/бр В/ж В/бр

Сроки высева (сутки) 3 11 3 21

Орган-мишень - Печень, селезенка - Селезенка - Печень, селезенка - Селезенка

Примечание: БУ50 - средневирулентная доза В/бр - внутрибрюшинное введение В/ж - внутрижелудочное введение * - Токсичность и токсигенность по критерию гибели. (-) отсутствие эффекта

Полученный результат позволил определить их как непатогенные и перейти к экспериментальным исследованиям с целью обоснования гигиенических нормативов в воздушной среде.

Исследования проводились в направлении идентификации биомаркеров действия промышленных штаммов в условиях хронического ингаляционного воздействия на уровне недействующей, пороговой и действующей концентраций. Оценивалось действие на состояние нервной системы, функции печени, почек, иммунной системы, состояние микрофлоры кишечника, неспецифической клеточной защитной системы респираторного тракта - альвеолярные макрофаги (АМ).

Было установлено, что изученные микроорганизмы не вызывают изменений в показателях состояния нервной системы в ряде тестов открытого поля (вертикальная и горизонтальная компоненты двигательной активности). Достоверность эффекта норкового рефлекса (р < 0,05) не подтверждена результатами корреляционного анализа (г-0,320).

Эти данные подтверждают предположение ряда авторов (Трахтенберг И.М., Тимофиевская Л.А., Квятковская И.Я., 1987) о том, что интегральные показатели нервной системы при действии биологических объектов не могут быть достаточно информативными, т.к. характерным для такого рода объектов является отсутствие токсического эффекта по критерию гибели животных даже при действии высоких доз. Кроме того, эти объекты не обладают способностью проникать через гематоэнцефалический барьер.

Отсутствие общетоксического эффекта изученных микроорганизмов подтверждается результатами тестов, позволяющих оценить сохранность функции печени и почек. Так, активность ферментов сыворотки крови (АсТ и АлТ) не изменялась в результате воздействия всех штаммов и по окончании эксперимента находилась на уровне контрольных показателей. В пользу этих данных свидетельствуют результаты пробы Квика - Пытеля.

Синтез гиппуровой кислоты в моче экспериментальных и контрольных животных после нагрузки бензойно-кислым натрием был на одном уровне.

Отсутствие значимых изменений в показателях белка и хлоридов в моче, а также мочевины в моче и крови свидетельствует об отсутствии токсического действия штаммов на функцию почек.

Эти данные позволили при гигиеническом регламентировании промышленных микроорганизмов в качестве специфических тестов использовать иммунологические показатели, показатели состояния микробного пейзажа толстого кишечника, показатели состояния неспецифической резистентности респираторного тракта. В пользу такого подхода свидетельствуют данные анализа заболеваемости работающих на предприятиях биотехнологической промышленности и проживающих в селитебной зоне. Так, по данным Никифирова Ю.Ф. и соавт. (1980), Селюжицкого Г.В. и соавт. (1979), иммунологические сдвиги определялись уже в первые годы работы на этих предприятиях у значительной части практически здоровых работающих. Отмечены случаи возникновения рецидивов аллергических заболеваний при возобновлении контакта с микроорганизмами-продуцентами. Причем, на заводах по производству БВК, использующих в качестве продуцентов микроорганизмы рода Candida, специфическая сенсибилизация к кандидоносительству выявляется у части лиц, не имеющих непосредственного контакта с готовым продуктом и микроорганизмом продуцентом, отмечено снижение общей резистентности организма по иммунологическим, биохимическим и микробиологическим показателям.

Определение биомаркеров сенсибилизирующего эффекта ПМ.

Экспериментальное изучение сенсибилизирующей активности позволило установить пороговые концентрации в тестах РСАЛ, ППН и ГЗТ и определить значимость этих тестов для гигиенического регламентирования.

Тест РСАЛ оказался более чувствительным для всех изученных видов. Достоверные изменения были получены при действии концентрации

103 КОЕ/м3, (3,0 х 103 - C.maltosa, 3,0 х 103 - C.tropicalis, 1,2 х 103 - С. ethanolica, 2,2 х 103 - С. lipolitica) в то время как в тесте I II III пороговой оказалась концентрация 2,7 х 104 КОЕ/м3 (C.lipolitica) и 3,1 х 10s КОЕ/м3 (C.maltosa C.tropicalis С. ethanolica).

В тесте ППН эффект был установлен для Rhodococcus (mans, erytropolis и rhodochrous) при концентрации 106 и 107 КОЕ/м3, так же как и для представителей рода Pseudomonas (stutzeri и fluorescens). Corinebacterium / Brevibacterium оказывали сенсибилизирующее действие, начиная с концентрации 105 КОЕ/м3 и выше.

Streptomyces, Actinomyces, Proactinomyces, а также Arthrobacter вызывали сенсибилизацию экспериментальных животных в концентрации

104 КОЕ/м3 и выше.

Наиболее выраженным этот эффект был для Acinetobacter и Endomycopsis - пороговая концентрация -103 КОЕ/м3.

В тесте РСАЛ были получены практически аналогичные результаты с той только разницей, что для одного из представителей Rhodococcus (erytropolis) эффект был установлен при действии более высокой концентрации, чем в тесте ППН - 107 КОЕ/м3 , а для Rhodococcus maris и rhodochrous более 107 КОЕ/м3.

При исследовании Streptomyces эффект по этому тесту (РСАЛ) был установлен при действии концентрации 105 КОЕ/м3 , то есть на порядок выше, чем в тесте ППН. По результатам теста ГЗТ пороговые концентрации установлены на тех же уровнях, что и в тесте РСАЛ (Рис. 1).

Результаты, полученные в тестах, определяющих сенсибилизирующую активность штаммов подтверждаются достоверным увеличением эозинофилов периферической крови на пороговых уровнях по тесту ГЗТ и РСАЛ для всех изученных микроорганизмов.

Определение биомаркеров иммуномодулирующего действия ПМ.

Изменения в иммунологических показателях, вызванных изученными штаммами, свидетельствуют об их иммунодепрессивном действии. Биомаркером этого эффекта являются Т лимфоциты. Было установлено достоверное снижение относительного содержания Т лимфоцитов (р < 0,05) и снижение показателей в тестах розеткообразования.

Иммуномодулирующее действие микроорганизмов рода Candida (проявилось в достоверном (р < 0,05) изменении процента ауто-РОК (тимус), Е-РОК, ВСЗ-РОК (селезенка, кровь).

Установлено снижение процентного содержания Т лимфоцитов в общем числе лимфоцитов к концу 4 недели воздействия.

Для С. ethanolica и C.tropicalis эти изменения зафиксированы в концентрации 3,2 х 103 КОЕ/м3 и 3,0 х 103 КОЕ/м3 и выше, а для С. maltosa и С. lipolitica аналогичные изменения происходят при действии более высоких концентраций (4,8 х 10' и 4,1 х 106 КОЕ/м3 соответственно).

В процессе эксперимента удалось зафиксировать достоверные изменения со стороны иммунной системы белых крыс при действии всех исследуемых микроорганизмов, за исключением Corinebacterium qlutamicum и Brevibacterium flavum. Максимально достижимая в условиях настоящего эксперимента концентрации - Ю' КОЕ/м3 этих ПМ не вызывала достоверных изменений ни в одном из изучаемых показателей.

Слабым иммуномодулирующим эффектом обладают представители рода Rhodococcus.

Rhodococcus maris, erytropolis и rhodochrous лишь в концентрации 10' КОЕ/м3 вызывают изменения в периферической крови (снижение процента Т-лимфоцитов). Представители Acinetobacter также изменяют содержание Т лимфоцитов периферической крови, а кроме того, увеличивают процент Ауто-РОК селезенки и снижают показатели ВС-РОК в селезенке и периферической крови. Эти изменения происходят при действии микроорганизмов в концентрации 106 - 10' КОЕ/м3 . ПМ рода Pseudomonas при действии в этих же концентрациях вызывают изменения только в показателях периферической крови (снижение Т лимфоцитов, а также снижение процента Ауто-РОК), a Arthrobacter вызывают достоверное увеличение одного показателя - массового коэффициента тимуса (концентрация 106 КОЕ/м3). Следует отметить, что это единственный штамм,

который вызывал изменения весовых коэффициентов иммунокомпетентных органов.

Представителей рода Endomycopsis также нельзя отнести к выраженным иммуномодуляторам. Несмотря на то, что концентрация этих микроорганизмов, вызывающая достоверные изменения в показателях иммунитета на порядок ниже, чем у предыдущих (105 КОЕ/м3), однако сами изменения не очень ярко выражены и касаются лишь одного показателя -титра AT к эритроцитам барана.

Streptomyces и Actinomyces реализуют свое действие начиная от концентрации 103 и выше. Представители этих родов достоверно снижают показатель Ауто-РОК тимуса, Е-РОК селезенки, Ауто-РОК периферической крови (Actinomyces) и Е-РОК периферической крови (Streptomyces).

Proactinomyces в концентрации 104 вызывают изменения только одного показателя - снижение Е-ЮК периферической крови (Таблицы 3,4,5).

Определение биомаркеров антибактериальной активности ПМ.

Микробный пейзаж толстого кишечника экспериментальных животных (белые крысы) при хроническом ингаляционном поступлении всех исследуемых представителей рода Candida изменялся, начиная с концентрации 103 КОЕ/м3 .

Увеличилось количество стафилококков, фекальных стрептококков. В то же время, количество лактобацилл резко снизилось. В восстановительном периоде эти показатели возвращались к уровню фоновых, однако, достоверно увеличивалось количество кишечной палочки. Качественные изменения микрофлоры толстого кишечника были идентичными при действии всех изученных видов рода Candida. Разница заключалась лишь в количественных показателях.

Изменения в микробном пейзаже толстого кишечника, вызываемые представителями рода Rhodococcus были зафиксированы при действии

Изменения иммунологических показателей белых крыс при хроническом ингаляционном воздействии ИМ (Тимус)

Род ПМ Концентрация КОЕ/м3 (пороговая) Массовый коэффициент, усл.ед. Ауго-РОК, % Е-РОК, %

К О К О К О

ШюсЬсоссш 10' 0,27±0,03 0,27±0,07 18±3,7 18,8±9,1 22,1*4,7 21,8*7,5

АстеюЬайег 10' 0,24±0,01 0,23*0,02 23*6,3 23±6,7 23±5,3 24*1,8

РцеиЛэптогш 10' 0,29±0,01 0,27±0,02 19,0*1,7 18,2±3,8 17,4±2,1 17,1±4,8

АпИгоЬас{ег 10" 0,27±0,01 0,42±0,09* 21*5,3 22*2,1 21±4,3 22±10,1

Еп<1отусор$1з 10' 0,15±0,03 0,18*0,05 15,5*1,9 15,0*2,9 16,0±2,1 16,1*7,3

Ргоасйпотусев ю4 0,24*0,07 0,22*0,09 23*6,3 23±5,1 23*5,29 24±11,6

Биеримпусез ю4 1,6±0,2 1,5±0,7 17,5*1,8 13,8*2,1* 18,0±2,1 18,1±5,3

0,16±0,01 0,19*0,03

Айтотусез 104 0,27±0,01 0,29*0,06 21 ±0,9 15*1,3* 22±3,1 21*3,1

Candida ю1 2,8±0,1 2,8 ±0,32 19,0*2,3 13,0*1,9* 20,0±1,8 20,0±3,2

Таблица 4

Изменения иммунологических показателей белых крыс при хроническом ингаляционном воздействии ПМ (селезенка)

РодПМ Пороговая конц, КОЕ/м3 Ауго-РОК, % Е-РОК, % ВС-РОК, %

К О К О к О

Мюс1ососс1И 10'' 27,3±1,8 27,0*1,1 19,2*0,9 20,1±2,4 23,8±1,8 25,4*3,7

АстеШЬайег 10' 37,0±3,5 43,0*1,5* 34,0±4,3 36,016,4 19±2,7 15,3*2,1*

РяжЦтопав ю7 14,4±1,8 15,1±5,6 21,1*1,9 20,0±3,7 27,4*1,9 22,5±4,8

АгАгоЬайег 106 26±3,5 27±9,7 24±4,3 22±4,8 19±2,1 1719,7

Endomycops¡s 105 14,0±4,1 13,8±3,9 16,9*7,0 17,1 ±8,8 44,0±4,0 44±2,0

Ргоамтошусев ю« 37*13,5 39±9,6 34±4,3 32*4,8 19*2,7 17±9,6

в^ерЮтусев "¡г 16,0*3,1 17,9*7,3 18,9*5,0 16,1*3,5* 43±10,1 42±5,5

Асипотусев 103 12*2,7 15±9,1 29±5,3 16*9,6* 30*5,1 29±5,1

СагкМа 101 П,0±4,1 16,0±1,1 30,0±5,1 17,0*1,0* 40,0±5,2 31,0*5,0*

Примечание: * р < 0,05

РОК -Розеткообразующие клетки Е-РОК -РОК с эритроцитами барана ВС-РОК - РОК с зимозан комплементом

Иммунологические показатели периферической крови белых крыс при _ хроническом ингаляционном воздействии ПМ_

РодПМ Пороговая конц, КОЕ /м5 Ayro-POK, % E-POK, % BC-POK

К О К О к О

Rhodococcus 10' 31,2±3,9 31,9±4.1 29,4±l,l 30±2,9 34,fti2.8 33.1±7,7

Acmetobacter 10s 36±3,4 35±1,1 46*3,6 45±2,9 23±2,7 I7±l,7*

Pseudomonas 10' 20,1*2,1 12,5±0,9* 38, l±2,l 37,6±4,9 49,4+3,5 47,1±6,8

Arthrobacter 10" 25±5,0 24±2,6 34±2,l 35±3,6 23±9,1 23±2,7

Endomycopsis 10' 14,1±7,7 14,3±4,1 27±7,1 28±3,5 52il8,7 52±9,7

Proactinomvces 104 36±3,4 35±6,0 46±3.6 23±1,1* 23±2,7 19±9,1

Streptom>ces 13,1±6,8 12,5±3,5 24±7,1 12*1,1* 52±19,6 56±5,1

Actinomyces 18,0±3,1 10,t±l.l* 22±2,1 21±1,3 57±10,2 56±1,8

Candida 10J 16.9±2,1 16,8±3,7 26,0*5,3 13±2,5* 53±10,5 54,0±9,8

Примечание- * р < 0,05 ; РОК - розеткообразующие клетки, Е-РОК - РОК с эритроцитами барана

Таблица 6

Биомаркеры антибактериального эффекта ПМ

Наименование рода ПМ Пороговая концентрация, КОЕ/м3 Кишечная палочка Стафилококк Фекальный стрептококк Лактобациллы

Rhodococcus 10' т - - -

Acinetobacter 103 т f i -

Pseudomonas ю' - ш4 т i i -

Arthrobacter ю4 1 t - -

Endomycopsis 10} т I 1 -

Proactinomyces Ю* 1 Г - -

Streptomyces ю> г т - -

Actinomyces 103 г - - -

Candida 10* - ! t 1

Coiynebact/Brevibact ю5 1 - - -

Примечание: | - достоверное увеличение показателя КОЕ/г) 1 - достоверное снижение показателя (Ц КОЕ/г) * - количество стафилококка, устойчивого к ристомицину не

изменялось.

достаточно высокой концентрации (10' КОЕ/м3) и проявлялись лишь в увеличении количества кишечной палочки.

Реакция кишечной флоры на поступление Acinetobacter (species и oleovorum) в концентрациях 105 КОЕ/м3 и выше проявлялась в виде увеличения количества кишечной палочки, стафилококка и снижения уровня фекального стрептококка. Изменения не носили необратимого характера и по окончании восстановительного периода возвращались к уровню фоновых.

Представители рода Corynebacterium/Brevibacterium вызывали изменения только одного показателя - количества кишечной палочки (пороговая концентрация - 3,2 х 105 КОЕ/м3). К концу 4 недели затравки происходило достоверное снижение количества этого микроорганизма в содержимом просвета толстой кишки, однако к концу восстановительного периода отличий не было ни от контроля, ни от фоновых показателей.

Антимикробное действие явилось лимитирующим критерием вредности для всех исследуемых микроорганизмов рода Pseudomonas.

Хроническое интраназальное поступление P.fluorescens в концентрации 104 КОЕ/м3 вызывало достоверное увеличение содержания кишечной палочки и снижение фекального стафилококка, по сравнению как с фоновыми показателями, так и с контролем. Однако, действие P.stutzeri проявилось и на более низкой концентрации (103 КОЕ/м3 ). Установлено увеличение количества кишечной палочки на фоне снижения стафилококка и фекального стрептококка.

Дисбиотическое действие Proactinomyces проявилось угнетением роста кишечной палочки, стафилококка при поступлении микроорганизма в концентрации 103 КОЕ/м3 и выше, при этом на уровне пороговой концентрации количество стафилококка, устойчивого к ристомицину, не изменялось.

При исследовании антибактериального действия S.fTadiae установлены изменения микробного пейзажа толстого кишечника, начиная с концентрации 105 КОЕ/м3 к концу 4 недели затравки, проявляющиеся в

увеличении количества кишечной палочки и фекального стрептококка. Изменения в количественном и качественном составе микрофлоры толстого кишечника, которые возникают при хроническом ингаляционном воздействии промышленных микроорганизмов, по нашим данным носят неспецифический характер. Биомаркерами этого эффекта является кишечная палочка, фекальный стрептококк (Таблица 6). Корреляционно-регрессионный анализ количественного показателя кишечной палочки, протея и фекального стрептококка позволил определить связь изменений микрофлоры с показателями клеточного иммунитета. Так, существует обратная корреляция между уровнем Е-РОК селезенки и периферической крови и количеством фекального стрептококка в толстом кишечнике. (г-0,69-0,73). Диссоциация кишечной флоры, выявленная нами в эксперименте не может быть связана с прямым воздействием изученных штаммов, т.к. на первом этапе исследования было установлено, что эти штаммы не обладают способностью к инвазии и диссеминации во внутренние органы. Поэтому результаты, полученные при корреляционном анализе, позволяют предположить, что изменения в микрофлоре в данном случае обусловлены снижением активности клеточного звена иммунитета и, как следствие, общей резистентности организма.

Определение биомаркеров действия ПМ на неспецифическую клеточную защиту респираторного тракта.

Изучение состояния одного из компонентов неспецифической клеточной защиты респираторного тракта - пула AM позволило установить, что достоверные изменения в количественных и функциональных показателях пула альвеолярных макрофагов в ответ на ингаляционное поступление непатогенных штаммов возникают на уровне пороговых концентраций эффектов, которые были приняты в качестве лимитирующих.

При изучении влияния ПМ на количественные и качественные показатели состояния AM было установлено, что общая картина реакции на ингаляционное поступление ПМ не зависит от топономии микроорганизма.

Реакция пула альвеолярных макрофагов включает в себя несколько стадий как по количественному (общее число AM), так и по функциональным показателям (активность лизосомальных ферментов, способность AM к адгезии).

Пороговые концентрации по этим эффектам разные у представителей различных родов ПМ, но у разных видов внутри одного рода находятся практически на одном уровне.

К концу 1-ой недели воздействия поступление большинства родов ПМ вызывает достоверное увеличение количества AM.

(Rhodococcus, Coiine/Brevibacteiium, Endomycopsis, Streptomyces, Actinomyces, Pseudomonas). Представители других родов ПМ (Acinetobacter, Proactinomyces, Arthrobacter) также вызывают рост числа AM, однако изменения этого показателя становятся достоверными только на 2 неделе затравки.

К концу экспозиционного периода происходит резкое снижение этого показателя во всех опытных группах животных, по сравнению с контролем (Рис.2).

На фоне роста количества AM происходит снижение процента жизнеспособных клеток. На уровне пороговых концентраций по данному эффекту представители родов Actinomyces и Arthrobacter вызывают достоверные изменения показателя уже на 2-ой неделе воздействия; Rhodococcus и Pseudomonas - на 3-ей неделе, а остальные - к концу 4 недели (Рис. 3).

Одновременно изменяется способность AM к адгезии - снижается процент адгезии. Впервые достоверное изменение этого показателя регистрируется на 2-ой неделе затравки при действии Rhodococcus, Actinomyces и Arthrobacter на уровне пороговых концентраций по данному

эффекту. К концу 4 недели эксперимента процент адгезии АМ снижается во всех опытных группах. Причем максимальное снижение вызывают представители рода Ргоасйпошусев (до 42% ± 3,0 против 80% ± 4,3) (Рис.4).

При определении активности лизосомальных ферментов АМ, а именно глюкозаминидазы,

было установлено, что при действии ПМ в пороговых концентрациях по данному эффекту и выше на протяжении 1-3 недели воздействия происходит увеличение общей активности ферментов. Достоверным этот показатель становится на 2-3 неделе, а к концу 4-ой - общий показатель активности может быть даже ниже контрольного.

Таким образом, все изученные ПМ, попадая в респираторный тракт, на первой стадии вызывают увеличение функциональной активности пула АМ, на что указывает достоверное увеличение количества АМ, процента адгезии этих клеток и коррелирующее с этими показателями увеличение активности лизосомальных гидролаз АМ. Т.е. имеет место фаза декомпенсации (первичной реакции), которая затем сменяется фазой компенсации. Однако, продолжительная экспозиция пороговых и действующих концентраций ПМ вызывает как истощение процесса образования АМ и поступления их в респираторный тракт, так и увеличение количества АМ с пониженной секреторной функцией в фазу декомпенсации. (Рис.5). Следствием этого является снижение функциональной эффективности лимфоцитов, т.к. взаимодействие макрофагов с лимфоцитами в индукции иммунного ответа осуществляется не только путем прямого контакта антигенной детерминанты иммунного макрофага с антиген распознающими рецепторами Т-лимфоцитов, но и путем секреции макрофагами различных медиаторов, влияющих на функцию Т-лимфоцитов. Кроме того, существует и обратная связь - воздействие лимфокинов, секретируемых Т-лимфоцитами на активность АМ. В процессе корреляционного анализа была установлена связь иммунодепрессивного эффекта, определяемого в тесте розеткообразования лимфоцитов с

Рис. 2. Изменение количества альвеолярных макрофагов (AM) при хроническом ингаляционном воздействии промышленных микроорганизмов (на примере рода Candida)

Ряд 1 - % минимальное отклонения от контроля, ряд 2 - % максимального отклонения от контроля, ряд 3 - % среднего отклонения от контроля. Ряд 4 - контроль. Ось X: 1 - 4 - недели экспозиции, 5 - восстановительный период

120%

1 2 3 4 5

Продолжительность воздействия (медали)

Рис. 3. Изменение процента жизнеспособных альвеолярных макрофагов (AM) при хроническом ингаляционном воздействии промышленных микроорганизмов (на примере рода Candida)

Ряд 1 - % минимальное отклонения от контроля, ряд 2 - % максимального отклонения от контроля, ряд 3 - % среднего отклонения от контроля. Ряд 4 - контроль. Ось X: 1 - 4 - недели экспозиции, 5 - восстановительный период.

1 2 3 4 5

Продолжительность воздействия (недели)

Рис. 4. Изменение процента адгезии альвеолярных макрофагов (AM) при хроническом ингаляционном воздействии промышленных микроорганизмов (на примере рода Candida)

Ряд 1 - % минимальное отклонения от контроля, ряд 2 - % максимального отклонения от контроля, ряд 3 - % среднего отклонения от контроля. Ряд 4 - контроль Ось X: 1 - 4 - недели экспозиции, 5 - восстановительный период

Продолжительность воздействия (недели)

Рис. 5 Фазы ответа пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное воздействие

ПМ

Ряд 1 - количество АМ, ряд 2 - процент жизнеспособных клеток, ряд 3 - процент адгезии, ряд 4 - общая активность В- галакгозидазы, ряд 5 - общая активность В-глкжозидазы, ряд б -общая активность ЫацетилВОглюкозаминидазы.

абсолютным количеством AM (r = 0,73-0,78) и общей активностью изученных ферментов (г = 0,70-0,73 -Р-гал: 0,69-0,73 - р-глюк и 0,67-0,71 -N-ацетил pD глюкоз). Корреляция выражена на уровне пороговых и действующих концентраций.

Полученные данные указывают на то, что снижение общего количества AM и их секреторной активности оказывает депрессивное действие на клеточное звено иммунитета.

О нарушении проницаемости клеточных мембран свидетельствует тот факт, что на 3-ей неделе затравки большинством ПМ регистрируется свободная активность лизосомальных ферментов Исключение составляют продуценты антибиотиков - представители родов Proactinomyces, Streptomyces, Actinomyces. Эти микроорганизмы вызывают появление свободной активноспр -галактозидазы, Р -глюкозидазы и N-ацетил РД глюкозаминидазы уже на 2-ой неделе (Таблица 7).

Причем, если в процессе восстановления после ингаляционного воздействия ПМ все исследованные показатели состояния AM как количественные, так и качественные, возвращаются к исходному уровню, изменения, вызванные этими микроорганизмами, сохраняются.

Установленный в процессе эксперимента факт выхода лизосомальных гидролаз за пределы клеточных мембран, биомаркером которого является неседиментированная (свободная) активность ферментов, может быть расценен как результат мембраноповреждающего эффекта изученных штаммов. Это утверждение, по всей вероятности, справедливо для одного из изученных представителей рода Candida и некоторых продуцентов антибиотиков (актиномицеты, стрептомицеты, проактиномицеты), т.к. по окончанию восстановительного периода после воздействия именно этих микроорганизмов этот показатель сохраняется.

Однако, следует иметь в виду, что выход из макрофагов лизосомальных ферментов является одним из механизмов внеклеточного

Сроки регистрации свободной активности ферментов на уровне пороговых концентраций

РодПМ Концентрация КОЕ/м3 Сроки обследования, недели

1 2 3 4 Реабил.

янсюососсш 106 _ + + _

АСШЕТОВАСТЕЯ 3 10 + +

СОЛЩЕВАСТЕШиМ ю4 - - + + -

ЕИШМУСОРЗК 3 10 _ _ + + _

РЯОАСТШОМУСЕБ 3 10 _ + + + +

БтаЕРТОМУСЕБ ,о4 _ + + + +

АСТШОМУСЕБ 3 10 _ + + + +

РБЕЦЕЮМО^ 4 10 _ _ + +

АЯТШОВАСТЕЯ 4 10 _ _ + + _

САШША 3 10 - - + + +

Примечание: «+»- наличие эффекта,«-»- отсутствие эффекта.

уничтожения микроорганизмов. Существование такого феномена было доказано в отношении ряда непатогенных микроорганизмов и, по всей вероятности, имеет место в отношении остальных изученных штаммов. В пользу этого предположения свидетельствует исчезновение свободной активности по окончании периода восстановления.

Математическое моделирование неспецифического клеточного ответа на ингаляционное поступление ПМ.

При исследовании реакции пула АМ на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов был установлен факт качественной идентичности ответа вне зависимости от таксономической принадлежности штамма. Кроме того, была определена высокая информативность комплекса показателей клеточного ответа, а так же корреляционная связь биомаркеров реакции пула АМ и клеточного звена иммунитета. Все это позволило использовать пул АМ в качестве базового при создании математической модели реакции защитных механизмов респираторного тракта в ответ на поступление промышленных микроорганизмов.

Построение «жизнеспособного» математического описания, в рамках которого объяснимы количественные изменения факторов процесса возможно только при детальном изучении взаимодействий, происходящих на уровне клеточных популяций и результатов экспериментальных исследований.

При создании математической модели были выбраны и описаны элементы пространства состояния процесса, основополагающей компонентой которого является количественное содержание АМ в альвеолах. Патогенетичекая схема процесса реакции пула АМ на поступление ПМ представлена на рисунке 6.

При построении уравнений модели учитывали непатогенный характер промышленных микроорганизмов, и неспецифичность реакции пула АМ на непатогенный штамм. Эти факты дают возможность в рассматриваемом нами случае значительно упростить математическое представление

Математическая модель строится исходя из предположения о том, что совокупности различных типов клеток, рассматриваемых нами в качестве участников общего процесса защиты легочного тракта от воздействия внешней среды, объединены в клеточные пулы. Уравнения, которые затем

Вдыхаемый воздух

Рис, б. Патогенетическая основа построения математической модели реакции пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов

"ОС национальная! библиотека | 33

СПетербург ( 09 Ш акт [

составляются, отражают баланс количественных соотношений между пулами в результате межклеточных взаимодействий и процессов, протекающих в организме. При составлении уравнений учитывается не только характер межклеточных взаимодействий, но и возможности дополнительных факторов, влияющих на процессы преобразования в составах пулов. В качестве компонент вектора состояния рассматриваются непрерывные действительные функции времени, описывающие концентрации различных типов клеточной массы. Тип клеток соответственно определяет тип пула и, следовательно, переменную вектора состояния процесса.

В Таблицах 8 и 9 перечислены переменные и дано их краткое описание, а также представлена система из шести дифференциальных уравнений, описывающих процесс количественной реакции АМ в ответ на ингаляционное поступление ПМ в зависимости от продолжительности и интенсивности воздействия.

Данные, полученные в результате математического моделирования показали, что модель может быть использована для оценки продолжительности восстановительного периода в зависимости от интенсивности и длительности поступления ПМ в респираторный тракт.

В математической модели предусмотрена возможность прогнозирования реакции пула АМ при прекращении действия ПМ в различные моменты времени, отличные от тех, которые использовались при лабораторных испытаниях. Кроме того, в математической модели есть реальная возможность задавать произвольный уровень поступления ПМв респираторный тракт, не обязательно постоянный, и на этом фоне прогнозировать изменения количественных и качественных показателей состояния неспецифической клеточной защиты респираторного тракта в зависимости от времени.

Переменные математической модели ответа пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов

ПЕРЕМЕННЫЕ ОПИСАНИЕ ПЕРЕМЕННЫХ

Мв Количество моноцитов крови

м, Количество моноцитов в интерсгиции

МА Количество "активных" альвеолярных макрофагов

MD Количество "неактивных" альвеолярных макрофагов

S Интенсивность воздействующего фактора (промышленные микроорганизмы)

D Фоновая нагрузка

В качестве программного инструментария модели предлагается использовать MMS V.5 Beta, который позволяет исследовать параметрические особенности широкого круга нелинейных моделей при различных типах нелинейностей и различных начальных условиях процессов.

Созданный универсальный программный комплекс является открытой системой и допускает возможность расширения своих функций. В частности одним из направлений такого расширения может быть увеличение размерности обрабатываемых систем дифференциальных уравнений, т.к. конструкция алгоритма это предусматривает без принципиальной перестройки последнего.

Система уравнений модели ответа пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов

| ~МВМВ(р}А 0)

Шло - (0+Мв (0)]М/ (/)+аюМ, (ОД/)} Д

(2)

(3)

II -УмрМр(0-Пмо(1)Мо(1)}А

(4)

| аГ

(5)

Гигиеническая классификация промышленных штаммов микроорганизмов и регламентирование их в воздушной среде.

На основании анализа полученных результатов исследований и более чем двадцатилетнего опыта регламентирования промышленных микроорганизмов в нашей стране, с учетом рекомендаций Европейской федерации биотехнологии разработана классификация ПМ по степени опасности, исходя из следующих критериев:

- Уровень ЛКВД по результатам хронического эксперимента

- Величина гигиенического норматива с учетом возможности диссоциации штаммов в условно- патогенную форму (Таблица 10).

Согласно предложенной гигиенической классификации можно отнести изученные штаммы ПМ к следующим классам опасности:

К I классу чрезвычайно опасных микроорганизмов относятся представители родов: Candida, Endomycopsis, Pseudomonas;

Ко 2 классу - высокоопасных - представители родов: Actinomyces, Arthrobacter, Streptomyces;

К 3 классу - опасных - представители родов Brevi/Corynebacteiium К 4 классу- малоопасных- представители рода - Rhodococcus.

Результаты собственных исследований и анализ опыта гигиенического нормирования промышленных микроорганизмов в объектах производственной и окружающей среды позволяет усовершенствовать существующую схему проведения экспериментальных работ (Таблица 11).

На первом этапе при проведении сбора информации об исследуемом штамме, помимо существующего комплекса данных, рекомендуется получить информацию о возможности и условиях диссоциации непатогенного штамма в условно-патогенный.

На втором этапе при проведении хронического эксперимента рекомендуется использовать критериальный комплекс, характеризующий функциональную компетентность пула AM, не только как систему

Гигиеническая классификация промышленных микроорганизмов по степени опасности

Показатели Класс опасности

1 Чрезвычайно опасные 2 Высоко опасные 3 Умеренно опасные 4 Мало Опасные

Порог ЖВД КОЕ/м3 <5000 5000-50000 50000-500000 >500000

ПДК р.з. КОЕ/м3 <500 500-5000 5000-50000 50000

Примечание: - При наличии сведений о патогенных свойствах представителей того же таксона (что указывает на возможность диссоциации непатогенного штамма в патогенный) класс опасности штамма микроорганизмов снижается.

- ЛКВД - лимитирующий критерий вредного действия

- КОЕ- колониеобразующие единицы

высокофагоцитирующих клеток, но и как центральное звено в индукции клеточного иммунного ответа на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов вне зависимости от их таксономической принадлежности.

По предлагаемой схеме были проведены экспериментальные исследования, на основании которых установлены ПДК р.з. и ПДК атм. представителей 10 родов ПМ, наиболее востребованных в биотехнологии. Представители родов Candida, Acinetobacter, Pseudomonas и Endomycopsis являются наиболее опасными из изученных непатогенных микроорганизмов на что, кроме уровня пороговой концентрации по ЛКВД и уровня гигиенического норматива указывает наличие патогенных форм в таксоне (Ред. Дж. Хоулта, 1980; Д.Саттон, А.Фотергилл, М.Ринальди, 2001).

Схема токснколого-гвгненических исследований промышленных микроорганизмов при гигиеническом

регламентировании их в воздушной среде

I Этап II Этан III Этап

1. Сбор информации о свойствах микроорганизма, способах его получения, назначении и предполагаемом объеме производства с учетом данных о возможности диссоциации в условно-патогенную форму ( наличие патогенов в таксоне) 1. Проведение экспериментальных работ с целью определения лимитирующего критерия вредного действия; установление пороговой концентрации по лимитирующему эффекту (сенсибилизирующему, иммунотоксическому, дисбиотическому) с учетом изменений в функциональном состоянии неспецифической клеточной защиты респираторного тракта(пул альвеолярных макрофагов) Корректировка ПДК по данным клинико-гигиенических исследований (снижение общей резистентности к инфекционным агентам, рост неспецифических заболеваний легких, аллергических заболеваний, кандидозов и кандидоносительства)

2. Первичная токсикологическая оценка по результатам определения вирулентности токсичности, токсигенности и инвазивности 2. Разработка метода контроля

Результаты Результаты Результаты

Квалификация штамма в качестве промышленного Определение необходимости нормирования Определение необходимого и достаточного объема дальнейших исследований Обоснование ПДК и определение класса опасности Подтверждение существующего уровня ПДК Корректировка существующего уровня ПДК

Запрет на выброс Нецелесообразность разработки нормативов

чО

Таким образом, результаты работы позволили определить комплекс биомаркеров основных эффектов промышленных микроорганизмов, установить значимость показателей функционального состояния неспецифической клеточной защиты респираторного тракта при ингаляционном воздействии ПМ и на базе этих данных научно обосновать критериальную и прогностическую значимость гигиенических исследований при регламентировании промышленных микроорганизмов в воздушной среде; усовершенствовать схему проведения исследований с целью гигиенического регламентирования промышленных микроорганизмов и разработать гигиеническую классификацию их по степени опасности.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ эффектов промышленных микроорганизмов при ингаляционном поступлении выявил комплекс значимых показателей, характеризующих формирование гиперчувствительности замедленного типа, иммунодепрессии в отношении клеточного звена иммунитета, дисбактериоза толстого кишечника, а также истощения адаптивных механизмов неспецифических клеточных факторов защиты респираторного тракта

2. Установлена идентичность биомаркеров сенсибилизирующего, иммунотоксического и антибактериального действия для всех изученных штаммов и зависимость степени выраженности эффектов от таксономической принадлежности микроорганизма

3. Определен критериальный комплекс исследований неспецифического клеточного ответа мононуклеарной фагоцитирующей системы респираторного тракта на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов, включающий следующие показатели:

абсолютное количество клеток, процент жизнеспособных клеток, процент адгезии, активность лизосомальных гидролаз (общая и свободная).

4. Дозозависимые изменения количества альвеолярных макрофагов и их секреторной активности на пороговых и действующих уровнях являются унифицированным критерием установления фаз развития реакции на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов, характеризующихся повышением количественных и качественных показателей (фаза первичных реакций), сменяющейся их нормализацией (фаза компенсации) и снижением показателей (фаза декомпенсации).

5. Установлена высокая критериально-прогностическая значимость снижения секреторной активности пула альвеолярных макрофагов в развитии иммунодепрессивного эффекта, подтвержденная наличием достоверной связи между показателями общей активности Р-галактозидазы,

Р- глюкозидазы и Ыацетил 00- глюкозаминидазы и активностью лимфоцитов в тестах розеткообразования (г= 0,69-0,73 ).

6. Подтверждена гипотеза о возможности внеклеточного уничтожения промышленных (непатогенных) микроорганизмов в результате выхода лизосомальных ферментов макрофагов за пределы клетки

7. Разработана гигиеническая классификация, позволяющая оценивать промышленные микроорганизмы по степени опасности в зависимости от уровня порога по лимитирующему критерию вредного действия, величины гигиенического норматива и возможностью диссоциации штамма в условно-патогенную форму.

8. Разработана математическая модель прогноза динамики реакции пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов.

9. Научно обоснованы и внедрены в практику здравоохранения критериальный комплекс и классификация оценки опасности ПМ, а также схема их гигиенического регламентирования, которые явились основой для разработки профилактических мероприятий по охране здоровья человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Меркурьева Л.В., Аулика Б.В., Божко А.Н., Сергеюк Н.П. Значение функционального состояния альвеолярных макрофагов и моноцитов периферической крови для оценки защитных реакций и повреждения клеток при действии продуктов микробиологического синтеза // Материалы Всесоюзной научной конференции «Биологический фактор -производственная и окружающая среда - здоровье человека»: Сб. трудов. -Новополоцк. - 1984. - С.47.

2. Система биохимических, цитологических, цитохимических и электронномикроскопических критериев оценки функционального состояния альвеолярных макрофагов человека и экспериментальных животных при действии факторов окружающей среды / Ред. Г.Т.Сидоренко. Методические рекомендации. М., -1984. - 27 с.

3. Буянов В.В., Сергеюк Н.П., Каплунов Ю.В. Гигиеническое нормирование условно-патогенных микроорганизмов на примере E.Coli // Гигиена труда и профессиональные заболевания -1990. - № 8. - С. 27-30.

4. Буянов В.В., Каплунов Ю.В., Сергеюк Н.П., Апенова Н.Н. К вопросу гигиенического нормирования микроорганизмов (на примере Serratia marcescens штамм ВКМ-851) // Гигиена и санитария. -1991. - № 2. -С.6-9.

5. Багдасарьян Г.А., Сергеюк Н.П. Токсиколого-гигиеническая оценка действия дрожжеподобных грибов рода Candida на организм теплокровных животных и человека (состояние проблемы).// Токсикологический Вестник, 1994. -№ 6. - С. 18-21.

6. Буянов В.В., Сергеюк Н.П., Сон Г.В. Результаты гигиенического нормирования сухой биомассы женьшеня // Токсикологический Вестник. -1994.-№6.-С. 22-25.

7. Сергеюк Н.П., Походзей Ю.И. Токсикология промышленных микроорганизмов и продуктов микробиологического синтеза // Токсикологический Вестник.- 1994. - № 6. - С. 5-10.

8. Багдасарьян ГЛ., Карамышева А.В., Сергеюк Н.П. Arthrobacter terregens (Штамм ВСБ-570) // Токсикологический Вестник. - 1994. - № 6. -С. 44.

9. Багдасарьян ГА, Карамышева А.В., Сергеюк Н.П., Бару Р.В. . Продуцент неомицина Streptomyces fradiae (Штамм ЛИАЗ-0306) //

Токсикологический Вестник. - 1994. - № 6. - С. 43.

10. Багдасарьян ГА, Карамышева А.В., Сергеюк Н.П., Бару Р.В. Продуцент Мономицина Actinomyces circulatus var. monomycini (штамм Л 31-13) // Токсикологический Вестник. -1994. - № 6. - С. 43-44.

11. Сергеюк Н.П., Багдасарьян ГА Микроорганизмы рода Rhodococcus // Токсикологический Вестник. - 1995. - № 6. - С.39.

12. Багдасарьян ГА, Сергеюк Н.П., Карамышева А.В. Продуцент брунеомицина Streptococcus albus var bruneomycini (штамм - ACB) // Токсикологический Вестник. -1995. - № 1. - С.64.

13. Сергеюк Н.П. О приоритетности критериев опасности веществ биологической природы // Конференция «Актуальные вопросы теоретической и прикладной токсикологии»/Тезисы доклада.- С. Петербург, 1990.-С. 123.

14. Сергеюк Н.П. Endomycopsis fibuliqera ВСБ-12 // Токсикологический Вестник. - 1996. - № 1. - С. 28.

15. Сергеюк Н.П., Григоренко А.С., Дудов Д.Е. Математическая модель механизма неспецифической клеточной защиты респираторного тракта при ограниченном ингаляционном воздействии промышленных штаммов микроорганизмов //I Съезд токсикологов России. /Тезисы доклада. М., 1998.-С. 316

16. Измеров Н.Ф., Молодкина Н.Н., Корбакова А.И., Сергеюк Н.П. и др. Гигиенические критерии оценки и классификация условий труда по

показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса. -М.: Гигиена труда, 1999. -190 с.

17. Курляндский БА., Сергеюк Н.П., Багдясарьян ГА. Основы государственной регистрации промышленных микроорганизмов // Биотехнология - народному хозяйству 2000/ АООТ «Биохиммаш».-МоскваДОО -С.40-41

18. Курляндский Б.А., Багдясарьян Г.А., Сергеюк Н.П. Основы, государственной регистрации промышленных микроорганизмов // Материалы 4-ого Международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнологии-2000»/ Сб. трудов. - Пущино ИБФМ РАН, - 2000. - С. 40-41

19. Курляндский Б. А., Сергеюк Н.П., Багдасарьян Г. А. Биологические вещества: основы государственной регистрации//Гигиеническая наука и практика на рубеже XXI века / IX Всероссийский съезд гигиенистов и санитарных врачей. М, - 2001. -Т. 1. - С. 496-498

20. Немыря В.И., Багдасарьян ГА, Сергеюк Н.П. Принципы гигиенического нормирования биологических поллютантов в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе населенных мест// Гигиеническая наука и практика на рубеже XXI века / IX Всероссийский съезд гигиенистов и санитарных врачей. М,- 2001. -Т.1. - С. 539-541

21. Сергеюк Н.П., Григоренко А.С., Дудов Д.Е., Чулков П.В. Математическое моделирование при проведении гигиенической регламентации микроорганизмов. // Гигиеническая наука и практика на рубеже XXI века/Материалы IX всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей. М,- 2001.-Т.1.- С.618-619.

22. Далин М.В., Немыря В.И., Багдасарьян Г.А., Сергеюк Н.П., Шеина Н.И. и др. Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов

в атмосферном воздухе населенных мест. - М: Гигиенические нормативы, 2001.- 11с.

23. Рахманин Ю.А., Багдасарьян Г.А., Немыря В.И., Сергеюк Н.П. Принципиальные подходы к нормированию биологических загрязнений. Гигиена и санитария. - 2001.- № 1.-С 12-15

24. Шеина Н.И., Сергеюк Н.П. и др. Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны. -М: Гигиенические нормативы, 2002. -63с.

25. Силаев А.А., Карамышева А.В., Походзей Ю.И., Сергеюк Н.П. Панкреатин // Токсикологический Вестник, -2002. -№ 5. -С. 7-9

26. N.I. Koroleva, Х.Мао, N.P. Serqeyuk Numercial Simulation of the Processes in the Pulmonary Tract with Delay under Random Perturbation. Proceedinqs. Materials of the 7th World Multiconterence on systemics, Cebemetics and Gntormatics (SCI 2003) Orlando, Florida, USA, July 27-30, 2003,T. 5 P. 220-226

27. N.I. Koroleva, X.Mao, N.P. Serqeyuk Numercial Simulation of the Processes in the Pulmonary Tract with Delay under Random Perturbation. Proceedinqs. The 7th World Multiconterence on systemics, Cebemetics and Gntormatics (SCI 2003) Orlando, Florida, USA, July 27-30, summary, 2003. P.27

28. Сергеюк Н.П., Супрун И.П., Буянов В.В. Таксономия, классификация и параметры токсикометрии промышленных микроорганизмов. - М, 2003. - 135с.

29. Сергеюк Н.П., Супрун И.П., Буянов В.В. (при участии Королевой Н.И.) Санитарно-эпидемиологическое нормирование промышленных микроорганизмов. - М, 2003. - 287с.

30. Сергеюк Н.П., Супрун И.П., Буянов В.В. Токсикология промышленных микроорганизмов. - М, 2003. - 127с.

31. Сергеюк Н.П., Королева Н.И., Буянов В.В., Супрун И.П. Математическое моделирование в токсикологии промышленных микроорганизмов. - М, 2003. - 147с.

32. Сергеюк Н.П., Королева Н.И., Мао X. Преимущества и проблемы математического моделирования в токсикологии промышленных микроорганизмов// 2-ой съезд токсикологов России. /Тезисы докладов -М, 2003.-С. 238-240/

33. Сергеюк Н.П., Королева Н.И., Мао X. Математическое моделирование в токсикологии промышленных микроорганизмов//Токсикологический Вестник..- 2004. - № 1. - С. 25-30

Отпечатано с готового оригинала

Лицензия ПД № 00326 от 14.02.2000 г.

Подписано к печати 1-• iO-ОЧ-Бумага 80 г/м2 "Снегурочка" Объем Z о /I •

Тираж 100 экз.

Формат 60x88/16 Ризография Заказ № BHi

Издательство Московского государственного университета леса. 141005. Мытшци-5, Московская обл., 1-я Институтская, 1, МГУЛ. Телефоны: (095) 588-57-62,588-53-48,588-54-15. Факс: 588-51-09. E-mail: izdat@mgul.ac.ru

»20 0 5 3

(

РНБ Русский фонд

2005-4 18290

В настоящее- время в России к связи с распространением химических и биологических загрязнителей окружающей среды сложилось чрезвычайно напряженное положение в сфере обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и здоровья населения (Потапов А.И., 1995; Сидоренко Г.И., 1997; Тутельян В.А, 2000; Потапов А.И., Ракитский В.Н., 2001; Савельев С.И. и соавт., 2002). Причем, если для химических веществ определены критерии выбора оптимального объема исследования в направлении гигиенического регламентирования и подходы к их безопасному обращению (Курляндский Б.А. и соавт., 1974, 1975, 1977; Курляндский Б.А., 1999, 2001), то для биологических веществ, в частности, для промышленных микроорганизмов, существующая система оценки опасности недостаточно отвечает требованиям современной науки и практики.

В то же время, номенклатура продукции биотехнологического производства в нашей стране постоянно расширяется и естественным следствием этого процесса является повышение удельного веса биологического загрязнения, включающего промышленные микроорганизмы, в объектах производственной и окружающей среды (БагдасарьянГ.А. 1980, 1984).

Понятие «Промышленные микроорганизмы» включает в себя как микроорганизмы - продуценты, так и микроорганизмы, являющиеся основой готовых форм различных препаратов.

К продуцентам относятся многочисленные представители рода Candida (продуценты БВК), рода Actinomyces, Streptomyces Nocardia, Micromonospora и др. (продуценты антибиотиков), продуценты ферментов, аминокислот и т.д.

Культивирование этих микроорганизмов имеет конечной целью получение того или иного продукта их жизнедеятельности. В этом направлении проводится и селекция штаммов. Кроме того, существует большое количество микроорганизмов, продукты жизнедеятельности которых не выделяют в чистом виде в процессе производства.

Эти штаммы входят в состав готовых форм препаратов в качестве действующего начала. Так, для очистки природных экосистем от нефти и нефтепродуктов в очищаемый объект вносят препараты, содержащие микроорганизмы, которые в процессе своей жизнедеятельности окисляют нефтяные алканы и ароматические углеводороды, выделяя в среду аминокислоты, витамины, поверхностно активные вещества.

Такого рода препараты активно используют в настоящее время в различных отраслях хозяйства: при производстве продуктов питания, животноводстве (как добавки к нормам, так и для обработки трудносилосующихся кормов) в парфюмерной промышленности, для повышения эффективности добычи нефти, для очистки от нефти морской воды, почвы, для очистки рыбохозяйственных водоемов и т.д.

Только для очистки экологических систем от нефти и нефтепродуктов существует более 20 препаратов на основе монокультур и столько же на основе консорциумов микроорганизмов.

Однако, уровень и объем исследований по влиянию промышленных микроорганизмов на состояние здоровья человека, а также на экологические системы объектов окружающей среды значительно отстают от таковых для химических веществ. Существующие подходы к гигиеническому регламентированию промышленных микроорганизмов не совсем отвечают тем условиям, которые сложились в последнее десятилетие на производствах, использующих биотехнологии, т.е., таких производствах, основой которых является использование в процессах микробного синтеза различных видов промышленных микроорганизмов. И это несмотря на то, что продукты биосинтеза активно используются практически во всех отраслях народного хозяйства - медицинской, пищевой, сельскохозяйственной и др. и включают предприятия по производству, как продуктов микробного синтеза, таге и препаратов, содержащих жизнеспособные штаммы микроорганизмов.

Естественным результатом развития этих производств является повышение удельного веса биологического загрязнения, включающего промышленные микроорганизмы, в объектах производственной и окружающей среды.

Биологические загрязнители объединяет одно общее свойство - в основе их производства лежит выращивание живых существ, способных в определенных условиях размножаться в окружающей среде (в том числе и в организме человека и животных), вызывать сдвиги иммунологического гомеостаза и изменять ассоциацию аутофлоры человека и животных. Характерным для промышленных (непатогенных) микроорганизмов при действии их на организм теплокровных животных является, как правило, отсутствие токсического эффекта по критерию гибели даже после введения больших доз. Вместе с тем, наличие большого количества микробов и продуктов их жизнедеятельности в воздухе и других средах оказывает воздействие как на реактивность организма человека, так и на стабильность природных экосистем.

Значительным количеством исследований установлено широкое распространение микроорганизмов-продуцентов и продуктов микробного синтеза в объектах окружающей среды, особенно вокруг крупнотоннажных биотехнологических производств. В частности, при работе первой очереди Башкирского БХЗ дальность распространения микроорганизмов-продуцентов (дрожжеподобные грибы рода Candida) составляла около 2-х км, а после введения в действие второй очереди - около 3-х км, при уровне загрязнения

13 3 ю1 - 1(Г м. кл/м. Методом отпечатков промышленные штаммы обнаруживались на расстоянии до 5 км, в снегу — до 1 км и в почвенных пробах - на расстоянии до 100-200м. (Мурзакаев Ф.Г., Бапшрова P.M. и др., 1978).

В экспериментальных и натурных условиях показана длительная выживаемость жизнеспособных микроорганизмов-продуцентов в объектах окружающей среды (почве, водной среде, пыли, снеге, на листьях растений и др.). Так установлено, что грибы рода Candida переживают в воде водоемов более полугода, в почве - до 2-х месяцев, при этом изменяются их биохимические свойства, что затрудняет идентификацию культур и контроль за их распространением (Пивоваров Ю.П., Королик Б.В., 1994).

Показано также, что бактерии рода Pseudomonas и Acinetobacter при поступлении в воду водоема не только сохраняют в ней свою жизнеспособность, но и размножаются в течение 5-20 дней. Причем установлено, что при одновременном поступлении в воду водоема органических веществ химической природы (фенол, нефтепродукты) происходит нарушение сложившихся микробиоценозов с преобладанием указанных микроорганизмов-продуцентов. Причем в концентрациях 104 и выше м. кл/л псевдомонады в загрязненной воде активно конкурируют с природным биоценозом (Трухина Г.М., 1993, Пивоваров Ю.П., Королик Б.В., 1994).

К настоящему времени накоплены многочисленные данные, свидетельствующие об отрицательном влиянии микроорганизмов и продуктов биосинтеза на организм человека и состояние объектов окружающей среды (Воробьев A.A., 1987, Зельцер П.Л., 1986, Немыря В.И., 1989, Соседова JI.M., Рукавишников B.C., 2003 и др.).

Выявлена значительная аллергизация работающих и населения, проживающего в районах влияния биотехнологических предприятий, ухудшение показателей их иммунного статуса. Иммунологические сдвиги определяются уже в первые годы работы на этих предприятиях у значительной части практически здоровых работающих. Отмечены случаи возникновения рецидивов аллергических заболеваний при возобновлении контакта, как с пылью готового продукта, так и с микроорганизмами-продуцентами. Причем, например, на заводах по производству БВК, использующих в качестве продуцентов дрожжеподобные грибы рода Candida, специфическая сенсибилизация к кандидоносительству выявляется у части лиц, не имеющих непосредственного контакта с готовым продуктом и микроорганизмами-продуцентами. (Никифиров Ю.Ф. и др., 1980, Селюжицкий Г.В., Белкин A.C., 1979).

По данным О.Г. Алексеевой (1994г.) в период пуска в эксплуатацию заводов БХЗ по производству БВК возникали вспышки аллегозов органов дыхания не только у рабочих, но и у населения селитебных зон. Эти заболевания плохо поддавались лечению вследствие наличия групповых антигенов с белками естественной флоры окружающей среды, которые поддерживали аллергизацию даже после прекращения контакта с кормовыми белками.

Известно, что снижение иммунного статуса организма у населения отмечается в три раза чаще под воздействием продуцентов, по сравнению с готовым продуктом. Выявлено также потенцирование действия при совместном воздействии живого и неживого компонента биологического загрязнения (Бапшрова P.M., 1989; Баширова P.M., Мурзакаев Ф.Г., Дольников И.Б., 1984).

Исследованиями, проведенными в натурных условиях, установлено,

О Ч что концентрации 6 х 10 и более клеток грибов-продуцентов в 1 м воздуха рабочей зоны вызывают профессиональную микологическую сенсибилизацию и кандидоносительство (Кашкин Н.П., Колло P.M. и др., 1977).

При характеристике аэрогенной микрофлоры в производственных животноводческих и птицеводческих комплексах (Кучук A.A. и др., 1989) также была установлена прямая зависимость между частотой сенсибилизации работающих к микроорганизмам и концентрацией аэрозоля последних в воздухе.

Приведенные данные убедительно свидетельствуют о том, что промышленные микроорганизмы представляют собой серьезную опасность как для организма человека, так и для объектов производственной и окружающей среды.

Однако, в настоящее время не только уровень и объем исследований по гигиеническому регламентированию биологических поллютантов отстает от таковых для химических веществ, но и более того -имеются данные о том, что гигиенические нормативы для ряда промышленных микроорганизмов (представителей рода Candida, в частности) не обеспечивают безопасные для организма человека уровни воздействия (Соседова JIM., Рукавишникова B.C., 2003 г).

Несмотря на постоянно расширяющуюся номенклатуру штаммов, активно использующихся в биотехнологии, в настоящее время не существует гигиенической классификации промышленных микроорганизмов по степени опасности.

В сложившейся ситуации несомненно актуальным является расширение объема исследований по идентификации биомаркеров основных эффектов промышленных микроорганизмов, направленных на повышение надежности разрабатываемых гигиенических нормативов - одного из наиболее важных элементов комплекса мероприятий по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Все это послужило основанием для проведения настоящего исследования и определило его цели и задачи.

Цель работы: Научное обоснование критериальной и прогностической значимости гигиенических исследований при оценке потенциальной опасности промышленных микроорганизмов с целью обеспечения профилактических мероприятий по предупреждению их неблагоприятного воздействия на объекты производственной и окружающей среды.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- провести сравнительный анализ концептуальной и методической базы санитарно-гигиенического нормирования химических и биологических веществ;

- определить критериальную значимость комплекса биомаркеров вредных эффектов промышленных микроорганизмов (сенсибилизирующего, иммуномодулирующего и антибактериального);

- изучить показатели неспецифического клеточного ответа респираторного тракта теплокровных животных на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов в условиях хронического эксперимента;

- усовершенствовать схему проведения работ по гигиеническому регламентированию промышленных микроорганизмов;

- разработать классификацию промышленных микроорганизмов по степени опасности;

- создать математическую модель неспецифической клеточной реакции респираторного тракта в ответ на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов; разработать и обосновать критериальный комплекс гигиенических исследований промышленных микроорганизмов, являющийся научной основой профилактических мероприятий по охране здоровья населения.

Научная новизна и теоретическая значимость работы состоит в том, что впервые:

- разработана классификация промышленных микроорганизмов по степени опасности; определен унифицированный критериальный комплекс показателей, характеризующих действие промышленных микроорганизмов на теплокровных при ингаляционном поступлении; установлена критериально-прогностическая значимость функциональной компетентности пула альвеолярных макрофагов в развитии иммунодепрессивного эффекта; разработана концепция математического моделирования динамики неспецифического ответа пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов. установлены дозо-время зависимости развития дисбиотического, сенсибилизирующего и иммунодепрессивного действия промышленных штаммов при ингаляционном поступлении в организм теплокровных животных; усовершенствована схема гигиенического регламентирования промышленных микроорганизмов разработана научная основа профилактических мероприятий по охране здоровья населения от неблагоприятного воздействия промышленных микроорганизмов

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Гигиеническая классификация промышленных микроорганизмов по степени опасности, в основу которой положены: уровни лимитирующего показателя вредного действия; уровни гигиенических нормативов с учетом возможности диссоциации микроорганизмов в условно-патогенную форму;

2. Дозозависимые закономерности формирования основных эффектов различных штаммов промышленных микроорганизмов с определением биомаркеров этих эффектов - гиперчувствительности замедленного и немедленного типа, функциональной активности клеточного звена иммунитета, изменений в микробном пейзаже толстого кишечника, функциональной компетентности пула альвеолярных макрофагов.

3. Закономерности формирования ответа пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов и математическое моделирование этого процесса.

4. Усовершенствованная схема нормирования промышленных микроорганизмов, включающая оценку возможности диссоциации штаммов в условно-патогенную форму, комплекс биомаркеров основных вредных эффектов и определение лимитирующего критерия вредного действия с учетом функционального состояния неспецифической клеточной защиты респираторного тракта.

5. Комплекс профилактических мероприятий, включающий нормативные и методические документы федерального уровня

Практическая значимость работы.

Материалы исследований были использованы при составлении: Руководства «Гигиенические критерии оценки и классификации условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса»

Р 2.2.755-99, утвержденного Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации;

Перечня ПДК «Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест» Доп. №2 к ГН 2.1.6.711-98 Гигиенические нормативы ГН 2.1.6.1041-01, утвержденного Главным Государственным врачом Российской Федерации;

Перечня ПДК «Предельно допустимые концентрации микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны» Доп. №2 к ГН 2.2.6.709 - 98. ГН 2.2.6.1080-01, утвержденного Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации.

Разработанных и утвержденных МЗ РФ гигиенических нормативов промышленных микроорганизмов:

28 ПДК в воздухе рабочей зоны ГН 2.2.6.709-98;

28 ПДК в атмосферном воздухе населенных мест ГН 2.1.6.711-98 и доп. №2 кГН 2.1.6.711-98; препаратов, представляющих собой консорциум промышленных микроорганизмов:

3 ПДК в воздухе рабочей зоны Доп. № 2 к ГН 2.2.6.709-98;

3 ПДК атмосферном воздухе населенных мест Доп. № 2 к ГН 2.1.6.711-98.

Пособия для врачей «Оценка опасности промышленных микроорганизмов», утвержденного секцией «Гигиена» УС МЗ РФ (протокол №4 от 21.04.04)

Пособия для врачей «Усовершенствование методических подходов к гигиеническому регламентированию промышленных микроорганизмов в воздушной среде», утвержденного секцией «Гигиена» УС МЗ РФ (протокол №4 от 21.04.04)

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 1-ой Всероссийской конференции токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии» (С-Петербург, 1995г.), 1-ом съезде токсикологов России (Москва, 1998г.), Международной конференции Биотехнология-2000 (Пущино, 2000г.), Международном семинаре Биотехнология - народному хозяйству 2000 (Москва, 2000г.), IX Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных врачей (Москва, 2001), 2-ом съезде токсикологов России (Москва, 2003г.), VII Международной конференции «Прикладная кибернетика и информатика» (Орландо, Флорида, США, 2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 33 печатных работы, в том числе 4 монографии (издательство РАН).

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения; аналитического обзора литературы; описания объектов, материалов и методов исследования; двух глав собственных экспериментальных исследований, одна из которых посвящена обоснованию гигиенических нормативов. Кроме того, в работе имеется глава, посвященная математическому моделированию; глава, содержащая обсуждение полученных результатов; основные выводы; список литературы и приложения. Текст изложен на 240 страницах, иллюстрирован 38 таблицами, 22 рисунками, имеет приложения. Указатель литературы содержит 184 источников, из них 154 отечественных и 30 иностранных авторов.

выводы

1. Сравнительный анализ эффектов промышленных микроорганизмов при ингаляционном поступлении выявил комплекс значимых показателей, характеризующих формирование гиперчувствительности замедленного типа, иммунодепрессии в отношении клеточного звена иммунитета, дисбактериоза толстого кишечника, а также истощения адаптивных механизмов неспецифических клеточных факторов защиты респираторного тракта

2. Установлена идентичность биомаркеров сенсибилизирующего, иммунотоксического и антибактериального действия для всех изученных штаммов и зависимость степени выраженности эффектов от таксономической принадлежности микроорганизма

3. Определен критериальный комплекс исследований неспецифического клеточного ответа мононуклеарной фагоцитирующей системы респираторного тракта на ингаляционное поступление промышленных микроорганизмов, включающий следующие показатели: абсолютное количество клеток, процент жизнеспособных клеток, процент адгезии, активность лизосомальных гидролаз (общая и свободная).

4. Дозозависимые изменения количества альвеолярных макрофагов и их секреторной активности на пороговых и действующих уровнях являются унифицированным критерием установления фаз развития реакции на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов, характеризующихся повышением количественных и качественных показателей (фаза первичных реакций), сменяющейся их нормализацией (фаза компенсации) и снижением показателей (фаза декомпенсации).

5. Установлена высокая критериально-прогностическая значимость снижения секреторной активности пула альвеолярных макрофагов в развитии иммунодепрессивного эффекта, подтвержденная наличием достоверной связи между показателями общей активности (3-галактозидазы,

3- гшокозидазы и Кацетил (Ш- глюкозаминидазы и активностью лимфоцитов в тестах розеткообразования (г= 0,69-0,73 ).

6. Подтверждена гипотеза о возможности внеклеточного уничтожения промышленных (непатогенных) микроорганизмов в результате выхода лизосомальных ферментов макрофагов за пределы клетки

7. Разработана гигиеническая классификация, позволяющая оценивать промышленные микроорганизмы по степени опасности в зависимости от уровня порога по лимитирующему критерию вредного действия, величины гигиенического норматива и возможностью диссоциации штамма в условно-патогенную форму.

8. Разработана математическая модель прогноза динамики реакции пула альвеолярных макрофагов на ингаляционное воздействие промышленных микроорганизмов.

9. Научно обоснованы и внедрены в практику здравоохранения критериальный комплекс и классификация оценки опасности ГУМ, а также схема их гигиенического регламентирования, которые явились основой для разработки профилактических мероприятий по охране здоровья человека.