Автореферат и диссертация по медицине (14.01.26) на тему:Тканевая инженерия кровеносных сосудов малого калибра на основе децеллюляризованной артерии пуповины человека

На правах рукописи

НАСРЕДИНОВ АРТЁМ СЕРГЕЕВИЧ

ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ МАЛОГО КАЛИБРА НА ОСНОВЕ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОЙ АРТЕРИИ ПУПОВИНЫ

ЧЕЛОВЕКА

14.01.26 - сердечно-сосудистая хирургия 03.03.04 — КЛеТОЧНаЯ биОЛОГИЯ, цитология и гистологи^ ^ ^^

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2015 00556"«'*

005563274

Работа выполнена в Федеральном государстзенном бюджетном учреждении «СевероЗападный федеральный медицинский исследовательский центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители:

Вавилов Валерий Николаевич, доктор медицинских наук, профессор Анисимов Сергей Владимирович, доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Хубулава Геннадий Григорьевич - доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, 1-я кафедра сердечно-сосудистой хирургии имени академика П.А. Куприянова Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова, начальник кафедры.

Насыров Руслан Абдуллаевич - доктор медицинских наук, профессор, кафедра патологической анатомии с курсом судебной медицины Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета, заведующий кафедрой и проректор по научной работе

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Защита состоится " 17 " ноября 2015 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.090.05 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова" (197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 6/8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова" и на сайте www.spb-gmu.iu.

Автореферат разослан "_"_2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, доцент

Мясникова Марина Олеговна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Быстрое развитие сердечно-сосудистой хирургии выявило очевидный в настоящее время дефицит сосудистых кондуитов малого диаметра. Последние необходимы для таких распространенных операций как аорто-коронарное шунтирование, реваскуляризация артерий нижних конечностей, создание артериовенозных фистул для гемодиализа и других. Лучшим материалом для шунтов принято считать аутологичные вены и артерии. Однако они не всегда доступны из-за различного ряда наблюдаемых в них изменений или из-за того, что они уже были использованы во время предыдущих операций. Синтетические протезы с успехом применяются при шунтировании сосудов с диаметром более 6 мм, но при меньшем размере они быстро тромбируются. Это обуславливает высокую потребность в получении сосудистых протезов малого диаметра, которые по основным характеристикам не отличались бы от аугошунтов (Kakisis J.D. et al., 2005; Campbell GR., Campbell J.H., 2007; Seifij D.G et al., 2013).

Создание искусственного сосудистого кондуита с проходимостью, подобной той, что наблюдается при использовании нативных вен или артерий, по мнению некоторых авторов -утопия (Conte M.S., 1998; Kakisis J.D. et al., 2005; Naito Y. et al, 2011, 2014).

Однако, тканевая инженерия - новая междисциплинарная область науки, занимающаяся разработкой биологических заменителей, для восстановления, сохранения и улучшения функции тканей или целого органа - уже сегодня опровергает эту точку зрения (Mclntire L.V., 2003; Peck M. et al., 2011; Seifu D.G et al., 2013). Благодаря исследованиям в этом направлении, к настоящему времени предложены варианты «изготовления» сосудов, которые приближаются по своим характеристикам к естественным их заменителям (Nerem R.M., Seliktar D., 2001; Baguneid M.S., 2006; Quint С. et al., 2011).

Во многих странах мира активно ведутся поиски оптимального материала для создания основы тканеинженерного кровеносного сосуда (ТИКС), выбор оптимального клеточного материала и способа его доставки на носитель. Обращает на себя внимание практически полное отсутствие отечественных работ, посвященных данной тематике.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования, используя методы тканевой инженерии, разработать способ создания кровеносного сосуда диаметром 3-4 мм из децеллюляризованной артерии пуповины человека, который по своим морфологическим и механическим свойствам был бы идентичен нативной артерии. Оценить эти свойства на экспериментальной модели.

В задачи исследования входило:

1. Разработка эффективной методики децеллюляризации артерий пуповины человека, оценка структуры, антигенного потенциала и механических свойств внеклеточного матрикса децеллюляризованных артерий пуповины.

2. Определение возможности длительного хранения децеллюляризованных артерий пуповины для создания «банка» сосудистых заменителей с целью сокращения временных и финансовых затрат на получение готового к использованию тканеинженерного кровеносного сосуда.

3. Разработка технологии заселения децеллюляризованных артерий пуповины жизнеспособными стволовыми клетками in vitro, оценка их пролиферативной активности.

4. Оценка морфофункциональных свойств полученных тканеинженерных кровеносных сосудов in vivo в эксперименте на мелких лабораторных животных.

Научная новизна.

Разработан оригинальный способ децеллюляризации артерий пуповины человека комбинированным детергентно-ферментным способом, патент РФ на изобретение №2504334.

Впервые проведена комплексная оценка морфологических и механических свойств артерий пуповины, децеллюляризация которых проведена оригинальным способом.

Определена оптимальная плотность посева на децеллюляризованные артерии пуповины мезенхимных стволовых клеток (МСК) и необходимая длительность их культивирования in vitro в проточном биореакторе оригинальной конструкции.

Показана возможность создания тканеинженерного кровеносного сосуда на основе децеллюляризованной артерии пуповины, заселенных МСК.

Оценена проходимость полученных тканеинженерных кровеносных сосудов в экспериментах in vivo.

Получены сведения о появлении в тканеинженерном сосуде in vivo дифференцированных клеток нормальной сосудистой стенки: эндотелиоцитов и миоцитов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Доказана возможность эффективной децеллюляризации артерий пуповины человека. Разработана новая методика децеллюляризации артерий пуповины. Создан оригинальный биореактор для успешного посева МСК на матрицу децеллюляризованной артерии пуповины. Получен сосуд, который может быть использован в продолжении экспериментальной работы в ФГБУ «СЗФМИЦ» и других лабораториях. Можно и необходимо исследовать возможность использования изготовленного сосуда в клинической практике.

Положения, выносимые на защиту.

1. Артерии пуповины могут быть использованы в качестве основы для создания тканеинженерного кровеносного сосуда.

2. Разработанный способ децеллюляризации артерий пуповины эффективно удаляет клетки и клеточный дебрис, оставляя внеклеточный матрикс артерии интактным.

3. Механические свойства нативных артерий сохраняются после децеллюляризации. Децеллюляризованные артерии пуповины могут длительное время (до 10 мес.) хранится без изменения своих механических свойств.

4. Использование проточного биореактора улучшает результаты рецеллюляризации артерий пуповины, лишенных клеточного состава.

5. Рецеллюляризация артерий пуповины по разработанной методике позволяет получить кровеносный сосуд, свойства которого близки естественному.

6. Высокая проходимость этих сосудов подтверждена в эксперименте.

Личное участие автора в проведении исследования.

Тема и план диссертации, её основные идеи и содержание разработаны совместно с научными руководителями. Автором изучена литература в данной области науки, в том числе на иностранном языке. Самостоятельно обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель, задачи и этапы научного исследования и проведения экспериментов.

Диссертант самостоятельно выделял артерии из пуповин, лично отрабатывал различные способы децеллюляризации, проводил их сравнительный анализ. Оригинальный способ децеллюляризации артерий пуповины разработан автором. Механические испытания нативных и децеллюляризованных артерий пуповины проводились автором совместно с сотрудником СПбГЭТУ «ЛЭТИ» им. В.И. Ульянова (Ленина) Лебедевой Е.А. Диссертант получал и культивировал МСК, проводил эксперименты по их заселению на децеллюляризованные артерии пуповины.

Автором разработана конструкция биореактора и способ рецеллюляризации. Автор проводил эксперименты по имплантации исследуемых сосудов лабораторным животным. Наблюдение и уход за животными осуществлялся совместно с сотрудниками вивария. Выведение животных из эксперимента и забор сосуда проводился автором.

Гистологические препараты изготавливались лаборантами отделения патоморфологии ФГБУ «СЗФМИЦ» Минздрава России. Иммуногистохимические препараты изготовляла научный сотрудник НИЛ патоморфологии Бещук О.В. Анализ препаратов проводил диссертант совместно с заведующей НИЛ патоморфологии д.м.н. Митрофановой Л.Б.

Сбор, обобщение, анализ, обработка результатов и написание диссертации выполнены автором.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертаций, и 6 тезисов докладов. Получен 1 патент РФ на изобретение. Материалы диссертации были представлены на XIX Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2013), на I Национальном Конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2013), на VII Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2014) и на собраниях проблемных комиссий института сердечно-сосудистой хирургии и института молекулярной биологии и генетики ФГБУ «СЗФМИЦ». По теме научно-исследовательской работы диссертант стал победителем конкурса на соискание именной стипендии ОАО «Сбербанк России» и «Фонда Алмазова» (2013), проходил стажировку в г. Лейпциге (Германия).

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированного 44 рисунками и 3 таблицами, содержит введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, выводы, список литературы, который включает 13 отечественных источника и 171 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

В качестве основы тканеинженерного сосуда малого калибра использовали артерию пуповины (АП) человека. Препарирование артерий не сложно, несмотря на «нежность» их стенки и малый диаметр сосуда. С использованием стандартного хирургического инструментария - пинцета и ножниц - возможно выделение большого количества материала в течение короткого периода времени. АП разделяли на участки длиной 5 см. Всего в ходе работы исследовано более 200 фрагментов АП.

На основании анализа литературы были выбраны и апробированы 6 различных способов децеллюляризации кровеносных сосудов, которые описаны авторами как эффективные (Daniel J.et al., 2005; Amiel GE. et al., 2006; Liu GF. et al., 2008; Егорова M.B. с соавг., 2011; Boer U. et al., 2011; Smith A.N., 2011). По каждому протоколу было обработано 3 фрагмента АП (всего было изготовлено и изучено 18 фрагментов АП, 48 гистологических препаратов). Однако ни один из этих вариантов не привел к полной элиминации клеточного дебриса из стенки сосуда (таблица 1). Анализ изученных вариантов децеллюляризации позволил сформировать собственную методику. Разработанный способ удаления клеток из стенки кровеносных сосудов состоит из нескольких этапов со сменой децеллюляризирующих растворов, в составе которых используются детергенты и ферменты, так поступали и другие

исследователи, однако разработанный способ отличается составом, последовательностью и длительностью применения децеллюляризирующих агентов, их более низкой концентрацией и использованием дополнительного физического воздействия - вибрации. В таком сочетании методы, ведущие к удалению клеток из ткани, ранее никем не были использованы. В то же время именно это по нашему мнению определило результат.

Таблица 1 - Результаты апробации различных способов децеллюляризации

Автор способа децеллюляризации Окраска гематоксилином и эозином Окраска по Ван-Гизону с эластикой ИГХ: CD31 ИГХ: а- SMA

Daniel J.et al., 2005 практически полностью отсутствовал эндотелий, но сохранялось большинство клеток в медии «Рыхлая» структура внеклеточного матрикса (В КМ) н/п н/п

Amiel GE. et al., 2006 клетки не визуализировались сохранный ВКМ ИГХ- ИГХ+

Liu GF. et al., 2008 эндотелии отсутствует, небольшое количество ядер клеток без четких контуров в медии выраженное нарушение структуры ВКМ н/п н/п

Егорова M.B. с соавт., 2011 клетки не визуализировались сохранный ВКМ ИГХ- ИГХ+

Bôer U. et al., 2011 практически полностью отсутствовал эндотелий, но сохранялось небольшое количество клеток в медии ВКМ стал более компактным н/п н/п

Smith A.N., 2011 клеток значительно меньше, чем в нативной артерии, их ядра стали заметно бледнее сохранный ВКМ н/п н/п

Прим.: «н/п» — исследование не проводилось; «ИГХ+» - положительная окраска на антиген; «ИГХ-» - отрицательная окраска на антиген.

Оригинальная технология удаления клеток из сосудистой стенки является следствием многократных экспериментов (не менее 16) со сменой параметров децеллюляризации, таких как: длительность, температура, концентрация и очередность использованных

децеллюляризационных агентов. Самым сложным оказалось соблюсти баланс между максимально полным удалением клеток и их остатков с минимальным повреждением ВКМ. Это было достигнуто следующим образом: после подбора оптимальной последовательности реагентов уменьшали их изначально высокую концентрацию и время их воздействия до минимально необходимого уровня, при котором децеллюляризация оставалась эффективной.

На первом этапе отмывали фрагмент кровеносного сосуда от крови в деионизированной воде (Milli-Q, Millipore, США) в течение 1 ч. при температуре +5 °С, которая является гипотоническим раствором, происходит осмотический шок и частичный лизис клеток. Затем сосуд помещали на 1 ч. при температуре 37 °С в 0,05 % раствор трипсина (Самсон-Мед, Россия). Этот фермент приводит к отделению клеток от ВКМ и «разрыхлению» его микроструктуры, способствует глубокому проникновению детергентов и улучшению удаления клеток из толщи сосудистой стенки на дальнейших этапах децеллюляризации. Затем артерии обрабатывали при комнатной температуре анионным и неионным детергентами: сначала в течение 22 ч. в 0,075 % растворе додецилсульфата натрия (Amresco, США), далее в течение 22 ч. - 0,25 % раствором тритон Х-100 (Amresco, США). Нами установлено, что это - минимально эффективные концентрации детергентов, комбинация которых усиливает действие друг друга. Эффективность децеллюляризации с применением только раствора тритон Х-100, либо только раствора додецилсульфата натрия в различных концентрациях, оказалась недостаточной. На последнем этапе, в течение 6 ч. при температуре +37 °С материал подвергали воздействию нуклеаз (РНКаза А 20мкг/мл, ДНКаза 1200мкг/мл, Росмедбио, Россия) в питательной среде М199 (Sigma-Aldrich, США). Все этапы децеллюляризации проводили при постоянном вращательном движении рабочих растворов в емкости, для чего последнюю устанавливали на орбитальном шейкере (скорость 30 об./мин, амплитуда движений 10 мм; орбитальный шейкер GFL 3005, GFL, Германия). Для глубокого проникновения децеллюляризирующих растворов в толщу сосудистой стенки и максимального удаления клеточных элементов, рабочую емкость подвергали вибрации, с помощью небольшого мотора с эксцентриком (вибромотор QX-6A-1, QX Motor, Китай). После каждого этапа участок артерии трижды промывали в фосфатно-солевом буферном растворе с 0,02 % этилендиаминтетраацетатом по 10-15 мин. для механического удаления свободного клеточного дебриса.

Децеллюляризованные артерии пуповины (ДАП) стандартно окрашивали гематоксилином и эозином для общей оценки препарата и визуализации ядер клеток. Для определения сохранности ВКМ, срезы окрашивали по Ван-Гизону с эластикой. Также проводили ИГХ анализ, используя непрямой двойной метод визуализации EnVision согласно протоколу производителя (EnVision Detection Systems Peroxidase/DAB Rabbit/Mouse Kit, Dako, Дания). В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к антигенам CD31

(РЕСАМ-1) и к альфа-шадкомышечному актину (a-SMA) (Dako, Дания).

Для визуального определения нуклеиновых кислот в образцах тканей использовали окраску DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид), высокотропную к ДНК и РНК.

Для количественного изучения содержания ДНК и РНК в децеллюляризованных артериях исследовали 3 фрагмента ДАП, фрагмент нативной АП в качестве положительного контроля, и ФСБ в качестве отрицательного контроля. ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QLAGEN, США) согласно протоколу производителя. Экстракцию РНК проводили хлороформом, затем её преципитировали изопропанолом из водной фазы, отмывали 75% этанолом, сушили воздухом при комнатной температуре и растворяли в чистой воде. Количественный анализ нуклеиновых кислот проводили на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США), качественный анализ РНК - на анализаторе BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, США), с использованием системы RNA nano chip (Agilent Technologies, США).

Хранение децеллюляризованных артерий.

Для определения возможности длительного хранения ДАП исследованы 2 способа. В первом случае, ДАП помещали в криовиалы (Nunc, США), замораживали и хранили при -80 °С от 1 до 3 мес. (п=25). В качестве криопротектора использовали ФСБ с 10 % диметилсульфоксидом (Sigma, США). Второй способ заключался в хранении ДАП в 15 мл полипропиленовых пробирках типа Falcon (Sarsted, Германия; Orange scientific, Бельгия), в стерильном ФСБ с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, Gibco, США), при температуре +4°С.

Изучение механических свойств артерий пуповины человека до и после децеллюляризации.

Поскольку прочность будущего тканеинженерного сосуда напрямую зависит от механических характеристик носителя клеток, эти свойства артерий пуповины после децеллюляризации и были изучены. Опыты разделили на 4 группы:

I группа (контроль) - нативные АП;

II группа - ДАП;

III группа - ДАП, после хранения в течение 10 мес. (без замораживания);

IV группа — криоконсервированные ДАП.

Определение механической прочности сосудов проводили путем заполнения их жидкостью до разрыва (п=10 в каждой группе), регистрировали максимальное (пиковое) давление, при котором происходило разрушение сосуда. Сравнивали результаты для четырех групп сосудистых кондуитов.

Изучение упруго-эластических свойств АП или ДАП в продольном и поперечном направлениях, их устойчивость к прорезыванию шовным материалом проводили на универсальной разрывной машине Instron 5543 (Instron, США). Результаты исследований

регистрировали и обрабатывали на компьютере с помощью прилагаемого программного обеспечения Bluehill2.

Посев клеток на децеялюляризованные артерии пуповины (рецеллюляризация)

Для культивирования клеток и проведения экспериментов по рецеллюляризации, использовали питательную среду а-МЕМ (ПанЭко, Россия) с 10 % фетальной бычьей сывороткой (Hyclone, США), 1 % шутамина (Invitrogen, США) и 1 % смесью пенициллина и стрептомицина (Invitrogen, США) без добавления факторов роста. Культивирование клеток и рецеллюляризацию сосудистых кондуитов проводили в лабораторном СОг-инкубаторе ShelLab (Sheldon Manufacturing, США) при 5 % содержании СОг и температуре 37 °С.

В ходе выполнения работы использованы МСК из двух источников - костного мозга и жировой ткани одной крысы. Первичную культуру МСК получали согласно традиционной методике селекции по адгезии к пластику (Dmitrieva et al., 2012). Для проведения рецеллюляризации использовали клетки 3-8 пассажей.

Перед началом экспериментов по рецеллюляризации сосудистых кондутитов предварительно рассчитывали исходное количество МСК на единицу длины ДАП, то есть определяли оптимальную плотность посева. Для этого использовали суспензию МСК в различной концентрации : lxlO5, 5x10s, lxlO6, 2хЮ6, ЗхЮ6 / 100 мкл, которой заполняли просвет ДАП (длиной 5 см, по 3 образца для каждой из 5 концентраций, всего п=15). Через 1 ч. инкубирования аккуратно промывали засеянные графты ФСБ, а клетки в промывном растворе осаждали центрифугированием и считали в гемоцитометре (N0CT). Эффективность клеточного использования определяли как соотношение числа клеток, адгезированных на ДАП, к исходному количеству клеток умноженному на 100%. Оптимальную плотность посева ДАП рассчитывали, исходя из оптимального исходного числа клеток на единицу длины сосуда.

В результате многочисленных экспериментов по повышению эффективности рецеллюляризации сосудистых кондуитов мы использовали комбинацию статичного метода доставки клеток с последующей перфузией сосудистого кондуита в биореакторе. lxlO6 меченых прижизненным флюоресцентным красителем РКН26 МСК ресуспендировали в 100 мкл культуральной среды и с помощью пипетки вводили в просвет сосуда. Затем засеянный сосудистый кондуит культивировали в оригинальном собственной конструкции биореакторе в течение 5 сут. Биореактор состоит из камеры и перистальтического насоса, соединенных полихлорвиниловыми трубками, и позволяет проводить постоянную перфузию питательной среды через просвет рецеллюляризируемого сосуда с заданным уровнем давления. Основными отличиями от аналогов, описанных в литературе (Lyons Е., Pandit А., 2005), являются наружное расположение насоса и компактные размеры камеры биореаюора, которая одновременно является также резервуаром питательной среды, что позволяет

культивировать ТИКС внутри любого СОг-инкубатора.

Для оценки жизнеспособности клеток мы использовали флюоресцентный краситель, а именно CFSE (сукцинилимидный эфир карбоксифлюоресцеина). Его особенностью является то, что он свободно проникает в цитоплазму всех клеток, но начинает флюоресцировать только после расщепления внутриклеточными эстеразами, которые функционируют лишь в живых клетках. Несмотря на то, что использование CFSE с такой целью ранее не описано, мы пришли к выводу, что это простой, наглядный и информативный метод оценки жизнеспособности клеток. Количество клеток, меченых РКН26 и видимых в красном диапазоне спектра соответствовало общему количеству клеток на матриксе. Визуализировавшиеся в желто-зеленом свете клетки, чья цитоплазма окрасилась красителем CFSE, считались живыми.

Полученные в результате этапа in vitro оптимистичные данные позволили нам перейти к исследованию получившихся ТИКС в экспериментах in vivo.

Изучение тканеинженерных сосудов в экспериментах in vivo.

Эксперименты проведены на самцах крыс породы Вистар массой 200-300 г (питомник «Рапполово» РАМН, г. Санкт-Петербург). Животных содержали в отдельных клетках, со стандартным суточным режимом и свободным доступом к воде и корму. Содержание и работу с лабораторными животными проводили в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «СЗФМИЦ».

В качестве протеза брюшного отдела аорты крысам имплантировали либо свежевыделенную аорту другой крысы (группа 1, контроль, п=5), либо ДАП (группа 2, п=10), либо ТИКС (группа 3, п=10). Всего поставлено 25 опытов.

В связи с очевидной разницей диаметра нормальной аорты крысы (1-1,2 мм) и артерий пуповины (их диаметр при физиологическом давлении около 4 мм), последние перед имплантацией в брюшную аорту «ушивали» до необходимого размера.

Крыс наркотизировали однократным внутрибрюшинным введением хлоралгидрата (Sigma, США) из расчета 425 мг/кг массы тела животного. Операцию проводили с использованием операционного стереоскопического микроскопа МБС-10 (ОАО «ЛЗОС», Россия). Выделяли брюшной отдел аорты, после пережатия иссекали её участок и в образовавшийся дефект вшивали подготовленный кондуит: нативная аорта крысы-реципиента (группа 1, контроль), ДАП (группа 2) или ТИКС (группа 3). После запуска кровотока проводили гемостаз, контролировали проходимость шунта, послойно ушивали рану брюшной стенки. В послеоперацинном периоде за животным наблюдали до пробуждения, после чего содержали в стандартных условиях. Антикоагулянты и

дезагреганты не назначали.

Крыс выводили из эксперимента на 30-е суг. после операции. При наличии проявлений тромбоза шунта (задний парапарез) крыс умерщвляли раньше планируемого срока наблюдения. Одно животное из 3-й группы без признаков тромбоза аорты выведено из эксперимента на 2-е сут. после операции для оценки динамики клеточного состава сосудистой стенки в раннем послеоперационном периоде. Это животное не учитывали при расчете степени проходимости изучаемых сосудов.

Перед умерщвлением крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением хлоралгидрата. Выполняли срединную лапоротомию и оценивали состояние тканей вокруг протеза, сращения, вид зоны протезирования, наличие расширения и т.п. Далее выделяли участок протезированного брюшного отдела аорты и визуально оценивали его проходимость. Затем животных умерщвляли введением летальной дозы хлоралгидрата. Имплантаты иссекали вместе с участком аорты проксимальнее зоны протезирования и с частью подвздошных артерий дистальнее графта. Изготавливали гистологические препараты, которые окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону с эластикой, выполняли ИГХ анализ с антителами к антигенам CD-31 и a-SMA. Кроме этого изготавливали неокрашенные срезы, которые анализировали с помощью флюоресцентного микроскопа Axiovert 40 CFL (Carl Zeiss, Германия) в красном спектре для оценки наличия и распределения клеток, меченых до имплантации прижизненным флюоресцентным красителем РКН26 (Sigma, США).

Статистический анализ

Данные, полученные при проведении исследований, были обработаны в программе Microsoft Excel 2010. Результаты приводятся как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение. Степень достоверности межгрупповых различий средних значений оценивали с помощью парного t-теста Стьюдента с двухсторонним распределением (функция «СТЬЮДЕНТ ТЕСТ» в Microsoft Excel 2010). Нулевая гипотеза заключалась в равенстве исследуемых групп. Если результат t-теста был больше уровня значимости (а=0,05), отличия в выборках считали достоверно не отличающимися друг от друга (Р<0,05) (Макарова Н.В., 2002; Гмурман В.Е., 2003).

Результаты исследования.

АП представляли собой мышечного типа артерии диаметром 2-3 мм в состоянии спазма. При заполнении жидкостью, наружный диаметр сосуда увеличивался до 4 мм. Спиралевидный ход артерий связан с характерным закрученным их положением в пупочном канатике.

ДАП сохраняли свою исходную форму и размеры, теряя естественный цвет и становясь белесыми, что характерно для всех децеллюляризованных тканей (Gilbert T.W. et al., 2006;

Crapo P.M. et al., 2011). Если исходно АП спазмированы, то после проведения децеллюляризации они становятся дилатированными, возможно из-за отсутствия ГМК.

Для гистологического и ИГХ исследования использовали 2 фрагмента необработанной артерии и 20 фрагментов ДАП, каждый длиной 5 см. После децеллюляризации сосуда клетки отсутствуют, просвет артерии дилатирован, а толщина её стенки несколько уменьшается. При окраске по Ван-Гизону, тропной к соединительно-тканным волокнам, видно, что ВКМ, состоящий преимущественно из коллагена остается неизмененным. Отсутствие ИГХ реакции к антигену CD31, характерному для эндотелиоцитов, и к альфа-гладкомышечному актину, характерному для миоцитов, косвенно подтверждает не только лизис этих клеток, но и удаление клеточного дебриса из всей толщи сосудистой стенки. Не было разницы в характере морфологических изменений стенки артерии на поперечных срезах не зависимо от того, какой срез сосуда исследовали (по краям или в центре). Это говорит о том, что разработанная методика позволила проводить равномерную децеллюляризацию АП на всём обрабатываемом участке.

Для визуального определения нуклеиновых кислот использовали окраску DAPI, которая была негативной после децеллюляризации. Отсутствие ДНК и РНК подтверждено также спектрофотометрическим методом.

Серии их 30 последовательных экспериментов подтверждают воспроизводимость результатов. На разработанный способ децеллюляризации был получен патент РФ на изобретение №2504334, который гарантирует приоритет разработки данной методики.

Таким образом, было достигнуто эффективное удаление клеток, клеточного дебриса и нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что исключает возможный иммунный ответ после трансплантации тканеинженерного сосуда реципиенту. ВКМ, состоящий преимущественно из соединительно-тканных белков, таких как коллаген и эластин, сохраняет свою естественную структуру, и предполагалось, что в связи с этим он окажется максимально благоприятной базой для последующей колонизации клетками реципиента. Дополнительным подтверждением сохранности ВКМ стали результаты механических испытаний ДАП.

Результаты исследования механической прочности испытуемых сосудов

В ходе настоящего диссертационного исследования впервые определены механические свойства АП до и после децеллюляризации. Полученные результаты представляют большой интерес, так как механические свойства будущего тканеинженерного сосуда, которые влияют на его проходимость, подверженность аневризмообразованию при последующей трансплантации в кровеносное русло в экспериментах in vivo, и зависят от характеристик ВКМ ДАП. Всего при изучении механической прочности испытуемых сосудов выполнено 109 экспериментов.

В течение испытаний на прочность, обнаружено, что ДАП не подвергаются разрушению

при давлении внутри сосуда значительно выше физиологического. Разрушение нативных АП (I группа, контроль) происходило при давлении внутри сосуда 951±161 мм рт. ст. Максимальное давление, которое выдерживали ДАЛ II и III групп, было несколько ниже, но достоверно не отличалось от показателя нативных АП, и составило 933±124 мм рт. ст. во II группе и 915±131 мм рт. ст. в III группе. Механическая прочность криоконсервированных ДАП (IV группа) была значительно ниже, они разрушались при давлении 456±123 мм рт. ст.

В серии опытов по изучению упруго-эластических свойств испытуемых сосудов, проводили медленное растяжение образцов нативной АП, ДАП, ДАП после 10-месячного хранения в ФСБ. Исследовано по 10 образцов артерий пуповины в каждой группе. При растяжении в продольном направлении максимум нагрузки, при котором происходило разрушение испытуемых образцов, для нативных АП составил 0,96±0,15 Н, для артерий II и III групп - 0,92±0,11 Н и 0,85±0,13 Н, соответственно. Межгрупповые различия статистически не значимы. При растяжении артерий в поперечной плоскости (также по 10 образцов в каждой группе) максимум нагрузки - 2,5±1,2 Н, 3,0±1.4 Н и 3,0±1,1 Н, а среднее изменение длины (AL) до разрушения образцов -252±58%, 318±31% и 270±32% для I, II и III групп, соответственно. Межгрупповые различия были не значимы. На рисунке 1 представлены усредненные кривые зависимости деформации от нагрузки, прилагаемой к испытуемым сосудам.

В экспериментах по определению устойчивости к прорезыванию шовным материалом испытуемых сосудов прошивали край исследуемой артерии нитью, которую затем вытягивали сквозь стенку сосуда. Нагрузка, которую необходимо было приложить, характеризовала устойчивость АП к прорезыванию шовным материалом. Сравнивали данные, полученные при тестировании 10 артерий каждой из трех групп. Во всех случаях происходило разрушение образца в месте шва (то есть прорезывание ткани артерии нитью). У нативных АП нагрузка при этом составила 0,54±0,14 Н, у ДАП 0,53±0,12 Н, ДАП после хранения 0,53±0,15 Н. Межгрупповые различия статистически не значимы

Таким образом, испытания на разрывной машине показали, что децеллюляризация не меняет значимо упруго-эластические свойства ДАП и устойчивость к прорезыванию шовным материалом, в том числе после длительного хранения в охлажденном ФСБ (группа III).

Сохранение механических свойств децеллюляризованных сосудов в ходе их хранения важно с точки зрения удобства работы и уменьшения времени на получение готового тканеинженерного графта. Методика криоконсервирования децеллюляризованных артерий привела к значимому снижению прочности сосуда после размораживания, возможно из-за повреждения структуры ВКМ кристаллами льда. В итоге мы от неё отказались и использовали способ, ранее предложенный Dahl S.L.M. et al. (2011), которые описали хранение децеллюляризованных сосудов в стерильном ФСБ при температуре +4°С до 12 мес.

без видимого разрушения ВКМ и, соответственно, сохранением прочности. Наши результаты также позволяют утверждать, что децеллюляризованные сосуды могут храниться таким образом достаточно долгое время (не менее 10 мес.) без изменения механических свойств.

О 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325

Деформация, %

Рисунок 1 - Зависимость растяжения испытуемого образца от прикладываемой к нему нагрузки А - в продольном , Б- в поперечном направлении. По оси абсцисс - увеличение длины образца от исходной (%), по оси ординат - нагрузка (ед. измерения - Ньютон)

20 25 30 35 40 45 50

Деформация, %

—Группа 1

Группа 2

Результаты испытаний различных способов доставки клеток на носитель. При рецеллюляризации ДАП объем вводимой в просвет сосуда клеточной суспензии был постоянен и равнялся 100 мкл. Количество МСК различалось от 1х105 до ЗхЮ6. Результаты

определения оптимального количества клеток в клеточной суспензии приведены в таблице 2.

|

Таблица 2 - Результаты определения эффективности посева различного количества МСК на децеллюляризованные артерии пуповины (среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение)

N исх. (кл.) N ост. (кл.) N адг. (кл.) Эффективность, %

1x10' 3,5±0,5 хЮ4 5,9±0,6 хЮ4 59±5,9

5x103 1,9±0,3 хЮ5 2,7±0,3 хЮ3 55,5±6,2

1x10" 5,2±0,3 хЮ3 4,0±0,3 х10ь 39,5±3,6

2x10" 1,3^,0x10" 4,1±1,2х106 20,4±5,8

3x10" 2,2*1,3x10" 4,1±1,5 хЮ6 13,7±4,9

Nhcx. - количество засеваемых клеток, Noct. - количество не фиксировавшихся на графте клеток, Naflr. - расчетное количество сохранившихся на графте клеток с учетом поправочного коэффициента.

Как видно из представленных данных, с повышением концентрации клеточной суспензии происходило линейное повышение количества адгезировавших на матрице клеток, но только до определенного уровня. При повышении исходного количества клеток более 1x106, значимого увеличения адгезировавших клеток не происходило. Таким образом, оптимальным содержанием МСК в суспензии является 1х106 клеток, что составляет 2x105 клеток/см длины засеваемого сосуда. Эффективность засевания при этом составила 39,5%.

В результате использования комбинации статического метода доставки клеток с последующей перфузией сосудистого кондуита в биореакторе, нам удалось улучшить результаты рецеллюляризации: повысить жизнеспособность клеток до 89.3 ± 5.9 %, сократить продолжительность культивирования до 5 сут., достигая образования нескольких слоев клеток по всей внутренней поверхности графта и инфильтраци их вглубь сосудистой стенки. В конце процедуры перфузии сосудистого кондуита в биореакторе мы получили прекондиционированный ТИКС, готовый к трансплантации в артериальную позицию лабораторного животного, где исследовалась дальнейшая его перестройка в «зрелый» кровеносный сосуд.

Результаты имплантации графтов in vivo.

Однократно (в качестве отдельного эксперимента) была имплантирована ДАП, которая не была предварительно ушита. При этом стало ясно, что анастомозирование сосудов возможно, несмотря на явное несоответствие их диаметров. Но турбулентный ток крови в расширенном участке кровеносного русла создавал повышенный риск тромбоза шунта и возможно привел бы к ложным результатам. Поэтому мы использовали методику предварительного

уменьшения диаметра исследуемых сосудов, что несколько увеличивало объем работы, но облегчало наложение анастомозов и исключало указанные нарушения тока крови по трансплантату.

Всего проведено 25 опытов. 5 животным имплантировали аорту другой крысы (группа 1, контроль), 10 животным - децеллюляризованную артерию пуповины, незасеянную клетками (группа 2) и еще 10 животным имплантировали ТИКС, засеянный МСК и культивированный в-проточном биореакторе в течение 5 сут. (группа 3).

Следует отметить, что в процессе имплантации артерии пуповины оказались удобны при исполнении всех необходимых манипуляций: легко захватывались и удерживались микропинцетом, игла без существенного сопротивления проходила сквозь стенку сосуда, в местах прокола кровотечение отсутствовало. Длительность операции составила 120 ± 15 мин., время пережатия аорты 55 ± 15мин., достоверной разницы по этим показателям между использованием различных видов имплантируемых сосудов не было. На каждый анастомоз было наложено от 8 до 10 отдельных узловых шва. Непосредственно после запуска кровотока все шунты бьии проходимы. Кровопотеря при запуске кровотока в области анастомозов была минимальной, останавливалась кратковременным локальным прижатием. В ряде случаев потребовалось наложение дополнительных швов. Протекания крови сквозь стенку сосудистых кондуитов не было.

При эксплантации графтов не было выявлено их аневризматечкого расширения, что еще раз подтверждает сохранность ВКМ после децеллюляризации. Макроскопически отмечено образование рыхлой рубцовой ткани в зоне операции во всех трех группах исследования.

В группе 1 (контроль) все 5 крыс оставались живы до 30 сут. после операции. Имплантированные сосуды этой группы были проходимы, несмотря на их аллогенное происхождение.

В группе 2 (незасеянные ДАП) 3 крысы погибли в первые 3 сут. после операции, во всех случаях в просвете имплантированного сосуда обнаружен тромб. Одна погибла на 7-е сутки от инфекционных осложнений (нагноение послеоперационной раны), исключена из исследования и при анализе проходимости не учитывается. У 4 из 6 оставшихся животных этой группы сосудистые кондуиты тромбировались в различные сроки в течение месяца после имплантации. При этом проявления тромбоза шунта (задний парапарез) развились лишь у двух крыс (50%).

В группе 3 (ТИКС, предварительно засеянные МСК и прекультивированные в биореакгоре) одно животное без признаков тромбоза ТИКС выведено из эксперимента на 2-е сут. после операции для изучения клеточного состава сосудистой стенки в раннем послеоперационном периоде. Это животное не учитывали при расчете показателя проходимости графтов. Остальные 9 крыс оставались живы до 30 сут. после операции,

парапарезов не было. При выведении отмечен тромбоз 1 из 9 имплантированных ТИКС.

Таким образом, ТИКС (группа 3), показали значительно более высокий уровень проходимости (8 из 9 графтов проходимы) по сравнению с незасеянными сосудистыми кондуитами (группа 2), где только 2 из 9 сосудов оставались проходимы в течение 30 сут., что очевидно связано с ключевой ролью МСК, адгезированными на внутренней поверхности ТИКС, несмотря на их аллогенное происхождение. Тем не менее роль этих клеток в ремоделировании ТИКС до конца не понятна. В препарате ТИКС через 2 суток после имплантации продолжали визуализироватсья аллогенные МСК, предварительно меченные РКН26 и засеянные на графт до имплантации. Следует отметить значительное уменьшение их количества и яркости свечения красителя по сравнению с препаратом ТИКС до имплантации. В препаратах ТИКС, эксплантированных через 30 сут. после операции, меченых клеток не обнаружено. Возможно, МСК обеспечивают лишь кратковременную антитромбогенность графта, привлекая и замещаясь зрелыми и прогениторными клетками реципиента (например, из зоны анастомозов или из циркулирующей крови). Возможно, хотя и маловероятно, что отсутствие меченых клеток в стенке ТИКС к 30-м сут. вызвано активной пролиферацией МСК и соответственно разведением красителя до визуально неопределяемого уровня.

При морфологическом исследовании сосудов группы 2 и 3 отмечена богатая инфильтрация стенки графтов клетками. Судя по их морфологии и расположению, можно предположить, что это - фибробласты или миофибробласты.

В просвете 7 графтов группы 2 отмечено наличие окклюзирующего тромба, в большинстве случаев сочетающееся с утолщением сосудистой стенки и сужением просвета. Остальные 2 из 9 сосудистых кондуитов этой группы, были проходимы, но также отмечено увеличение толщины их стенки.

На препаратах ТИКС, эксплантированного на 2-е сутки после операции обнаружено большое количество клеток, привлеченных в зону графта с его наружной стороны. Отсутствие ИГХ реакции на а-БМА позволяет считать, что это - фибробласты или прогениторные клетки. Такая быстрая реакция организма, вероятно, обусловлено особенностями крысы как экспериментальной модели, известной своей способностью к быстрой регенерации.

Гистологическая картина всех 8 проходимых к 30-м сут. ТИКС в группе 3 одинаковая. Клетки реципиента инфильтрировали стенку ТИКС, формируя ткань, напоминающую адвентицию и средний слой нормального сосуда. На препаратах, окрашенных по Ван-Гизону, отмечено сохранение богатого коллагеном ВКМ. Клетки, выстилающие внутреннюю поверхность ТИКС, имели положительную ИГХ-окраску на антиген СО-31, характерный для эндотелия. Средняя часть сосудистой стенки была богато инфильтрирована клетками, часть

которых экспрессировала а-БМА, характерный для ГМК. Перестройка прогениторных клеток в дифференцированные миоциты обусловлена, возможно, двумя причинами: наличием МСК в сосудистой стенке и действием микроокружения. Таким образом, можно говорить о ремоделировании ТИКС в зрелую нативную артерию в организме реципиента, который выступает в этом случае в роли идеального (с точки зрения воссоздаши физиологических условий) биореакгора.

Таким образом, результаты данного диссертационного исследования показывают, что создание искусственных сосудов с заданными биологическими и механическими свойствами - выполнимо. ТИКС на основе ДАП, заселённые мезенхимными стволовыми клетками, пригодны для решения как экспериментальных задач, так, возможно, и для реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии. Дальнейшие исследования могут быть направлены на трансляцию методов тканевой инженерии кровеносных сосудов в клиническую практику.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный способ децеллюляризации артерий пуповины. При этом механические свойства нативных артерий после децеллюляризации сохраняются. В децеллюляризованных артериях клетки и клеточный дебрис не определяется, внеклеточный матрикс артерии остается интактным.

2. Механические свойства децеллюляризованных артерий пуповины не меняются при их длительном хранении.

3. МСК фиксируются на стенке децеллюляризованных артерий пуповины и сохраняют свою жизнеспособность. Определена оптимальная плотность и методика посева МСК на децеллюляризованные артерии пуповины. Разработан оригинальный проточный биореактор, использование которого улучшает результаты рецеллюляризации артерий пуповины, лишенных клеточного состава.

4. Через 30 сут. наблюдения проходимость децеллюляризованных артерий пуповины, засеянных МСК, значительно выше чем незасеянных.

5. Полученные в ходе диссертационной работы результаты позволяют перейти к доклиническому исследованию полученных тканеинженерных кровеносных сосудов.

6. Рецеллюляризированные артерии пуповины показали высокую проходимость в эксперименте.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При оценке свойств новых видов децеллюляризированных сосудов предлагаем использовать тот же объем проведенного нами комплексного изучения полноты удаления клеток и клеточного дебриса из донорской ткани с обязательным определением

механических характеристик.

2. Артерии пуповины подходят для изготовления тканеинженерных кровеносных сосудов диаметром 3-4 мм и длиной до 50 см. Мы рекомендуем использовать предлагаемую методику децеллюляризации для получения неиммуногенного внеклеточного матрикса сосудов с сохраненными механическими параметрами.

3. Децеллюляризированные артерии пуповины следует хранить в охлажденном фосфатно-солевом буферном растворе.

4. Перед имплантацией засеянных графтов необходимо проводить их прекультивирование в биореакторе, обеспечивающим постоянный ток питательный среды через просвет сосуда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Насрединов A.C., Лаврешин A.B., Аиисимов C.B., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И. Децеллюляризованные артерии пуповины человека как основа тканеинженерных кровеносных сосудов малого калибра // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - T. VIII. - № 1. - С. 66-71.

2. Насрединов A.C., Лаврешин A.B. Тканевая инженерия кровеносных сосудов: способы совмещения клеток и носителя // Гены & Клетки (бывш. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия). - 2014. - T. IX. - № 1. - С. 23-34.

3. Лаврешин A.B., Насрединов A.C., Курапеев Д.И., Аниснмов C.B., Митрофанова Л.Б., Бещук О.В. Децеллюляризация аортальных гомографтов и их морфологическая оценка // Гены & Клетки (бывш. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия). - 2014. - T. IX. - № 1. - С. 64-71.

4. Насрединов A.C., Лаврешин A.B., Лебедева Е.А., Анисимов C.B., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И. Артерии пуповины человека сохраняют свои механические свойства после децеллюляризации// Гены & Клетки (бывш. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия). -2014. - T. IX. - № 2. - С. 80 - 86.

5. Насрединов A.C., Анисимов C.B., Вавилов В.Н., Пузанов М.В., Курапеев Д.И. Рецеллюляризация тканеинженерных сосудов в проточном биореакторе // Цитология. - 2014. - Т. 56. - № 12. - С. 926-932.

6. Насрединов A.C. Способ децеллюляризации кровеносных сосудов малого калибра. Патент РФ на изобретение №2504334, приоритет изобр. 28.11.12. Зарегистрирован в гос. реестре изобр. РФ 20.01.14 г.

7. Насрединов А. С., Лаврешии А. В., Анисимов С. В., Вавилов В. Н., Курапеев Д. И. Способ получения экстрацеллюлярных матриксов кровеносных сосудов малого калибра методом децеллюляризации и их морфологическая оценка // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2013. - Т. 14. - № 6. - Приложение «Сборник докладов и сообщений 19 Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов, Москва, 24-27 ноября 2013г.». - С. 250

8. Насрединов A.C., Анисимов C.B., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И., Лебедева Е.А. Оценка механических свойств децеллюляризованных артерий пуповины человека // Материалы I Национального Конгресса по регенеративной медицине. - М.: «Меди Экспо», 2013.-С. 181.

9. Насрединов A.C., Лаврешин A.B., Анисимов C.B., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И. Рецеллюляризация сосудистого кондуита мезенхимными стволовыми клетками // Материалы I Национального Конгресса по регенеративной медицине. - М.: «Меди Экспо», 2013.-С. 182.

10. Насрединов A.C., Лаврешин A.B., Анисимов C.B., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И. Способ получения внеклеточных матриксов артерий малого калибра и их морфологическая оценка // Материалы I Национального Конгресса по регенеративной медицине. - М.: «Меди Экспо», 2013. - С. 183.

11. Насрединов A.C., Лаврешин A.B., Анисимов C.B., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И. Биоинженерный кровеносный сосуд малого калибра на основе артерии пуповины человека // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2014. - T. XVI. -Приложение «Материалы VII Всероссийского съезда трансплантологов, Москва, 28-30 мая 2014г.».-С. 282.

12. Насрединов A.C., Лаврешин A.B., Анисимов C.B., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И. Использование проточного биореакгора улучшает результаты рецеллюляризации биоинженерных сосудистых кондуитов // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2014. - T. XVI. - Приложение «Материалы VII Всероссийского съезда трансплантологов, Москва, 28-30 мая 2014г.». - С. 251.

Принятые сокращения

АП - артерии пуповины

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГМК - гладкомышечные клетки

ДАП - децеллюляризованные артерии пуповины

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИГХ - иммуногистохимия

МСК - мезенхимные стволовые клетки

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТИКС - тканеинженерный кровеносный сосуд

ФГБУ «СЗФМИЦ» - Федеральное государственное бюджетное учреждение «СевероЗападный федеральный медицинский исследовательский центр» ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор а-БМА - альфа-гладкомышечный актин

Подписано в печать 21.09.2015 Формат 60x84 Vi6 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ № 14/09 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)