Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Экспериментальное обоснование метода получения аутопротезов для восстановительной хирургии сосудов

07-3 2140

На правах рукописи

Крохин Дмитрий Иванович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ АУТОПРОТЕЗОВ ДЛЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ ХИРУРГИИ СОСУДОВ

14.00.27 - Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Екатеринбург - 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» на базе Муниципального учреждения «Городская клиническая больница № 40» г. Екатеринбурга.

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Ходаков Валерий Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Макарова Нина Петровна

доктор медицинских наук Левчик Евгений Юрьевич

Ведущая организация

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится « 23 » ьССОЖ 2007г. в часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.102.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Уральской государственной медицинской академии по адресу: 620028 г. Екатеринбург, ул. Репина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО УГМА Росздрава (г. Екатеринбург, ул. Ключевская, 17), а с авторефератом на сайте академии www. usma. ru

Автореферат разослан « » 2007г.

Ученый секретарь Совета доктор медицинских наук, профессор

В. А. Руднов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из основных проблем в современной медицине является поиск путей совершенствования и разработка принципиально новых подходов в хирургическом лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы. Еще не решен вопрос о получении эффективного материала для протезирования и шунтирования артерий малого и среднего калибра (Miller J. Н. et al., 1984; Rankin J. S. et al., 1986; Weinsehelbaum E. E. et al., 1997).

В клинической практике в настоящее время используется пластика артерий собственными сосудами организма - a. mammaria, а. thoracica interna, v. saphena magna, и т. д. (Лебедев Л. В. с соавт., 1997; Шнейдер Ю. А. с соавт., 2004; Miller J. Н. et al., Rankin J. S. et al., 1984; Weinsehelbaum E. E. et al., 1997), либо искусственными протезами (Л. А. Бокерия с соавт., Л. В. Лебедев с соавт., 1996; Лазарев С. Н. с соавт., 2000; В. Воусе, 1982). При этом указываются и недостатки данных методов. Так, например, J. Н. Campbell (1999) указывает на варикозно-дегенеративные изменения вен у больных преклонного возраста, которые приводят к формированию аневризм венозных трансплантатов в условиях воздействия на них артериального давления. Аутовены в 25-30% недоступны из-за анатомического строения и использования их в предыдущих операциях (Барсуков В.Л., 1987; Campbell J. Н., 1999). Известно, что после аорто-коронарного шунтирования аутовеной уже через 2-5 лет остаются проходимыми лишь 60-70% трансплантатов (Miller J. Н., 1984). Шунты из аутоартерий, как правило, атеросклерогически изменены, что ограничивает возможность их применения (Шнейдер Ю. А., 2004; Miller J. Н., 1984; Weinsehelbaum Е. Е., 1997; Campbell J. Н., 1999).

В 80-е годы большой интерес вызывало использование ксенопротезов, получаемых при ферментативно-химической обработке артерий млекопитающих. Они обладают нулевой хирургической порозностыо, адекватными пластическими и иммунологическими свойствами (Бохуа Н. К., 1979; Сычеников И. А., 1980; Дронов А. Ф., 1983; Егембердиев Т. Ж., 1984; Леменев В. Л., 1985). Простые ксенотрансплантаты склонны к формированию аневризм и слабо резистентны к инфекции и тромботической индукции, не более 40% их остаются проходимыми в течение 6-8 месяцев (Буяновский В. Л., 1983; Барсуков В. Л., 1987; Campbell J. Н., 1999). Гепаринизация их внутренней поверхности не обеспечивает необходимого антиагрегантного потенциала (Иоселиани Г. Д., Бохуа Н. К., 1979; Шумаков В. И., 1981; Доброва Н. Б., 1985; 1979; Sawyer Р., 1978). Известны другие способы увеличить тромборезистентность и продолжительность функционирования ксенопротеза (Кованова В. В., 1967; Егембердиев Т. Ж.. 1984; Барсуков В. Л., 1987; Sawyer Р., 1978; Raghumth К, 1983).

Общеизвестно, что синтетические сосудистые протезы в отдаленные сроки после имплантации в артерии малого калибра тромбируются в 100% случаев (Stanley J. С., Burkel W. Е., 1982). Перспективны эксплантопротезы с эндотелиальным покрытием, чему посвящено много работ в России и за

рубежом (Абзианидзе Г. А., 1989; Stanley J. С., Burkel W. С., 1982; Shepard A. D„ F.ldrup-Jorgensen J., 1986; Schneider P. A. et al., Wakefield Т. W., 1988). Эндотелиальное покрытие ангиоэксплантатов выполняли как аутологичными, так и культивируемыми алло - и ксенокультурами клеток интимы. Однако выделение и выращивание эндотелиальных клеток in vitro - дорогой и трудоемкий метод, а эндотелий таких ангиопротезов либо слущивается, либо подвергается иммунной атаке "организм против трансплантата" в относительно неотдаленные сроки (Campbell J. Н., 1999). Поэтому в последние годы начаты работы по формированию сосудов из клеток различных тканевых культур.

Значительное распространение в клинической практике и научных исследованиях, посвященных проблеме лечения ишемических заболеваний, связанных с поражением артерий малого калибра, получили методы, основанные на ангиогенезе за счет имплантаций стволовых клеток в ишемизированную ткань (К. Hirata, 2002; Н. F. Tse, 2003; J. Chen, 2003; A. Al-Khaldi, 2003; H. Kamihata, 2002). Другие разработки, освященные в литературе, осуществляются несколькими путями: засеванием биополимерных каркасов культурой гладкомышечных клеток (McKee J.A., 2003), выращиванием протезов в организме, требующем ангиопластики (Campbell J. Н., 1999, 2000; Efendy J. L., 2000). Данные методы вызывают значительный научный интерес и требуют дальнейшего детального изучения. При этом недостаточно изучены механизмы формирования сосудистых аутопротезов in vivo, влияние регуляторных систем организма на этот процесс. Огромный интерес для ученых вызывают вопросы регуляции на клеточном уровне, межклеточных взаимодействий, регуляции роста, дифференцировки и регенерации клеток с помощью факторов роста, которые вырабатываются специфическими регуляторными клетками. Исследована и описана данная функция у макрофагов, тучных и иммунокомпетентных клеток (Юшков Б. Г., Черешнев В. А., 2002) Эти разработки послужили теоретическим обоснованием созданию современных протезов для ангиопластики.

Таким образом, имеющиеся недостатки уже разработанных методов послужили основанием для дальнейших исследований в этой области. Остается нерешенным вопрос о подходящем материале для пластики артерий малого и среднего калибра, а современные наработки в области использования стволовых клеток не являются путем решения хирургических проблем, требующих ангиопластики, а имеют терапевтический подход. Остаются недостаточно исследованными механизмы формирования сосудистых соединительнотканных аутопротезов и участие регуляторных систем организма в этом процессе.

Все выше изложенное послужило основанием для определения цели и задач настоящего исследования.

Целью исследования является получение сосудистых аутопротезов для пластики сосудов малого калибра.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1) разработать метод получения сосудистых протезов на разных видах экспериментальных животных;

2) дать сравнительную характеристику аутопротезов для ангиопластики, полученных в организме крыс и кроликов;

3) дать сравнительную характеристику аутопротезов. полученных при подкожном и внутрибрюшинном введении миллипоровых и полихлорвиниловых трубчатых имплантатов;

4) дать характеристику механизмов регуляции в формировании сосудистых аутопротезов;

5) разработать метод ангиопластики на сосудах малого калибра, на экспериментальных животных, с использованием полученных аутопротезов;

6) оценить эффективность метода с помощью инструментальных и морфологических исследований.

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые показана (на экспериментальных животных) возможность создания и использования соединительнотканных аутопротезов для пластики сосудов малого и среднего калибра. Проведена комплексная оценка эффективности полученных протезов при ангиопластике. Впервые продемонстрировано, что соединительнотканный протез, имплантируемый в артерии разного типа, обеспечивает в оперированном сосуде кровоток и служит основой для формирования элементов стенки сосуда данного типа.

Определены физические и биологические свойства протезов (прочность, гистологическое строение, состав клеточного компонента и межклеточного вещества). Определено значение некоторых механизмов регуляции процесса формирования соединительнотканных аутопротезов in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы. Показано, что в условиях пластики полученными аутопротезами артерий малого и среднего калибра происходит дифференцировка соединительнотканных элементов и формирование структур сосудистой стенки - интимы, предшественников гладкомышечных клеток меди, и зрелых эластических структур внутренних и наружных эластических мембран. Дано научное обоснование возможности использования данных сосудистых аутопротезов в качестве пластического материала при формировании артериовенозных фистул для гемодиализных больных, в дальнейшем - для повторных аортокоронарных шунтирований, и вообще реконструкций сосудов малого и среднего калибра (Патент за № 2260379 «Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей»).

Положения, выносимые на защиту:

1. Для пластики артериальных сосудов малого и среднего калибра может быть использован протез, получаемый как соединительнотканная капсула вокруг инородного тела.

2. Качество соединительнотканного аутопротеза зависит от материала протезформирующего имплантата, от места его введения, вида животных, состояния иммунной системы и различных лекарственных воздействий на их организм.

3. В зависимости от местных условий (параметры кровотока, тип сосуда), в

имплантированном сегменте формируется (на основе соединительнотканного протеза) сосуд данного типа, происходит дифференцировка его структур.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются при обучении студентов в курсе «Общая хирургия» на кафедре общей хирургии УГМА, в учебном процессе на кафедре патофизиологии Челябинской государственной медицинской академии. Отработанные в процессе выполнения диссертации методические приемы используются в выполняемых в рамках НИР диссертационных и студенческих работах на кафедре общей хирургии УГМА, а также внедрены в научные исследования, выполняемые на кафедре физиологии человека и животных УРГУ (зав. каф. д.м.н., профессор Юшков Б. Г.) и лаборатории Института иммунологии и физиологии УО РАН (зав. д.м.н., академик РАН, профессор Черешнев В. А.).

Получен патент на изобретение № 2260379 от 20.09.2005 г. «Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей».

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, сделан ряд докладов на научных конференциях разного уровня. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании Областного хирургического научно-практического общества хирургов (Екатеринбург, 2004), на XXI международном съезде физиологов им. И. П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на IX итоговой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке" (Киров, 2005), на X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005), на Всероссийской конференции «Медицина и патофизиология» (Санкт-Петербург , 2005), на научной конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний в клинике и эксперименте» (Москва, 2005), в докладах Академии наук РФ (2006).

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы описания материала и методов исследования, двух глав с изложением и обсуждением результатов собственных исследований, общего заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 109 отечественных и 95 иностранных источников. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 32 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на 70 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 200-250г. и 26 беспородных взрослых кроликах массой 4кг.

Под эфирным наркозом 70 белым беспородным крысам и 26 кроликам при соблюдении правил асептики и антисептики под кожу спины имплантировали трубки из полихлорвинила (ПХВ) и пористой целлюлозы длиной 20мм и диаметром 1-2мм, служившие для формирования соединительнотканного протеза (протезформирующие имплантаты). Группе из 30 беспородных крыс

внутрибрюшипно имплантировали трубки из пористой целлюлозы (пористый целлюлозный фильтр, НА 0.45^) длиной 20мм и диаметром 1мм, служившие для формирования соединителыю-тканного протеза. Группе из б кроликов имплантировали целлюлозные трубки подкожно и впутрибрюшинно, и из ПХВ — подкожно. Рану ушивали отдельными узловыми швами.

Динамику формирования соединительнотканных аутопротезов изучали на протяжении 6 недель у крыс и кроликов. Протезформирующие имплантаты, покрытые соединительнотканной капсулой, извлекали через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель, капсулы (далее - аутопротезы) оценивали по макро - и микроскопическим характеристикам. Все животные разделены на 6 групп соответственно срокам введения протеэформирующих имплантатов. С целью оценки возможности использования полученных протезов для пластики сосудов 5-недельные аутопротезы под эфирным наркозом, при помощи микрохирургического инструментария и луп с 10-кратным увеличением, вшивали узловыми швами, атравматической пропиленовой нитью фирмы «ЕЙнсоп» 9-0, способом «конец в конец» в рассеченную общую сонную артерию 10 крыс. Подобным образом проводили ангиопластику резецированной бедренной артерии у 20 кроликов под нейролептанальгезией (ромитар и гексенал).

Оценивали проходимость аутопротезов через 3 и 6 месяцев после имплантации клинически и с помощью инструментальных методов (в группе кроликов), затем их извлекали для морфологического исследования. При гистологической оценке качества протезирования исследовали: I - участок сонной артерии, II - участок ткани в месте анастомоза, III - участок самого протеза. Контролем служила контралатеральная сонная артерия. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, на эластические структуры по Вейгерту, а также их комбинации;

Морфологическое исследование микропрепаратов проводилось на базе отдела общей патологии ЦНИЛ (зав. - д. м. н., профессор В. В. Базарный) старшим научным сотрудником к.м.н. С. Ю. Медведевой. Для гистологического исследования брались соединительно-тканные протезы, снятые с протезформирующего имплантата в разные сроки эксперимента, и участки аутопротезов, через 3 и 6 месяцев после протезирования артерий лабораторных животных. После стандартной гистологической обработки срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону на коллагеновые волокна, по Вейгерту на эластические волокна.

Наряду с обзорным гистологическим описанием препаратов проводили морфометрическое исследование толщины стенки протезов с помощью окуляр-микрометра (МОВ-1-15х), полученные результаты выражали в мм, производили подсчет количества клеток на единицу площади (0,01 мм2) и определяли их качественный состав.

Прочность на разрыв измеряли и сравнивали между собой на сонных артериях крыс и 5-недельных аутопротезах, сформированных на протезформирующих имплантатах из ПХВ.

Для определения влияния функционально-метаболической активности

макрофагов на процесс формирования аутопротезов использовали внутримышечное введение препарата «Тамерит» по 0,4мг и внутрибрюшинное -каррагинана по 1,5мг на протяжении 4-х недель, у отдельной группы из 40 крыс. Тамерит - иммуномодулятор, избирательно регулирующий функционально-метаболическую активность макрофагов (Абидов М.Т., Караулов A.B., 2002). Каррагинан - альгельный полисахарид, при попадании в организм захватывается макрофагами, вызывая обратимую ингибицию функции фагоцитирующих клеток (Фримель Г., 1987). Проводили гистологическое и морфометрическое исследования 4-недельных протезов в двух исследуемых группах: 1 - на фоне введения каррагинана (п=15), 2 - на фоне введения тамерита (п=15), контролем явились 4-недельные протезы животных, не получавших препараты (п=10).

Инструментальные методы оценки состоятельности кровотока в имплантатах кроликов выполнялось на базе диагностического отделения (зав. -М. В. Налесник) МУ ГКБ № 40 (гл. врач - д. м. н. Ф.И. Бадаев) врачом М. М. Тутуниной, Ю. Е. Мамонтовой и включали в себя ультразвуковое дуплексное сканирование и рентгеноангиографию бедренной артерии.

Ультразвуковое дуплексное сканирование проводилось с помощью системы Siemens Sonoline Antares (USA), с использованием широкодиапазонных многочастотных датчиков Multi Hertz от 4 до 8,89 Мгц в М-режиме, цветовом режиме, в энергетическом режиме, а также в режиме Допплера. Получали изображение графических кривых звуковых пульсовых волн, сравнивали с показателями нормального артериального кровотока артерий соответствующего калибра; оценивались состояние стенки и просвета, толщина, диаметр протезированного участка артерии. Использовалось цветное картирование протезированного участка. Оценивался центробежный (артериальный) кровоток, кодированный в красный цвет, и центростремительный (венозный) кровоток, кодированный в синий цвет - одноименная вена. Рентгеноангиографическое исследование проводилось на

рентгенодиагностическом телеуправляемом комплексе «Электрон» - КРТ (г. Санкт-Петербург), при экспозиции 160 mAs, силе тока 63 kV, 250 mS. Выполнялось по 3 серийных снимка подряд, от начала введения рентген-контраста (урографин 70%-1,0 ml). Контраст вводили через гибкую канюлю, введенную проксимальнее места имплантированного 6 месяцев назад аутоангиопротеза, в наружную подвздошную артерию, с контрольной артериографией противоположной конечности.

Результаты морфометрического исследования обработаны методами вариационной статистики с вычислением средней величины (М), стандартной ошибки средней величины (т). При сравнении количественных показателей использовался t - критерий Стьюдента. Достоверными считались различия при уровне значимости Р<0,05. Использовался непараметрический метод Манна-Уитни с применением стандартного пакета прикладных программ «Statistica 6.0, StatSoft, Inc», пакет статистических программ Microsoft Excel 7.0.

Результаты и их обсуждение. Первоочередной задачей работы явилась разработка метода получения сосудистых протезов на разных видах экспериментальных животных. 6 группам из 5 крыс и 1 кролика подкожно имплантировали протезформирующие ' имплантаты из ПХВ и пористой целлюлозы. Другим 6 группам из 6 крыс и 1 кролика внутрибрюшинно вводили целлюлозные имплантаты. Извлечение имплантатов проводилось через 1, 2, 3,4, 5 и 6 недель соответственно группе. Уже через 2 недели на протезформирующих имплантатах наблюдали сформировавшиеся соединительнотканные капсулы, которые свободно снимались, сохраняя форму трубки. При макроскопической оценке трубки-аутоангиопротезы имели различную толщину и плотность, на разрезе внутренняя поверхность гладкая, без каких-либо утолщений и разрывов. Далее трубка-аутоангиопротез подвергалась стандартной гистологической обработке для проведения микроскопической оценки.

Последующие морфологические и морфометрические исследования полученных протезов позволили определить структуру их стенки, этапы формирования, особенности их образования в различных условиях эксперимента.

Формирование аутопротезов для ангиопластики, полученных при подкожном введении имплантата из ПХВ, характеризовалось определенной динамикой. В 2-х недельных аутопротезах наблюдалось преобладание клеточных элементов с межклеточным веществом, что расценено как активная воспалительная реакция на введенный имплантат. Стенка аутопротезов имела четкое разделение на внутренний, средний и наружный слои (рис.1).

Рис. 1. 2-я неделя эксперимента. Стенка протеза, представленная рыхлой соединительной тканью с диффузной лейкоцитарной инфильтрацией.

Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 100

Поздние сроки эксперимента характеризовались существенным снижением числа элементов воспаления, более упорядоченной морфоструктурной организацией в стенке протезов, увеличением доли волокнистых структур, их упорядоченным циркулярным и продольным расположением. Особенно показательно это у 5-недельных протезов (рис.2).

Рис. 2. 5-я неделя эксперимента. Стенка протеза, представленная волокнистой соединительной тканью с очаговой лейкоцитарной инфильтрацией.

Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 100

Таким образом, проведенные исследования позволили предположить, что пятая неделя - оптимальный срок для использования протезов для ангиопластики, учитывая достаточное количество клеточного материала для его дальнейшей дифференцировки в новых гемодинамических условиях артериального сосуда, минимально выраженную воспалительную реакцию. Достаточно развит в этих сроках и коллагеновый матрикс, что необходимо для прочностных свойств протеза.

На следующем этапе исследования проводилась сравнительная оценка динамики формирования аутопротезов у разных видов лабораторных животных. Особенности формирования соединительнотканных протезов в организме крыс и кроликов наиболее показательны на 5 неделе эксперимента (табл.1). Толщина стенки протеза в динамике процесса его формирования прогрессивно уменьшается, составляя в сроке 5 недель - 0,09±0,05мм у крыс, при этом данный показатель в 3,7раза (р<0,001) больше в группе кроликов.

Количество клеток в стенке протеза сопоставимо в сравниваемых группах, аутопротезы имеют одинаковый клеточный состав, в котором преобладают элементы фибробластического ряда. Фибробласты являются коммитированными клетками и образуют волокна соединительной ткани, а также аморфный компонент межклеточного вещества. Они сосредоточены ближе к наружной и внутренней поверхностям трубки, зонам активного образования соединительной ткани, при этом в центральной части стенки протеза располагаются фиброциты. Количество фибробластов в протезах крыс и кроликов одинаково, а более зрелых клеток - фиброцитов у кроликов на 80% (р<0,01)меньше.

Таблица 1

Сравнительная характеристика аутопротезов у различных видов животных через 5 недель после имплантации под кожу ПХВ основы

Показатели Крысы Кролики

Толщина стенки, мм 0,09±0,005 0,34±0,01***

Кол-во клеток на 0,01 мм2 70,04±1,9 28,1±0,99

Фибробласты 15,7±3,4 15,84±1,5

Фиброциты 50,6±3,1 10,1±1,6**

Фибробласты + фиброциты 66,3±0,8 25,89±0,6

Лимфоциты 3,5±0,8 0,8±0,3

Сегментоядерные нейтрофилы 0,3±0,2 1,3±0,3

Макрофаги 0 0,06±0,04

Плазматические клетки 0 0

Примечание: в таблицах 1 и 2

* различие между группами достоверно (р<0,05) ** различие между группами достоверно (р<0,01) *** различие между группами достоверно (р<0,001)

Таким образом, в результате сравнительного гистологического и морфометрического анализа структур стенки аутопротезов у крыс и кроликов обнаружено, что процесс их формирования проходит одинаковые этапы. С увеличением сроков эксперимента уменьшается толщина стенки протеза, уменьшается количество клеток на единицу площади за счет снижения числа элементов воспаления, уменьшения клеток фибробластического ряда, нарастает число зрелых форм - фиброцитов, происходит созревание соединительной ткани с образованием волокнистых структур, ориентированных продольно. Однако с учетом морфометрических данных установлено, что у кроликов дольше сохраняются признаки воспаления, замедлены темпы созревания соединительной ткани, у крыс процесс формирования аутопротезов протекает существенно быстрее.

Использование разных материалов при имплантации под кожу как основы для формирования соединительнотканных протезов (на примере целлюлозы и ПХВ) позволило установить общие закономерности формирования структурных элементов образованных соединительнотканных капсул-протезов. При морфологическом исследовании аутопротезов, полученных подкожно на целлюлозных имплантатах, выявлена определенная динамика их формирования, подобная увиденной в эксперименте с использованием ПХВ имплантатов. С увеличением срока зрелости протеза уменьшается толщина его стенки, в ее структуре происходит уменьшение клеточности за счет снижения числа элементов воспаления, фибробластов, увеличивается количество зрелых фиброцитов и упорядоченных коллагеновых и эластических волокон.

При морфометрическом исследовании структурных элементов стенки аутопротезов, полученных на ПХВ и целлюлозной основах на 5-й неделе эксперимента, установлен ряд особенностей (табл.2).

Таблица 2

Сравнительная характеристика аутопротезов у крыс через 5 недель после имплантации под кожу ПХВ и целлюлозной основы

Показатели ПХВ целлюлоза

Толщина стенки, мм 0,09±0,005 0,22±0,02***

Кол-во клеток на 0,01 мм2 70,04±1,9 100,42±3,6***

Фибробласты 15,7±3,4 23,7±2,0*

Фиброциты 50,6±3,1 57,6±8,7

Фибробласты + фиброциты 66,3±0,8 81,3±6,9*

Лимфоциты 3,5±0,8 3,2±1,4

Ссгментоядерные нейтрофилы 0,3 ±0,2 12,9±5,7*

Макрофаги 0 3,0±1,3

Плазматические клетки 0 0

При сравнительном анализе выявлено, что у протезов, полученных на целлюлозной основе, в сроке 5 недель толщина стенки больше в 2,4 раза (р<0,001), в соединительной ткани выражен клеточный компонент, он преобладает над волокнистыми структурами, количество клеток на единицу площади больше на 43,4% (р<0,001). Более высокое суммарное количество фибробластов и фиброцитов на 22,6% (р<0,05), в основном за счет фибробластов, число которых больше на 50,9% (р<0,05), существенно больше элементов воспаления в стенке протеза.

Таким образом, аутопротезы на целлюлозной основе характеризуются большей толщиной стенки, в структуре которой более выражен клеточный компонент за счет фибробластов, более выражена воспалительная реакция, чем в протезах, полученных на ПХВ имплантатах. Полученные данные дают основание считать, что формирование аутопротезов на подкожно введенных целлюлозных трубчатых имплантатах у крыс отличается более медленной динамикой, чем на ПХВ имплантатах, что делает последние более привлекательными для формирования аутопротезов.

В проведенных экспериментах наряду с подкожным введением целлюлозных имплантатов животным проводилось и внутрибрюшинное их введение с целью сравнения качества получаемых при этом протезов. При исследовании протезов, полученных внутрибрюшинным введением имплантатов, выявлены аналогичные этапы формирования структур, образующих стенку протеза. Динамика внутрибрюшинного формирования сосудистых аутопротезов имеет ряд особенностей при морфологическом и морфометрическом анализе. С увеличением срока формирования не выявлено динамического уменьшения толщины стенки протеза за счет сохраняющегося отека. Уменьшение количества фибробластов в структуре стенки не сопровождалось увеличением числа зрелых фиброцитов, в более поздние сроки происходило снижение интенсивности воспалительной лимфоидной реакции по сравнению с подкожной имплантацией. Полученные данные свидетельствуют о том, что внутрибрюшинное формирование соединительнотканных протезов характеризуется замедленной динамикой, что позволяет считать подкожное

моделирование аутопротезов для ангиопластики более предпочтительным.

Моделирование сосудистого протеза, проведенное нами в эксперименте, основано на привлечении и дифференцировке стволовых клеток соединительной ткани. В настоящее время чрезвычайно актуально изучение вопросов межклеточных взаимодействий, регуляции роста, дифференцировки и регенерации клеток с помощью факторов роста, которые вырабатываются специфическими регуляторными клетками. Ведущую роль в регуляции росга соматических клеток организма играют макрофаги, тучные и иммунокомпетенгные клетки (Бабаева А. Г., 1990; Маянский Д. Н., 1991; Маянский Д. Н., Пикуза О. И., 1993; Донцов В. И., 1998; Шехтер А. Б., Серов В. В., 1991; Черешнев В. А., Юшков Б. Г. с соавт., 2002; Шгап Я. Б., 1999).

Механизмы формирования сосудистых аутопротезов остаются недостаточно изученными. При гистологическом исследовании в стенке протеза обнаружено значительное количество клеточных элементов, которое уменьшается и претерпевает качественные изменения в поздние сроки эксперимента. Среди клеток инфильтрата в стенке протеза выявляются лимфоциты и макрофаги. В этой связи нам представлялось актуальным исследовать влияние функционального состояния макрофагов на динамику формирования сосудистых аутопротезов. Для изменения функционального состояния макрофагов внутримышечно вводили животным тамерит, и внутрибрюшинно - каррагинан. В результате проведенного исследования, среди различных механизмов регуляции, влияющих на процесс формирования сосудистого аутопротеза, показана важная роль системы фагоцитирующих мононуклеаров. По нашим данным, подавление функции макрофагов каррагинаном тормозило формирование соединительнотканных аутопротезов, в то время как ее стимуляция тамеритом ускоряла этот процесс. Следовательно, процесс формирования сосудистых аутопротезов зависит от функционального состояния макрофагов (табл.3).

Таблица 3

Сравнительная характеристика 4-недельных аутопротезов при введении препаратов разнонаправленного действия

Показатели Контроль Тамерит Каррагинан

Толщина стенки (мм) 0,14±0,02 0,02±0,001*** 0,30±0,02***

Количество клеток на 0,01 мм2 62,33±1,95 48,93±1,68*** 65,46±2,41

Фибробласты 17,9±3,7 7,3±1,5 31,3±2,9*

Фиброциты 37,2±4,4 41,6±1,5 26,8±43

Фибробласты +фиброциты 55,6±0,75 48,93±0,001** 58,13±1,7

Лимфоциты 4,6±0,9 0 2,5±1,0

Сегментоядерные лейкоциты 1,5±1,2 0 4,8±2,0

Макрофаги 1,2±0,7 0 0

Примечание: * - различие с контролем достоверно (р<0,05) ** - различие с контролем достоверно (р<0,01) *** - различие с контролем достоверно (р<0,001)

Исходя из этого, можно полагать, что темпы созревания аутопротезов для ангиопластики могут модулироваться путем направленной фармакологической коррекции активности системы фагоцитирующих мононуклеаров организма.

Прочность 5-недельных соединительнотканных протезов и сонной артерии крыс определяли и сравнивали на разрыв. Предельную прочность высчитывали по формуле:

ав = Р/Рр (1)

где а„- предельная прочность, кг/мм2, Р - приложенная нагрузка, кг,

Бр- площадь артерии или протеза после разрыва, мм2

Рр= 0,785 (с12н- сі \) где сі„- наружный диаметр артерии или протеза после разрыва, мм, с1в— внутренний диаметр артерии или протеза после разрыва, мм

(2)

Таблица 4

Сравнительная характеристика показателей сонной артерии и 5-недельного соединительнотканного аутопротеза

Показатели Сонная артерия Аутопротез

с!„ (наружный диаметр, мм 0,34±0,02 0,58±0,1

с1в (внутренний диаметр), мм 0,06±0,02 0,18±0,03*

Р (нагрузка), кг 0,287±0,04 0,334±0,14

Р„ (площадь), мм2 0,085±0,01 0,254±0,1

ав (предельная прочность), кг/мм2 3,42±0,21 1,31±0,04***

Примечание: * - различие с сонной артерией достоверно (р<0,05)

*** - различие с сонной артерией достоверно (р<0,001)

Как видно из таблицы, предельная прочность протеза в 2,5 раза меньше предельной прочности сонной артерии крысы. Этого оказалось достаточно для проведения реконструкции артерии малого и среднего диаметра.

Следующей важной задачей для осуществления поставленной цели явилась разработка метода ангиопластики на сосудах малого калибра на экспериментальных животных, с использованием полученных аутопротезов. С целью оценки возможности использования полученных протезов для реконструкции сосудов в рассеченную общую сонную артерию 10 крыс и в резецированную бедренную артерию 20 кроликов вшивали 5-недельные соединительнотканные аутопротезы.

После проведенной операции состояние лабораторных животных оставалось удовлетворительным, признаки ишемических расстройств отсутствовали на всех сроках наблюдения.

Особый интерес в нашей работе представляла оценка эффективности метода ангиопластики полученными в эксперименте аутопротезами с помощью

инструментальных и морфологических исследований. У крыс инструментальная оценка их проходимости не проводилась, а эффективность протезирования оценивали тремя способами:

1) путем перевязки противоположной общей сонной артерии. Отсутствие церебральных нарушений свидетельствовало о проходимости протеза, поскольку последние проявляются у крыс при закупорке сонных артерий;

2) извлечение протезов начинали со стороны дистального конца анастомоза, и наличие кровотечения указывало на проходимость имплантата;

3) исследование гистологических препаратов.

У кроликов через 6 месяцев после реконструкции бедренной артерии кроликов соединительнотканными аутопротезами проводили оценку эффективности кровотока с использованием инструментальных методов исследования, а в последующем - гистологический анализ извлеченных аутопротезов и сегментов протезированной артерии.

По данным проведенного дуплексного исследования протезированной бедренной артерии кролика, выявлен активный артериальный кровоток, соответствующий нормальному по всем показателям исследования; стенка протеза и его просвет аналогичны нормальным интактным бедренным артериям животного (рис. 3).

Рис. 3. УЗДГ протезированного сосуда.

По результатам ангиографии протезированной бедренной артерии кролика, установлен активный артериальный кровоток через протезированный участок сосуда и воспринимающих дистально лежащих артерий, соответствующий нормальному кровотоку; стенка протеза и его просвет аналогичны нормальным интактным бедренным артериям животного (рис. 4).

Рис. 4. Рентгеноконтрастная артериография протезированной артерии.

Таким образом, результаты проведенных инструментальных исследований сосудистого кровотока (ультразвуковое дуплексное сканирование, рентгеноконтрастная артериография) свидетельствуют о состоятельности анастомоза и проходимости аутопротеза у всех экспериментальных животных в течение 6 месяцев наблюдения.

В результате проведенного гистологического исследования установлено, что при протезировании аутопротезом бедренной артерии кролика, относящейся к артерии мышечно-эластического типа, через 6 месяцев эксперимента имплантат является проходимым, происходит дифференцировка структурных элементов его стенки. Наблюдается образование и упорядоченное расположение эластических волокон, формирование эластических мембран, определяется васкуляризация слоев наружной оболочки, имеется четкая дифференцировка стенки протеза на слои, обнаруживаются эндотелиоподобные клетки (рис. 5).

Рис. 5. Имплантат бедренной артерии. Просвет свободен, эластическая

мембрана - с признаками деструкции. Адвентициальная оболочка сосуда представлена плотной волокнистой соединительной тканью, коллагеновые волокна сопровождаются тонкими эластическими — «протез в сосуде». Комбинированная окраска (по Ван-Гизону и Вейгерту). Ув. х 100.

С целыо морфологической оценки динамики формирования структурных элементов стенки аутопротезов в гемодинамических условиях протезированной артерии группе животных проводилось оперативное извлечение и последующее гистологическое исследование 3-месячных аутопротезов и сегментов бедренной артерии. По данным гистологического исследования протезированных участков бедренных артерий кроликов, являющихся у этих животных артериями мышечно-эластического типа, зафиксировано формирование основных структур сосудов данного типа уже через 3 месяца после имплантации соединительнотканного протеза. На гистопрепаратах определяются формирующиеся эластические волокна и мембраны, просвет артерий проходим, нет четкой диф-ференцировки сосудистой стенки на слои (рис. 6). _

Рис. 6. 3-месячный аутопротез. В стенке контурируются слои: внутренний, средний, наружный, сегментарно выражена внутренняя эластическая мембрана.

Комбинированная окраска (по Ван-Гизону и Вейгерту). У в. х 100.

У крыс в сроке 6 месяцев после имплантации соединительнотканных аутопротезов обнаруживается более высокая степень дифференцировки последних в сосуды того типа, в который были имплантированы (рис. 7). Кроме развитых эластических мембран и довольно четкой дифференцировкой на слои, обнаруживаются формирующийся эндотелий, а также скопления миобластов, что говорит о формировании гладкомышечных клеток (рис. 8).

Рис. 7. Участок протеза через 6 мес. Тонкие эластические волокна во внутренней и средней оболочках, зрелые утолщенные эластические волокна в наружной. Комбинированная окраска (по Ван-Гизону и Вейгерту). Ув. х 496.

I ,. ч

Рис. 8. Участок имплантата. Единичные эндотелиоциты во внутренней оболочке, единичные миобласты в средней оболочке.

Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х 2000.

Таким образом, в результате проведенного гистологического исследования показана возможность использования соединительнотканных аутопротезов в качестве материала для ангиопластики артерий мышечно-эластического типа. При гистологическом исследовании протеза у крыс и кроликов на 6 месяце наблюдения установлено, что при протезировании аутопротезом бедренной артерии кролика и сонной артерии крысы, относящихся к артерии мышечно-эластического типа, протез является проходимым, происходит дифференцировка структурных элементов его стенки. Наблюдается образование и упорядоченное расположение эластических волокон, формирование эластических мембран, определяется васкуляризация слоев наружной оболочки, имеется четкая дифференцировка стенки имплантата на слои, обнаруживаются эндотелиоподобные клетки. В ряде случаев наблюдается врастание ткани протеза в просвет прилегающей артерии и формирование в этом протезе структур артерии - эндотелий, внутренняя и наружная эластическая мембраны, элементы средней оболочки. У крыс в сроке 6 месяцев после имплантации соединительнотканных аутопротезов обнаруживается более высокая степень дифференцировки структурных элементов их стенки, определяются эндотелиальные клетки в интиме и гладкомышечные элементы средней оболочки.

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте на крысах и кроликах разработана методика получения соединительнотканных аутопротезов для ангиопластики, формирующихся в течение 5 недель при подкожном или внутрибрюшинном введении полихлорвиниловых и целлюлозных трубчатых основ.

2. С увеличением срока эксперимента уменьшается толщина стенки протеза, уменьшается количество элементов воспаления и фибробластов, нарастает число зрелых форм - фиброцитов, происходит созревание

соединительной ткани. Однако у крыс процесс формирования аутопрогезов протекает быстрее.

3. Для аутопрогезов на целлюлозной основе характерно более медленное созревание, чем протезы, полученные на полихлорвиниловых имплантатах, что делает последние более эффективными при формировании протезов для ангиопластики.

Внутрибрюшинное формирование соединительнотканных протезов характеризуется более медленной динамикой, поэтому подкожное моделирование аутопротезов для ангиопластики более предпочтительно.

4. Установлено, что подавление функции макрофагов тормозит формирование соединительнотканных аутопротезов, в то время как ее стимуляция ускоряет этот процесс.

5. Оптимальный срок для формирования и использования протезов для ангиопластики - 5 недель.

6. Проходимость аутопротеза у кроликов в течение 6 месяцев доказана с помощью УЗДГ и ангиографии. К этому времени происходит дифференцировка элементов стенки протеза на слои, соответствующие оболочкам артерии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ходаков В. В. Экспериментальное обоснование метода получения аутопротезов для артерий / В. В. Ходаков, Д. И. Крохин, С. Ю. Медведева, Б. Г. Юшков, Н. В. Тюменцева // Хирургия. - 2005. - №9. - С. 10-13.

2. Юшков Б. Г. Роль надпочечников в формировании аутопротезов для ангиопластики / Б. Г. Юшков, В. А. Черешнев, Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин, В. В. Ходаков, С. Ю. Медведева // Вестник Уральской медицинской академической науки. - Екатеринбург. - 2004. - №3. -С. 57-60.

3. Тюменцева Н. В. Аутопротезы в пластике сосудов / Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин, Б. Г. Юшков // Материалы международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». - Тюмень, 2005. - С. 263.

4. Юшков Б. Г. Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей / Б. Г. Юшков, В. В. Ходаков, Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин, М. А. Ранцев // Бюллетень. Изобретения. Полезные модели. - 2005. - Часть 3. -№26.-С. 423.

5. Тюменцева Н. В. Роль стимуляторов и ингибиторов макрофагов в формировании аутопротезов для ангиопластики / Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин // Материалы IX итоговой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке". - Киров, 2005. -С. 54.

6. Крохин Д. И. Метод получения сосудистых протезов для ангиопластики / Д. И. Крохин, Н. В. 'Гюменцева // Материалы IX итоговой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XX] веке». - Киров, 2005. - С. 17.

7. Черешнев В. А. Роль функциональной активности системы фагоцитирующих мононуклеаров в формировании аутопротезов для ангиопластики / В. А. Черешнев, Н. В. Тюменцева, Б. Г. Юшков, И. Г. Данилова, В. В. Ходаков, Д. И. Крохин, С. Ю. Медведева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - Т. 140. - №8. - С. 186188.

8. Тюменцева Н. В. Особенности внутрибрюшинного формирования сосудистых аутопротезов для ангиопластики / Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин // Тезисы докладов X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2005. - С. 263.

9. Тюменцева Н. В. Влияние гепатэктомии на формирование сосудистых аутопротезов для ангиопластики / Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин // Материалы XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт-Петербург , 2005. - С. 79-81.

Ю.Тюменцева Н. В. Сравнение соединительнотканных протезов для ангиопластики, полученных в организме крыс и кроликов / Н. В. Тюменцева, Б. Г. Юшков, Д. И. Крохин, В. В. Ходаков, С. Ю. Медведева // Бюллетеь Сибирской медицины. - Т. 4. - Приложение 1. - Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда. - Томск: СибГМУ. - 2005. - С. 22.

11. Тюменцева Н. В. Новый метод получения сосудистых аутопротезов для ангиопластики / Н. В. Тюменцева, Б. Г. Юшков, Д. И. Крохин, В. В. Ходаков // Научные труды 1-ого съезда физиологов СНГ. - Дагомыс. -

2005.-Т. 2.-С. 153-154.

12.Тюменцева Н. В. Возможность стимуляции формирования сосудистых аутопротезов препаратом «Тамерит» / Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин // Вестник молодых ученых. — Приложение к серии науки о жизни. -Материалы Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». - Санкт-Петербург, 2005. - С. 122.

13.Черешнев В. А. Новый подход к получению аутопротезов для пластики сосудов / В. А. Черешнев, Б. Г. Юшков, Н. В. Тюменцева, С. Ю. Медведева, В. В. Ходаков, Д. И. Крохин, К. В. Мерсаидов // Доклады академии наук. -

2006.-Т. 408.-№ 5.-С. 711-713.

Крохин Дмитрий Иванович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ АУТОПРОТЕЗОВ ДЛЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ ХИРУРГИИ СОСУДОВ

14.00.27 - Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

■ Подписано в печать 26.03.2007г. Формат 60x84 1/16 Усл. Печ. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ №_20_. Отпечатано в типографии УГМА, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.

t"

2006131098

Актуальность проблемы

Проблема сосудистой патологии, в настоящее время, является одной из основных в современной медицине, что обусловливает поиск путей совершенствования и разработку принципиально новых подходов в лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Совершенствование хирургической техники, создание прецизионного инструментария позволяют производить вмешательства на артериях малого диаметра: коронарных, интракраниальных, брыжеечных, артериях голени [18, 11, 90, 127,22,201,199].

В клинической практике в настоящее время используется в основном ангиопластика артерий собственными сосудами организма — артерией молочной железы, внутренней грудной артерией, большой подкожной веной и др. [64, 106, 164, 177, 199], либо искусственными протезами [14, 65, 67, 63, 119, 110, 112]. При этом указываются и недостатки данных методов. J. Н; Campbell et al (1999) указывает на варикозно-дегенеративные изменения вен у больных преклонного возраста, которые приводят к формированию аневризм венозных трансплантатов в условиях воздействия на них артериального давления [141]. Аутовены в 25-30% случаев недоступны из-за анатомического строения и использования их в предыдущих операциях [11, 124]. Известно, что после аорто-коронарного шунтирования аутовеной уже через 2-5 лет остаются проходимыми лишь 6070% пересаженных трансплантатов [164]. Шунты из аутоартерий, как правило, атеросклеротически изменены, что ограничивает возможность их применения [106, 164, 199, 124].

В 80-е годы большой интерес вызывало использование ксенопротезов, получаемых при ферментативно-химической обработке артерий млекопитающих. Они обладают нулевой хирургической порозностью, адекватными пластическими и иммунологическими свойствами [15, 94, 36, 39, 69]. Простые ксенотранс-плантаты склонны к формированию аневризм и слабо резистентны к инфекции и тромботической индукции, не более 40% их остаются проходимыми в течение 6-8 месяцев [16; 11, 124]. Повышение противотромботических свойств протезов путем гепаринизации их внутренней поверхности не обеспечивает необходимого антиагрегантного потенциала [49, 15, 108, 30, 186]. Известны другие способы увеличить тромборезистентность и продолжительность функционирования; ксе-нопротеза [53, 40, 11, 186, 176].

Общеизвестно, что синтетические сосудистые протезы в отдаленные сроки после имплантации в артерии малого калибра тромбируются в 100% случаев [200]. Ауто- и аллотрансплантаты не могут решить проблему пластического материала в ангиологии [108]; Перспективны эксплантопротезы с эндотелиальным покрытием, чему посвящено очень много научных работ, особенно с начала 80-х годов как у нас, так и, в особенности, за рубежом [2, 200, 188; 187, 196, 174]. Эндотелиальное покрытие ангиоэксплантатов выполняли как аутологичными, так и культивируемыми алло - и ксенокультурами клеток интимы. Но при этом сразу же выяснилось, что выделение, и выращивание, эндотелиальных клеток in : vitro — дорогой и трудоемкий метод, а эндотелий таких ангиопротезов либо слущивается, либо подвергается иммунной атаке "организм против трансплантата", в относительно неотдаленные сроки [124, 166]: Поэтому в последние годы начаты работы по формированию сосудов из клеток разных тканевых культур.

В настоящее время значительное распространение в клинической практике и научных; исследованиях, посвященных проблеме ишемических заболеваний, получили методы, основанные на ангиогенезе за счет имплантаций стволовых клеток в ишемизированную ткань [150, 195, 127, 112, 154, 167, 168, 169, 170]. В основном такие методы имеют терапевтический подход, не являются методами истинной хируругической коррекции. До сих пор остается открытым вопрос о получении эффективного материала для протезирования и шунтирования артерий малого и среднего калибра [164, 177, 199]. Научно-практические разработки в этом направлении, освященные в литературе, осуществляются несколькими путями: покрытием внутренней поверхности основы культурой; эндотелиальных клеток [2, 162, 203, 204], засеванием биополимерных каркасов культурой гладкомышечных клеток [162]; выращиванием протезов в организме, требующем ангиопластики, [124, 125]. Данные методы вызывают значительный научный интерес и требуют дальнейшего детального изучения. При этом остаются недостаточно изученными механизмы! формирования сосудистых аутопротезов in vivo, влияние регуляторных систем организма на этот процесс: В настоящее время огромный интерес ученых вызывают вопросы регуляции? на кле- / точном уровне, межклеточных взаимодействий^ регуляции) роста, дифференци-ровки и регенерации клеток с помощью факторов роста, которые вырабатыва- , ются -специфическими регуляторными клетками; Исследована и описана данная функция у макрофагов, тучных и иммунокомпетентных клеток [109, 100;. 112, 115, 123, 136, 137] Эти разработки послужили теоретическим обоснованием созданию современных протезов для ангиопластики. ,

Таким образом, имеющиеся недостатки уже разработанных методов послужили основанием для дальнейших исследований в этой области. Остается нерешенным; вопрос о подходящем материале для пластики артерий, малого и среднего калибра, а современные наработки в области использования стволовых клеток не являются путем решения хирургических проблем; требующих ангиопластики, а имеют терапевтический подход. Остаются недостаточно исследованными механизмы формирования сосудистых соединительнотканных аутопротезов и участие регуляторных систем организма в этом^п^

Все вышеизложенное послужило основанием для» определения цели и; основных задач настоящего исследования.

Цель: получение искусственных сосудистых аутопротезов для реконструкций сосудов малого калибра.

Задачи исследования:

1) разработать метод получения сосудистых протезов на разных видах экспериментальных животных;

2) дать сравнительную характеристику аутопротезов для ангиопластики, полученных в организме крыс и кроликов;

3) дать сравнительную характеристику аутопротезов, полученных при' подкожном и внутрибрюшинном введении миллипоровых и полихлорвиниловых трубчатых имплантатов;:

4) дать характеристику механизмов регуляции в формировании сосудистых аутопротезов;

5) разработать метод ангиопластики сосудов, малого калибра, на экспериментальных животных, с использованием полученных аутопротезов;

6) оценить эффективность метода с помощью инструментальных и морфологических исследований.

Научная новизна;

Показана на экспериментальных животных возможность создания: соединительнотканных аутопротезов и использования их для пластики артерий малого и среднего калибра; Проведена комплексная оценка эффективности полученных протезов при ангиопластике. Впервые продемонстрировано, что соединительнотканный протез, имплантируемый в артерии разного типа, обеспечивает в оперированном сосуде кровоток и служит основой для формирования элементов сосуда даннрго типа: Определены физические и биологические свойства протезов (прочность, гистологическое строение, состав клеточного' компонента и межклеточного вещества). Определено значение некоторых механизмов регуляции процесса формирования соединительнотканных аутопротезов in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы

Показано, что в условиях пластики полученными аутопротезами артерий малого и среднего калибра происходит дифференцировка соединительнотканных элементов и формирование структур сосудистой стенки — интимы, предшественников гладкомышечных клеток, медии и зрелых эластических структур внутренних и наружных эластических мембран; Дано научное обоснование возможности использования данных сосудистых аутопротезов в качестве пластического материала при - формировании артериовенозных фистул для гемодиализ-ных больных, в дальнейшем - для повторных аорто-коронарных шунтирований; и вообще реконструкций артерий малого и среднего калибра.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования используются при обучении студентов в курсе «Общая хирургия» на кафедре общей хирургии УГМА (зав. каф. д.м.н., профессор Ходаков В.В.).

Отработанные в процессе выполнения диссертации методические приемы используются в выполняемых в рамках НИР диссертационных и студенческих работах на кафедре общей хирургии УГМА (зав. каф. д.м.н., профессор Ходаков В.В.), а также внедрены в научные исследования, выполняемые на кафедре физиологии человека и животных УРГУ ( зав. каф. д.м.н., профессор Юшков БЛ7.) и лаборатории Интститута иммунологии и физиологии УО РАН (зав. д.м.н, академик РАН, профессор Черешнев В. А.).

Получен патент на изобретение № 2260379 от 20.09.2005 г. Юшков Б.Г., Ходаков В. В., Крохин Д. И. «Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей».

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании Областного хирургического общества (Екатеринбург, 2004), на XXI международном съезде физиологов им. И. П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень-Тобольск, 2005), на IX итоговой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке" (Киров, 2005), на X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005), на XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005).

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте на крысах и кроликах разработана методика и доказана возможность получения соединительнотканных протезов для ангиопластики, формирующихся в течение 5 недель при подкожном или внутрибрю-шинном введении полихлорвиниловых и целлюлозных трубчатых основ.

2. При гистологическом и морфометрическом исследовании соединительнотканных протезов у разных видов лабораторных животных^ полученных при подкожном введении полихлорвиниловой основы, определена динамика их формирования. Стенка аутопротезов у крыс и кроликов представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью с воспалительной реакцией, при этом процесс формирования протезов проходит одинаковые этапы. С увеличением срока эксперимента уменьшается толщина стенки протеза, уменьшается количество элементов воспаления и фибробластов, нарастает число зрелых форм— фиброцитов, происходит созревание соединительной ткани с увеличением упорядоченно расположенных коллагеновых и эластических волокон. Однако у крыс процесс формирования аутопротезов протекает существенно быстрее.

3. При сравнительном анализе формирования структурных элементов стенки аутопротезов, полученных подкожно на целлюлозной и полихлорвиниловой основах, установлены общие закономерности. При этом аутопротезы на целлюлозной основе характеризуются более медленной динамикой созревания, более выраженной воспалительной реакцией, чем в протезах, полученных на полихлорвиниловых имплантатах, что делает последние более эффективными для формирования протезов для ангиопластики.

При исследовании соединительнотканных протезов, полученных при внутрибрюшинном введении трубчатых имплантатов, выявлены аналогичные этапы формирования структур, образующих их стенку. При этом длительно сохраняющийся отек стенки протеза, снижение темпов созревания соединительной ткани и сохранение воспалительной реакции в поздние сроки свидетельствовало о том, что внутрибрюшинное формирование соединительнотканных протезов характеризуется замедленной динамикой- что позволило считать подкожное моделирование аутопротезов для ангиопластики более ' предпочтительным;.

4: Среди различных механизмов регуляции,, влияющих на процесс формирования сосудистого аутопротеза у крыс, определена зависимость темпов созревания протезов от функционального состояния макрофагов. Установлено, что подавление функции макрофагов каррагинаном тормозило формирование соединительнотканных аутопротезов, в то время как ее стимуляция та-меритом ускоряла этот процесс.

5. На основании морфологического исследования определено, что 5 не- ' ■ дель - оптимальный; срок; для формирования и использования протезов для ангиопластики, учитывая достаточное количество клеточного материала для его дальнейшей дифференцировки в новых; гемодинамических условиях артериального сосуда, минимально выраженную воспалительнуюреакцию, достаточные прочностные свойства протеза: Разработана методика ангиопластики 5-недельными аутопротезами сонной артерии крыс, бедренной артерии кролика.

6. На основании результатов ультразвукового дуплексного сканирования; и рентгеноконтрастной артериографии доказана состоятельность анастомоза и проходимость аутопротеза у кроликов в течение 6 месяцев наблюдения. При гистологическом исследовании установлено, что при протезировании аутопротезом бедренной артерии кролика и сонной артерии крысы, через 6 месяцев эксперимента аутопротезы проходимы, в гемодинамических условиях артерии; мышечно-эластического типа происходит дифференцировка структурных элементов стенки протеза в виде четкого разделения на слои, соответствующие оболочкам артерии, формирования эластических мембран, эндотелиальных клеток, гладкомышечных элементов медии, васкуляризации наружной оболочки.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время значительное распространение в клинической практике и научных исследованиях, посвященных проблеме ишемических заболеваний, получили методы, основанные на ангиогенезе за счет имплантаций стволовых клеток в ишемизированную ткань (К. Hirata, 2002; Н. F. Tse, 2003; J. Chen, 2003; A. Al-Khaldi, 2003; Н. Kamihata, 2002). В основном такие методы имеют терапевтический подход, не являясь методами истинной хируруги-ческой коррекции. До сих пор остается открытым вопрос о получении эффективного материала для протезирования и шунтирования артерий малого и среднего калибра (Miller J. Н., 1984; Rankin J. S., 1986; Weinsehelbaum E. E., 1997).

Технологии, связанные с использованием стволовых клеток, для решения данной проблемы встречаются в единичных исследованиях. Одним из новых и перспективных подходов является выращивание аутопротезов необходимой длины и диаметра в организме хозяина (Campbell J. Н., 1999; Efendy J. L., 2000). В его основе лежит развитие воспалительной реакции (Маянский Д. Н., 1991; Маянский Д. Н., Пикуза О. И., 1993). Данные методы,вызывают значительный научный интерес и требуют, дальнейшего детального изучения. Остаются недостаточно исследованными механизмы формирования сосудистых соединительнотканных аутопротезов и участие регуляторных систем организма в этом процессе.

Использование стволовых клеток для получения новообразованных сосудов подвигло нас к созданию научной гипотезы о возможном применении таких технологий в хирургической практике. В этой связи целью настоящего исследования явилось получение сосудистых аутопротезов для пластики сосудов малого калибра.

Первоочередная задача исследования - разработка метода получения сосудистых протезов на разных видах экспериментальных животных. Лабораторным животным (крысам и кроликам) подкожно имплантировали: трубки из полихлорвинила или целлюлозы, служившие для формирования соединительнотканного протеза. В дополнительной серии эксперимента проводили внутрибрю-шинное введение целлюлозных трубчатых имплантатов. Извлечение имплантатов проводилось через 1, 2, 3, 4, 5, 6 недель. Уже к 2 неделям вокруг имплантатов наблюдали сформировавшиеся соединительнотканные капсулы, которые; свободно снимались с основы, сохраняя форму трубки. При макроскопической оценке они имели различную толщину и плотность, на разрезе внутренняя по- ! верхность протезов гладкая, без каких-либо утолщений и разрывов. Основа (полихлорвиниловая или целлюлозная трубка) удалялась, полученная соединительнотканная трубка-ангиоаутопротез подвергалась стандартной гистологической обработке для проведения микроскопической оценки; '

В • проведенных нами экспериментах показана возможность образования на вшитой под кожу и внутрибрюшинно трубчатой основе соединительнотканных протезов. Последующие морфологические и морфометрические исследования f полученных протезов позволили определить структуру их стенки, этапы формирования, особенности их образования в различных условиях эксперимента.

Формирование аутопротезов для-ангиопластики, полученных при подкожном введении полихлорвиниловой основы, характеризовалось определенной динамикой. В соединительнотканных 2-недельных протезах наблюдалось преобладание клеточных элементов, с межклеточным веществом, что расценено как активная воспалительная реакция. на введенный имплантат. Стенка аутопротезов имела четкое разделение на внутренний, средний и наружный слои. Поздние сроки эксперимента характеризовались существенным снижением числа элементов воспаления, более упорядоченной морфоструктурной организацией в стенке протезов, таких как увеличение волокнистых структур, упорядоченное циркулярное и продольное их расположение.

Таким образом, проведенные исследования позволили предположить, что пятая неделя - оптимальный срок для использования протезов для ангиопластики, учитывая достаточное количество клеточного материала для его дальнейшей дифференцировки в уже изменившихся, новых условиях артериального сосуда; минимально выраженную воспалительную реакцию. Достаточно развит в этих сроках и коллагеновый матрикс, что необходимо для прочностных свойств протеза.

Следующей задачей явилась сравнительная оценка динамики формирования аутопротезов у разных видов- лабораторных животных; В результате сравнительного гистологического и морфометрического анализа структур стенки аутопротезов у крыс и кроликов обнаружено, что процесс их формирования проходит одинаковые этапы. С увеличением: сроков эксперимента уменьшается толщина стенки протеза, уменьшается количество клеток на единицу площади за счет снижения числа элементов воспаления, уменьшения клеток фибробластического ряда, нарастает число зрелых форм - фиброцитов, ; происходит созревание соединительной ткани- с образованием волокнистых, структур, ориентированных продольно. Однако с учетом морфометрических ' данных установлено, что у кроликов дольше сохраняются признаки воспаления^ замедлены тёмпьг созревания соединительной ткани, у крыс процесс : формирования аутопротез9в протекает существенно быстрее.

Использование разных материалов при имплантации под кожу как основы для формирования соединительнотканных протезов (на примере: целлюлозы и полихлорвинила) показало, что имеются общие закономерности формирования структурных элементов образованных соединительнотканных капсул-протезов и различия по темпам созревания соединительной ткани и интенсивности воспалительной реакции. При- морфологическом и морфометри-ческом исследований аутопротезов, полученных при подкожном введении целлюлозных имплантатов выявлено, что при формировании аутопротезов имеется- определенная динамика, подобная полученной в эксперименте с, использованием ПХВ' имплантатов. С увеличением срока зрелости протеза; уменьшается толщина его стенки, в ее структуре происходит уменьшение клеточности за счет снижения числа элементов воспаления, фибробластов, 83 увеличивается количество зрелых фиброцитов и упорядоченных коллагено-вых и эластических волокон.

Для сравнительного анализа структурных элементов стенки аутопротезов, полученных на ПХВ и целлюлозной основах, проводилось сопоставление показателей протеза, зафиксированных на оптимальном сроке для его формирования - 5 недель эксперимента. При анализе морфометрических показателей 5-недельных протезов на основе ПХВ и целлюлозных имплантатов выявлен ряд особенностей. Аутопротезы на целлюлозной основе характеризуются большей толщиной стенки, в структуре которой более выражен клеточный компонент за счет фибробластов, более выражена воспалительная реакция; .чем в протезах, полученных на ПХВ имплантатах. Полученные данные позволили считать, что формирование аутопротезов при подкожном введении целлюлозных трубчатых имплантатов у крыс отличается более замедленной v динамикой по сравнению с ПХВ основами, что делает последние более привлекательными для формирования аутопротезов.

В проведенных экспериментах наряду с подкожным введением целлюлозных имплантатов* крысам проводилось и внутрибрюшинное введение основы с целью создания соединительнотканных протезов для ангиопластики. При исследовании;.соединительнотканных протезов,.полученных при внутри-брюшинном введении трубчатых имплантатов, выявлены аналогичные этапы формирования структур, образующих их стенку. С увеличением зрелости протеза увеличивается количество волокнистых структур, нарастает упорядоченное их расположение, уменьшается плотность клеточного компонента соединительной ткани его стенки. Динамика внутрибрюшинного формирования сосудистых аутопротезов имела ряд особенностей при морфологическом и морфометрическом анализе. С увеличением срока эксперимента не выявлено динамического уменьшения толщины стенки протеза за счет сохраняющегося отека, уменьшение фибробластов в ее структуре не сопровождалось увеличением числа зрелых фиброцитов, в более поздние сроки происходило снижение интенсивности воспалительной лимфоидной реакции по сравнению с подкожной имплантацией. Полученные данные свидетельствуют о том, что внутрибрюшинное формирование соединительнотканных протезов характеризуется более медленной динамикой, что позволяет считать подкожное моделирование аутопротезов для ангиопластики более предпочтительным.

Моделирование сосудистого протеза, проведенное нами в эксперименте, основано на привлечении и дифференцировке стволовых клеток соединительной ткани. В настоящее время чрезвычайно актуально изучение вопросов межклеточных взаимодействий, регуляции роста, дифференцировки и регенерации клеток с помощью факторов роста, которые вырабатываются специфическими регуляторными клетками. Ведущую роль в регуляции роста соматических клеток организма играют макрофаги, тучные и иммунокомпетентные. клетки (Бабаева А. Г., 1990; Маянский Д. I I., 1991; Маянский Д. II., Пикуза О. И., 1993; Донцов В. И., 1998; Шехтер А. Б;, Серов В; В;, 1991; Черешнев В: А., { Юшков Б. Г., 2002; Cotran R. S., 1999).

Механизмы формирования: сосудистьк аутопротезов остаются недостаточ- ' • но изученными. При гистологическом исследовании в стенке протеза обнаружено значительное количество клеточных элементов, которое уменьшается и претерпевает качественные изменения в поздние сроки эксперимента. Среди клеток инфильтрата в стенке протеза выявляются? лимфоциты и макрофаги. В этой связи нам представлялось актуальным исследовать влияние функционального состояния макрофагов на динами^ формирования сосудистых аутопротезов.

В результате проведенного исследования; среди различных механизмов регуляции, влияющих на процесс формирования сосудистого аутопротеза, показана важная роль системы фагоцитирующих мононуклеаров. По нашим данным, подавление функции макрофагов каррагинаном тормозило формирование соединительнотканных аутопротезов, в то время как ее стимуляция та-меритом ускоряла этот процесс. Следовательно, процесс формирования сосудистых аутопротезов зависит от функционального состояния макрофагов. Исходя из этого можно полагать, что темпы созревания аутопротезов для ангиопластики могут. модулироваться путем направленной фармакологической коррекции активности системы фагоцитирующих мононуклеаров организма.

Следующей важной задачей для осуществления поставленной цели явилась разработка метода ангиопластики на сосудах малого калибра на экспериментальных животных, с использованием полученных аутопротезов. С целью оценки возможности использования полученных протезов для; пластики сосудов 5-недельные. аутопротезы вшивали в рассеченную общую сонную артерию 10 крыс, из организма, которых они были извлечены через 6 месяцев после операции. Подобным образом проводили ангиопластику 5-недельными протезами резецированной бедренной артерии у 10 кроликов, извлеченными через 3 и 6 месяцев эксперимента. После проведенных операций состояние: лабораторных животных оставалось удовлетворительным; признаки ишеми-ческих расстройств отсутствовали на всех сроках наблюдения.

Особый; интерес в нашей работе представляла оценка эффективности метода ангиопластики полученными в эксперименте аутопротезами с помощью инструментальных, и морфологических исследований. У крыс инстру- -ментальная оценка их проходимости не проводилась, эффективность протезирования оценивали тремя способами:

1) отсутствие церебральных нарушений свидетельствовало о проходимости протеза; поскольку последние проявляются у крыс при закупорке сонных артерий; ,

2) извлечение протезов начинали со стороны дистального конца анастомоза, и наличие кровотечения указывало на проходимость имплантата;

3) исследование гистологических препаратов.

У кроликов через 6 месяцев после ангиопластики бедренной артерии соединительнотканными? аутопротезами проводили оценку эффективности кровотока с использованием инструментальных методов исследования, а в последующем - гистологический анализ извлеченных аутопротезов и участков протезированной артерии.

По данным проведенного дуплексного исследования протезированной бедренной артерии экспериментального животного, выявлен активный артериальный кровоток, соответствующий нормальному по всем показателям исследования; стенка протеза и его просвет аналогичны нормальным интактным бедренным артериям животного через 6 месяцев после аутопротезирования.

По результатам проведенной рентгеноконтрастной ангиографии артерии экспериментального животного, установлен активный артериальный кровоток через протезированный участок сосуда и воспринимающих дистально лежащих артерий, соответствующий нормальному кровотоку; стенка протеза и его просвет аналогичны нормальным интактным бедренным артериям животного через 6 месяцев после аутопротезирования.

Таким образом, результаты проведенных инструментальных исследований кровотока (ультразвуковое дуплексное сканирование, рентгеноконтраст-ная артериография) свидетельствуют о состоятельности анастомоза и проходимости аутопротеза у всех экспериментальных животных в течение 6 месяцев наблюдения.

В результате проведенного гистологического исследования установлено, что при протезировании аутопротезом бедренной артерии кролика, относящейся к артерии мышечно-эластического типа, через 6 месяцев экспери- • мента у животных имплантат является проходимым, происходит дифферен-цировка структурных элементов его стенки! Наблюдается образование и упорядоченное расположение эластических волокон, формирование эластических мембран, определяется васкуляризация слоев наружной оболочки, имеется четкая дифференцировка стенки протеза на слои, обнаруживаются эндоте-лиоподобные клетки и миобласты.

С целью морфологической оценки динамики формирования структурных элементов стенки аутопротезов в гемодинамических условиях протезированной артерии группе животных проводилось оперативное извлечение и последующее гистологическое исследование 3-месячных аутопротезов и сегментов бедренной артерии. По данным гистологического исследования протезированных участков бедренных артерий кроликов, являющихся у этих животных артериями мышечно-эластического типа, зафиксировано формирование основных структур сосудов данного типа уже через 3 месяца после имплантации соединительнотканного протеза. На гистопрепаратах определяются формирующиеся эластические волокна и мембраны, просвет артерий проходим, нет четкой дифференцировки сосудистой стенки на слои.

У крыс в сроке 6 месяцев после имплантации соединительнотканных аутопротезов обнаруживается более высокая степень дифференцировки последних в сосуды того типа, в который были имплантированы. Кроме развитых эластических мембран и довольно четкой дифференцировкой на слои, обнаруживаются формирующийся эндотелий, а также скопления миобластов, что говорит о формировании гладкомышечных клеток.

Таким образом, в результате проведенного гистологического исследования показана возможность использования соединительнотканных аутопротезов в качестве материала для ангиопластики артерий мышечно-эластического типа. При гистологическом исследовании протеза у крыс и кроликов на 6 месяце наблюдения установлено, что при протезировании ау- ' топротезом бедренной артерии кролика и сонной артерии крысы, относящихся к артерии мышечно-эластического типа, протез является проходимым, происходит дифференцировка структурных элементов его стенки. Наблюдается образование и упорядоченное расположение эластических волокон, формирование эластических мембран, определяется васкуляризация слоев наружной оболочки, имеется четкая дифференцировка стенки имплантата на слои, обнаруживаются эндотелиоподобные клетки. В ряде случаев наблюдается врастание ткани протеза в просвет прилегающей артерии и формирование в этом протезе структур артерии - эндотелий, внутренняя и наружная эластическая мембраны, элементы средней оболочки. У крыс в сроке 6 месяцев после имплантации соединительнотканных аутопротезов обнаруживается более высокая степень дифференцировки структурных элементов их стенки, определяются эндотелиальные клетки в интиме и гладкомышечные элементы средней оболочки.