Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Технология и стандартизация лиофилизированных лекарственных препаратов фотодитазина

На правах рукописи

Аршинова Ольга Юрьевна

ТЕХНОЛОГИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ФОТОДИТАЗИНА

14.04.01 - технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

11 MAP 2015

Москва-2015

005560560

005560560

Диссертационная работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина»

Научный руководитель:

Оборотова Наталия Александровна - доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты:

Алексеев Константин Викторович - доктор фармацевтических наук, профессор, заместитель директора по инновационной деятельности ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»

Павлова Людмила Анатольевна - кандидат фармацевтических наук, доцент, заведующая лабораторией биологически активных соединений НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится « /¿Г» «.¿¿/^//¿2015 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова по адресу: 117997, г.Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайте ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М.Сеченова www.mma.ru.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В современной онкологической практике широкое распространение получил метод фотодинамической терапии (ФДТ), принцип лечебного воздействия которого основан на избирательном накоплении в ткани опухоли светочувствительных веществ - фотосенсибилизаторов (ФС), которые при лазерном облучении в результате фотохимической реакции продуцируют синглетный кислород и кислородсодержащие свободные радикалы, вызывающие гибель опухолевых клеток. В связи с этим актуальным является поиск и разработка стабильных лекарственных форм ФС, проявляющих высокую фотодинамическую активность.

Одним из таких перспективных ФС является фотодитазин, синтезированный в научно-производственной фирме ООО «ВЕТА-ГРАНД» (Россия, Москва) и представляющий собой N-диметилглюкаминовую соль хлорина е6. Терапевтическая эффективность фотосенсибилизаторов хлоринового ряда обусловлена наличием в их спектре интенсивной полосы поглощения в длинноволновой области, чему соответствует эффективная глубина проникновения лазерного излучения в ткани; высокой скоростью распределения и накопления в опухоли и относительно быстрым выведением из организма. Некоторые особенности данной группы ФС, к которой относится и фотодитазин, (гидролитическая не устойчивость, термолабильность) вызывают определенные затруднения при разработке и хранении инъекционных лекарственных препаратов на их основе. В этой связи особый интерес представляет метод сублимационного высушивания (лиофилизация).

Исследования по разработке и унификации технологии получения и методов анализа лиофильно-высушенных «сухих инъекций» отечественного препарата фотодитазин являются актуальными.

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время для

клинического применения разрешена инъекционная лекарственная форма данного

хлоринового фотосенсибилизатора - «Фотодитазин, концентрат для приготовления

раствора для инфузий, 5мг/мл» (Регистрационное удостоверение № JIC-001246 от

18.05.2012 г.). Кроме того, с целью увеличения избирательности

противоопохулевого действия фотодитазина в ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина»

В

разработана липосомальная лекарственная форма препарата [Чан Тхи Хай Иен, автореф.... дис. к.ф.н., 2010].

Высокая реакционная способность, гидролитическая нестабильность, чувствительность к действию света раствора и липосомальной дисперсии фотодитазина определяют необходимость разработки новых стабильных лекарственных форм фотодитазина.

Цель настоящего исследования. Целью настоящей работы являлась разработка технологии и стандартизация лиофилизированных лекарственных форм фотодитазина, обеспечивающих стабильность препарата.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать технологию получения стабильной при хранении лиофнлизированной лекарственной формы фотодитазина.

2. Оптимизировать технологию сублимационной сушки липосомальной дисперсии фотодитазина.

3. Разработать методику качественного анализа, апробировать и валидировать методику количественного анализа лиофнлизированной лекарственной формы фотодитазина.

4. Определить показатели качества для стандартизации полученных лиофилизированных препаратов фотодитазина, разработать и утвердить проект фармакопейной статьи предприятия и лабораторные регламенты, предложенных лекарственных препаратов.

5. Изучить стабильность лиофилизированных лекарственных форм фотодитазина в процессе хранения.

6. Изучить уровень и селективность накопления фотодитазина в лиофнлизированной лекарственной формы на перевиваемой опухоли мышей.

Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые разработана стабильная лиофилизированная лекарственная форма фотодитазина - «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для

инфузий 25 мг», сохраняющая качество на протяжении всего срока хранения. Выбрана оптимальная технология лиофилизации раствора фотодитазина. Разработана методика качественного хроматографического анализа лиофилизата фотодитазина. Апробирована и валидирована методика количественного определения фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме методом спектрофотометрии при длине волны 662 нм. Определены показатели качества для стандартизации препарата «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг». Получены фармакокинетические данные о высоком уровне и селективности накопления фотодитазина в новой лиофилизированной лекарственной форме на перевиваемой опухоли мышей.

Теоретическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в обосновании целесообразности использования сублимационного высушивания в технологии получения новых лекарственных форм препарата фотодитазин с целью повышения стабильности и совершенствования их качества. Представленный в работе экспериментально-практический материал может служить теоретической базой для исследования и создания новых лиофилизированных лекарственных форм противоопухолевых препаратов.

Практическая значимость работы. На основе выбранных показателей качества разработан проект фармакопейной статьи (ФСП) на «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг». Разработаны и внедрены в практику лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» технологические лабораторные регламенты на «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг» и на «Фотодитазин липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 5 мг». Материалы исследования внедрены в работу научно-производственной фирмы ООО «ВЕТА-ГРАНД» (Россия, Москва) и в учебный процесс кафедры фармацевтической технологии и фармакологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения РФ. (Акты внедрения).

Методология и методы исследования. Методология исследования заключалась в изучении всех стадий сублимационной сушки раствора и

липосомальной дисперсии фотодитазина, влияния различных технологических факторов на качество получаемых лекарственных форм препарата с последующим выбором оптимальных условий лиофилизации. При выполнении работы были использованы методы сравнительного, документированного анализа; комплекс физико-химических, биологических методов, технологических испытаний; математические методы анализа и обработки результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.

Степень достоверности результатов. Для проведения экспериментальных работ использовано современное сертифицированное оборудование; установлена воспроизводимость и правильность результатов исследований; сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки позволяет считать их достоверными.

Апробация диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: X и XI Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011 и Нижний Новгород, 2012).

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в постановке' цели и задач настоящего исследования, их реализации, анализе и обобщении данных, изложении полученных результатов в виде научных публикаций и нормативных документов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 -технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» по теме: «Создание технологии лекарственных форм противоопухолевых препаратов с организацией производства». Номер государственной регистрации 01.200.809454.

Основные положения, выносимые на защиту

- Технология получения препарата «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг».

- Оптимизация технологии сублимационной сушки препарата «Фотодитазин липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 5 мг».

- Результаты качественного и количественного анализа лекарственной формы «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг», валидация методики количественного определения фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме методом спектрофотометрии.

- Результаты контроля качества наработанных серий лиофилизированных лекарственных форм фотодитазина по выбранным показателям и изучение их стабильности в процессе хранения.

- Результаты оценки уровня и селективности накопления фотодитазина из лиофилизированной лекарственной формы на перевиваемой опухоли мышей Р-388.

Объем н структура диссертации. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 33 рисунка. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, глав обсуждения результатов собственных исследований, выводов, приложения, библиографического указателя, включающего 155 наименований, из которых 119 на иностранном языке.

Содержание работы Материалы и методы исследования

В исследованиях использовалась субстанция фотодитазина (рис. 1), синтезированная в научно-производственной фирме ООО «ВЕТА-ГРАНД» (Россия, Москва) и соответствующая требованиям ФСП 42-0531-5369-04.

Рис. 1. Структурная формула фотодитазина

Стерилизующая фильтрация раствора фотодитазина

Перед началом лиофнлизации раствор фотодитазина (5 мг/мл) пропускали через целлюлозные мембранные фильтры «Millipore» с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат собирали в стерильный сборник. Затем стерильный раствор разливали по 5 мл в стеклянные флаконы вместимостью 30 мл (толщина слоя составляла 10 мм) и лиофилизировали.

Получение дисперсии многослойных (мультиламеллярных) липосом фотодитазина

Компоненты липосомального бислоя (холестерин, яичный фосфатидилхолин, полиэтиленгликоль-2000-дистеароилфосфатидилэтаноламин -PEG-2000-DSPE) растворяли в хлороформе. Полученный раствор фильтровали через мембранные фильтры «Millipore» с размером пор 0,22 мкм и переносили в круглодонную колбу. Содержимое колбы упаривали на роторном испарителе «BUCHI Rotavapor R-200» при температуре водяной бани (+37 °С) до образования однородной полупрозрачной липидной пленки. Пленку подсушивали под вакуумом в течение 2,5 ч до удаления остатков хлороформа. Липидную пленку гидратировали стерильным раствором фотодитазина 2,5 мг/мл, полученным путем разведения жидкой субстанции водой.

Получение дисперсии однослойных (моноламеллярных) липосом фотодитазина

Дисперсию мультиламеллярных липосом фотодитазина измельчали на

экструдере «ЫРЕХ™», продавливая через нейлоновые мембранные фильтры «Pall»

с размером пор 1,2 мкм. Далее липосомальную дисперсию фотодитазина

измельчали на экструдере, пропуская через нейлоновые мембранные фильтры с

размером пор 0,45 мкм (1 раз) и целлюлозные мембранные фильтры «Millipore» с

размером пор 0,22 мкм до получения малых однослойных липосом (5 раз).

8

Стерилизующая фильтрация липосомальной дисперсии фотодитазина

К дисперсии однослойных липосом фотодитазина добавляли необходимый объем стерильного раствора криопротектора (сахарозы), перемешивали и проводили фильтрацию на фильтровальной установке под давлением через стерилизующие мембранные фильтры «Millipore» с размером пор 0,22 мкм. Затем полученную стерильную липосомальнуто дисперсию фотодитазина разливали по 3 мл в стеклянные флаконы вместимостью 20 мл и лиофилизировали.

Лиофилизацию раствора фотодитазина 5 мг/мл и липосомальной дисперсии фотодитазина проводили на сублимационной установке «Minifast DO.2» (Его Electronic S.p.A., Великобритания).

Для достижения поставленной цели и решения задач исследования использовали следующие методы анализа:

• Количественное определение содержания фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме определяли методом спектрофотометрии на спектрофотометре Сагу 100 (Varian, Inc., Австралия).

Содержимое флакона растворяли в 5 мл воды. Затем прибавляли 10 мл спирта 95%, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили спиртом 95% до метки, перемешивали. Отбирали 2,5 мл полученного спиртового раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем спиртом 95% до метки и перемешивали. Определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 662 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно спирта 95%. Параллельно проводили определение оптической плотности раствора рабочего стандартного образца (РСО) фотодитазина относительно спирта 95%.

Содержание фотодитазина в одном флаконе (X, мг) рассчитывали по формуле:

х- А'8С А»

>

где Ai - оптическая плотность испытуемого раствора; А« - оптическая плотность стандарстного раствора фотодитазина; С - содержание фотодитазина в РСО, мг/мл.

• Качественный состав лиофилизированного фотодитазина подтверждали тонкослойной хролттографией на пластинках «Kieselgel» (Мерк, Германия).

На линию старта хроматографической пластинки размером 5x15 см наносили по 5 мтсл 0,5 % раствора субстанции фотодитазина, 0,5 % раствора содержимого флакона, полученного из лиофилизата фотодитазина, а рядом в качестве стандартного образца вещества-свидетеля (СОВС) - 0,1 % раствора N-метилглюкамина. Пластину с нанесенными пробами подсушивали на воздухе в течение 5-10 мин, затем помещали в камеру, предварительно насыщенную смесью растворителей спиртом 96 % - водным аммиаком (7:3) в течение 2-3 ч, и хроматографировали восходящим способом. Когда расстояние от фронта растворителей до конца пластины достигало 9,0 см, пластину вынимали из камеры и подсушивали на воздухе в течение 15-20 мин. Затем пластину опрыскивали аммиачным раствором серебра нитрата и нагревали в течение 20 мин при 100°С. На хроматограмме проявлялись пятна темно-коричневого цвета на уровне пятна СОВС (N-метилглюкамин).

• Размер липосом определяли методом динамической спектроскопии светорассеяния на наносайзере «Nicomp 380 Submicron Particle Sizer» (Particle Sizing Systems, США).

На всех стадиях получения липосом производили измерение размера фосфолипидных везикул. Для этого 1 мл липосомальной дисперсии фотодитазина растворяли в 50 мл воды и перемешивали до получения гомогенной дисперсии. 1 мл полученной дисперсии переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем водой очищенной до метки, перемешивали и проводили определение размера частиц на наносайзере.

• Эффективность включения фотодитазина в липосомы определяли методом гель-фильтрации на хроматографических колонках С 10/20, Amersham Biosciences (Швеция).

0,4 мл липосомальной дисперсии с фотодитазином наносили на хроматографическую колонку, заполненную Sephadex G-50, н элюировали 0,15 М раствором натрия хлорида, скорость элюции составляла 0,4-0,5 мл/мин. Процесс

10

очистки контролировали с помощью детектора Uvis-920 при длине волны 215 нм, подключенного к самописцу REC - 111 (Amersham Biosciences ВС). Для количественного определения содержания фотодитазина в первой фракции использовали метод спектрофотометрии. Затем рассчитывали включение, используя процентное соотношение к общему содержанию фотодитазина в первоначальной липосомальной дисперсии по формуле:

где А| — оптическая плотность раствора фракции с очищенным липосомальным фотодитазином; А| -оптическая плотность раствора исходной липосомальной дисперсии до сушки или после сушки; С1 -величина разбавлении фракции с очищенным липосомальным фотодитазином; С - величина разбавления исходной липосомальной дисперсии до сушки или после сушки; V, - объем фракции с очищенным липосомальным фотодитазином, мл; V - объем исходной липосомальной дисперсии до сушки или после сушки, нанесенной на колонку, мл.

Изучение уровня и селективности накопления лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина

Исследование проводили на перевиваемой опухоли мышей: лимфоцитарной лейкемии Р-388. Р-388 перевивали мышам гибридам первого поколения ВБр1 (С57В1//6 х БВА/г) внутримышечно в голень правой задней лапы асцитной жидкостью разведенной средой 199 по 0,2 мл, содержащих 106 опухолевых клеток. Изучаемые лекарственные формы вводили однократно внутривенно в дозе 10 мг/кг. Уровень накопления фотодитазина в опухоли и нормальной ткани (коже) оценивали по флуоресценции фотосенсибилизатора спектрально-флуоресцентным методом с использованием спектроанализатора «ЛЭСА-01-Биоспек».

Результаты собственных исследований 1. Разработка методики хроматографического анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина

Следует отметить, что молекула М-метилглюкамина содержит 5 свободных гидроксилъных групп, вследствие чего чрезвычайно склонна к адсорбции и остается на старте пластины при хроматографии в системах, используемых для ТСХ порфиринов. Поиск системы растворителей, которая обеспечила бы движение М-метилглюкамина со старта, проводили на 7 подвижных фазах, представленных в табл. 1.

Таблица 1

Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа лиофилизированного фотодитазина на хроматографических пластинка» «гА/еу^/^е/»__

Система растворителей (объемные соотношении) Значение

ЬЛ-метилглюкамин

РСО ЛЛФ

Спирт 95%/ЛУК (15:2) 0,10 0,09

Хлороформ/аммиак водный (7:3) 0,07 0,06

Спирт 95%/хлороформ/ЛУК (25:8:2) 0,11 0,10

Хлороформ/аиетон/мстанол/ЛУК (10:5:2:2) 0,05 0,04

Хлороформ/метанол/вода (25:10:2) 0,08 0,07

Спирт 96%/аммнак водный (7:3) 0,13 0,13

Хлороформ/аммиак водный (20:7) 0,10 0,10

В результате в качестве эффективной системы, позволяющей определять

основной компонент фотодитазина (Ы-метилглюкамин), выбрана система растворителей спирт 96 % / аммиак водный (7:3).

2. Методика спектрофотометрического количественного определения фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме

В результате исследования было подтверждено использование методики спектрофотометрического определения содержания фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме, как наиболее точной и чувствительной. Данная методика была валидирована по критериям: аналитическая область, специфичность, линейность, правильность, сходимость.

Первоначально регистрировали электронный спектр поглощения спиртового раствора субстанции фотодитазина, на котором, как видно рис. 2, в области от 340 нм до 700 нм наблюдаются следующие максимумы поглощения: 400+2 нм, 504+2 нм, 534+2 нм, 608+2 нм, 662+2 нм.

1.0-.

0.8-

400 500 800 700 «00

Рис. 2. Электронные спектры поглощения спиртовых растворов: 1 - 0,5 % субстанции фотодитазина; 2 - 0,5 %лиофилизированного фотодитазина; 3 -95% спирта

Длину волны 662+2 нм выбрали в качестве аналитической для проведения спектрофотометр ического анализа с целью определения количественного содержания фотодитазина в изучаемой лекарственной форме. В ходе исследования сравнивали спектры спиртовых растворов субстанции и лиофилизата фотодитазина в диапазоне длин волн от 340 нм до 700 нм. Как видно из рис. 2, электронные спектры идентичны по форме и положению максимумов, а 95 % спирт, используемый в качестве растворителя при количественном анализе в данном диапазоне длин волн, свет не поглощает и, следовательно, не учитывается при расчетах количественного содержания фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме. Это свидетельствует о специфичности методики обнаружения фотодитазина в лекарственной форме методом спектрофотометрии.

Линейная зависимость оптической плотности для спиртового раствора субстанции фотодитазина и лиофилизата при 662 нм соблюдалась в диапазоне концентраций от 4 до 6 мг/мл. Следовательно, можно утверждать, что количественное спектрофотометрическое определение фотодитазина как в виде субстанции, так и в лиофилизате позволяет получить достоверные результаты. При статистическом анализе результатов количественного спектрофотометрического определения показана достаточно высокая сопоставимость результатов данной методики - погрешность определения была менее 1,0 %.

3. Стерилизация раствора фотодитазина

Важным моментом в разработке инъекционных препаратов является выбор метода стерилизации. В связи с термолабильностью и гидролитической неустойчивостью фотодитазина применение большинства существующих термических методов неприемлемо, поэтому стерилизацию водного раствора фотодитазина проводили с помощью фильтрации через целлюлозные мембранные фильтры «МПИроге» с размером пор 0,22 мкм.

4. Разработка режима лиофилизации раствора фотодитазина

Для разработки режима сублимационной сушки первоначально изучали влияние скорости и времени замораживания на качество препарата. С этой целью раствор фотодитазина замораживали, применяя способы быстрого и медленного замораживания.

Таблица 2

Качество лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина в зависимости от способа замораживания* ____

Способ замораживания Описание Значение рН Остаточная влажность, % Растворимость Содержание фотодитазина в лиофилизате, мг

Нормативные значения Сухая пористая масса темно-зеленого цвета 9,1-9,5 не более 3% При добавлении к содержимому флакона воды для инъекиий образуется раствор темно-зеленого цвета 22,5 мг-27,5 мг

Быстрое замораживание 9,1 0,1 25,0

Медленное замораживание 9,2 0,09 24,9

'данные среднее арифметическое от 5 определений

Как видно из табл. 2, способ замораживания не оказывает значительного влияния на основные показатели качества фотодитазина. Проведенные исследования показали, что в рамках разработки экономичного технологического процесса (в целях экономии электроэнергии и времени) следует использовать быстрое замораживание полок сублимационной камеры от +20 °С до —45 °С с последующей выдержкой при данной температуре в течение 3 ч.

С целью оптимизации всего технологического процесса лиофилизации и получения качественного препарата изучали влияние скорости и продолжительности основной сублимационной сушки и досушивания. Сублимационную сушку замороженного раствора фотодитазина проводили, используя следующие режимы:

Режим 1. Полки выдерживали при температуре -45 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0) х 10~2 мБар в течение 3 ч, далее их нагревали от -45 °С до - 10 °С со скоростью 6 °С/ч. Затем полки нагревали от -10 °С до +5°С со скоростью 3°С/ч, а от +5 °С до +20 °С со скоростью 6 °С/ч. После достижения на препарате температуры +20 °С выдерживали при этой температуре в течение 3 ч (досушивание). Лиофилизация продолжалась 24 ч.

Режим 2. Полки выдерживали при температуре -45 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0) х 10~2 мБар в течение 3 ч, далее их нагревали от -45 °С до -10 °С со скоростью 5 °С/ч. Затем полки нагревали от -10 °С до +5°С со скоростью 2°С/ч, а от +5 °С до +20 °С со скоростью 5 °С/ч. После достижения на препарате температуры +20 °С выдерживали при этой температуре в течение 3 ч (досушивание). Лиофилизация продолжалась 26 ч (рис. ЗА).

Режим 3. Полки выдерживали при температуре -45 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0) х 10~2 мБар в течение 3 ч. Далее их нагревали от -45 °С до 0 °С со скоростью 5 °С/ч. От 0 °С до +20 °С полки нагревали со скоростью 4 °С/ч. После достижения на препарате температуры +20 °С выдерживали при этой температуре в течение 3 ч (досушивание). Лиофилизация продолжалась 23 ч.

Режим 4. Полки выдерживали при температуре -45 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0) х 10~2 мБар в течение 3 ч, далее их нагревали от —45 °С до 0 °С со скоростью 5 °С/ч. От 0 °С до +20 °С полки нагревали со скоростью 2 °С/ч. После достижения на препарате температуры +20 °С выдерживали при этой температуре в течение 4 ч (досушивание). Лиофилизация продолжалась 28 ч.

Режим 5. Полки выдерживали при температуре - 45 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0) * 10~2 мБар в течение 3 ч, далее их нагревали от - 45 °С до - 10 °С со скоростью 5 °С/ч. Затем полки нагревали от — 10 °С до +5 °С со скоростью 2 °С/ч, а от +5° С до +20 °С со скоростью 5 °С/ч.. После достижения на препарате температуры +20 °С выдерживали при этой температуре в течение 4 ч (досушивание). Лиофилизация продолжалась 28 ч (рис. ЗБ).

Температура полки Температура препарата

Температура полки Температура препарата

Рис. 3. Температура палок и препарата при лиофшпгаации раствора фотодитазина согласно режиму № 2 (А) и № 5 (Б)

После окончания процесса сушки, согласно всем указанным режимам, вакуум в сублимационной камере гасили стерильным воздухом, пропущенным

через стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Флаконы с препаратом выгружали из сублимационной камеры, закрывали пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Оценку качества готового лиофилизата проводили по следующим показателям: описание, значение рН после растворения в воде, растворимость в воде и прозрачность, потеря в массе при высушивании, количественное содержание препарата во флаконе.

В ходе анализа полученных данных (табл. 3) стало очевидным, что из всех рассматриваемых режимов лиофилизации, только 2 и 5 режимы обеспечивают получение лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина, соответствующей заданным параметрам качества.

Таблица 3

Влияние режима лиофилизации на качество готовой лекарственной формы фотодитазина_

Режим Описание Значение рн* Остаточная влажность*, % Прозрачность Содержание фотодитазина*, мг

1 Неоднородна* масса темно-зеленого цвета 9,0 0,15 Раствор содержимого флакона в 125 мл воды прозрачен 24,9

2 Сухая пориста« масса темно-зеленого цвета 9,» 0,10 25,0

3 Неоднородная плотная масса темно- зеленого цвета 9,1 0,12 Раствор содержимого флакона в 125 мл воды содержит нсрастворившнсся частицы 24,5

4 Неоднородная масса темно-зеленого цвета 9,0 0,09 24,8

5 Сухая пористая масса темно-зеленого цвета 9,1 0,10 Раствор содержимого флакона в 125 мл воды прозрачен 24,9

* данные среднее арифметическое от 5 определений

В результате дальнейшего исследования установлено увеличение выхода продукции с единицы оборудования и уменьшение количества препарата, не удовлетворяющего по внешнему виду заявленным нормам, выявляемого на стадии высушивания при лиофилизации серий (каждая объемом по 100 флаконов) фотодитазина с использованием режима 2 по сравнению с препаратом, высушенным согласно 5 режиму (рис. 4).

Р«жии5 Режим 2

□ серия 2-01 Всерия2-02 □серия2-03

□ серия 5-01 ■ серия 5-02 □ серия 5-03

Рис. 4. Потери препарата (число флаконов) при лиофилизации согласно режимам 2 и 5

Средний процент потерь (за счет деформации поверхности лиофилизата) составил для серий, высушенных согласно 2 режиму — 1,3 %, а согласно 5 режиму -4,0 %. Эти данные позволили выбрать 2 режим в качестве наиболее приемлемого с точки зрения качества получаемой продукции и экономической целесообразности технологического процесса производства.

Лиофилизация, проводимая согласно 2 режиму, требует меньших затрат времени, а соответственно и электрической энергии, именно этот режим и использовали при наработке лиофилизированной формы фотодитазина. 5. Стандартизация лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина

В соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00, для стандартизации лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина выбраны следующие показатели качества: описание, растворимость (регидратация), подлинность, средняя масса содержимого флакона, значение рН, прозрачность, потеря в массе при высушивании, количественное определение. На основании выбранных показателей разработан проект ФСП на «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг», на основе которого оценивали качество шести серий лиофилизата фотодитазина сразу после получения и при хранении в течение 2 лет.

При оценке качества серий лиофилизата фотодитазина (табл. 4), полученного с применением разработанной технологии лиофилизации (№2), на протяжении 2 лет установлено отсутствие значимых изменений показателей качества, заявленных в проекте ФСП. Изучение стабильности препарата в процессе хранения продолжается.

Таблица 4

Анализ качества серий препарата «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг» ___после получения и в процессе хранения_

Критерии качества Пределы по ФСП Срок хранения,г Серия препарата

011010Л | 021010Л | 031010Л ( 230111Л | 240111Л | 250111Л

Описание Сухая пористая масса темно-зеленого цвета

Растворимость Образование темно-зеленого раствора после добавления к содержимому флаконы 5 мл воды для инъекций

Подлинность Наличие в электронном спектре поглощения спиртового раствора фотодитазина характеристических максимумов при длинах волн: 204 ± 2 нм, 286 ± 2 им, 400 ± 2 нм, 504 ± 2 им, 534 ± 2 им, 608 ± 2 нм, 662 ± 2 нм. Ы- метилглюкамин в составе лекарственной формы определяли с помощью ТСХ

Средняя масса содержимого флакона, г 0,043-0,057 - 0,052 0,054 0,056 0,055 0,052 0,054

0,5 0,053 0,055 0,056 0,055 0,054 0,056

1 0,053 0,055 0,057 0,056 0,054 0.056

1,5 0,055 0,057 0,057 0,057 0,057 0,057

2 0,056 0,057 0,057 0,057 0,057 0,057

рн 9,1-9,5 - 9,1 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5

0,5 9,1 9,3 9,2 9,5 9,6 9,5

1 9,0 9,2 9,2 9,5 9,4 9,5

1,5 9,0 9,2 9,2 9,3 9.4 0,3

2 9,0 9,2 9,1 9,3 9.4 9,3

Потеря в массе при высушивании, % не более 3,0 - 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1

0,5 0,2 0,2 0,2 0,2 ОД ОД

1 0,2 0,3 0,3 0,2 0,3 0,2

1,5 0,3 0,4 0.4 0,2 0,3 0.4

2 0,3 0,5 0,6 0,3 0,3 0,6

Прозрачность Раствор содержимого флакона в 125 мл воды прозрачен

Содержание, мг 22,5-27,5 - 24,2 23,4 25,1 24,3 23,5 23,4

0,5 24,0 23,4 25,0 24,2 23,2 23,3

1 23,7 23,0 24,8 23,9 23,2 23.0

1,5 23,6 23,0 24,5 23,5 23,0 23,0

2 23,5 22,8 24,4 23,4 23,0 22,9

6. Оптимизация технологии лиофилизации липосомальной дисперсии фотодитазина

Для выбора оптимального режима сублимационной сушки липосомальной дисперсии фотодитазина проводили процесс лиофилизации 3 способами (рис.5.).

Рис. 5. Температурные режимы препарата при лиофилизации липосомальной дисперсии фотодитазина

Режим 1. Препарат помещали на полки сублимационной камеры при температуре (20 ± 2) °С и охлаждали их до -40 °С в течение 2 ч. После достижения заданной температуры на препарате выдерживали в течение 3 ч (стадия замораживания). Затем включали вакуум в камере. После выравнивания температуры и вакуума (около 3 ч) начинали сублимационную сушку, поднимали температуру от -40 °С до +20 °С со скоростью 5 °С/ч (сублимационная сушка). После достижения на препарате температуры +20 °С выдерживали при этой температуре в течение 3 ч (досушивание). Общее время сублимационной сушки составило 20 ч.

Режим 2. Препарат помещали на полки сублимационной камеры при температуре (20 ± 2) °С и охлаждали ступенчато от +20 до -15 °С, выдерживали 2,5 ч; затем охлаждали до -25 °С в течение 2 ч; после этого в течение 4,5 ч понижали температуру до -40 °С. После достижения заданной температуры замораживания на препарате выдерживали в течение 3,0 ч. Последующий нагрев препарата до температуры -20 °С вели со скоростью 5 °С/ч, время выдерживания 2 ч; нагрев полок до температуры -10 °С вели со скоростью 3 °С/ч; нагрев полок до комнатной температуры 20 ± 2 °С осуществляли со скоростью 5 °С/ч. Далее проводили

досушивание препарата около 3 ч. Общее время сублимационной сушки препарата составило 33 ч.

Режим 3. Препарат помещали на полки сублимационной камеры при температуре (20 ± 2) °С и охлаждали до - 20 °С, выдерживали 1 ч. Далее охлаждали от - 20 до - 30 °С и выдерживали еще 1 ч, затем понижали температуру от - 30 до - 40 °С и после достижения препаратом температуры -40 °С выдерживали его в течение 3 ч при данной температуре (стадия замораживания). После выравнивания температуры и вакуума (около 3 ч), начинали сублимационную сушку. Проводили повышение температуры в три этапа: до -10 °С со скоростью 5 °С/ч; от -10 °С до +5°С со скоростью 2°С/ч, а от +5 °С до +20 °С со скоростью 5 °С/ч. После достижения препаратом температуры +20 °С осуществляли процесс досушивания в течение 3 ч. Общее время сублимационной сушки составило 26 ч.

Таблица 5

Влияние режима лиофилизации на качество лиофилизированного липосомального фотодитазина_

Режим Описание Значение Остаточная Размер частиц. Включение

рн влажность, % нм фотодитазина в липосомы*, %

Нормативные значения 3 • Р 5 1 ч 1 ° Р В|1 5,5-6,5 не более 3% не более 200 не менее 85 %

1 6,6±0,2 1,5±0,1 169±10 69,0

2 и §• а « д Э Н п 6,0±0,1 135±10 85,0

3 6,5±0,3 1,1±0,2 168±10 80,0

♦данные среднее арифметическое от 5 определений

Анализ представленных данных (табл. 5) позволяет утверждать, что из трех предложенных режимов по критерию включение препарата в липосомы и размеру фосфолипидных везикул наиболее приемлемым является режим с постепенным замораживанием и последующим медленным подъемом температуры в камере сублимационной установки (режим №2).

Для количественного определения основного действующего вещества в препарате использовали метод прямой спектрофотометрии. Во всех исследованных образцах содержание действующего вещества в препарате составляло от 4,8 мг до 5,2 мг во флаконе. Предложенная методика епектрофотометрического определения достаточно чувствительна, обладает высокой точностью и воспроизводимостью, при этом ошибка определения среднего результата не превышала 2,00 % (табл. 6).

Таблица 6

Содержание фотодитазина в лиофилизированной липосомалыюй лекарственной форме

№ образца Оптическая плотность исследуемого раствора Найдено мг/флакон Метрологические характеристики

1 2 3 4 5 6 0,637 0,640 0,638 0,642 0,643 0,638 4.90 4,93 4.91 4.95 4.96 4,91 х=4,93 «р.с=2,57 $х~=2,21*10 Ах-0,0044 = 1,99 %

7.Стандартизация лиофилизированной липосомальной лекарственной формы

фотодитазина

В качестве критериев для стандартизации лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина выбраны: описание, растворимость (регидратация), подлинность, средняя масса содержимого флакона, значение рН, размер частиц (везикул), потеря в массе при высушивании, количественное определение.

Таблица 7

Анализ качества серий лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина после получения и в процессе хранения для установления срока годности_

Серия Срок хранения, мес Значение рН Размер частиц, им Количественное определение, мг/флакоц

010312 . 6,5 130 4,90

3 6,5 135 4,89

6 6,5 139 4,87

9 6,5 140 4,87

12 6,4 142 4,86

18 6,4 142 4,86

020312 . 6,3 128 4,92

3 6,4 140 4,92

6 6,4 144 4,90

9 6,4 146 4,87

12 6,4 146 4,87

18 6,3 147 4,82

030312 - 6,5 134 4,88

3 6.5 140 4,86

6 6,5 145 4,83

9 6,5 147 4,82

12 6,4 149 4,81

18 6,4 149 4,80

По проекту ФСП на «Фотодитазин липосомальный, лиофилизат для

приготовления раствора для инъекций 5 мг» проводили анализ качества трех серий

лиофилизата фотодитазина сразу после получения и при хранении в течение 1,5

21

лет. Из табл. 7 видно, что анализ качества лиофилизированной липосомальной формы фотодитазина в течение 1,5 лет показал отсутствие значимых изменений показателей качества, введенных в проект ФСП. Изучение стабильности препарата в процессе хранения продолжается.

8. Изучение уровня и селективности накопления лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина

Исследование уровня и селективности накопления фотодитазина проводили на перевиваемой опухоли мышей - лимфоцитарной лейкемии Р-388.

После введения раствора-субстанции фотодитазина максимальный уровень его накопления в опухоли и коже наблюдали через 1 ч после внутривенного введения (рис.бА). При этом, накопление раствора-субстанции в опухолевой ткани почти в два раза превышало (1,1 усл.ед.) уровень накопления фотодитазина в здоровой ткани - коже, который составлял 0,6 усл.ед.

Рис. 6. Уровень накопления фотодитазина в виде субстанпии (А) и лиофилизата (Б) по интенсивности флюоресценции в опухолевой и нормальной ткани

Максимальный уровень накопления фотодитазина после введения лиофилизата как в опухоли, так и в коже был выявлен через 1 ч после его введения и составлял 1,9 усл.ед. и 1,0 усл.ед., соответственно. Далее уровень накопления резко снижался, и через 24 ч в опухолевой и нормальной ткани оставались только следовые количества ФС (рис. 6Б). На основании данных, полученных по накоплению фотодитазина в виде раствора-субстанции и лиофилизата, рассчитывали значения индекса селективности с целью определения влияния лиофилизации на уровень накопления фотодитазина в опухоли.

А

Б

В ходе проведенных испытаний максимальный индекс селективности наблюдается через 5 ч после внутривенного введения фотодитазина, как в виде субстанции, так и в виде лиофилизата и равен 4. Данные показатели свидетельствуют о высоком уровне и селективности накопления фотодитазина лиофилизата в опухоли. Общие выводы:

1. Разработана технология получения стабильной при хранении лиофилизированной лекарственной формы «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг».

2. Оптимизирован процесс сублимационной сушки липосомальной дисперсии фотодитазина, выбран наиболее приемлемый режим по критериям - сохранение уровня включения фотодитазина в липосомы (85 %) и размера фосфолипидных везикул (135 нм).

3. Разработана методика качественного хроматографического анализа лиофилизата фотодитазина в тонком слое сорбента с применением системы растворителей спирт 95 % / аммиак водный (7:3). Апробирована и валидирована методика количественного определения фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг» методом спектрофотометрии при длине волны 662±2 нм.

4. Определены и научно обоснованы показатели качества для стандартизации лиофилизированных препаратов фотодитазина. Разработаны проект ФСП и лабораторный регламент на «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг». Разработан и утвержден лабораторный регламент на «Фотодитазин липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 5 мг».

5. На шести сериях лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина установлено сохранение заявленных в проекте ФСП показателей качества в течение 2 лет. Сохранение показателей качества, заявленных в проекте ФСП лиофилизированного липосомального фотодитазина, на протяжении 1 года доказано при оценке показателей качества трех серий лекарственного препарата, исследования продолжаются.

6. Изучены фармакокинетнческие данные лиофилизированной лекарственной формы фотодитазнна. Показаны высокий уровень и селективность накопления фотодитазина в виде лиофилизата на перевиваемой опухоли мышей -лимфоцитарной лейкемии Р-388.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аршинова, О.Ю. Технология получения лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина - сенсибилизатора для фотодинамической терапии опухолей / О.Ю. Аршинова, А.П. Полозкова, O.JI. Орлова, Ю.В. Родионова // Отечественные противоопухолевые препараты: материалы X Всероссийской науч. конф. с междунар. участием. - Москва, 2011. - С.5.

2. Смирнова, З.С. Изучение динамики уровня и селективности накопления лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина на Р-388 / З.С. Смирнова, О.Ю. Аршинова, JI.M. Борисова, М.П. Киселева, А.П. Полозкова, О.Л. Орлова, Г.А. Меерович, H.A. Оборотова // Отечественные противоопухолевые препараты: материалы XI Всероссийской науч. конф. с междунар. участием. - Нижний Новгород, 2012. - С. 50

3. Аршинова, О.Ю. Анализ лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина методами тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии / О.Ю. Аршинова, Е.В. Игнатьева, H.A. Оборотова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - №3. - С. 28-31.

4. Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных препаратов / О.Ю. Аршинова, Е.В. Санарова, A.B. Ланцова, H.A. Оборотова // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т.46, № 4. - С. 29-34.

5. Получение и биофармацевтическое исследование лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина / О.Ю. Аршинова, А.П. Полозкова, О.Л. Орлова [и др.] // Биофармацевтический журнал. - 2013. - Т.5, №1. - С.27-29.

6. Аршинова, О.Ю., Вспомогательные вещества в технологии лиофилизации лекарственных препаратов / О.Ю. Аршинова, H.A. Оборотова, Е.В. Санарова // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2013. - №1 (2). -С. 20-24.

Подписано в печать 11.02.2015 г. Формат А4/2 Бумага офсетная. Печать цифровая Тираж 100 экз. Заказ № 233 Рекламно-производственная компания

«Дмитров.Ком» М.о., г. Дмитров, ул. Московская, д. 10 Тел.: (495) 727-37-54, 743-35-60