Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Технология получения и контроль качества липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора – фотодитазина для фотодинамической терапии

004603895

На правах рукописи

Чан Тхи Хай Иен

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА - ФОТОДИГАЗИНА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия '14.04.01 .-.технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2010

2 2 И10/1 20Ю

004608895

Работа выполнена в ГОУ ВПО ММА имени И.М. Сеченова и НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН (РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН).

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор, академик РАМН

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор Оборотова Наталия Александровна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор

Арзамасцев Александр Павлович

Раменская Галина Владиславовна

Демина Наталья Борисовна Сливкин Алексей Иванович

Ведущая организация: Центр по химии лекарственных средств - ЦХЛС -ВНИХФИ

Защита диссертации состоится « _» ОЗ_2010 г. в /У^часов на

заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М.Ссченова Росздрава по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 117418, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан » 0~[_2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор иСф-Ф) Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время отмечается повышенный интерес к использованию производных хлоринового ряда в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований. Одним из лучших ФС этого ряда является фотодитазин - оригинальный отечественный препарат, созданный ООО «Вета-Гранд». Препарат не имеет аналогов и способ получения защищен патентом [Пономаров Г.В. и др., патент РФ 2006]. Фотодитазин (ди-N-метилглюкаминовая соль хлорина еб) получен путем химической модификации метилфеофорбида, выделенного из биомассы зеленой микроводоросли Spirulina platensis Gom. Geitleri, путем культивирования ее в асептическом биофотореакторе. Фотодитазин обладает спектральными, физико-химическими и энергетическими характеристиками, выгодно отличающими его от используемых в клинике ФС отечественного и импортного происхождения. Лекарственной формой фотодитазина является концентрат для приготовления раствора для инфузий 5 мг/мл (Регистрационное удостоверение № JIC-001246 от 10.02.2006).

Успешное применение ФДТ для лечения опухолей зависит от способности ФС селективно накапливаться в ткани опухоли [Kessel D. et al., 1999]. Поэтому актуальным направлением исследований является совершенствование лекарственной формы с целью повышения селективности накопления фотодитазина в опухоли и увеличения эффективности ФДТ. Одним из возможных путей решения проблемы является создание липосомальной лекарственной формы препарата, которую можно лиофилизировать и хранить при пониженной температуре.

Цель исследования: создание и контроль качества липосомальной лекарственной формы фотодитазина, увеличивающей избирательность противоопухолевого действия и фотодинамической эффективности препарата.

Задачи исследования:

1. На основе фармацевтических исследований выбрать оптимальный

состав липосомальной лекарственной формы фотодитазина.

2. Разработать способ получения липосом с максимальной степенью включения фотодитазина.

3. Сравнить избирательность накопления фотодитазина в опухоли известной лекарственной формы и новой липосомальной лекарственной формы.

4. Изучить эффективность фотодинамической терапии с липосомальной лекарственной формой фотодитазина in vivo.

5. Получить лиофилизированную форму липосомального фотодитазина.

6. Обосновать химико-фармацевтические критерии качества готового препарата и разработать методики для установления стандартности липосомальных форм фотодитазина.

Научная новизна исследования. Впервые разработана новая пэгилированная липосомальная лекарственная форма фотодитазина, повышающая избирательность противоопухолевого действия препарата. Обоснованы требования к стандартизации липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора. Установлены критерии и параметры качества липосомальной лекарственной формы: однородность липосомальной дисперсии, размер частиц не более 200 им, эффективность включения препарата в липосомы (не менее 85 %). Получены данные о селективности накопления липосомальной лекарственной формы в ткани опухоли Эрлиха мышей, показана высокая эффективность ФДТ.

Практическая значимость. Создана новая пэгилированная липосомальная лекарственная форма «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг». В эксперименте in vivo при ФДТ опухоли Эрлиха показана ее высокая эффективность по сравнению с водным раствором фотодитазина. Разработаны методики: подлинности яичного фосфатидилхолина и

фотодитазина (ТСХ и спектрофотометрия), количественного определения фотодитазина в липосомальной лекарственной форме (спектофотометрия), а также очистки липосом от невключившегося препарата (гель-фильтрация). По результатам работы составлен проект ФСП на «Липосомальный фотодитазин, лиофйлизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг».

Разработка и производство отечественного высокоэффективного липосомального препарата для ФДТ позволит использовать этот локальный метод лечения на более широком спектре опухолей человека и расширить доступность для широкого круга пациентов.

Апробация работы. Материалы- проведенных исследований представлены на конференциях: VIII и IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», (Москва, 21-22 апреля 2009 г.; Нижний Новгород, 18-19 мая 2010 г.); научной конференции с международным участием «Наноонкология», (Москва 18-19 февраля 2009 г.).

Апробация диссертационной работы проведена 24 мая 2010 г. на совместном заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М.Сеченова и лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ (из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ).

Положения, выносимые на защиту:

1. Состав и технология получения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина.

2. Методики фармацевтического анализа: спектрофотометрическое (качественное и количественное) и хроматографическое определение компонентов липосомальной лекарственной формы, гель-фильтрация для очистки липосом от невключившегося в везикулы препарата.

3. Результаты оценки селективности накопления препарата и эффективности ФДТ липосомальным фотодитазином in vivo.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав результатов собственных исследований, общих выводов, списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и 18 таблиц. Библиографический список включает 130 наименований, в том числе 92 - на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

1. Метод получения липосомальной лекарственной формы фотодитазина

Для получения многослойных липосом с инкапсулированным фотодитазином использовали метод Бенгема. Компоненты липосомальной мембраны: яичный фосфатидилхолин (ЯФХ) (Lipoid, Германия), 1,2-дистеароил-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль (DSPE-PEG-2000) и холестерин (ХОЛ) (Avanti Polar Lipids, Inc., США) и а-токоферола ацетата помещали в круглодонную колбу вместимостью 2 л и растворяли в хлороформе. Органический растворитель упаривали на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С до образования липидной пленки, которую затем сушили в течение 2 ч. Высушенную липидную пленку гидратировали раствором фотодитазина при постоянном перемешивании до образования дисперсии многослойных липосом.

Для получения малых однослойных липосом использовали экструзионный метод, который основывается на последовательном продавливании дисперсии липосом через мембранные фильтры «Nuclepore» (Whatman, Великобритания) с диаметром пор 400, 200 нм по 19 раз с применением ручного мини-экструдера (Avanti Mini-Extruder, США).

Для стабилизации липосомального фотодитазина после стерилизующей фильтрации проводили сублимационную сушку.

Анализ среднего диаметра везикул и оценку их распределения по размерам проводили с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния) на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США).

2. Изучение эффективности ФДТ липосомалыюго фотодитазина на опухоли Эрлиха мышей

Фотодитазин в дозе 5мг/мл в виде липосомальной дисперсии и водном растворе вводили мышам однократно внутривенно на 6 сутки после перевивки клеток опухоли Эрлиха, когда средний объем опухолей в группах не превышал 530 мм3.

Оценку эффективности ФДТ оценивали по торможению роста опухоли (ТРО,%) в разные сроки наблюдения. Торможение роста опухоли рассчитывали по формуле:

ТРО (%) = (VK-V0)/VK хЮО

где Vk - средний объем опухоли в контрольной группе (мм3), Vo - средний объем в опытной группе (мм3).

Выживаемость животных (Sa, %) в каждой группе вычисляли по формуле:

SA(%)= -S—100

где N - количество выживших животных в группе на конкретный срок ; N0 - общее количество животных в группе.

Излеченными считали животных, не имеющих рецидивов заболевания после окончания лечения в течение 3-х месяцев.

Результаты исследований

1. Оптимизация состава липосомальной лекарственной формы фотодитазина

Для выбора оптимального состава липосомальной лекарственной формы фотодитазина (ЛЛФФ) наработаны три модели липосом, отличающиеся по

липидному составу. Критериями выбора являлись: размеры везикул и эффективность инкапсулирования фотодитазина в липосомы. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1

Эффективность включения фотодитазина в липосомы разных составов и размеры везикул

Молярное соотношение ЯФХ:ХС(Л:О8РЕ-РЕО-2000 30:6:1 30:10:1 30:14:1

Яичный фосфатидилхолин 300 мкмоль 300 мкмоль 300 мкмоль

Холестерин 60 мкмоль 100 мкмоль 140 мкмоль

05РЕ-РЕС-2000 10 мкмоль 10 мкмоль 10 мкмоль

а-токоферол ацетат 10 мкмоль 10 мкмоль 10 мкмоль

Фотодитазин 20,6 мкмоль 22,8 мкмоль 25 мкмоль

Средний диаметр липосом (нм) 180±27 165±15 170±23

Эффективность включения фотодитазина в липосомы (%) 30,10 ±2,1 40,40*' *± 1,2 35,50*±1,1

Молярное соотношения сумма липидов: фотодитазина составляет ¡8:1.

* - р< 0,05 (достоверность различий по отношению к составу 30:6:1)

# - р < 0,05 (достоверность различий по отношению к составу 30:14:1)

Липосомальные дисперсии трех составов не расслаивались при хранении в водной среде в течение 1 месяца, т.е. оказались стабильными. Как видно из табл. 1 размеры липосом трех составов незначительно отличались друг от друга, но липосомы, содержащие ЯФХ:ХОЛ:05РЕ-РЕС-2000 в молярном соотношении 30:10:1, имели наибольшую эффективность включения 40,4 ±1,2 %. Таким образом, данный состав является наиболее оптимальным для создания ЛЛФФ.

2. Разработка технологии повышения эффективности включения фотодитазина в липосомы Повышение загрузки фотодитазина в везикулы является важной задачей технологии получения ЛЛФФ. С этой целью использовали метод создания рН-градиента снаружи липосом. К объему полученной дисперсии малых однослойных липосом добавляли цитратный буфер рН 4,0; 5,0 и 6,0 в соотношении по объему 2:1. Определяли эффективность включения фотодитазина каждой дисперсии по времени, считая от момента добавления. Результаты приведены на рис. 1.

Рис. 1. Эффективность включения фотодитазина в липосомы в зависимости от рН цитратного буфера и от времени.

Как видно из рис. 1, при добавлении в липосомальную дисперсию растворов цитратного буфера рН 4,0; 5,0 и 6,0 эффективность включения фотодитазина в везикулы достигла максимального значения через 48 часов с момента добавления цитратного буфера и составляла 93% и 91% и 70% соответственно. Однако при применении цитратного буфера рН 4,0 наблюдали зеленоватый осадок в хроматографической колонке, используемой в процессе очистки липосом от невключившегося фотодитазина. Это показывало, что в данном условии фотодитазин изменяет свою структуру и выпадает в осадок. Поэтому для получения липосом с наибольшей степенью инкапсулирования фотодитазина в везикулы рациональнее использовать цитратный буфер рН 5,0.

3. Выбор криоаротектора для сублимационной сушки липосомальной дисперсии фотодитазина

Изучали влияние криопротекторов: глюкозы, маннита, сахарозы и лактозы на качество липосом (размер везикул и эффективность включения) до и после сушки. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Размер везикул и эффективность включения фотодитазина в липосомы до и

после сушки

Криопротектор До сушки После сушки

Средний размер везикул, нм Эффективность включения, % Средний размер везикул, нм Эффективность включения, %

4 % Сахароза 160 ±25 89,9 ± 2,1 169 ±29 85,5 ± 1,7

4 % Лактоза 165 ±23 90,2 ± 2,4 171 ±22 74,4 ±2,2

4 % Манит 171 ±22 - 371 ±155 -

4 % Глюкоза 170 ±22 - 220 ±75 -

Как видно из представленных в таблице данных, в качестве криопротектора сахароза и лактоза имеют преимущество перед глюкозой и маннитом, т.к. после лиофилизации липосомалькая структура фотодитазина сохраняется, размер липосом с сахарозой и лактозой не изменился. Однако включение фотодитазина в липосомы при использовании сахарозы составляло 85,5 % , а лактозы - 74,4 %. Поэтому сахароза была выбрана как оптимальный криопротектор для лиофильной сушки липосомальной дисперсии фотодитазина.

В результате проведенных исследований разработаны оптимальный состав липосомальной дисперсии (таблица 3) и технология получения (рис. 2) липосомальной лекарственной формы фотодитазина.

Таблица 3

Оптимальный состав липосомальной дисперсии фотодитазина

Яичный фосфатидилхолин 300 мкмоль 0,228 г

Холестерин 100 мкмоль 0,039 г

05РЕ-РЕй-2000 10 мкмоль 0,028 г

о-токоферол ацетат 30% 10 мкмоль 17 мкл

£ липидов 410 мкмоль

Раствор фотодитазиа (2,25 мг/мл) и криопротектора сахарозы (60 мг/мл) 22,8 мкмоль 10 мл

Цитратный буфер рН 5,0 5 мл

Молярное соотношение липидных компонентов липосомальной мембраны ЯФХ:ХОЛ:05РЕ-РЕСг-2000 = 30:10:1

Молярное соотношение сумма липидов : фотодитазина составляет 18:1.

Рис.2. Схема технологии получения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина.

4. Разработка методики спектрофотометрии для качественного и

количественного анализа ЛЛФФ 4.1. Методика спектрофотометрии для подтверждения подлинности фотодитазина в ЛЛФФ

Абсорбционные характеристики липосомального фотодитазина в УФ и видимой областях спектра изучали с помощью спектрофотометра Сагу 100 Scan (Varian, Австралия). Липосомальную лекарственную форму и субстанцию растворяли в 95 % этиловом спирте до концентрации фотодитазина 10 мкг/мл. Полученные спектры поглощения показаны на рис. 3.

Рис. 3. Спектр поглощения спиртового раствора субстанции фотодитазина (1) и липосомального фотодитазина (2), пустых липосом (3).

На рисунке 3 показано, что липосомальный фотодитазин имеет три основных максимума поглощения: два максимума в видимой области при длинах волн около 401 и 662 нм, соответствующие двум максимумам фотодитазина, и один максимум в УФ области при 202 нм, соответствующий максимуму поглощения ЯФХ, составляющего липидную мембрану. Спектр поглощения липосомального фотодитазина в области 300-800 нм идентичен спектру поглощения субстанции фотодитазина, т.е не отличается от спектра

субстанции фотодитазина по положению максимума, величине и форме кривой. Таким образом, абсорбционный спектр поглощения липосомалыюго фотодитазина может применяться для идентификации фотодитазина в липосомальной лекарственной форме.

4.2. Методика количественного определения фотодитазина в ЛЛФФ

Разработка спектрометрической методики количественного определения исследуемой субстанции в лекарственной форме включала в себя решение ряда задач:

-изучение спектра поглощения основного вещества в спиртовом растворе, определение максимумов поглощения и их интенсивности; выбор рабочей длины волны;

-определение пределов обнаружения и концентраций фотодитазина, при которых наблюдается линейная зависимость оптической плотности от концентрации вещества, т.е. соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера;

-выбор рабочих концентраций исследуемых растворов фотодитазина, при которых оптическая плотность находится в пределах 0,200-0,700;

-изучение влияния вспомогательных ингредиентов, входящих в состав липосомальной лекарственной формы, на спектральные характеристики фотодитазина.

Абсорбционный спектр спиртовых растворов липосомалыюго фотодитазина имеет две основные полосы поглощения: одну, интенсивную, с максимумом около 401 нм и другую, меньшей интенсивности, с максимумом поглощения около 662 нм. Для анализа можно использовать обе длины волны, но меньшая интенсивность поглощения при длине волны 662 нм позволяет использовать для измерения более концентрированные растворы и готовить их прямым растворением.

Как видно из рис. 3, спиртовой раствор пустых липосом, приготовленных из всех вспомогательных компонентов, не имеет собственного поглощения в области от 300 до 800 нм. Установили, что все

вспомогательные вещества в соотношениях, соответствовавших составу лекарственной формы, практически не влияли на поглощение фотодитазина и не мешали его спектрофотометрическому определению.

Линейная зависимость оптической плотности для спиртового раствора субстанции фотодитазина при 662 ± 2 нм соблюдалась в интервале концентраций от 6 мкг/мл до 20 мкг/мл. Оптическая плотность спиртовых растворов находилась в пределах 0,2-0,7 единиц при концентрации фотодитазина 6-13 мкг/мл.

Содержание фотодитазина в липосомальной лекарственной форме определяли методом спектрофотометрии с использованием рабочего стандартного образца (РСО) при длине волны 662 ±2нм. Измерение оптической плотности спиртовых растворов ЛЛФФ и РСО проводили относительно 95 % этилового спирта в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм.

Содержание фотодитазина (X, мг) рассчитывали по формуле: Р-а-У D0 V0

Где: D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность растворов РСО фотодитазина; V - величина разбавления испытуемого раствора; Vo -величина разбавления раствора РСО; а - содержание фотодитазина в субстанции; мг.

Содержание фотодитазина во флаконе лиофилизированной липосомальной лекарственной формы, которое рассчитывали по значениям оптической плотности, измеренной при длине волны 662 ± 2 нм, составляло 1,52 ± 0,04 мг, относительная ошибка среднего результата (г) не превышала 2,7 %.

5. Определение эффективности включения фотодитазина в липосомы

Для очистки липосом от невключившегося в везикулы фотодитазина применяли метод гель-фильтрации на колонке С 10/20, заполненной сефадекс G-50 superfine (Amersham Biosciences, Швеция). В качестве подвижной фазы использовали раствор натрия хлорида 0,15 М и фосфатный буфер рН 6,68. Процесс очистки контролировали с помощью детектора

Uvis-920 с длиной волны 215 нм, подключенного к самописцу REC - 111 (Amersham Biosciences, Швеция). Скорость элюции - 0,4 - 0,5 мл/мин.

В результате проведенных исследований показано, что нечеткое разделение между пиками очищенных лииосом и свободного фотодитазина получено при элюировании липосомальной дисперсии фотодитазина фосфатным буфером, а четкое разделение (рис.4) - при использовании в качестве элюента раствора натрия хлорида 0,15 М. Следовательно, для очистки липосом с водорастворимым фотосенсибилизатором фотодитазином от невключившегося препарата методом гель-фильтрации целесообразно использовать в качестве элюента раствор натрия хлорида 0,15 М.

Рис. 4. Очистка липосом с фотодитазином от невключившегося препарата методом гель-фильтрации.

При внесении в колонку 0,4 мл липосомальной дисперсии фотодитазина на выходе из колонки получали три фракции (рис. 4): I фракция - чистая липосомальная дисперсия, непрозрачный раствор зеленоватого с желтым оттенком цвета, II фракция - цитратный буфер, бесцветный прозрачный раствор, III фракция - свободный фотодитазин, прозрачный раствор зеленоватого с желтым оттенком цвета. Из рис. 4 видно, что липосомы с фотодитазином и пустые липосомы начали сходить через 12 мин после нанесения на колонку, цитратный буфер выходил

™™ Липссомальная дисперсия фотодитазина — Пустые липосомы

Субстанция фотодитазина

1 6 1116 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 Время, мин

спустя 27 мин, а невключившийся фотодитазин - через 55 мин. Таким образом, весь процесс гель-фильтрации продолжался около 1,5 ч.

Эффективность включения фотодитазина в липосомы (В, %) определяли методом спектрофотометрии при длине волны 662±2нм и вычисляли по формуле: D, V, V.

B"lT

где Di - оптическая плотность раствора I фракции; D - оптическая плотность раствора исходной липосомальной дисперсии; vi - объем I фракции, мл; v - объем исходной липосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл; Vi - величина разбавления I фракции; V - величина разбавления исходной липосомальной дисперсии.

Эффективность включения фотодитазина в лиофилыю-высушенные липосомы, которую рассчитывали по выше разработанной методике составляла 85,1 ± 1,42 %, относительная ошибка среднего результата (с) не превышала 1,7 %.

6. Применение метода тонкослойной хроматографии для

качественного анализа ЛЛФФ

Качественный анализ липосомального фотодитазина методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили в следующих системах растворителей:

- хлороформ : метанол: вода (65:25:4)

- н-бутанол: ледяная кислота: вода (12:3:5)

- хлороформ : метанол : ледяная уксусная кислота: вода (25:15 :4 :2) и

(60 : 50 :1:4)

На линию старта хроматографической пластинки «Silica gel 60 F 254» 10x20 (Merck KGaA, Германия) наносили 5 мкл образца липосомального фотодитазина, 15 мкл стандартного образца вещества-свидетеля фотодитазина, 15 мкл стандартного образца вещества-свидетеля фосфатидилхолина. Пластинку с нанесенными пробами выдерживали на воздухе в течение 5-10 мин, затем помещали в камеру, предварительно насыщенную смесью растворителей, и хроматографировали восходящим способом. При достижении фронта растворителей расстояния 10 см,

16

пластину вынимали из камеры и сушили на воздухе до полного удаления следов растворителей. В качестве детектора для яичного фосфатидилхолина использовали пары йода. Пятна яичного фосфатидилхолина идентифицировали по желтой окраске, а пятно фотодитазина - по характерной зеленной окраске.

о q

Rf = 0.8

О

\

о

Rf= 0.4

Рис. 5. ТСХ ЛЛФФ на пластинке «Silica gel 60 F 254» 10x20 см в системе хлорофом:метанол:вода (65:25:4) 1 - липосомы фотодитазина

2 - субстанция фотодитазина

3 - яичный фосфатидилхолин

Рис. 6. ТСХ ЛЛФФ на пластинке «Silica gel 60 F 254» 10x20 см в системе н-бутанол: ледяная уксусная кислота: вода (12:3:5)

1 - липосомы фотодитазина

2 - субстанция фотодитазина

3 - яичный фосфатидилхолин

Наиболее четкое разделение яичного фосфатидилхолина и фотодитазина в составе лекарственной формы наблюдали в системах растворителей хлорофом : метанол: вода (65:25:4) и н-бутанол: ледяная кислота: вода (12:3:5). Предел обнаружения яичного фосфатидилхолина в указанных системах составил 2,5 мкг.

Наименее удачной оказалась хроматографическая система хлороформ : метанол : ледяная уксусная кислота : вода, в которой яичный фосфатидилхолин и фотодитазин в составе лекарственной формы не разделялись.

7. Изучение селективности накопления липосомального фотодитазина в опухоли Эрлиха мышей

Фармакокинетические исследования проводили на 6 мышей И1 с внутримышечно перевитой в голень правой задней лапы опухоли Эрлиха. Мышей разделили на 2 группы. Уровень накопления фотодитазина в опухоли оценивали спектрально-флуоресцентным методом, предполагая, что интенсивности флуоресценции в биологической ткани пропорциональны его содержанию в ней. Измерения производились в нескольких точках опухоли, а также в нормальной ткани в контралатеральной зоне (в левой лапе) мышей. Индекс селективности накопления фотосенсибилизатора оценивали как соотношение средней интенсивности его флуоресценции в опухоли и нормальной ткани.

время, часы

—•—в виде водного раствора -»-в виде липосомальной формы

Рис. 7. Индекс селективности накопления фотодитазина в опухоли Эрлиха (ELD) по сравнению с нормальной тканью при внутривенном введении двух лекарственных форм в дозе 5 мг/кг массы тела мыши.

Полученные результаты показали, что введение фотодитазина в виде полученной липосомальной формы по сравнению с водным раствором

позволяет повысить на 15-20% селективность накопления ФС в опухоли по сравнению с нормальной тканью (рис. 7). Максимальный индекс селективности накопления фотодитазина в опухоли Эрлиха (ELD) по сравнению с нормальной тканью при использовании липосом достигает 3,4 через 4,5 ч после введения препаратов, поэтому оптимальный интервал между введением липосомального препарата фотодитазина и лазерным облучением составляет 4,5 часа.

8. Изучение эффективности ФДТ с липосомальным фотодитазнном на опухоли Эрлиха мышей

Сравнительные исследования терапевтической эффективности полученной липосомальной формы и водного раствора фотодитазина проводили in vivo на 3 группах мышей Balb/c (п=7). Мышам первой группы за 4,5 часа до лазерного облучения вводили внутривенно липосомальную дисперсию фотодитазина в дозе 5 мг/кг массы тела животного, мышам второй группы - водный раствор фотодитазина в той же дозе. При ФДТ опухолей использовали лазер «ЛФД-01/670-Биоспек» (Биоспек, Россия) с длиной волны 671 нм и плотностью мощности до 260 мВт/см2 в течение 20 мин.

Таблица 4

Эффективность ФДТ с использованием фотодитазина на мышах с опухолью Эрлиха

Группы Доза, мг/кг, в/в путь введения ТРО%

сутки после облучения

4 S 11 15 18 23

Фотодитазин раствор 5 27 48 39 44 48 57

Фотодитазин липосомальный 5 36 58 61 76 83 86

Результаты исследования показали, что рост опухоли Эрлиха (ELD) после ФДТ с липосомальным фотодитазином существенно замедляется к 8 дню после лечения. При дальнейшем наблюдении фотодинамическая

эффективность этой липосомальной формы нарастает и на 23 день ТРО уже составляет 86 % (табл. 3). В группе с водным раствором фотодитазина значимый эффект достигается только к концу наблюдения, ТРО=57% (р<0,05). Излечение животных при применении липосомального фотодитазина составляло 40 % , а водного раствора - 0 %. Эти данные свидетельствуют о значительном преимуществе ФДТ с липосомальным фотодитазином в дозе 5мг/мл, чем с его водным раствором.

9. Химико-фармацевтический анализ липосомальной лекарственной

формы фотодитазина Проект Фармакопейной статьи предприятия на препарат «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг» разработан в соответствии с требованиями ОСТа 91400.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения", ГФ XII издания, т.1, ст.47 «Срок годности лекарственных средств».

ФСП предусматривает определение в препарате следующих показателей: описание, подлинность фотодитазина и яичного фосфатидилхолина, размер частиц, рН, средняя масса содержимого во флаконе, потеря в массе при высушивании, пирогенность, токсичность, стерильность, эффективность включения фотодитазина в липосомы и количественное определение. Выбор условий хранения осуществлен на основе изучения свойств фотодитазина и «Липосомального фотодитазина, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг», а именно: в защищенном от света месте при температуре не выше +10 °С. Определение качества препарата при хранении проводили через каждые три месяца хранения по методикам, разработанным для стандартизации препарата. Срок годности исследуется.

Таблица 5

СПЕЦИФИКАЦИЯ

для ФСП «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг»

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визу&чьный Сухая пористая масса светло-зеленого цвета с желтоватым оттенком. При добавлении к содержимому флакона 1 мл раствора натрия хлорида 0,9% и интенсивном встряхивании в течение 2 мин должна образовываться липосомальная дисперсия зеленоватого с желтым оттенком цвета

Подлинность Спектрофотометр ия Спектр поглощения препарата, приготовленного по методике количественного определения должен иметь максимумы при длинах: 202±2 нм, 400±2нм, 662±2 нм.

тех 1. В системе растворителей хлороформ:метанол: вода (65:25:4) на хроматограмме испытуемого препарата должно обнаруживаться пятно желтого цвета на уровне пятна свидетеля яичного фосфотидилхолина (Rf = 0) и зеленое пятно на уровне пятна свидетеля фотодитазина (Rf около 0,9) 2. В системе растворителей н-бутанол: ледяная уксусная кислота: вода (12:3:5) • на хроматограмме испытуемого препарата должно обнаруживаться пятно желтого цвета на уровне пятна свидетеля яичного фосфотидилхолина (Rf около 0,4) и зеленое пятно на уровне пятна свидетеля фотодитазина (Rf около 0,8)

Средняя масса и однородность по массе ГФ XI, т.2, с. 142 70-90 мг Отклонение от средней массы ±10 %

рН ГФ XII, тЛ, с.89, потенцнометрически 5,5-6,5

Размер липосомальных частиц Лазерная спектроскопия рассеивания Не более 200 нм

Эффективность включения Гель-фильтрация Спектрофотометрия Не менее 85 %

Механические включения ГФ XI, т.2, с. 140. Отсутствуют

Потеря в массе при высушивании ГФ XI, т. 1, с.176 Не более 3,0 %

Пирогенность ГФ XII, т. 1, с. 125 Должен быть апирогенным

Токсичность ГФ XII, т. 1, с. 124 Препарат должен быть нетоксичным

Стерильность ГФ XII, т. 1, с.150 Должен быть стерилен

Количественное определение Спектрофотометрия 1,3 -1,7 мг

Упаковка Во флакон из трубки стеклянной для лекарственных средств из оранжевого нейтрального стекла или импортный, укупоренный резиновой пробкой или импортной, разрешенными МЗ РФ, с обкаткой алюминиевым колпачком или импортным. Каждый флакон вместе с инструкцией по применению укладывают в картонную пачку из картона для потребительской тары марки коробочный или хром-эрзац или бумаги пачечной двухслойной или импортной.

Хранение В защищенном от света месте при температуре не выше +10 °С

Срок годности Исследуется

Выводы

1. Разработан оптимальный состав и технология получения пэгилированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина со средним диаметром частиц свежеприготовленной дисперсии 165±15 нм и эффективностью включения препарата 91 ± 2 %.

2. Введение в состав дисперсионной среды раствора сахарозы позволяет проводить сублимационную сушку липосомальной дисперсии без нарушения размера везикул и с сохранением высокой эффективности включения фотодитазина.

3. Подобраны критерии и параметры качества липосомальной лекарственной формы фотодитазина. Разработаны методики для качественного (тонкослойная хроматография и спектрофотометрия) и количественного

(спектрофотометрия) определения препарата. Относительная ошибка количественного определения не превышала 2,7 %.

4. На животных с экспериментальной опухолью Эрлиха показано, что при использовании липосомального фотодитазина избирательность накопления препарата в опухоли увеличивается на 15-20% по сравнению с водным раствором, при этом эффективность по критерию излечения животных соответственно повышается от 0 % до 40 % .

5. Разработан проект ФСП на «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чаи Тхи Хай Иен, Г.В. Раменская, H.A. Оборотова. Фотосенсибилизаторы хлоринового ряда в фотодинамической терапии опухолей // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 4 (8). - С. 99-105.

2. Чан Тхи Хай Иен, А.П. Полозкова, Е.В Тазина, H.A., В.М. Печенникое, H.A. Оборотова, A.I1. Арзамасцев. Разработка технологии получения липосомалыюй лекарственной формы фотосенсибилизатора фотодитазина // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 1 (8). - С. 12.

3. Чан Тхи Хай Иен, А.П. Полозкова, Е.В Тазина, H.A., В.М. Печенникое, H.A. Оборотова, А.П. Арзамасцев. Разработка методики очистки липосом с водорастворимым фотодэтазином от невключившегося препарата // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. -№2 (8).-С. 50.

4. Чан Тхи Хай Иен, В.И. Поздеев, Г.А. Меерович, С.Ш. Каршиева, U.M. Борисова, О.Л.Орлова, А.П. Полозкова, Г.В.Раменская, H.A. Оборотова. Липосомальная лекарственная форма фотодитазина // Российский биотерапевтический журнал. -2010.-№2(9).-С. 105-107.

5. Чан Тхи Хай Иен, Е.В. Тазина, В.М. Печенникое, А.П. Полозкова, Г.В.Раменская, H.A. Оборотова. Применение тонкослойной хроматографии для качественного определения липосомальной лекарственной формы фотодитазина // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (18-19 мая 2010 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - № 2 (9). - С. 91.

6. Чан Тхи Хай Иен, Е.В. Игнатьева, А.П. Полозкова, Г.В.Раменская, H.A. Оборотова. Качественный и количественный анализ новой лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина // Химико-фармацевтический журнал. - 2010. - № 6 (44).-С. 53-56.

Подписано в печать:

28.06.2010

Заказ №3916 Тираж-100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы

В настоящее время отмечается повышенный интерес к использованию производных хлоринового ряда в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований. Одним из перпекстивных ФС этого ряда является фотодитазин - оригинальный отечественный препарат, созданный ООО «Вета-Гранд». Препарат не имеет аналогов и способ получения защищен патентом [24]. Фотодигазин (ди-N-метилглюкаминовая соль хлорина еб) получен путем химической модификации метилфеофорбида, выделенного из биомассы зеленой микроводоросли Spirulina platensis Gom. Geitleri, путем культивирования ее в асептическом биофотореакторе. Фотодитазин обладает спектральными, физико-химическими и энергетическими характеристиками, выгодно отличающими его от используемых в клинике ФС отечественного и импортного происхождения. Лекарственной формой фотодитазина является концентрат для приготовления раствора для. инфузий 5 мг/мл (Регистрационное удостоверение № J1C-001246 от 10.02.2006).

Успешное применение ФДТ для лечения опухолей зависит от способности ФС селективно накапливаться в ткани опухоли [21;88]. Поэтому актуальным направлением исследований является совершенствование готового препарата с целью повышения селективности накопления фотодитазина в опухоли и увеличения эффективности ФДТ. Одним из возможных путей решения проблемы является создание липосомальной лекарственной формы препарата, которую можно лиофилизировать и хранить при пониженной температуре.

В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.П.Блохина РАМН разработана лиофилизированная липосомальная лекарственная форма фотодитазина «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг».

Цель исследования - создание и контроль качества липосомальной лекарственной формы фотодитазина, увеличающей избирательность противоопухолевого действия и фотодинамическую эффективность препарата.

Задачи исследования:

1. На основе • фармацевтических исследований выбрать оптимальный состав липосомальной лекарственной формы фотодитазина.

2. Разработать, способ получения липосом с максимальной степенью включения фотодитазина.

3. Сравнить избирательность накопления фотодитазина в опухоли известной лекарственной формы и новой липосомальной лекарсгвениой формы.

4. Изучить эффективность фотодинамической терапии липосомальной лекарственной формы фотодитазина in vivo.

5. Получить лиофилизированную форму липосомального фотодитазина.

6. Обосновать химико-фармацевтические критерии качества готового препарата и разработать методики для установления стандартности липосомальных форм фотодитазина.

Научная новизна

Впервые разработана новая пэгилированная липосомальная лекарственная форма фотодитазина, увеличивающая избирательность противоопухолевого действия препарата. Обоснованы требования к стандартизации липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора. Установлены критерии и параметры качества липосомальной лекарственной формы: однородность липосомальной дисперсии, размер частиц не более 200 нм, эффективность включения препарата в липосомы (не менее 84 %). Отработаны методы: очистка липосомальной лекарственной формы от невключившегося' препарата, и определение эффективности включения фотодитазина в липосомы. Получены данные о селективности накопления новой липосомальной лекарственной формы в опухоли на животных с экспериментальной опухолью, показана высокая эффективность ФДТ.

Практическая значимость

Создана новая пэгилированная липосомальная лекарственная форма «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг». В эксперименте in vivo при ФДТ опухоли Эрлиха показана ее высокая эффективность по сравнению с водным раствором фотодитазина. Разработаны методики: подлинности яичного фосфатидилхолина и фотодитазина (ТСХ и спектрофотометрия), а также количественного определения фотодитазина в липосомальной лекарственной форме (спектофотометрия). По результатам работы составлен проект ФСП на «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг».

Разработка и производство отечественного высокоэффективного липосомального препарата для ФДТ позволит использовать этот локальный метод лечения на более широком спектре опухолей человека и расширить доступность для широкого круга пациентов.

Апробация работы

Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VIII и IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», (Москва, 21-22 апреля 2009 г.; Нижний Новгород, 18-19 мая 2010 г.); научной конференции с международным участием «Наноонкология», (Москва 18-19 февраля 2009 г.).

Апробация диссертационной работы проведена 24 мая 2010 г. на совместном заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М.Сеченова и лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ (из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ).

Положения, выносимые на защиту:

1. Состав и технология получения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина.

2. Методики фармацевтического анализа: спектрофотометрическое (качественное и количественное) и хроматографическое определение компонентов липосомальной лекарственной формы, гель-фильтрация для очистки липосом от невключившегося в везикулы препарата.

3. Результаты оценки селективности накопления препарата и эффективности ФДТ липосомальным фотодитазином in vivo:

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав результатов собственных исследований, общих выводов, списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и 18 таблиц. Библиографический список включает 130 наименований, в том числе 92 — на иностранном языке.

Общие выводы

1. Разработан оптимальный состав и технология получения пэгилированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина со средним диаметром частиц свежеприготовленной дисперсии 165±15 нм и эффективностью включения препарата 91 ± 2 %.

2. Подобраны критерии и параметры качества липосомальной лекарственной формы фотодитазина. Разработаны методики для качественного (тонкослойная хроматография и спектрофотометрия) и количественного (спектрофотометрия) определения препарата. Относительная ошибка количественного определения не превышала 2,7 %.

3. На животных с экспериментальной опухолью Эрлиха показано, что при использовании липосомального фотодитазина избирательность накопления препарата в опухоли увеличивается на 15-20% по сравнению с водным раствором, при этом эффективность по критерию излечения животных соответственно повышается от 0 % до 40 % .

4: На основании разработанного режима сублимационной сушки липосомальной формы фотодитазина выбран состав липосом с криопротектором сахарозой.

5. Разработан проект ФСП на «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для увеличения срока хранения липосомальной лекарственной формы фотодитазина разработали режим сублимационной сушки и подобрали состав липосом, подлежащий высушиванию. Использование в качестве криопротекторов маннита, лактозы, глюкозы и сахарозы, в водной фазе липосомальной дисперсии фотодитазина (внутри и снаружи) с последующим замораживанием и сублимацией, позволило предупредить фазовое разделение липидной композиции и предохранить фотодитазин от вытекания и сохранить способность липосом к регидратации. Проведенный эксперимент показал, что по внешнему виду дисперсии липосом с разными криопротекторами не различались друг от друга. После лиофильной сушки липосомальных дисперсий с сахарозой структуры и средний размер липосом с фотодитазином практически не отличались от параметров,, определенных до лиофилизации. Кроме того, эффективность включения- фотодитазина внутрь липосом с сахарозой' составляла достаточно высокое значение 85,1 ±1,42% при £ = 1,67 %. В результате проведенных исследований отобран состав лиофильно-высушенных липосом с криопротектором — сахарозой. Количественное содержание фотодитазина в одном флаконе лиофилизированных липосом с сахарозой- составило 1,52' ± 0,04 мг, относительная ошибка среднего результата не превышала 2,71 %.

Для идентификиции яичного фосфотидилхолина и фотодитазина для стандартизиции, а также в процессе получения, препарата разработана методика спектрофотометрии и подобраны оптимальные условия хроматографического анализа лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина. Определено содержание продукта перекисного окисления липидов липосомальной оболочки - МДА. Проведенные исследования показали, что в лиофилизированных липосомах фотодитазина с сахарозой количество МДА составляло — 3,90 ± 0,229 нмоль/мл.

Совокупность разработанных химико-фармацевтических методов легли в основу проекта ФСП на «Липосомальный фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг». Срок годности изучается.