Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Технологические особенности проведения высокодозного донорского тромбоцитафереза

На правах рукописи

Варламова Светлана Васильевна

□□3453178 Технологические особенности проведения

высокодозного донорского тромбоцитафереза

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

003459178

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Николай Николаевич Калинин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Лидия Семеновна Любимова доктор медицинских наук, профессор Валерий Борисович Хватов

Ведущая организация:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф .Владимирского.

Защита состоится «21 января» 2009г. в 14 00 час. На заседании диссертационного совета Д 001.042.01 в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН

Автореферат разослан «18 декабря » 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Зыбунова Елена Евгеньевна

Общая характеристика рабсмы Актуальность проблемы.

Постоянно возрастающая потребность в безопасных и эффективных компонентах крови при лечении онкогематологических больных -характерная черта современной гематологической клиники. Лечение больных с заболеваниями системы крови невозможно без гемокомпонентаой терапии, особая роль в которой отводится тромбоцитам (Городецкий В.М., 2006). Программная химиотерапия опухолей системы крови, апластичсской анемии, трансплантации костного мозга, комплексная терапия острого диссемшшровашюго сиергыпаиия крови, массивной кровопотсри предусматривают переливание тромбоцитнога концентрата (ТК).

Вместе с тем, с повышением потребностей в трансфузиях ТК, увеличивается риск развития поспрансфузнонных осложнений, растет риск передачи гемотрансмиссивных инфекций пропорционально количеству доноров, участвующих в заготовке ТК (Селиванов Е.А., 2006; Лазарецко М.И., 2007).

Внутривидовые различия людей по антигенам систем ABO, HLA, НРА, высокая иммуногенность ряда антигенов являются причиной аллоиммупизации пациентов при проведении трансфузионной терапии ТК. Аллоиммупизация пациентов приводит к полному отсутствию клинического эффекта от переливания тромбоцитов, в организме реципиентов происходят тяжелые нарушения в иммунной системе, проявляющиеся в срыве иммунологической толерантности и развитии аутоиммунного процесса, приводящего к тяжелым геморрагическим проявлениям (Головкина Л.Л., 2008г.). В связи с чем, для гематологических больных, зависимых от трансфузий тромбоцитов, иммунокомироментированных пациентов, нуждающихся в многократных переливаниях ТК, принципиальное значение имеет получение лечебных доз 1ромбоцитов от минимального числа доноров (Савченко В.Г., 2006; Arnold D.M., 2006). Особо актуальной становится проблема заготовки нескольких терапевтических доз ТК от одного подобранного донора.

В настоящее время получение ТК в терапевтических дозах от одного донора возможно только с использованием аферезной технологии на сепараторах клеток крови. Поэтому в большинстве высокоразвитых стран безусловное предпочтение отдается методам заготовки аферезных ТК (Burgstaler Е.А, 2004, 2006; Chaudhary R., 2005; Cloutier D.A., 2005). Тактика получения максимально эффективной дозы тромбоцитов от одного донора соответствует современным клиническим требованиям, дает возможность пролонгированной трансфузионной поддержки больного с осуществлением принципа - «один донор - один реципиент» (Воробьев А.И, 1985); имеет экономические преимущества, так как сокращает потребность в донорах, повышает эффективность использования оборудования и приводит к уменьшению затрат на трансфузиологическое обеспечение больных (Фрсгатова Л.М., 2006).

Вместе с тем, новый приказ Минздравсоцразвития РФ «Об утверждении порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов» от 06.06. 2008г. (№ 261н) практически не предъявляет дополнительных требований к донорам тромбоцитов.

По данным Лыспак С.А. и соавт. (2008) при отборе доноров для приготовления ТК должно учитываться количество тромбоцитов в периферической крови (150-320><109/л), время свертывания крови (5-10 мин.). Эти требования утверждены МЗ Республики Украина.

До настоящего времени в РФ нет регламентирующих документов проведения аппаратного тромбоцитафереза (ТЦФ), отсутствуют методические подходы безопасного проведения интенсивного ТЦФ в оптимальных режимах, позволяющих стабильно получать высокодозные ТК на сепараторах клеток крови. Не обоснованы также четкие критерии отбора доноров и контроля за их состоянием здоровья при заготовке высокодозных ТК, не определено безопасное для доноров количество ТЦФ в год.

Таким образом, актуальной и важной задачей для клинической гематологии и современной трансфузиологии является необходимость повышения эффективности донорского аппаратного ТЦФ с разработкой методических подходов его проведения и обоснованием критериев отбора доноров для безопасной и стабильной заготовки двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови от одного донора за одну процедуру.

Цель работы. Повысить эффективность аппаратного ТЦФ и изучить влияние интенсивных ТЦФ на организм донора. Задачи исследования.

1. Разработать методические подходы проведения ТЦФ по заготовке двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови.

2. Обосновать критерии отбора доноров тромбоцитов, обеспечивающих безопасное проведение ТЦФ при получении двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов.

3. Провести сравнительный анализ эффективности сбора тромбоцитов на различных сепараторах клеток крови (Cobe Spectra, CS 3000 Plus, Amicus, MCS+).

4. Изучить морфофункциональные свойства заготовленных тромбоцитных концентратов.

5. Изучить переносимость донорами процедур интенсивного ТЦФ. Научная новизна работы.

Впервые изучено влияние интенсивного аппаратного ТЦФ у доноров на основные показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, иммуноглобулинов, обмена железа.

На основании полученных данных разработаны безопасные режимы интенсивного ТЦФ при заготовке двух и трех терапевтических доз тромбоцитов.

Предложенная технология получения высокодозных ТК, позволила повысить заготовку аферезных тромбоцитов и стабильно (в 92% случаев) получать двойные (59%) и тройные (33%) терапевтические дозы.

Впервые дана морфофункциональная оценка ТК, полученных и больших терапевтических дозах. Показано, что морфофункциональные характеристики тромбоцитов, заготовленных в больших дозах, соответствовали нормальным значениям и исходным параметрам донора.

Сделан сравнительный анализ ТЦФ при заготовке ТК в больших терапевтических дозах на 4-х сепараторах клеток крови (Cobe Spectra, Amicus, CS 3000 Plus, MCS+). При оценке выхода тромбоцитов, эффективности сбора и основных параметров ТЦФ получены результаты, свидетельствующие о высокой эффективности сбора тромбоцитов на всех аппаратах (74%). Вместе с тем, больший выход клеток в ТК от одного донора за одну процедуру при проведении интенсивного ТЦФ отмечен на сепараторе Cobe Spectra (15 единиц ТК). Практическая ценность работы.

На основании полученных данных показана безопасность и хорошая переносимость донорами заготовки больших терапевтических доз аферезных тромбоцитов в интенсивном режиме ТЦФ. Установлено, что восстановление исходного содержания тромбоцитов у доноров после ТЦФ, происходит при двухнедельном интервале между процедурами.

Обосновано применение методических подходов, включающих введение критериев отбора доноров (исходное содержание тромбоцитов не менее 250х109/л, ОЦК не менее 5 л) и увеличение объема обработанной крови в среднем до 5,5±0,6 л при проведении аппаратного ТЦФ. Разработанные технологические особенности проведения ТЦФ дают возможность заготавливать более 600х109 тромбоцитов (двойную и тройную терапевтическую дозу) от одного донора за одну процедуру. Внедрение а практику.

Метод заготовки двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов внедрен в отделении экстракорпорального очищения крови и отделении заготовки компонентов крови ГНЦ РАМН.

Результаты исследования используются в лекционных и практических занятиях на курсах по «Клинической трапсфузиологии». Положения, выносимые на защиту.

1. Заготовка двух и трех лечебных доз аферезных тромбоцитов в интенсивном режиме ТЦФ не оказывает отрицательного воздействия на организм донора.

2. Методические особенности ТЦФ при заготовке двойных и тройных доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови заключаются в увеличении объема обрабатываемой крови в среднем до одного ОЦК донора, без значительного увеличения времени процедуры и объема вводимого антикоагулянта.

3. Минимально допустимым исходным содержанием тромбоцитов у доноров для получения двойных терапевтических доз установлено

250x10 /л и 290x109/л - для заготовки тройных терапевтических доз тромбоцитов.

4. Уменьшение тромбоцитов после ТЦФ, в среднем до 149. 6±3,2х Ю /л, при заготовке высокодозных тромбоцитных концентратов является хорошим прогностическим признаком резервных и функциональных возможностей тромбоцитопоэза донора. Снижение тромбоцитов менее 150х 109/л не вызывает изменений в плазменно-тромбоцитарном звене гемостаза.

5. Высокая эффективность сбора двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов показана на всех сепараторах клеток крови.

6. Морфофункциональные характеристики тромбоцитов, заготовленных в больших дозах, соответствовали нормальным значениям и исходным показателям доноров.

Апробация диссертации.

Апробация работы состоялась 11 сентября 2008г. на заседании проблемной комиссии ГНЦ РАМН «Проблемы донорства, производства и контроля качества компонентов и препаратов крови».

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на ежегодных конференциях Московского общества гемафереза в 2004г. и 2005г.; на симпозиуме Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития «Безопасность переливания компонентов крови» (Москва, 2006г.); на съезде гематологов и трансфузиологов, посвященному 80-летию ЦОЛИПК (Москва, 2006г.); на VI съезде гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Минск, 2007г.): на научно-практических конференциях «Проблемы клинической трансфузиологии» (Москва, ГНЦ РАМН, 2007 и 2008 гг.). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 работ в отечественных и зарубежных изданиях, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК. Объем и струстура работы.

Диссертация изложена на 166 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 30 таблицами, 31 рисунком, 3 диаграммами. Работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 304 источника, из них 100 отечественных и 204 зарубежных.

Работа выполнена в отделении экстракорпорального очищения крови ГНЦ РАМН (научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор H.H.Калинин) в сотрудничестве с научными лабораториями и клиническими подразделениями ГИЦ РАМН (директор - академик А.И.Воробьев).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Характеристика групп доноров

Заготовка тромбоцитов у доноров проводилась в отделении экстракорпорального очищения крови ГНЦ РАМН на 4-х сепараторах клеток крови: непрерывно-поточного действия - Cobe Spectra (фирма Gambro), CS 3000 Plus, Amicus (фирма Baxter) и на аппарате прерывисто-поточного фракционирования - MCS+ (фирма Haemonetics).

За период 2002 - 2007 гг. выполнено 214 процедур донорского ТЦФ у 130 доноров, которые были разделены на 3 группы.

1-я группа сформирована из 11 кадровых доноров с разрешения этического комитета ГНЦ РАМН и Ученого Совета ГНЦ РАМН (Протокол № 6 от 30.11. 2003г.). Было проведено 95 ТЦФ в интенсивном режиме. Алгоритм интенсивного ТЦФ заключался в проведении циклов по 5 процедур ТЦФ с интервалом в 14 дней, с последующим перерывом в 3 месяца и продолжением цикла ТЦФ в количестве 5 процедур (до 10 ТЦФ в год). Доноры были отобраны но основным критериям.

Во 2-ю и 3-ю группу включены доноры, которым ТЦФ проводились без использования критериев отбора.

Во 2-ой группе 63 донорам ТЦФ проведены с использованием методических подходов, которые заключались в обработке больших объемов крови по сравнению с ТЦФ, выполненными в стандартном режиме.

В 3-ей группе 56 донорам ТЦФ проведены без увеличения объемов обрабатываемой крови, т.е. по стандартным протоколам. Характеристика доноров представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика допоров. (М±ш)

Исследуемые Количество Пол Возраст Вес Рост ОЦК

группы доноров ж м кг см л

1-я группа 11 1 10 34,1± 0,7 79,9± 1,1 180,0± 0,5 5,3± 0,04

2-я группа 63 4 59 25,7± 0,9 74,9± 1,2 175,9± 0,9 4,9± 0,07

3-я группа 56 12 44 28,3± 1,0 76,5± 1,8 176,6± 1,0 5,1± 0,1

ТЦФ на сепараторах клеток крови проводили согласно руководствам по использованию и технической эксплуатации каждого из аппаратов.

Таблица 2. Количество ТЦФ, проведенных в 3-х группах доноров на _ сепараторах клеток крови.__

Исследуемые Сепараторы клеток крови

группы Cobe Spectra CS 3000 Plus Amicus MCS+ Всего

1-я 37 24 15 19 95

2-я 15 - 41 7 63

3-я 12 21 14 9 56

Всего: 64 45 70 35 214

Основными критериями отбора доноров для проведения ТЦФ на сепараторах клеток крови являлись: исходное содержание тромбоцитов и объем циркулирующей крови (ОЦК), определяющий общее количество циркулирующих тромбоцитов. ОЦК вычисляли по росто-весовым показателям донора с помощью формул (70 мл хкг массы тела-для мужчин или 65 мл хкг массы тела - для женщин) или с помощью номограммы (расчетные таблицы Надлера). При определении значений исходного содержания тромбоцитов, для заготовки двойных и тройных терапевтических доз, учитывали рекомендации Совета Европы о нежелательности снижения тромбоцитов у доноров после ТЦФ менее 150х109/л клеток.

Предварительными критериями отбора доноров для получения высокодозных ТК принято: исходное содержание тромбоцитов - не менее 250х109/л, ОЦК - не менее 5 л. Это соответствует массе тела донора от 75 кг и росту от 170 см. Данные показатели определены с учетом многолетнего опыта по заготовке тромбоцитов на сепараторах клеток крови отделения экстракорпорального очищения крови ГНЦ РАМН и анализа данных отечественных и зарубежных исследователей.

Методы исследования допоров и ТК

Медицинское освидетельствование доноров проводил врач отдела заготовки компонентов крови ГНЦ РАМН в соответствии с инструкцией «Порядок освидетельствования донора крови и ее компонентов», утвержденной МЗ РФ № 364 от 14.09. 2001г.

Дополнительно выполнены следующие исследования: электрофоретический анализ белковых фракций сыворотки крови; определение содержания иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM); исследование коагуляционного и тромбоцитарпого гемостаза, определение уровня электролитов, обмена железа.

Анализ белков сыворотки включал в себя определение процентного содержания белковых фракций (альбумины и глобулины - 0|, а2, Р, у) методом электрофореза в агарозном геле на оборудовании Paragon и тест-системах фирмы Beekman Coulter (США). Денситометрию проводили на аппарате Appraise той же фирмы.

Уровень сывороточных Ig классов А, М, G, определяли методом радиальной иммунодиффузии (РИФ) в геле по G. Mancini (1965), используя моноспецифические сыворотки, выпускаемые фирмой «Им Био»

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) измеряли осаждением ПЭГ-6000 (Hashkova V. et al., 1976).

Определение индуцированной агрегации тромбоцитов у доноров и в ТК (индукторы: АДФ, ристомицин, адреналин) проводили по методу Вот (1962) па приборе агрегометр Elvi 840 (Италия).

Состояние плазменного гемостаза оценивали по следующим параметрам: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ГШ), фибриноген.

АЧТВ определяли по Caen (1968).

IIB исследовали по Quick (1935).

Количественный анализ фибриногена проводили по Claus (1957).

Уровень электролитов (Са, К, Na в mmol/l) определяли ионоселективным методом на электролитном анализаторе AVL 984-S (Австрия).

Оценку клеточного состава крови выполняли с помощью проточного счётчика «Cobas Micros -18 ОТ» фирмы «La Rochc-АВХ» с подсчетом 18 гематологических параметров, включая тромбоцитомегрические характеристики: содержание тромбоцитов (PLT, 103мм3); средний объём тромбоцита (MPV, мкм3); ширину распределения тромбоцитов по объёму (PDW, %); тромбокрит (РСТ, %).

Поверхностная архитектоника тромбоцитов и эритроцитов изучалась с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в электронном микроскопе JEOL-1200EX (Япония).

Статическую обработку результатов проводили с помощью программ «Microsoft Excel» и «Statistica» ver. 6.0. Достоверность различий определяли параметрическими методами с помощью критерия Стьюдента и непараметрическими методами (U-критерий Манна-Уитни, коэффициент корреляции Спирмена). Критическая величина уровня значимости (для оценки статистической значимости) была принята равной 0,05.

Автор считает своим долгом выразить признательность за совместные исследования и помощь в работе: сотрудникам лаборатории гемоцитологии проф. Козинцу Г.И., в.н.с. Сарычевой Т.Г., в.н.с. Новодержкиной Ю. К., в.н.с. Шмарову Д.А., с.н.с. Шишкановой З.Г., с.н.с. Наумовой И. Н., с.н.с. Поповой О.В.(зав. лаб. д.м.н. Погорелов В.М.); зав. лаборатории гуморального иммунитета к.м.н. Варламовой Е.Ю.; сотрудникам лаборатории патологической физиологии с.н.с. Балакиной Т.А., н.с. Марковой MJI.; сотрудникам лаборатории патологии эритрона ст.н.с. Левиной А.А., н.с. Цыбульской М.М., зав. лабораторией экспресс-диагностики Грозной Т.Г.; сотрудникам ОЗКК и К ГНЦ РАМН Орловой Г.К., Шелеповой Л.И.; зав. отд. клинической трансфузиологии Шумиловой Л.Л.; зав. лабораторией биостатистики и информационных систем к.т.н. Куликову С.М. и с.н.с. Гемджяну Э.Г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Технологические особенности заготовки терапевтических доз тромбоцитов

Оптимально возможная заготовка компонентов крови от одного донора является принципом нового направления современного развития трансфузиологии, которое определено, как мультикомпонентное донорство. К одному из составляющих этого вида донорства относится тактика увеличения заготовки тромбоцитов от одного донора путем получения двойных (600-800x10" клеток или 11-14 единиц ТК) и тройных (более 800x10й тромбоцитов или >15 единиц ТК) терапевтических доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови.

Анализ собственных данных, полученных при проведении 214 ТЦФ у 130 доноров, позволил обосновать и установить минимальное количество тромбоцитов у донора, при котором возможно заготавливать большие дозы тромбоцитов без снижения их количества после аппаратного ТЦФ ниже порогового уровня (150х109/л клеток). На первом этапе исследований была проведена оценка содержания тромбоцитов у доноров всех трех групп до и после процедуры ТЦФ (табл. 1).

Исследованные параметры Группы доноров (Х± БО)

1 группа Количество ТЦФ-95 2 группа Количество ТЦФ-63 3 группа Количество ТЦФ-56

Содержание тромбоцитов у донора до ТЦФ (х109/л) 265,6 ±47,7 246,4± 33,3 234,4± 39,8

Содержание тромбоцитов у донора после ТЦФ (х109/л) 149,6± 30,2 167,6± 27,2 155,5± 41,3

Достоверность различий между содержанием тромбоцитов до и после ТЦФ р<0,0001 существенны р<0,0001 существенны р<0,0001 существенны

Коэффициент корреляционной связи г=+0,59 связь прямая, умеренная г=+0,52 связь прямая, умеренная г=+0,69 связь прямая, умеренная

Установлено, что содержание тромбоцитов у доноров всех групп после процедуры ТЦФ достоверно снижалось. Отмечена прямая корреляционная связь между показателями содержания тромбоцитов до и после проведения процедуры ТЦФ, что косвенно свидетельствовало о целесообразности отбора доноров по критерию исходного содержания тромбоцитов для проведения интенсивного аппаратного донорского ТЦФ.

Для подтверждения предварительных выводов каждая из групп доноров была разделена на подгруппы, которые отличались содержанием тромбоцитов после ТЦФ: подгруппы 1а, 2а, За-менее 150х109/л, подгруппы 16,26,36 - более 150х109/л (табл.4).

Таблица 4. Оценка содержания тромбоцитов в крови доноров до и после ___ТЦФ, разделенных на подгруппы.__

Исследованные Группы и подгруппы доноров (Х± ЙО)

параметры 1 группа 2 группа 3 группа

1а 16 2а 26 За 36

42 ТЦФ 53 ТЦФ 14 ТЦФ 49 ТЦФ 19 ТЦФ 37 ТЦФ

Содержание 240,8± 291,5± 232,2± 250,7± 212,7± 248,7±

тромбоцитов до 34,8 45,0 27,9 33,8 35,4 36,3

ТЦФ (хЮ'/л)

Содержание 118,3± 173,4± 131,1± 178,8± 116,3± 180,3±

тромбоцитов 15,8 20,4 10,5 19,9 19,8 30,6

после ГЦФ

(х109/л)

Достоверность различий между Р< 0,0001 Р< 0,0001 Р< 0,0001 Р< 0,0001 Р< 0,0001 Р< 0,0001

показателями суще- суще- суще- суще- суще- суще-

ствен- ствен- ствен- ствен- ствен- ствен-

ны ны ны ны ны ны

Коэффициент г=-0,09 г=+0,51 г=+0,60 г=+0,52 г=+0,28 г=+0,74

корреляционной связь связь связь связь связь связь

связи отсут- прямая, прямая, прямая, прямая прямая

ствует умерен- умерен- умерен- слабая силь-

ная ная ная ная

Количество 12,4±2,2 14,6±2,3 12,6±2,2 13,2±3,2 8,4±2,5 11,1±3,5

единиц ТК

Дифференцированный анализ данных (табл.4) содержания тромбоцитов у доноров после ТЦФ в 2-х подгруппах (при снижении <150х109/л и количестве тромбоцитов >150х10'/л), позволил подтвердить значимость критерия исходного содержания тромбоцитов при селекции доноров на процедуры интенсивного донорского аппаратного ТЦФ.

Из таблицы видно, что минимальное исходное содержание тромбоцитов у доноров при заготовке двойных терапевтических доз тромбоцитов, при котором количество тромбоцитов после ТЦФ остается >150x109/л, является 248,7±36,3х109/л, что соответствовало предварительно выбранным значениям (250x10%). При заготовке тройных терапевтических доз исходное количество тромбоцитов в среднем составило 291,5±44,9х109/л. Таким образом, был установлен диапазон и сходных значений тромбоцитов у доноров, при котором возможна заготовка высокодозпых ТК: от 250х109/л - при заготовке двойных терапевтических доз тромбоцитов (11-14 единиц ТК), 290x109/л - при получении тройных терапевтических доз ТК (>15 единиц ТК).

Сравнительная характеристика ТЦФ в 3-х исследуемых группах С целью изучения эффективности использованных методических подходов для заготовки больших доз тромбоцитов (две-три терапевтические дозы) на сепараторах клеток крови и для определения основных параметров, влияющих на выход тромбоцитов в конечном продукте - ТК, проведена сравнительная характеристика ТЦФ в 3-х группах доноров.

Таблица 5. Сравнительная характеристика исходных параметров __доноров.__

Исходные Исследуемые группы доноров Р

параметры доноров 1-я группа п=11 2-я группа п=63 3-я группа п=56

ОЦК, л 5,3±0,01 4,9 ±0,01 5,1±0,01 0,01

М±ш

Исходное

количество 265,6+4,8 247,5±4,2 236,6±5,4 <0,05

тромбоцитов (х 109/ л) М±ш

Количество

циркулирующих тромбоцитов (х10п) М±т 14,1±0,25 12,0±0,3 11,6±0,5 0,01

Из представленных в таблице данных видно, что исходные параметры доноров 1-ой группы достоверно отличались от исходных параметров доноров 2-ой и 3-ей группы.

Рис.1. Величина объема обработанной крови в группах доноров ТЦФ.

Объем обработанной крови в 1-ой группе доноров (рис.1) превышай объем обработанной крови во 2-ой группе на 23% и в 3-ей группе на 30%. Между 2-ой и 3-ей группами доноров Д% по объему обработанной крови составила 10%.

Таблица 6. Сравшпельнан характеристика ТК, заготовленных в группах

Исследованные параметры Исследуемые группы доноров Р

1-я группа 95 ТЦФ 2-я группа 63 ТЦФ 3-я группа 56 ТЦФ

Количество тромбоцитов в ТК хЮ9 (М ± а) 758,3±15,7 672,2±21,0 518,9±26,3 <0,01

Количество единиц ТК (М± а) 13,9±0,3 12,4±0,4 9,6±0,5 <0,01

Сравнительная характеристика ТК в 3-х исследуемых группах по выходу тромбоцитов в ТК (табл. 6) показала, что наибольшее количество единиц ТК получено в 1-ой группе (13,9±0,3 ед. ТК, от 8 до 20 сд. ТК), что статистически значимо отличалось от количества единиц ТК, полученных во второй (12,4±0,3) и третьей (9,6±0,5) группах доноров.

г — 0,4 р < 0,01

"1 I I I I I I I

2500 3500 4500 5500 6500 Объём обработанной крови

Рис. 2. Корреляция между объемом обработанной крови и количеством заготовленных тромбоцитов (единиц ТК).

Анализ факторов, влияющих на результаты заготовки терапевтических доз тромбоцитов (рис.2), выявил статистически значимую положительную корреляцию (критерий Спирмена г ,¡=0,4, р=0,01) от объёма обрабатываемой крови. Было показано, что с увеличением объёма обработанной крови растёт количество получаемых доз тромбоцитов.

Менее выраженная корреляция (г,=0,2, критерий Спирмена) была отмечена между количеством циркулирующих тромбоцитов и выходом тромбоцитов в ТК (р=0,05) (рис.3).

8 10 12 14 16 18 20 22 24 Колич. циркул. тромбоцитов

Рис. 3. Корреляция между количеством циркулирующих тромбоцитов у доноров и количеством заготовленных тромбоцитов (единиц ТК).

На основании результатов, полученных по заготовке тромбоцитов в 3-х группах доноров установлено, что количество доз тромбоцитов, заготовленных методом аппаратного ТЦФ, существенно зависит от объема обработанной крови (г5=0,4). При статистически незначимой (р>0,05) разнице в исходном уровне тромбоцитов во 2-ой (247,5±4,2хШ9/л) и 3-ей (236,6±5,4х109/л) группах - на 5%, увеличение объема обработанной крови в среднем на 10%, привело к росту количества заготовленных доз тромбоцитов во 2-ой группе в 1,3 раза по сравнению с 3-ей группой (12,4 и 9,6 единиц ТК, соответственно). Результаты сбора тромбоцитов на сепараторах клеток крови у доноров 1-ой группы показали, что с введением критериев отбора доноров, отмечено статистически значимое (р<0,01) более высокое исходное количество циркулирующих тромбоцитов (14,1±0,25х10п) по сравнению с 2-ои (12,0±0,3х10п) и 3-ей (11,6±0,5х10 ) группами. Увеличение объема обработанной крови в 1 группе доноров в среднем до 5476,8±61,9 мл (не менее 1 ОЦК), обеспечивает повышение количества единиц ТК на 30% по сравнению с 3-ей группой, где ТЦФ проводился по стандартной методике.

Диаграмма 1. Сравнительные результаты заготовки терапевтических доз тромбоцитов у доноров 1 группы,

59%

И 1 лечебная доза

тромбоцитов ■ 2 лечебные дозы

тромбоцитов Ы 3 лечебные дозы тромбоцитов

Соотношение терапевтических доз тромбоцитов (диаграмма 1) в 1-ой группе доноров составило: 3 лечебные дозы - 33%, 2 лечебные дозы - 59%, ! лечебная доза - 8%.

Диаграмма 2. Сравнительные результаты заготовки терапевтических доз тромбоцитов у доноров 2 группы.

И 1 лечебная доза

тромбоцитов Н 2 лечебные дозы

тромбоцитов ЕЭ 3 лечебные дозы тромбоцитов

иное распределение терапевтических доз тромбоцитов: 3 лечебные дозы - 29%, 2 лечебные дозы -41%, 1 лечебная доза - 30% (диаграмма 2).

Диаграмма 3. Сравнительные результаты заготовки терапевтических доз тромбоцитов у доноров 3 группы.

9% □ 1 лечебная доза

тромбоцитов И 2 лечебные дозы

тромбоцитов S 3 лечебные дозы тромбоцитов

В 3-ей группе доноров терапевтические дозы тромбоцитов распределились следующим образом: 3 лечебные дозы - 9%, две лечебные дозы - 25%, одна лечебная доза - 66%.

Таким образом, наибольшее количество заготовленных высокодозных ТК (92%) получено в 1-ой группе интенсивного ТЦФ у доноров с большим количеством циркулирующих тромбоцитов, отобранных но критериям (ОЦК, количество тромбоцитов) и при проведении ТЦФ с увеличением объема обработанной крови (не менее 1 ОЦК). Во 2-ой группе, где не применялись критерии отбора доноров, но были увеличены объемы обработанной на сепараторах крови, большие дозы тромбоцитов удалось получить в 70%. В 3-ей группе доноров, проведение ТЦФ по стандартной методике обеспечило получение только 34% высокодозных ТК.

Характеристика интенсивного ТЦФ

С целью отработки технологических подходов заготовки больших доз тромбоцитов нами проведено 95 процедур интенсивного донорского ТЦФ на сепараторах крови: Cobe Spectra -37, Amicus - 15, CS 3000 Pius - 24, MCS+ -19 ТЦФ.

29%

30%

41%

Во второй ipynne доноров получено

Изменение методики проведения ТЦФ на сепараторах крови заключалось в обработке большего объема крови (не менее 1-ого ОЦК) с максимально комфортным режимом для донора, а именно без значимого увеличения времени проведения ТЦФ и объема вводимого антикоагулянта (АСИ). Отработка параметров режима ТЦФ заключалась в подборе оптимальной скорости подачи крови, которая в результате в среднем составила 65 мл/мин, что обеспечило сокращение длительности процедуры. Дальнейшее увеличение скорости потока повышает риск цитратной реакции и клеточной контаминации ТК. За счет поэтапного увеличения соотношения кровь-антикоагулянт (от 9:1 до 12:1) через каждый 1 л обработанной крови проводили уменьшение подачи антикоагулянта.

Таблица 7. Сравнительная характеристика интенсивного ТЦФ.

Величина параметров ТЦФ на 4-х сепараторах клеток крови

Параметры т'ш-тах Всего п=95 Cobe Spectra п=37 CS 3000 Plus п=24 Amicus п=15 MCS+ п=19 Р

Объем обработанной крови, л 5,5±0,6 3,7-6,9 5,8±0,4 4,4-6,9 5,7±0,4 5,0-6,0 5,3±0,6 4,7-6,2 4,7±0,5* 3,7-5,5 <0,05

Время, мин 106,9± 21,7 76-179 100,3± 3,5 90-110 98,0± 6,0 87-110 90,7± 12,2 76-109 144,7± 19,8* 100-179 <0,02

АСБ, мл 535,0± 55,8 360-656 521,5± 38,3 360-630 573,8± 52,9 400-650 564,9± 55,8 483-656 490,7± 48,1* 375-575 <0,05

Скорость крови, мл/мин 65± 5,5 60,7± 5,8 60± 5,5 64± 5,3 69,5± 10,4 >0,05

^показатели, имеющие статистически значимые различия

Анализ данных (табл.7) свидетельствует, что в среднем за процедуру аппаратного ТЦФ можно обработать 5,5±0,6 л крови. Однако, на сепараторе MCS+ (прерывисто-поточная обработка крови с одноигольным венозным доступом) имеют место существенные ограничения. Продолжительность процедур в среднем составила 106,9±21,7 мин, но на сепараторах непрерывно-поточного фракционирования время процедуры было короче -96,3±7,2 мин. Минимальное время сбора тромбоцитов отмечено на аппарате Amicus - 90,7±12,2 мин. Самые длительные ТЦФ были на сепараторе MCS+ -144,7 ± 4,5 мин. За процедуру ТЦФ донору вводили в среднем 535,0±5,6 мл раствора антикоагулянта (ACD).

Таблица 8. Сравнительная характеристика ТК, полученных на 4-х _сепараторах клеток крови._

Параметры Х±80 Всего п-95 Cobe Spectra CS 3000 Plus Amicus MCS+

пнп-тах n=37 n=24 п=15 п=19

Исходное

содержание 265,6±47,7 267,7±51,0 266,5±42,4 256,8±49,2 283,3±44,4

тромбоцитов 200-440 200-440 200-390 200-340 200-330

(х109/л)

Содержание тромбоцитов 149,6±30,2 149,6±35,2 150,3±27,9 132,2±29,8* 157,8±33,8

после ТЦФ 100-270 100-230 110-250 100-190 100-190

(х109/л)

Объем ТК, 449,1±87,4 475,6±75,0 374,0±50,3* 550,9±72,1 409,1±47,2

мл 300-660 360-660 300-500 430-640 310-500

Концентрация тромбоцитов, (х10п) 7,6±1,5 4,0-11,2 8,2±1,6* 5,4-11,2 7,5±1,3 5,7-11,0 7,3±1,3 5,4-10,5 6,7±1,4* 4,0-8,8

Количество 13,9±2,8 14,9±2,9* 13,8±2,4 13,3±2,2 12,3±2,6*

единиц ТК 8-20 10-20 10-20 10-19 8-16

* - значения, имеющие достоверные различия.

Результаты ТЦФ показывают (табл.8), что более высокий выход тромбоцитов в ТК отмечен при заготовке тромбоцитов на сепараторе Cobe Spectra (14,9±2,9 единиц ТК), имеющий статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению с количеством доз заготовленных на CS 3000 Plus (13,8±2,4), Amicus (13,3±2,2) и MCS+ (12,3±2,6).

Таблица 9. Эффективность и скорость сбора тромбоцитов при заготовке

ТК на 4-х сепараторах клеток крови.

Исследуемые параметры п=95 Показатели эффективности и скорости сбора тромбоцитов на сепараторах клеток крови (М±т)

Cobe Spectra n=37 Amicus n=15 CS 3000 Plus n=24 MCS+ n=19

Эффективность сбора тромбоцитов, % 75,1±2,3 78,4±3,9 74,1 ±3,9 67,9±4,6*

Скорость сбора тромбоцитов, мин. 0,081 0,081 0,077 0,046*

* статистически значимые различия (р < 0,05)

Нами проведен сравнительный анализ эффективности и скорости сбора тромбоцитов на 4-х сепараторах клеток крови.

Сравнительная характеристика эффективности сбора тромбоцитов (табл.9) показала высокие значения на всех сепараторах клеток крови (в среднем - 73.5%). Статистически значимые различия выявлены между показателями эффективности сбора тромбоцитов на аппарате МСБ+ (67,9±4,6%) с величиной эффективности на всех других аппаратах. На

сепараторах непрерывно- поточного действия (Cobe Spectra, CS 3000 Plus, Amicus) показатели эффективности сбора тромбоцитов были близки по значениям, без статистически значимых различий. Наиболее высокий показатель эффективности сб>ора тромбоцитов (78,4±3,9%) был получен на сепараторе Amicus. Данные показатели соотносились с результатами по скорости сбора тромбоцитов, которая была в 1,7 раза ниже на аппарате MCS+ и статистически значимо отличалась от скорости сбора на сепараторах Cobe Spectra, CS 3000 Plus и Amicus.

Таким образом, методические подходы заготовки в интенсивном режиме ТЦФ больших доз тромбоцитов (двух и трех терапевтических доз) на 4-х сепараторах клеток крови позволили предложить медицинскую технологию интенсивного ТЦФ: отличающуюся увеличенным объемом обработанной крови (в среднем 5,5±0,6 л); оптимальным временем процедуры (в среднем - 106,9±2,2 мин, а на сепараторах непрерывно-поточной подачи крови - 96,3±7,2 мин); оптимальным объемом вводимого антикоагулянта (в среднем до 535,0±5,6 мл) и скоростью подачи крови (в среднем 65 мл/мин). Полученные результаты показали, что разработанная медицинская технология интенсивного ТЦФ с применением критериев отбора доноров, позволит существенно повысить количество заготовленных доз тромбоцитов на сепараторах клегок крови от одного донора, с преимущественной заготовкой двух-трех терапевтических доз тромбоцитов, за одну процедуру ТЦФ.

Морфофункциональная характеристика тромбоцитов в крови доноров и в тромбоцитном концентрате

Исследование морфологии тромбоцитов (табл.10) показало, что более 90% тромбоцитов, циркулирующих в периферической крови доноров, представлено дискоидными и переходными формами с короткими единичными отростками.

Таблица 10. Цитоархитектоника тромбоцитов ТК в сканирующем

электронном микроскопе. (М ± ш)

Морфология тромбоцитов (п=95) %

Дискоидные тромбоциты 70,0 ± 1,06

Тромбоциты с короткими отростками 27,0 ± 0,96

Тромбоциты с длинными отростками 1,85 ±0, 07

Сфероидные тромбоциты 1,14 ±0,02

Следует отметить, что в ТК 70 % составляли тромбоциты нормальной конфигурации, представленные дискоидными формами. Отмечено увеличение клеток с короткими отростками до 27,0±0,96%, которые являются обратимой формой тромбоцитов. Необратимые формы с длинными отростками (1,85±0,07%) и сфероидные клетки (1,14±0,02%) выявлены в минимальном количестве (табл.10).

Таким образом, результаты изучения морфологии тромбоцитов в высокодозных ТК, показали хорошую сохранность цитоархитектоники клеток, заготовленных на всех сепараторах клеток крови.

Исследование функциональных свойств тромбоцитов в крови доноров и в тромбоцитпых концентратах

Динамику изменений функциональных свойств тромбоцитов изучали путем сравнения исследуемых показателей при проведении первых пяти ТЦФ - первый цикл (55 процедур ТЦФ) с данными, полученными при последующих пяти процедурах ТЦФ - второй цикл (40 процедур ТЦФ), проведенных тем же 8 донорам после трехмесячного перерыва.

Таблица 11. Показатели функциональной активности тромбоцитов у ___доноров и в ТК.____

ТЦФ № Динамика показателей Агрегация тромбоцитов (М±т)

Скорость агрегации N-18-40 сек АДФ N-55-65% Ристомицин N - 65-85% Адреналин N-55-65%

1 ТЦФ До ТЦФ 16 ± 0,7 71 ± 2,4 83 ± 2,6 76 ±3,2

После 21 ± 1,4* 66 ±3,8 77 ± 3,9 64 ±6,5

Через неделю 14 ±1,1 67 ±3,3 75 ± 3,1 72 ±3,7

ТК 18 ±4,0 46 ± 8,8** 81 ± 2,9 61 ±9,2

2 ТЦФ До 15 ±0,9 71 ± 1,6 78 ± 1,2 76 ± 1,4

После 18 ± 0,7 62 ± 2,6 73 ± 3,2 65 ±4,0

Через неделю 14 ±0,8 71 ±3,1 82 ± 2,3 69 ±6,6

ТК 15 ± 2,7 52 ± 8,1* 82 ± 2,7 55 ±1,6*

ЗТЦФ До 15 ± 0,5 69 ±2,5 78 ± 3,3 72 ± 2,3

После 21 ±1,5* 55 ±3,2* 71 ± 5,2 64 ± 5,2

Через неделю 15 ±1,0 75 ±3,6 82 ± 3,9 69 ±8,6

ТК 15 ±2,2 49 ±7,2* 85 ±2,9 70 ±6,4

4 ТЦФ До 14 ± 0,7 74 ±3,5 81 ± 2,7 76 ±4,4

После 20 ± 1,7* 57 ±1,2* 68 ± 1,2 54 ± 6,8*

Через неделю 14 ± 1,0 74 ±113 81 ± 1,4 59 ± 2,0

ТК 15 ± 1,4 55 ± 8,6* 78 ± 2,3 61 ± 4,7

5 ТЦФ До 16 ±03 67 ± 9,0 86 ± 2,5 69 ±3,9

После 18 ± 1,0 50 ± 13,8* 71 ± 2,9 57 ± 4,0

Через неделю 14 ± 1.5 55 ± 2,5 80 ± 3,0 65 ± 3,5

ТК 8,0 ±2,7*** 47 ± 15,7** 87 ± 4,4 32 ±2,3***

* - достоверность различий параметров по сравнению с исходными данными (*р < 0,05, ** р < 0,02, *** р < 0,001)

Из таблицы видно, что у доноров в исходном состоянии отмечено незначительное увеличение скорости процесса агрегации в среднем на 17% (до 15 сек.) и незначительное повышение агрегации тромбоцитов с двумя индукторами - АДФ и адреналином в среднем на 7% и 12%. После ТЦФ наблюдалось снижение (в среднем на 20-30%) скорости процесса агрегации до нормальных значений по сравнению с исходными данными. Агрегационная активность тромбоцитов со всеми тремя индукторам также снижалась, достигая уровня нормальных величин. Колебание значений ристомицин-агрегации тромбоцитов происходило в пределах нормальных значений. Исследование этих показателей в динамике через 1 неделю после

проведения ТЦФ в большинстве случаев показало возвращение функциональной активности тромбоцитов к исходному уровню.

При исследовании функциональной активности тромбоцитов в ТК (табл.11) в 1-ом цикле ТЦФ было отмечено, что скорость процесса агрегации не отличалась от исходных величин у доноров, за исключением ТК, заготовленных на 5-й процедуре ТЦФ, где выявлено повышение скорости процесса агрегации тромбоцитов в 2 раза (до 8 сек). При этом выявлено незначительное снижение агрегации тромбоцитов с АДФ в среднем на 10%. В ТК, заготовленных на 5-й процедуре ТЦФ, отмечено снижение агрегации с адреналином (32%). Ристомицин-агрегация тромбоцитов в ТК при всех исследованиях находилась в пределах нормальных значений (табл.11).

Изменения агрегации тромбоцитов у доноров во втором цикле ТЦФ имели аналогичные особенности динамики, отмеченные в первом цикле.

Исследование тромбоцитов в ТК, полученных во 2-ом цикле ТЦФ, показало, что скорость процесса агрегации имела тенденцию к дальнейшему повышению и превышала нормальные значения в среднем на 33%, но не имела статистически достоверных различий с изменениями этих показателей в 1-ом цикле ТЦФ. Значения агрегационной активности тромбоцитов были в основном в пределах нормальных значений, за исключением ТК, заготовленных на 2-й процедуре ТЦФ, где отмечено незначительное повышение процента агрегации с АДФ и адреналином.

Изучение влияния снижения тромбоцитов на степень индуцированной агрегации тромбоцитов проведено в подгруппах доноров, условно разделенных по признаку содержания тромбоцитов в крови после ТЦФ: 1-я подгруппа - более 150 * 109/л и 2-я подгруппа - менее 150 х 109/л.

Таблица 12. Агрегационная функция тромбоцитов у доноров в _зависимости от редукции тромбоцитов после ТЦФ._

Параметры до и после ТЦФ Количество тромбоцитов у доноров после ТЦФ (М± о)

1-я подгруппа >150 (п=31) 2-я подгруппа <150 (п=32)

ДО после Р ДО после Р

Количество тромбоцитов (х 109/л) 284,6± 37,1 166,1± 16,6 0,0001 243,0± 31,9 117,6± 14,3 0,0001

Агрегация тромбоцитов с АДФ (N-55-65%) 70,0± 9,6 60,8± 9,3 0,0001 70,6± 10,4 57,1± 17,1 0,0001

с ристомицином (Ы - 65-85%) 79,6± 10,1 71,3± 12,2 0,0001 79,8± 10,8 73,7± 9,8 0,0001

с адреналином (Ы - 55-65%) 73,9± 9,7 66,7± 11,1 0,0001 70,6± 14,8 58,4± 18,6 0,0001

Данные таблицы 12 свидетельствуют о статистически значимых различиях между показателями агрегации тромбоцитов с тремя индукторами

до и после заготовки тромбоцитов (р=0,0001). Показатели индуцированной агрегации тромбоцитов после ТЦФ в обеих подгруппах доноров оставались на нормальных значениях. На основании этого можно сделать предварительный вывод, что снижение тромбоцитов после интенсивного аппаратного ТЦФ существенно не изменяет их способности к агрегации.

Таким образом, анализ динамики агрегации тромбоцитов у доноров, показал более высокий исходный уровень агрегационной функции, с последующей нормализацией этих значений после процедуры ТЦФ. Отмеченное повышение скорости процесса агрегации тромбоцитов в среднем на 33% в ТК, наблюдаемое во 2-ом цикле ТЦФ, свидетельствует об активации клеток и является неблагоприятной тенденцией для функциональных свойств тромбоцитов. Эти данные послужили обоснованием для ограничения количества процедур ТЦФ при заготовке терапевтических доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови до 10 в год.

Исследование переносимости донорами интенсивного ТЦФ

Динамическое наблюдение за гемопоэзом доноров осуществляли при проведении донорского ТЦФ на сепараторах клеток крови с заготовкой двух - трех терапевтических доз тромбоцитов. Морфофункциональная оценка гемопоэза была проведена у 11 доноров тромбоцитов при выполнении 95 ТЦФ (табл.13).

Таблица 13. Динамика показателей гемограммы у доноров тромбоцитов.

Показатели гемограммы доноров тромбоцитов (М± а)

"ГЦФ Параметры явс НОВ нет РЬТ

№ 109/л 10,2/л г/дл % 109/л

4,0-9,0 4,0-5,0 13,0-16,0 40-48 180-320

До 7,1±0,8 4,6±0,4 14,5±0,5 40,6±2,5 261,7±45,1

I После 6,8±0,6 4,7±0,4 14,5±0,7 40,6±2,7 146,1±29,5

Через 1 нед 7,4±1,0 4,9±0,3 15,1±0,8 42,2±1,4 214,4±14,9

До 7,0±0,7 4,9±0,2 14,9±0,7 41,9±1,6 266,3±29,3

II После 6,7±0,5 5,0±0,2 14,9±0,5 42,8±1,3 154,8±26,2

Через 1 нед 7,1±0,7 5,0±0,3 14,9±1,0 42,6±2,6 170,3±27,8

До 6,6±0,6 4,9±0,3 14,1±1,0 41,0±2,2 253,6±31,2

III После 6,9±0,4 5,1±0,3 14,5±0,7 42,7±2,1 145,3±20,4

Через 1 нед 6,8±0,6 5,2±0,3 14,9±0,6 43,4±1,4 229,2±21,3

До 6,3±0,5 4,9±0,3 14,3±0,9 41,3±2,7 294,9±42,3

IV После 6,2±0,4 4,9±0.3 14,3±0,7 41,0±1,9 157,5±50,1

Через 1 нед 6,7±0,8 4,9±0,3 14,3±0,4 41,0±0,5 230,7±28,7

V До 5,5±0,4 5,1 ±0,2 14,4±0,3 42,3±1,5 272,1±39,5

После 5,9±0,4 5,0±0,2 14,4±0,5 41,9±1,9 141,6±42,0

Показатели гемограммы до и после ТЦФ, а так же спустя 1 неделю имели колебания в пределах нормальных значений без статистически

значимых различий (р>0,05), за исключением снижения количества тромбоцитов после ТЦФ (р< 0,01). Количество тромбоцитов у доноров снижалось до 149,6±30,2х109/л. Динамика тромбоцитов после заготовки больших доз тромбоцитов доказала восстановление их до нормального уровня через 1 неделю после ТЦФ, а исходного содержания - перед следующим ТЦФ.

Исследование цитометрических параметров тромбоцитов Изучение цитометрических параметров тромбоцитов проведено у 48 здоровых лиц, не являющихся донорами и у И доноров при проведении интенсивных ТЦФ (95 процедур), выполненных на различных сепараторах клеток крови (табл.14). Основными исследуемыми тромбоцитометрическими параметрами являлись: МРУ-средний объем тромбоцита (при ускорении тромбоцитопоэза средний объем тромбоцитов возрастает и «молодые» тромбоциты имеют больший объем); РСТ - тромбокрит, отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами; РО\У-коэффициснт вариации тромбоцитометрической кривой, количественно отражает гетерогенность популяции тромбоцитов по размерам (степень анизоцитоза тромбоцитов). Известно, что у здоровых людей средний объем тромбоцитов изменяется обратно пропорционально их количеству. При снижении количества тромбоцитов происходит возрастание среднего клеточного объема, что имеет компенсаторный характер.

Таблица 14. Динамика цитометрических параметров тромбоцитов у _ доноров по сравнению с контрольной группой.__

Доноры тромбоцитов 11=11 Цитометрические параметры тромбоцитов (М+ш)

РЬТ 103мм3 180-320 МРУ мкм0 8-9 Я РСТ % 0,15-0,40 РО\У % 12-20

Контрольная группа п=48 212,1+7,5 8,3+0,12 0,18+0,006 13,2510,16

до ТЦФ 265,6±4,9 8,0±0,10 0,1810,004 13,1110,21

после ТЦФ 149,6+3,2* 7,93+0,10 0,1210,003* 12,64+0,17*

через 1 неделю после ТЦФ 222,5±5,3 8,15±0,11 0,18+0,003 13,2710,20

* - значения, имеющие достоверные различия.

Отмечено достоверное снижение уровня тромбоцитов, тромбокрита и ширины тромбоцитометрической кривой у доноров сразу после ТЦФ. Различия этих показателей были достоверны и спустя 1 неделю после ТЦФ (1=2,4, р < 0,05). Средний объем тромбоцитов имел тенденцию к снижению, но различия средних были статистически недостоверны (табл.14).

Выявлена положительная линейная корреляция между средним клеточным объемом и шириной тромбоцитометрической кривой, которая в

контроле была слабой, но значительно возрастала у доноров при заготовке больших доз тромбоцитов.

Таким образом, отсутствие каких-либо различий между цитометрическими показателями до начала проведения всей серии исследований и после ее завершения свидетельствуют о безопасности процедуры ТЦФ для доноров при заготовке больших доз тромбоцитов на сепараторах крови.

Исследование уровня электролитов у доноров при проведении аппаратного ТЦФ

Полученные данные, представленные в таблице 15, показывают, что у доноров до проведения ТЦФ были отмечены нормальные значения уровня электролитов.

Таблица 15. Уровень электролитов при проведении ТЦФ у доноров

на сепараторах клеток крови. (М±т)

Исследуемые параметры ммоль/л Показатели электролитов при проведении ТЦФ

До ТЦФ После ТЦФ Через 1 неделю Р

Са2+- 1,05-1,34 1,145±0,01 0,924±0,03* 1,113±0,02 <0,05

К- 3,5 -5,5 4,38±0,05 4,35±0,11 4,62±0,12 >0,05

N3-130-159 147,1±0, 52 146,9±0, 47 147,9±0,69 >0,05

После завершения процедуры ТЦФ отмечено статистически значимое снижение ионизированного кальция на 18%, который в среднем составил 0,924±0,03 ммоль/л (р<0,05). При контрольном исследовании уровня ионизированного кальция через 1 неделю отмечено его восстановление до нормальных значений (1,113±0,02 ммоль/л). Тактика мониторирования ионизированного кальция при проведении ТЦФ, позволила избежать возникновения цитратных реакций у доноров и профилактировать усиление гипокальциемии назначением глюконата кальция. Изменения уровней калия и натрия после ТЦФ и спустя 1 неделю выявлено не было (табл.15).

Исследование коагуляционных показателей у доноров тромбоцитов Изучение динамики коагуляционных показателей после проведения первых пяти процедур ТЦФ (табл.16) и последующих 5 ТЦФ (во втором цикле) не выявила закономерных сдвигов ни в сторону активации системы гемостаза, ни в сторону гипокоагуляции. Полученные результаты близки к нормальным показателям.

Средние значения показателей гемостаза (АЧТВ, ПВ, фибриноген) в процессе ТЦФ имеют колебания в пределах нормальных величин, характерных для нормокоагуляции. Отмечено статистически значимое удлинение АЧТВ до 40,4±1,6 сек (р < 0,05) в 1-ом цикле и перед 4-ым ТЦФ по сравнению со 2-ым, 3-им и 5-ым ТЦФ, с укорочением до 36,1±2,4 сек спустя 1 неделю после ГЦФ.

Таблица 16. Динамика показателей гемостаза у доноров ТЦФ.

Исследуемые параметры (М±т)

АЧТВ, (N=35-45 сек) ПВ, (N=70-120%) Фибриноген, (N=1,8-4 г/л)

ТЦФ до после через 1 нед до после через I нед до после через 1 нед

1-ый 37,3± 38,0± 36,2± 94± 86±* 98,5± 1,8± 1,6±* 1,8±

1,0 1,7 1,7 2,7 2,2 3,2 0,1 0,09 ОД

2-ой 37,9± 38,9± 36,5± 98± 89±* 103± 1,7± 1,5±* 1,8±

1,3 4,0 3,0 2,7 2,6 7,7 0,08 0,08 0,1

3-ий 37,5± 37,4± 35,0± 97± 88±* 99± 1,6± 1,5± 1,7±

1,7 1,6 1,6 3,8 1,7 3,6 0,07 0,07 0,1

4-ый 40,4± 38,2± 39,9± 96+ 87±* 103± 1,8± 1,6±* 1,8±

1,6* 1,3 1,3* 3,9 3,9 2,2 0,1 0,1 0,1

5-ый 37,1± 37,5± 36,5± 95± 86±* 100± 1,8± 1,5±* 1,8±

1,4 1,8 1,7 0,5 1,9 4,7 0,1 0,1 0,1

* - значения, имеющие достоверные различия.

Для изучения изменений гемостаза в зависимости от показателя снижения содержания тромбоцитов при заготовке высоких доз ТК, была исследована кровь доноров в подгруппах: 1-я подгруппа - при количестве тромбоцитов у доноров после ТЦФ более 150х109/л и 2-я подгруппа - менее

150хю7л.

Таблица 17. Зависимость показателей гемостаза от снижения

тромбоцитов после заготовки высокодозных ТК.

Исследованные 1-я подгруппа 2-я подгруппа Р 1-2

параметры п=31 п=32

гемостаза до после Р до после Р

Фибриноген 1,8± 1,6± 0,001 1,8± 1,6± 0,001 >0,05

(N=2-4 г/л) 0,3 0,2 0,3 0,2

ПВ 97± 88,1± 0,0001 100± 91,6± 0,0001 >0,05

(N=70-120%) 9,0 7,2 9,0 9,9

АЧТВ 39,1± 39,3± 0,3 36,и 37,1± 0,0001 0,006

(N=35-45 сек) 3,9 3,6 4,4 4,0

Весь период наблюдения между подгруппами не отмечено статистически значимых различий по уровню фибриногена и ПВ (р>0,05). Выявлено изменение показателей АЧТВ, при этом у доноров 2-ой подгруппы отмечено укорочение АЧТВ по сравнению с 1-ой подгруппой, что может говорить о компенсаторном характере изменений в ответ на снижение количества тромбоцитов.

В результате изучения коагуляционных параметров при проведении интенсивного ТЦФ нежелательных изменений в системе гемостаза не выявлено. Таким образом, благодаря нормальным компенсаторным возможностям организма отобранных доноров достигнута удовлетворительная переносимость процедур. Вероятно это было

обеспечено оптимальным объемом вводимого нитратного раствора и оптимально подобранными соотношениями кровь : антикоагулянт.

Исследование белкового состава сыворотки крови доноров и соотношения классов иммуноглобулинов Динамическое наблюдение за злектрофоретическим спектром белков сыворотки крови доноров не выявило патологических изменений. Отмечено снижение уровня IgG с 137,8±5,8 до 127,0±7, 2 МЕ/мл у всех доноров после 5 последовательных процедур ТЦФ и незначительное повышение IgM с 172,3±10,6 до 184±9,5 МЕ/мл (р>0,05). Уровень альбумина и глобулинов сохранялся в пределах нормальных значений.

Таким образом, исследование переносимости заготовки больших доз тромбоцитов и влияния аппаратного интенсивного ТЦФ на доноров, не выявило отрицательного влияния на их здоровье. Процедуры ТЦФ хорошо переносились донорами и не сопровождались реакциями и осложнениями. Легкие проявления гипокальциемиии были быстро купированы введением кальция. Следует отметить, что большинство исследуемых параметров имели достаточно большую амплитуду колебаний, но все они находились в пределах нормальных показателей. Изъятие большого пула тромбоцитов при заготовке высокодозных ТК на сепараторах крови приводило к достоверному снижению тромбоцитов в крови доноров, однако это не вызывало значимых изменений ни в лромбоцитарном, ни в плазменном звене гемостаза, что свидетельствует о высоком гемостатическом потенциале и компенсаторных возможностях отобранных доноров.

ВЫВОДЫ

1. Показана безопасность и хорошая переносимость донорами заготовки больших терапевтических доз аферезных тромбоцитов в интенсивном режиме ТЦФ. Не выявлено отрицательного влияния высокодозных ТЦФ на показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, соотношения классов иммуноглобулинов, обмена железа и морфофункциональные характеристики тромбоцитов доноров.

2. Разработаны методические подходы проведения ТЦФ на сепараторах клеток крови (Cobe Spectra, Amicus, CS 3000 Plus, MCS+), позволившие увеличить заготовку доз тромбоцитов и стабильно (в 92% случаев) получать двойные (59%) и тройные (33%) терапевтические дозы тромбоцитов от одного донора за одну процедуру.

3. Определены дополнительные критерии отбора доноров тромбоцитов, обеспечивающие безопасную заготовку больших доз тромбоцигных концентратов: ОЦК не менее 5 л, исходное содержание тромбоцитов не менее 250х109/л при получении двойных терапевтических доз и не менее 290х105/л - при заготовке тройных терапевтических доз тромбоцитов.

4. Показано, что при заготовке высокодозных тромбоцишых концентратов, после ТЦФ происходит снижение тромбоцитов в среднем до 149,6±3,2х109/л. Редукция тромбоцитов менее 150x10% не

вызывала у доноров достоверных изменений в тромбоцитарном и коагуляционном звене гемостаза.

5. Установлена высокая эффективность сбора тромбоцитов на всех сепараторах клеток крови (в среднем 74%). Наибольший выход клеток в тромбоцитном концентрате от одного донора за одну процедуру получен при заготовке тромбоцитов на сепараторе Cobe Spectra - 15 единиц ТК (8,2±0,5х10'1 клеток).

6. Показано, что функциональная активность тромбоцитов, заготовленных в больших дозах, соответствовала нормальным значениям и исходным показателям доноров.

7. Морфологическая характеристика тромбоцитов в тромбоконцентратах, заготовленных в двойных и тройных терапевтических дозах, показала сохранность цитоархитектоники клеток. По данным сканирующей электронной микроскопии 70% тромбоцитов имели дискоидную форму, 27% переходную и только 3% тромбоцитов имели необратимые формы (сфероидные и с длинными отростками).

Практические рекомендации

1. При проведении ТЦФ в интенсивном режиме с заготовкой двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов необходима селекция доноров с формированием донорского пула для повторного привлечения к аппаратному ТЦФ.

2. Рекомендуемыми критериями отбора доноров для интенсивного ТЦФ являются: исходное количество тромбоцитов не менее 250><109/л для заготовки двойных терапевтических доз тромбоцитов, не менее 290x109/л для заготовки тройных терапевтических доз; ОЦК от 5 л, масса тела от 75 кг.

3. Для допуска донора к интенсивному ТЦФ рекомендуется дополнительное исследование коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза.

4. Предлагаемый алгоритм проведения интенсивного ТЦФ у селективных доноров состоит из проведения 5 ТЦФ с интервалом в 14 дней с последующим перерывом в 3 месяца, повторением цикла из 5 ТЦФ (до 10 ТЦФ в год).

5. Методические особенности заготовки высокодозных тромбоцитных концентратов заключаются: 1) в увеличении объема обрабатываемой крови в среднем до 1 ОЦК донора (5,5±0,6 л) на Cobe Spectra, Amicus, CS 3000 Plus; на MCS+ - 4,7±0,5 л (в среднем 11 циклов обработки крови); 2) оптимальной скорости эксфузируемой крови - 65-70 мл/мин.; 3) поэтапной коррекции соотношения кровь : антикоагулянт с 9:1 до 12:1, через каждый 1 литр перфузируемой крови.

6. Для проведения интенсивного ТЦФ целесообразно использование сепараторов 4 и 5 поколения с наиболее эффективными программами ТЦФ, эффективной лейкоредукцией, автоматической и индивидуальной подачей антикоагулянта, таких как Cobe Spectra и Amicus.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Петров М.М., Варламова C.B., Калинин H.H., Никитин И.К., Левина Т.Н., Орлова Г.К.. Семинишипа И.Т., Шумилова JI.J1. Качественный состав тромбоцитов: нерешенные вопросы и пути рационального использования. // Материалы конференции «Трансфузиология и служба крови», Москва. 1998, - с. 55.

2. Калинин H.H., Петров М.М, Варламова C.B. Влияние интенсивного тромбоцитафсреза с получением двойной лечебной дозы на организм донора. //Тезисы 7-ой конференции Московского общества гсмафсреза, Москва, 1999,-с. 86.

3. Калинин H.H., Петров М.М., Варламова C.B., Штырева Е.М. Получение концентрата тромбоцитов на сепараторах крови. // Материалы 2-ой Северной научно-практическая конференция «Актуальные проблемы эфферентной терапии», Северодвинск, 1999, - с. 10.

4. Варламова C.B., Петров М.М., Никитин И.К., Калинин H.H. и соавт. Возможность заготовки двойных доз компонентов крови. // Материалы 11-ой конференции Московского общества гемафереза, Москва. 2003, -с. 15.

5. Варламова C.B., Петров М.М., Кураева Ю.И. и соавт. Получение двух и более лечебных доз тромбоцитов. // Ж. «Проблемы гематологии и переливаиия крови». 2005. -№ 1,- с. 27. Материалы конференции «Новое в гематологии и клинической трапсфузиологии».

6. Варламова C.B., Петров М.М., Калинин H.H. и соавт. Получение терапевтических доз тромбоцитов на сепараторах крови. // Ж. «Гематология и трансфузиология», 2005. -№ 6, - с. 16-20.

7. Варламова C.B.. Петров М.М., Балакина Т.А., Калинин H.H. и соавт. Морфофункциональная оценка тромбоцитов, полученных на сепараторах клеток крови. // Ж. «Гематология и трансфузиология», 2006. -№ 6, -с. 24-30.

8. Варламова C.B., Петров М.М., Балакина Т.А., Маркова М.Л., Калинин H.H. и соавт. Заготовка и оценка качества лечебных доз тромбоцитов. // «Новое в гематологии и трапсфузиологии», 2006,- № 7,- с. 87- 90. Киев. Международный научно-практический рецензируемый сборник.

9. Варламова C.B., Петров М.М., Черкасова И.В. и соавт. Заготовка больших доз тромбоцитов на сепараторах крови. // Материалы 13-ой конференции Московского общества гемафереза. Москва, 2005. -с. 2930.

Ю.Варламова C.B.. Петров М.М., Калинин H.H., Балакина Т.А., Маркова МЛ., Сарычева Т.Г., Наумова И.Н. и соавт. Исследование переносимости донорами тромбоцитаферезов при заготовке больших доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови. // Материалы VI-ого съезда гематологов и трансфузиологов республики Беларусь, «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Минск. 2007. - с. 55.

П.Варламова C.B., Петров М.М., Балакина Т.А., Маркова МЛ., Сарычева Т.Г., Наумова И.Н., Шишканова З.Г, Шмаров Д.А., Козинец Г.И., Калинин H.H. Изучение влияния тромбоцитаферезов на организм доноров при заготовке больших доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови. // Материалы 15-ой научно-практической конференции МОГ, Москва, 2007, - с. 91- 92.

12.Варламова C.B., Петров М.М., Калинин H.H., Балакина Т.А., Маркова M.J1. и соавт. Аппаратный тромбоцитаферез - метод получения больших доз тромбоцитов. // Материалы научно-практической конференции, посвященной 75-летию Российского НИИ гематологии и трансфузиологии. Ж. «Трансфузиология», 2007, - с. 56.

П.Варламова C.B., Петров М.М., Левина A.A., Цибульская М.М., Мамукова Ю.И., Хорошко Н.Д., Калинин H.H. Исследование обмена железа у доноров тромбоцитов. // Материалы 16-ой научно-практической конференции МОГ, «Методы гемаферсза и квантовая терапия в клинической медицине», Москва, 2008, - с. 24.

Н.Варламова C.B., Петров М.М., Грозная Т.Г., Клочкова И.В., Калинин H.H. Изменение уровня электролитов у доноров при аппаратном тромбоцитаферезе. // Материалы 16-ой научно-практической конференции МОГ, «Методы гемафереза и квантовая терапия в клинической медицине», Москва, 2008, - с. 25.

Список сокращений

АДФ аденозин дифосфат

АЧТВ активированное частичное тромбопластиновое время

ОЦК объем циркулирующей крови

ПВ протромбиновое время

СЭМ сканирующий электронный микроскоп

тк тромбоцитный концентрат

ТЦФ тромбоцитаферез

ЦИК циркулирующие иммунные комплексы

Подписано в печать:

16.12.2008

Заказ № 1386 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wvvw.autoreferat.ru

Актуальность проблемы.

Постоянно возрастающая потребность в безопасных и эффективных компонентах крови при лечении онкогематологических больных — характерная черта современной гематологической клиники. Лечение больных с заболеваниями системы крови невозможно без гемокомпонентной терапии, особая роль в которой отводится тромбоцитам (6, 27). Трансфузии тромбоцитов, как средство заместительной терапии, являются в настоящее время общепринятым методом профилактики и лечения геморрагического синдрома при тромбоцитопении (1,8, 22). Для предупреждения спонтанной или приобретенной кровоточивости трансфузии тромбоцитов необходимы при проведении химио- и лучевой терапии, при трансплантации костного мозга и гемопоэтических клеток крови (2), при лечении больных с апластическим синдромом (92), а так же при различного рода тромбоцитопатиях (9, 36). Для успешного лечения гематологических больных особенно актуальным становится их обеспечение достаточным количеством тромбоцитных концентратов (ТК).

В последние годы актуальность приобретает проблема получения лечебных доз тромбоцитов от минимального числа доноров. Это связано с целым рядом причин, к которым можно отнести сохраняющийся кризис донорских кадров, увеличение передачи гемотрансмиссивных инфекций (ГТИ) при использовании тромбоцитов, заготовленных от многих доноров.

Это приводит к необходимости более тщательной селекции доноров, максимального и эффективного использования кадровых доноров с повторным привлечением к ТЦФ и увеличением кратности процедур. Важной проблемой в трансфузионной тактике остается предупреждение рефрактерности к тромбоцитам, вызванной иммунным компонентом, в частности, антителами против антигенов тромбоцитов (система HP А) и лейкоцитов (система HLA) (32, 84). Все это требует поиска новых методических подходов для получения оптимальных количеств тромбоцитов от одного донора за одну процедуру.

В настоящее время получение ТК в терапевтических дозах от одного донора возможно только с использованием аферезной технологии на сепараторах клеток крови. Поэтому в большинстве высокоразвитых стран безусловное предпочтение отдается методам заготовки аферезных ТК.

Существенные преимущества ТК, заготовленных на сепараторах клеток крови, состоят в возможности получения от одного донора до 2-х и 3-х лечебных доз тромбоцитов. При этом хранение тромбоцитов до 5 дней и при необходимости разделение двойной дозы ТК на два контейнера, создают возможность для пролонгированной трансфузионной поддержки больного с осуществлением принципа - «один донор — один реципиент» (18). Кроме того, аферезные тромбоциты содержат минимальную примесь лейкоцитов в ТК, при которой не требуется дополнительная фильтрация; обладают повышенной приживаемостью (106), меньшей бактериальной контаминацией по сравнению с тромбоцитами, заготовленными другими методами (296). Все это позволяет повысить эффективность и безопасность трансфузионной терапии тромбоцитами, снизить частоту аллоиммунизации больных, уменьшить посттрансфузионные осложнения (23, 24).

Тактика получения максимально эффективной и безопасной дозы тромбоцитов от одного донора соответствует современным клиническим требованиям и имеет экономические преимущества, так как сокращает потребность в донорах, повышает эффективность использования оборудования и приводит к уменьшению затрат на трансфузиологическое обеспечение больных (45, 94, 95).

В настоящее время нет регламентирующих документов для проведения аппаратного ТЦФ, единых методических подходов и критериев для безопасного проведения интенсивного ТЦФ в оптимальных режимах, позволяющих стабильно получать высокодозные ТК на сепараторах клеток крови.

Таким образом, актуальность работы обусловлена необходимостью разработки методических подходов проведения ТЦФ и критериев отбора доноров для заготовки больших доз тромбоцитов (двойных и тройных терапевтических доз) на сепараторах клеток крови. Цель работы:

Повысить эффективность аппаратного ТЦФ и изучить влияние интенсивных ТЦФ на организм донора.

Задачи исследования:

1. Разработать методические подходы проведения ТЦФ по заготовке двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови.

2. Обосновать критерии отбора доноров, обеспечивающих безопасное проведение ТЦФ при получении двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов.

3. Провести сравнительный анализ эффективности сбора тромбоцитов на различных сепараторах клеток крови (Cobe Spectra, CS 3000 Plus, Amicus, MCS+).

4. Изучить морфофункциональные свойства заготовленных тромбоцитных концентратов.

5. Изучить переносимость донорами процедур интенсивного ТЦФ. Научная новизна.

Впервые изучено влияние интенсивного аппаратного ТЦФ у доноров на основанные показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, иммуноглобулинов, обмена железа. На основании полученных данных разработаны безопасные режимы интенсивного ТЦФ при заготовке двух и трех терапевтических доз тромбоцитов.

Предложенная технология получения высокодозных ТК, позволила повысить заготовку аферезных тромбоцитов и стабильно (в 92% случаев) получать двойные (59%) и тройные (33%) терапевтические дозы.

Впервые дана морфофункциональная оценка ТК, заготовленных в больших терапевтических дозах. Показано, что морфофункциональные характеристики тромбоцитов, заготовленных в больших дозах, соответствовали нормальным значениям и исходным параметрам донора.

Сделан сравнительный анализ ТЦФ при заготовке ТК в больших терапевтических дозах на 4-х сепараторах клеток крови (Cobe Spectra, Amicus, CS 3000 Plus, MCS+) по выходу тромбоцитов, эффективности сбора, основным параметрам ТЦФ. Полученные результаты показали высокую эффективность сбора тромбоцитов на всех аппаратах (74%). Вместе стем, больший выход клеток в ТК от одного донора за одну процедуру при проведении интенсивного ТЦФ отмечен на сепараторе Cobe Spectra (15 единиц ТК).

Научно-практическая ценность работы.

На основании полученных результатов показана безопасность и хорошая переносимость заготовки у доноров больших терапевтических доз аферезных тромбоцитов в интенсивном режиме ТЦФ.

Обосновано применение методических подходов, включающих введение критериев отбора доноров (исходное содержание тромбоцитов не менее 250x109/л, ОЦК не менее 5 л) и увеличение объема обработанной крови в среднем до 5,5±0,6 л при проведении аппаратного ТЦФ. Разработанные технологические особенности проведения ТЦФ дают возможность заготавливать более 600x109 тромбоцитов (двойную и тройную терапевтическую дозу) от одного донора за одну процедуру.

Полученные результаты будут способствовать более широкому внедрению метода интенсивного аппаратного ТЦФ в практику учреждений службы крови, что позволит повысить эффективность метода аппаратного ТЦФ, минимизировать количество доноров при заготовке ТК для реципиентов, нуждающихся в многократных трансфузиях. Заместительная терапия ТК, заготовлеными в режиме интенсивного ТЦФ в больших дозах от одного донора, поможет уменьшить риск передачи гемотрансмиссивных инфекций и посттрансфузионных осложнений. Внедрение в практику.

Метод получения двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов внедрен в отделении экстракорпорального очищения крови и отделении заготовки компонентов крови ГНЦ РАМН.

Результаты исследования используются в программе подготовки врачей по «Клинической трансфузиологии». Положения, выносимые на защиту.

1. Заготовка двух и трех лечебных доз аферезных тромбоцитов в интенсивном режиме ТЦФ не оказывает отрицательного воздействия на организм донора.

2. Технологические особенности ТЦФ при заготовке двойных и тройных доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови заключаются в увеличении объема обрабатываемой крови в среднем до одного ОЦК донора, без значительного увеличения времени процедуры и объема вводимого антикоагулянта.

3. Минимально допустимым исходным содержанием тромбоцитов у доноров для получения двойных терапевтических доз установлено 250x10%; для заготовки тройных терапевтических доз тромбоцитов -290x109/л.

4. Уменьшение тромбоцитов после ТЦФ при заготовке высокодозных тромбоцитных концентратов в среднем до 149,6±3,2х 109/л является хорошим прогностическим признаком резервных и функциональных возможностей тромбоцитопоэза донора. Снижение тромбоцитов после ТЦФ менее 150х109/л не вызывает изменений в плазменно-тромбоцитарном звене гемостаза.

5. Высокая эффективность сбора двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов показана на всех сепараторах клеток крови.

6. Морфофункциональные характеристики тромбоцитов, заготовленных в больших дозах, соответствовали нормальным значениям и исходным показателям доноров. Апробация диссертации.

Апробация работы состоялась 11 сентября 2008г. на заседании проблемной комиссии ГНЦ РАМН «Проблемы донорства, производства и контроля качества компонентов и препаратов крови».

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на ежегодных конференциях Московского общества гемафереза в 2004 и 2005г.; на симпозиуме Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития «Безопасность переливания компонентов крови» (Москва, 2006г.); на съезде гематологов и трансфузиологов, посвященному 80-летию ЦОЛИПК (Москва, 2006г.); на VI съезде гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Минск, 2007г.); на научно-практических конференциях «Проблемы клинической трансфузиологии» (Москва, ГНЦ РАМН, 2007 и 2008 гг.). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 работ в отечественных и зарубежных изданиях, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 166 страницах печатного текста, иллюстрирована 30 таблицами, 31 рисунком, 3 диаграммами. Работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 304 источника, из них - 100 отечественных и 204 зарубежных.

выводы

1. Показана безопасность и хорошая переносимость донорами заготовки больших терапевтических доз аферезных тромбоцитов в интенсивном режиме ТЦФ. Не выявлено отрицательного влияния высокодозных ТЦФ на показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, соотношения классов иммуноглобулинов, обмена железа и морфофункциональные характеристики тромбоцитов доноров.

2. Разработаны методические подходы проведения тромбоцитафереза на сепараторах клеток крови (Cobe Spectra, Amicus, CS 3000 Plus, MCS+), позволившие увеличить заготовку доз тромбоцитов и стабильно (в 92% случаев) получать двойные (59%) и тройные (33%) терапевтические дозы тромбоцитов от одного донора за одну процедуру.

3. Определены дополнительные критерии отбора доноров тромбоцитов, обеспечивающие безопасную заготовку больших доз тромбоцитных концентратов: ОЦК не менее 5л, исходное содержание тромбоцитов не менее 250x109/л при получении двойных терапевтических доз и не менее 290x109/л — при заготовке тройных терапевтических доз тромбоцитов.

4. Показано, что при заготовке высокодозных тромбоцитных концентратов, после тромбоцитафереза происходит снижение тромбоцитов в среднем до 149,6±3,2хЮ9/л. Редукция тромбоцитов менее 150х109/л не вызывает у доноров достоверных изменений в тромбоцитарном и коа1уляционном звене гемостаза.

5. Установлена высокая эффективность сбора тромбоцитов на всех сепараторах клеток крови (в среднем 74%). Наибольший выход клеток в тромбоцитном концентрате от одного донора за одну процедуру получен при заготовке тромбоцитов на сепараторе Cobe Spectra - 15 единиц ТК (8,2±0,5х10п клеток).

6. Показано, что функциональная активность тромбоцитов, заготовленных в больших дозах, соответствовала нормальным значениям и исходным показателям доноров.

7. Морфологическая характеристика тромбоцитов в тромбоконцентратах, заготовленных в двойных и тройных терапевтических дозах, показала сохранность цитоархитектоники клеток. По данным сканирующей электронной микроскопии 70% тромбоциты имели дискоидную форму, 27% переходную и только 3% тромбоцитов имели необратимые формы (сфероидные и с длинными отростками).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении ТЦФ в интенсивном режиме с заготовкой двойных и тройных терапевтических доз тромбоцитов необходима селекция доноров с формированием донорского пула для повторного привлечения к аппаратному ТЦФ.

Рекомендуемыми критериями отбора доноров для интенсивного ТЦФ являются: исходное количество тромбоцитов не менее 250x109/л для заготовки двойных терапевтических доз тромбоцитов, не менее 290x109/л для заготовки тройных терапевтических доз; ОЦК > 5л, масса тела > 75 кг.

2. Для допуска донора к интенсивному ТЦФ рекомендуется дополнительное исследование коагулограммы с агрегацией тромбоцитов.

3. Предлагаемый алгоритм проведения интенсивного ТЦФ у селективных доноров состоит из проведения 5 ТЦФ с интервалом в 14 дней с последующим перерывом в 3 месяца, повторением цикла из 5 ТЦФ (до 10 ТЦФ в год).

4. Методические особенности повышения эффективности заготовки терапевтических доз тромбоцитов на сепараторах клеток крови заключаются: 1) в увеличении объема обрабатываемой крови в среднем до 1 ОЦК донора (5,5±0,6 л) на сепараторах Cobe Spectra, Amicus, CS 3000 Plus; на MCS+ - 4,7±0,5 л (в среднем 11 циклов обработки крови);

2) оптимальной скорости эксфузируемой крови — 65-70 мл/мин.;

3) поэтапной коррекции соотношения кровь : антикоагулянт с 9:1 до 12:1, через каждый 1 литр перфузируемой крови.

5. Для проведения интенсивного ТЦФ целесообразно использование сепараторов 4 и 5 поколения с наиболее эффективными программами ТЦФ, эффективной лейкоредукцией, автоматической и индивидуальной подачей антикоагулянта, таких как Cobe Spectra и Amicus.