Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Динамическое исследование тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов

На правах рукописи

Уфимцева Виктория Юрьевна

ДИНАМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРОМБОЦИТОПОЭЗА У ДОНОРОВ ТРОМБОЦИТОВ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 1 НОЯ 2012

Москва 2012

005054246

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

доктор медицинских наук, профессор Погорелов Валерий Михайлович

Васильев Сергей Александрович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Гематологический Научный Центр» Минздравсоцразвития России, заведующий научно-клинической лабораторией клинической коагулологии

Русанов Валентин Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, Лауреат государственной премии СССР, ГБУ Станция переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы, заместитель главного врача по производству

Ведущее учреждение:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный московский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится « »_2012 г. в_часов _минут на заседании

диссертационного совета Д.208.135.01 при ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России, по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, дом 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Зыбунова Елена Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

С 1960-х годов в России внедряется трансфузионная доктрина использования не столько цельной консервированной донорской крови, сколько ее дериватов, т.е. компонентов и препаратов крови, дефицитных при заболеваниях человека: эритроцитной, тромбоцитной, лейкоцитной масс, плазмы или белковых фракций [В.М. Городецкий, 2000]. Нередко для лечения одного пациента нужны трансфузионные среды от нескольких доноров. Поэтому донорство крови и ее компонентов — вопрос национальной безопасности и сохранения здоровья общества.

Уровень участия населения в донорском движении — это универсальный социальный индикатор развития общества и значимости в нем человеческих ценностей. Необходимо помнить о том, что развитие идей донорства будет способствовать укреплению гуманизма и взаимопонимания в нашем обществе [Г.И.Козинец, 2005]. Главным остается донорство, а в нем — добрая воля человека, готового поделиться своей кровью. Вопрос сохранения и увеличения донорских кадров является ключевым.

"Взятие от донора крови и ее компонентов допустимо только при условии, если здоровью донора не будет причинен вред" [Закон Российской федерации «О донорстве крови и ее компонентов» № 5142, 1993]. Особенно актуальным это требование становится при заготовке компонентов с малым сроком хранения, в частности, тромбоцитных концентратов (ТК). Получить монодорский ТК, - высококачественный продукт, с максимальной концентрацией тромбоцитов и с минимальной контаминацией лейкоцитами и эритроцитами - можно или на рефрижераторных центрифугах 3-х кратным тромбоцитафезом (ТЦА) в строенные пластикатные закрытые контейнеры или посредством аппаратного афереза, когда при помощи сепаратора крови от одного донора заготавливается в среднем 8 доз ТК. Оптимизация режимов донорского ТЦА с получением высокодозных ТК с одной стороны способствует улучшению трансфузиологического обеспечения больных, с другой - создает условия для воплощения принципа "один донор — один реципиент", т.е. становится основой уменьшения риска аллосенсибилизации и передачи гемотрансмиссивных инфекций [А.И.Воробьев, 2003]. Поэтому приоритетным становится использование методов автоматического (аппаратного) афереза, которые позволяют получать терапевтические дозы компонента в закрытой (замкнутой) системе от одного донора [H.H. Калинин, 1986; JI M. Фрегатова, 2006]. Вместе с тем, данные о влиянии процедур ТЦА, особенно с использованием сепараторов клеток крови, на здоровье доноров продолжают быть противоречивыми. Эффекты ТЦА на тромбоцитопоэз в костном мозге доноров не изучены. Даже при убедительном доказательстве отсутствия отрицательного влияния интенсивного ТЦА на основные показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, иммуноглобулинов и обмена железа [C.B. Варламова, 2008], детальная оценка эффективности тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов все еще остается необходимой. Самое первостепенное, это определение исходного уровня и морфофункциональных

параметров тромбоцитов в крови донора перед донацией. Обычный набор лабораторных параметров в этом отношении недостаточен.

Тромбоциты периферической крови являются производными полиплоидных мегакариоцитов костного мозга. Они, как и эритроциты, - уникальный пример предельной специализации клетки, функционирующей в отсутствии ядра [В.М. Погорелов и соавт., 2011]. Тромбоциты выполняют ангиотрофическую и адгезивно-агрегационную функции, участвуют в процессах свертывания и фибринолиза, обеспечивают ретракцию кровяного сгустка, способны переносить на своей мембране циркулирующие иммунные комплексы и поддерживать спазм сосудов. Дисковидные по форме эти клетки имеют диаметр от 2 до 5 мкм, а их толщина колеблется от 0,5 до 0,75 мкм. Разнообразие циркулирующих в периферической крови тромбоцитов определяется скоростью продукции, оборота, активации и удаления этих клеток [Javela, 2006]. Среди них принято выделять пять морфологических групп [Г.И. Козинец и соавт., 2006]: юные с диаметром 5-5,5 мкм (3,2%), зрелые - 1,5-3 мкм (87%), старые - 0,5-15 мкм (4,5%), макроформы - > 5 мкм (2,8%) и формы раздражения (2,5%). Интересно, что юные, незрелые тромбоциты гемостатически более активны, инициируют образование тромба, уменьшаясь в числе на дальнейших стадиях его формирования [Thattaliyath et al., 2005].

Связь активации костномозгового тромбоцитопоэза с увеличением количества незрелых тромбоцитов в периферической крови подтверждается и в клинике, и в эксперименте [Rinder et al., 1993; Robinson et al., 1998; Hanahachi et al., 2001; Smith et al., 2002; Wang et al., 2002; Okamura et. al., 2003; Michimoto et. al., 2004]. Считается, что, отражая реакцию костного мозга на запрос организма, увеличение объема фракции незрелых тромбоцитов является ранним индикатором потребления кровяных пластинок [Briggs et al., 2004]. Можно предположить, что реализация резервов тромбоцитопоэза за счет незрелых тромбоцитов представляет своего рода адаптацию, которая в случае необходимости компенсирует потребленные или разрушенные тромбоциты. Поэтому большинство исследователей в настоящее время к тромбопоэтическим индексам, наряду с концентрацией тромбопоэтина, относят параметр «Фракция незрелых тромбоцитов», по которому можно судить о состоянии тромбоцитопоэза [Л И. Бурячковская, 2007; Consolini et al., 2001; Butkiewiez et al., 2006].

Современные гематологические анализаторы, обеспечивая воспроизводимость всех известных тромбоцитарных параметров, на базе избирательной окраски РНК и проточной цитофлуориметрии оценивают еще и фракцию незрелых тромбоцитов. Эти клетки содержат РНК и окрашиваются флуорохромами. В частности, объем фракции незрелых тромбоцитов (IPF) на анализаторе "Sysmex ХЕ-2100" (Sysmex, Kobe, Japan) определяется по специальной программе «IPF Master». Параметр выражается как % от общего количества тромбоцитов (IPF,%), так и в абсолютных значениях (IPFxlO'/л). На основании анализа фракции незрелых тромбоцитов при относительной тромбоцитопении после ТЦА Stohlawetz et al. (1998) пришли к выводу о возможности мониторинга тромбопоэтической активности костного мозга у кадровых доноров тромбоцитов.

Следует учесть также, что незрелые тромбоциты - крупные клетки. Интересно, что крупные тромбоциты отличаются от остальных большим содержанием полисахаридов [В.М Погорелов и соавт., 2012]. В этой связи тест на гликоген, то есть результаты микроскопии продукта Periodic Acid-Schiff (PAS) цитохимической реакции может дополнить параметр IPF при оценке степени зрелости тромбоцитов.

Таким образом, современная оценка морфофункциональных характеристик тромбоцитов периферической крови доноров актуальна и позволяет получить адекватную информацию о влиянии тромбоцитафереза на тромбоцитопоэз.

Цель исследования - оценить содержание незрелых тромбоцитов как индикаторов активности тромбоцитопоэза в периферической крови доноров до и после процедур тромбоцитафереза.

Задачи исследования:

1. Определить влияние процедур тромбоцитафереза на количество тромбоцитов, циркулирующих в крови доноров.

2. Провести анализ содержания незрелых тромбоцитов в периферической крови первичных и кадровых доноров до и после проведения процедур Зх-кратного и аппаратного тромбоцитафереза.

3. Определить эффективность идентификации незрелых тромбоцитов с помощью проточной цитофлуориметрии и посредством PAS-цитохимической реакции на полисахариды.

4. Уточнить характер взаимосвязи между количеством незрелых тромбоцитов в периферической крови первичных и кадровых доноров и показателями индуцированной агрегации тромбоцитов до и после процедур тромбоцитафереза.

Научная новизна

Впервые по совокупности морфоцитохимических характеристик тромбоцитов периферической крови практически здоровых людей (доноров тромбоцитов), изучены реакции организма на процедуры тромбоцитафереза. На основании чего дана оценка влияний тромбоцитафереза и определена эффективность использования параметра «фракция незрелых тромбоцитов» при анализе тромбоцитопоэза у доноров.

Научно-практическая ценность работы

Установленный в диссертации факт того, что происходящая у первичных доноров адаптация тромбоцитопоэза, закрепляется у кадровых доноров и в течение двух недель «отдыха донора» надежно компенсирует потребности организма в тромбоцитах, служит базой оптимизации режимов донорского тромбоцитафереза с получением тромбоцитных концентратов.

Положения, выносимые па защиту:

1. Относительная тромбоцитопения после тромбоцитафереза как у первичных, так и у кадровых доноров функционально компенсируется незрелыми тромбоцитами.

2. Повышенные значения параметра "Фракция незрелых тромбоцитов" можно рассматривать как результат регенераторного ответа организма доноров на процедуру тромбоцитафереза.

3. Как цитофлуорометрия, так и анализ микроскопических изображений незрелых тромбоцитов (РАБ-реакция) демонстрируют адаптированность доноров к донации тромбоцитов по установленным в России нормативам.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ "Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)" 21.05.2012г.

Материалы работы представлены на IV научно-практической конференции с международным участием «Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи» (Москва, 29-30 марта 2010г.), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 13-14 мая 2010г.), научно-практической конференции «Проблемы заместительной терапии концентратами тромбоцитов» (Москва, 19 октября 2010г.), конгрессе гематологов России (Москва, 2-4- июля 2012г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 1 в зарубежном издании, из них 10 в рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 25 рисунков и 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 125 источников, 51 из них - отечественных авторов и 74- зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Всего под наблюдением находилось 276 практически здоровых мужчин, включая обследованных на стадии селекции доноров (контроль, п = 87) в возрасте от 18 до 60 лет (медиана возраста 26 лет) и доноров (п = 189). Доноры были разделены на три группы. В первую группу

вошли первичные доноры (п= 24) в возрасте от 18 до 52 лет (медиана возраста 22,5 года), из лейкоцитарно-тромбоцитарного слоя (ЛТС) периферической крови которых, впервые (в анамнезе одна кроводача), посредством поэтапного фракционирования трех доз крови с использованием центрифуги Sorvall RS ЗС (USA) получались пулированные монодонорские ТК; во вторую -кадровые доноры (п= 44) в возрасте от 20 до 51 года (медиана возраста 23 года), аналогичный ТЦА которым проводился регулярно в среднем от 2 до 5 лет; в третью - кадровые доноры (п=121) в возрасте от 20 до 51 года (медиана возраста 27 лет), ТЦА которым в течение 2-3 лет выполнялся преимущественно на сепараторе крови MCS+ "Haemonetics" (USA).

В двух первых группах доноров ТЦА в среднем продолжался 80 мин., обрабатывалось 2052 мл крови, а объем ТК колебался от 150 до 250 мл (4 дозы); при прерывисто-поточной сепарации крови продолжительностью 90-100 мин. (группа 3), объем обработанной крови составил 3100 - 3900 мл, а объем ТК - около 400 мл (8 доз). Повторные ТЦА проводились с интервалами в среднем в две недели.

Процедуры ТЦА выполнялись в «Отделе заготовки крови и ее компонентов» ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ. Медицинское освидетельствование в соответствии с действующим приказом Минздрава РФ от 14.09.2001 № 364 «Об утверждении Порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов» проводил врач Отдела. К основным критериям отбора доноров для проведения ТЦА относились: исходное содержание тромбоцитов в периферической крови не менее 210х103/мкл и объем циркулирующей крови (ОЦК), равный 5335 мл. ОЦК вычислялся по формуле: 70 мл х кг массы тела.

Зх-кратный тромбоцитаферез выполнялся в соответствии с Инструкцией по заготовке тромбоцитов от одного донора методом прерывистого тромбоцитафереза с применением полимерных контейнеров, утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации 29 мая 1995 года и Приказом Минздрава РФ от 23.09.2002 № 295 «Об утверждении «Инструкции по проведению донорского прерывистого плазмафереза». Процедура включала в себя взятие у донора крови, возврат ему аутоэритроцитов и аутоплазмы. Соответствующим образом для последовательного использования готовились три контейнера, заполнялась система для внутривенного введения стерильного изотонического раствора 0,9% хлорида натрия. Контейнеры маркировались, забор крови осуществлялся после венопункции кубитальной вены, а по его окончанию, отступя 4-5 см от канюли находящейся в вене иглы, шланг зажимался двумя зажимами и разрезался стерильными ножницами. Подключалась система с 0,9% раствором хлорида натрия и с плеча донора снимался жгут. Полимерный контейнер с кровью помещался в центрифужный стакан, уравновешивался и кровь центрифугировалась (1800 об/мин, 10 мин., 21°С), после чего контейнер осторожно, чтобы не нарушить границы между фазами эритроцитов и плазмы, переносился в плазмаэкстрактор. Зажим снимался с трубки, соединяющей большой и малый контейнеры, после чего плазма и лейкоцитарно-тромбоцитарный слой (ЛТС) начинали поступать малые контейнеры (Рис. 1).

Рис. 1. Фракционирование обогащенной тромбоцитами плазмы и лейкоцитарно-тромбоцитарного слоя из контейнера с кровью донора:

• а - контейнер после центрифугирования (1800 об/мин, 10 мин,

• б - контейнер с плазмой,

• в - контейнер с лейкоцитарно-тромбоцитарным слоем.

Как только обогащенная тромбоцитами плазма полностью перемещалась в малый контейнер, оба контейнера разделялись и герметизировались. В контейнер с эритроцитами вводилось 50 мл изотонического раствора 0,9% хлорида натрия и после проверки его маркировки аутоэритроциты использовались для реинфузии донору. Контейнер с ЛТС опускался в центрифужный стакан, уравновешивался и подвергался повторному центрифугированию при 800 об/мин (10 мин,

21°С). После окончания центрифугирования контейнер осторожно переносился в плазмоэкстрактор, к нему присоединялись полимерные емкости контейнера «Компопласт-300» (Рис. 2), которые затем разделялись и герметизировались.

Рис. 2. Фракционирование лейкоцитарно-тромбоцитарного слоя после повторного центрифугирования (800 об/мин, 10 мин,

Описанная методика позволяет из 500 мл консервированной крови в результате двухэтапного центрифугирования получить в среднем одну дозу ТК. Следующий этап прерывистого ТЦА начинался с взятия следующей дозы крови донора, причем только после возврата ему не менее половины объема аутоэритроцитов. Присоединение второго полимерного контейнера

производилось к трубке на канюле, находившейся в вене донора. Затем повторялись все описанные выше этапы получения ТК.

За три цикла донору реинфузировались три дозы аутоэритроцитов и две дозы обедненной тромбоцитами плазмы, в то время как последняя доза плазмы замораживалась и использовалась в качестве дозы свежезамороженной плазмы (СЗП). Все три дозы ТК объединялись с помощью одноразового стерильного коннектора в первом, наиболее богатом тромбоцитами контейнере.

Аппаратный тромбоцнтаферез проводился на сепараторах крови "Haemonetics MCS+" (USA) согласно руководству по их использованию и технической эксплуатации (Рис. 3).

Рис. 3. Процедура аппаратного тромбоцитафереза на непрерывно-поточном сепараторе крови фирмы "Haemanetics MCS+" (USA).

Заготовка тромбоцитов в этом случае выполнялась одноигольным доступом, методом прерывисто-поточного фракционирования, при котором поступление крови с антикоагулянтом (ACD, рН= 5,0: лимонная кислота - 0,8 г, глюкоза - 2,45 г., трехзамещенный цитрат натрия - 2,2 г., дистиллированная вода для инъекций - до 100 мл) в колокол Латхмана для сепарации чередуется с возвратом обработанной крови донору. Плазма собирается в отдельном контейнере и после того, как наберется ее большой объем, а лейкоцитарно-тромбоцитарный слой зарегистрируется оптическим датчиков, она рециркулируется в колокол, где тромбоциты, наиболее легкие клетки, вымываются, а остальные клетки по завершению цикла возвращаются донору. За один цикл сепарации в колоколе накапливается около 40 мл ТК (1 доза).

Проточная цитомстрия. С целью определения тромбоцитарных параметров венозная кровь (7 мл) доноров в вакутейнерах с К3 ЭДТА автоматически анализировалась на приборе "Sysmex ХЕ-2100" (Sysmex, Cobe, Japan) в режиме «CBC+Ret». Тромбоцитарные параметры в пробах крови при Зх-кратном ТЦА регистрировались перед набором каждого из трех контейнеров, а при прерывисто-поточном фракционировании - в начале и по окончанию процедуры.

Автоматический гематологический анализатор "Sysmex ХЕ-2100" проводит исследование тромбоцитов несколькими методами [Inoue, 1999]. Во-первых, (Рис. 4; PTL-O) оптический метод (проточная цитометрия), реализующий прямое светорассеяние (объемы частиц) и флуоресценцию

окрашенных флуорохромами структур (РНК, ДНК) в определенной длине волны (боковое светорассеяние). Именно по интенсивности флуоресценции в излучении полупроводникового

Рис. 4. Принципы цитометрии: концепция Sysmex (Inoue, 1999):

PTL-0 - оптический и PTL-1 - кондуктометрический методы анализа тромбоцитов.

лазера (>.= 633 нм) связанного с РНК полиметинового красителя по специальной программе «IPF Master» оцениваются фракция незрелых тромбоцитов. Параметр выражается как % от общего количества тромбоцитов (IPF,%), так и в абсолютных значениях (IPFxl09/L). Воспроизводимость метода (CV, %) регистрации IPF при повторном анализе 40 проб крови практически здоровых людей колеблется от 8% до 18% в зависимости от величины параметра [Jung et al., 2010]. Во-вторых (Рис. 4, PTL-I), кондуктометрический метод (апертуро-импедансный), подсчета числа и определения характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое событие, - прохождение клеток через апертуру - сопровождается появлением электрического импульса. Разделение происходит по измерению амплитуды электрического сигнала. Тромбоциты (небольшие по размеру клетки) генерируют электрические импульсы низкой амплитуды (в сравнении с эритроцитами). Данный метод позволяет определять объемные параметры тромбоцитов и в их числе: MPV (средний объем тромбоцитов, фл), PDW (относительная ширина распределения тромбоцитов по объему, фл), P-LCR (% тромбоцитов, по объему превышающих 12 фл).

Анализ клеточного изображения. Дополнительно микроскопические изображения тромбоцитов из мазков тех же проб крови, что и для гематологического анализатора, оценивались на отечественном анализаторе клеточного изображения «АСПЕК» после проведения Periodic Acid-Schiff (PAS) цитохимической реакции на гликоген (Рис. 5). Результаты сравнивались со значениями параметра IPF, %, определенными на гематологическом анализаторе Sysmex ХЕ 2100 (Sysmex, Kobe, Japan).

Рис. 5. Анализ микроскопических изображений клеток на приборе «АСПЕК»:

а) РАв-негативные тромбоциты; Ь) РАБ-позитивные (незрелые) тромбоциты.

Примечание: Изображение нейтрофила представлено для контроля качества РАв-цитохимической реакции.

Мазки венозной крови 40 доноров окрашивались с использованием реагентов и протокола РАЭ-реакции (МасМапиэ, 1946), рекомендованных НПФ «Абрис+» (Санкт-Петербург). Доноры были разделены на три группы: 21 человек отобраны из числа обследованных на стадии селекции, 9 - первичные доноры, которым проводился 3-кратный ТЦА и 10 - кадровые доноры с ТЦА на сепараторе крови МСв+ "Наетопейсз" каждые 14 дней в течение 2-3 лет.

РА5-реакция. Тонкие и высушенные на воздухе мазки крови в течение 10 мин. фиксировались 10% этиловым спиртом на формалине, промывались (10 сек.) дистиллированной водой, на 10 мин. погружались в 1% раствор йодной кислоты, вновь промывались дистиллированной водой (10 сек.), промокались фильтровальной бумагой, на 30 мин. помещались в охлажденный до 4°С реактив Шиффа, 5 мин. промывались проточной водой, в течение 15 мин докрашивались гематоксилином Майера и окончательно промывались водопроводной водой. Гранулы гликогена окрашивались в темно красный цвет (Рис. 6).

Рис. 6. Гранулы гликогена в тромбоцитах периферической крови доноров. Стрелкой отмечена РАБ-положительная клетка.

Компьютерная морфометрия. Случайные выборки изображений окрашенных тромбоцитов (100 в каждом случае) накапливались в базе данных прибора «АСПЕК» во время световой микроскопии (ЮООх) мазков крови. Алгоритмы автоматической их обработки базировались на оцифровке, сегментации и процедурах распознавания изображений клеток, совместно разработанных сотрудниками Радиотехнического института имени академика А.Л.Минца АН РФ и лаборатории гемоцитологии ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ ( патенты № 212171, 1998; № 2147123, 2000 и № 32279, 2003). Использование алгоритмов в приборе подразумевало сегментацию («вручную» или с помощью процедуры «волшебная палочка»), измерение (Рис. 6), формирование обучающих выборок и классификацию тромбоцитов, для объективного описания которых использовались значения площади: Б тмт. Предварительные данные показали высокую воспроизводимость параметра: в 12 повторных измерениях СУ, % колебался от 3,9% до 5,5%.

| - - • -Пека -он з. к 1

• а »"чаячий» «"У, " ш и ля тяммшм <.м « Г к» п як >*» л Г аи V м \1>ч!>ш,\т тя (г* " пи V «я (гжммьия «« а ш 9 §4

^и ___ ^

Ьр ."•»."Л [и *

шмишш МММ вз- э..

Рис. 7. Компьютерная морфометрия изображений окрашенных (РАв-реакция) тромбоцитов на приборе «АСПЕК».

Формирование обучающих выборок. При экспертной классификации изображений тромбоцитов (Рис. 8) за основу принимались литературные данные об особенностях

Рис. 8. Экспертная классификация изображений тромбоцитов (РАБ-реакция):

а - зрелые тромбоциты; Ь - незрелые тромбоциты.

PAS-реакции в тромбоцитах у эволюционно сложившихся видов - рыб, животных и человека: (а) проявление реакции соотносится с запасами гликогена, который в тромбоцитах концентрируется в виде гранул или распределяется диффузно [Gibb and Stowell, 1949]; (б) пропорция PAS-позитивных клеток, отражая эффективность тромбоцитопоэза, у человека и животных примерно одинакова и колеблется от 6% до 38% [Vossen et al., 1968; Davis, 1973; Murata at al., 1977; Pankraz et al., 2008], (в) незрелые тромбоциты - крупные, более 5 кв.мкм, клетки [Ф.В.Коробова, 2001; Thattaliyath et al., 2005]; (в) незрелые тромбоциты содержат более Зх-гранул PAS-положительного материала, тогда как зрелые - менее Зх [Anderson et all., 1996].

Индуцированная агрегация тромбоцитов доноров с агонистами in vitro. Исследование агрегации тромбоцитов in vitro до и после процедур ТЦА было выполнено у 30 доноров: 10 первичных и 10 кадровых, которым проводился 3-кратный ТЦА, 10 кадровых с ТЦА на сепараторе крови MCS+ "Haemonetics". Венозную кровь (2 мл), стабилизированную раствором гепарина, собирали в пробирку "Monovette" и использовали через 60 мин после взятия. В качестве индукторов агрегации в работе применены аденозидифосфат (АДФ) (Boehringer Mannheim, Австрия) в конечной концентрации lxlO"5 М и адреналин в концентрации 1x10^ М. Анализ агрегации тромбоцитов выполнялся на приборе «230 LA НФП БИОЛА» (РФ) традиционным гурбометрическим методом.

Статистическая обработка данных. Все данные выражались в виде среднего значения и стандартного отклонения (mean ±SD), медианы (Med), 95% доверительных интервалов (95% CI), коэффициента вариации (CV, %) и коэффициента корреляции Spearman's (rs); различия между группами оценивались с использованием Wilcoxon Sing-Rank теста, принимаясь статистически значимыми при р < 0 05 для всех тестов. Для статистической обработки использовался пакет SPSS (версия 10.0.5) для Windows (SPSS, Chicago, IL).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Взаимосвязь параметров «Количество тромбоцитов» (РЬТх103/мкл) и «Фракция незрелых тромбоцитов» (IFF, %) в венозной крови доноров до и после процедур тромбоцита фереза.

Сравнение двух вариационных рядов (параметры «общее количество тромбоцитов» и «фракция незрелых тромбоцитов, %») в группе практически здоровых мужчин (контроль, п = 87), отобранных на стадии селекции доноров, наряду с выраженной гетерогенностью распределений (CV, %= 16,7 и 57,14%, соответственно), выявило отрицательную зависимость параметров: rs= -0,14. Отсюда можно заключить, что, чем больше кровяных пластинок циркулирует в крови, тем меньше среди них незрелых тромбоцитов.

В таблице 1 значения вышеприведенных параметров сравниваются с данными, полученными Jung et al., 2010 на большей выборке практически здоровых мужчин.

Таблица 1. Значения тромбоцитарных параметров, полученные в группе практически здоровых мужчин с использованием анализатора "Sysmex ХЕ-2100" (Sysmex, Kobe, Japan)

Статистики Собственные данные Jung et al., 2010*

п= 87 n=1146

PLTxl03/L IPF, % PLTxl03/L IPF, %

M±SD 234±38 1,6±0,9 225±42 1,3±0,9

Разброс 168-354 0,3-4,6 150-441 0,4-5,7

CV, % 16,2 56,2 19,1 69,2

* Jung H., Jeon H-K., Kim H-J., Sun-Hee Kim S-H. Immature Platelet Fraction: Establishment of a Reference Interval and Diagnostic Measure for Thrombocytopenia. Korean J. Lab. Med. 2010; 30: 451459.

Примечание: n - число наблюдений; PLT - тромбоциты; IPF - фракция незрелых

тромбоцитов; M - среднее арифметическое значение; SD - стандартное отклонение; CV - коэффициент вариации.

2. Сравнительная оценка содержания незрелых тромбоцитов в периферической крови

доноров до и после процедур тромбоцитафереза.

Как первичные, так и кадровые доноры до начала процедур ТЦА ни по количеству циркулирующих в крови тромбоцитов, ни по вариабельности внутригрупповых значений этого показателя статистически значимо не отличались от практически здоровых людей: контроль (234 ± 38 х103/мкл; 226-242; CV = 16,2%) vs. первой группы (239 ± 47 х103/мкл; 219-259; CV = 19,7%), второй группы (237 ± 40 х103/мкл; 225-249; CV = 23,3%) и третьей группы (240 ± 44 х103/мкл; 232248; CV = 27,7%).

При проведении ТЦА у первичных доноров (первая группа) число тромбоцитов начинало уменьшаться перед набором второго контейнера (213 ± 50х103/мкл; 192-234), а по окончанию процедуры статистически значимо (р= 0,05) по отношению к контролю нарастала относительная тромбоцитопения в терминах РЬТх103/мкл: (189 ± 52х103/мкл, 167-211). В том же временном интервале отмечен подъем значений IPF (%): (2,4 ± 1,5%; 1,7-3,0) и (3,4 ± 2,2%; 2,44,3), соответственно (р — 0,05).

При получении пулированных монодонорских ТК у кадровых доноров (вторая группа) количество циркулирующих в периферической крови тромбоцитов также снизилось перед набором второго контейнера (208 ± 41х103/мкл; 196-221) и статистически значимо (р= 0,05) упало в конце ТЦФ (189 ± 44х103/мкл; 175-202). В отличие от первой группы доноров значения IPF (%) здесь были высокими еще до начала процедуры и значимо (р = 0,05) увеличивались по ее окончанию: (2,2 ± 1,1%; 1,8-2,5), (2,6 ± 1,4%; 2,1-3,0) и (2,8 ± 1,4%; 2,4-3,3).

Аналогично, но более выражено, чем в предыдущих группах количество тромбоцитов уменьшалось у кадровых доноров, подвергающихся аферезу (третья группа): (166 ± З0х103/мкл, 160-171). Так же как во второй группе, фракция незрелых тромбоцитов оказалась увеличенной (р= 0,05) еще до начала процедуры, а по ее окончанию наблюдалась только тенденция к снижению

значений показателя IPF: (2,3 ± 1,4%; 2,1-2,6) и (1,8 ± 1,8%; 2,3-3,0), причем на фоне выраженной внутригрупповой вариабельности (CV= 100%).

Потребности лечебно-профилактических учреждений страны в компонентах и препаратах крови за последнее десятилетие значительно выросли. По данным Н.Г.Филиной и соавт. (2010 г.) обеспечение ТК и плазмой гематологических стационаров только одного Красноярского края за 2007-2008 гг. увеличилось в два раза. Современная полихимиотерапия больных гемобластозами создает условия еще большей потребности в заместительной терапии донорскими тромбоцитами для снижения частоты угрожающих кровотечений [В.Г.Савченко и Е.Н.Паровичникова, 2004]. В этой ситуации принятие обоснованного решения о допуске донора на процедуру тромбоцитафереза, особенно аппаратного, и определение количества заготавливаемых доз тромбоцитов, становится актуальным.

Известно, что и способ заготовки ТК, и частота донаций обуславливают транзиторное, но статистически значимое уменьшение количества тромбоцитов в периферической крови доноров: иногда до 40х10'/л. [Schrezenmeier & Seifried„2000; Lazarus et al„ 2001]. Некоторые "ферезные" системы могут вызвать существенную потерю тромбоцитов. При этом процедура деплеции тромбоцитов с одной стороны подавляет функцию этих клеток, циркулирующих в крови доноров [I eunng et al., 2001], а с другой может способствовать активации тромбоцитопоэза и восстановлению тромбокрита в течение буквально нескольких дней [Ifran et al., 2005]. И если понятно, что индивидуальные отклонений тромбоцитов при ТЦА определяются врожденными особенностями доноров [Gamer et al., 2008], то эффекты регулярного изъятия тромбоцитов, включая аферез, на тромбоцитопоэз доноров до сих пор изучены недостаточно. Автоматический гематологический анализатор "Sysmex ХЕ-2100" (Sysmex, Kobe, Japan) кроме учета известных тромбоцитарных параметров, на базе избирательной окраски РНК и проточной цитофлуориметрии оценивают еще и фракцию незрелых тромбоцитов Именно на основании анализа незрелых или "ретикулярных" тромбоцитов при транзиторной тромбоцитопении у доноров был сделан вывод о возможности мониторинга тромбопоэтической активности костного мозга у кадровых доноров тромбоцитов [Winters, 2006].

Современная модель тромбоцитопоэза предполагает, что эндоредупликация мегакариоцитов в костном мозге завершается образованием протромбоцитов, от которых отшнуровываются и вьгходят в кровоток зрелые тромбоциты [Kleiman et al., 2008; Lecine et al., 2000; Patel et al., 2005; Sigurjönsson, 2001]. Мегакариоцит, самая крупная в костном мозге клетка, в которой уже отчетливо видны признаки нестабильности и готовящейся дезинтеграции в виде образования псевдоподий, а также обилие специфических гранул и демаркационных мембран, обозначающих участки будущей сегментации цитоплазмы. Протромбоциты, - крупные участки цитоплазматических псевдоподий мегакариоцита, как и индивидуальные тромбоциты, обнаруживаются в просвете венозных синусов костного мозга. Зрелые тромбоциты, как правило, имеют форму круглых или овальных двояковыпуклых дисков, иногда с короткими единичными

отростками; встречаются также сфероидные или шарообразные клетки с гладкой или складчатой поверхностью.

Одно из неспецифических отклонений тромбоцитопоэза - увеличенный выход в кровь незрелых тромбоцитов, было описано при экспериментальной кровопотере у собак [Ingram, Coopersmith, 1969]. Эти незрелые тромбоциты, - аналоги ретикулоцитов в красном ростке кроветворения по уровню дифференцировки, но не по функции. Их количество в периферической крови отражает состояние регуляторных механизмов гемостаза и ответ костного мозга на кровопотерю. По результатам морфологических исследований мазков крови в норме доля незрелых тромбоцитов составляет 3,2 ± 0,13 % [Г.И.Козинец и соавт., 2004]. Kern et al. (2000) допускают возможность реализации резервов тромбоцитопоэза при повышенном потреблении тромбоцитов путем отшнуровки их незрелых форм непосредственно от мегакариоцитов, минуя

стадию протромбоцитов.

В настоящей работе проведено сравнение количества тромбоцитов и значений IPF (%) в контроле и у доноров, при получении ТК из цельной крови и посредством процедур аппаратного афереза. Сравниваемые параметры проанализированы у первичных доноров и у доноров, сдающих тромбоциты каждые две недели в течение от 2 до 5 лет. Исходя из полученных данных, можно предположить, что реализация резервов тромбоцитопоэза за счет фракции незрелых тромбоцитов представляет своего рода адаптацию, которая в промежутках между донациями у доноров компенсирует изъятые тромбоцитов. Действительно, в начале процедур ни первичные, ни кадровые доноры не отличались от контроля по количеству циркулирующих тромбоцитов. В динамике ТЦА как у тех, так и у других развилась относительная тромбоцитопения, наиболее выраженная по окончанию афереза. При этом если во время поэтапного фракционирования трех доз крови у первичных доноров подъем IPF был выявлен, начиная с забора второго контейнера, то у кадровых, не взирая на способ получения ТК, ее высокие по сравнению с контролем значения сохранялись в течение двух недель после последней донации.

Эффекты деплеции тромбоцитов у первичных и кадровых доноров ранее были исследованы Stohlawetz et al. (1998). Статистически значимый (по сравнению с первичными донорами) более низкий уровень тромбоцитов у доноров, сдающих тромбоциты каждую неделю в течение 18 месяцев, авторы объясняют относительным истощением у них тромбоцитопоэза вследствие долгосрочной донации. По данным этих авторов у первичных доноров уровень IPF, %, достигая максимума на четвертый день после афереза, начинал повышаться уже через три дня по окончанию процедуры; у кадровых доноров подъем его значений также регистрировался между 1 и 4 днями, но они были ниже, чем у первичных. Интересно, что средняя величина IPF в третьей группе наших кадровых доноров, которым проводился аферез, превышая контроль на 14 день после донации, сразу же после афереза снижалась. Ответ тромбоцитопоэза на современную методологию извлечения тромбоцитов был также исследован Gyongyossy-Issa (2001). Оценка частоты незрелых тромбоцитов в периферической крови доноров до и после проведения ТЦА

позволила авторам предположить, что их пик на второй день после процедуры и последующая циркуляция в течение семи дней, скорее всего, связаны с выходом клеток из селезеночного депо.

Измененная морфология тромбоцитов позволила Везз18 (1972) в свое время связать появление в периферической крови крупных незрелых кровяных пластинок с регенеративным ответом костного мозга и форсированным тромбоцитопоэзом При этом в сравнении полученных в работе данных оценки 1РР у доноров с литературными сведениями о концентрации тромбопоэтина проявляют аналогичную тенденцию (табл.2).

Таблица 2. Фракция незрелых тромбоцитов (собственные данные) и концентрация эндогенного тромбопоэтина (литература) у доноров тромбоцитов.

Авторы Параметр Доноры

Собствен

ные 1РР, % данные

ОеМке а1., 1998

\Л/е1зЬасИ е1 а1., 1999 Таске е1 а1., 1999

\Nagner е1 а1., 2001

ТПО пг/мл

Первичные (п= 24)

Кадровые (Зх-кр.ТЦА) (п= 44)

Кадровые (апп.ТЦА) (п= 121)

(П= 21)

(п=101) (п=12)

До Середина

процедуры процедуры 1,8±1,5 2,4±1,5

2,3±1,4

х исследования {М±БО)

69,2±7,1 49,5±25,5

Окончание процедуры 3,4±2,2

1,8±1.8

117±6,8 (2 дн.) 56,9±26,7

Подъем после процедуры на фоне высокой биологической вариабельности

103,3±18,5 135,8±25,8 (1 дн.)

Примечание: п - число наблюдений; 1РР - фракция незрелых тромбоцитов;

ТПО- тромбоэтин; М - среднее арифметическое значение; БЭ - стандартное отклонение.

В этой связи, стойкое увеличение фракции незрелых тромбоцитов в периферической крови кадровых доноров, подвергающихся долгосрочному извлечению тромбоцитов, не исключая возможности выхода незрелых клеток из депо, мы склонны объяснить своего рода адаптацией тромбоцитопоэза к частым донациям. В любом случае оценка параметра 1РР может быть признана практически пригодной для принятия обоснованного решения о допуске донора на процедуру тромбоцитафереза, особенно аппаратного.

3. Эффективность идентификации незрелых тромбоцитов с помощью проточной

цитофлуорнметрии и посредством РА£-цитохимической реакции на полисахариды.

Идентификация полисахаридов на светооптическом уровне с помощью цитохимической РАБ-реакции в гематологии - обычный метод анализа дифференцировки клеток крови [Г.И.Козинец и соавт. 2006]. Однако ее применение для исследования тромбоцитов ограничено. Как правило, изменения гликогена в гранулах тромбоцитов исследуются при электронной микроскопии и чаще всего в экспериментах на животных. Вместе с тем, известно, что как

костномозговые мегакариоциты, так и тромбоциты периферической крови человека, различных видов животных и рыб содержат внутриклеточный гликоген [Gibb & Stowel, 1949; Vossen et al.,1968; Nafstad & Nafstad, 1968; Davis, 1973; Murata et al.,1977; Anderson et al., 1996; Du Plessis et al., 1999]. Гликоген сохраняется в тромбоцитах наряду с остатками РНК. И в мегакариоцитах, и в тромбоцитах полисахариды проявляются в двух формах: отчетливые гранулы и диффузное распределение в цитоплазме. Гликоген необходим тромбоцитам как источник энергии для мембранного транспорта и фагоцитоза, хранения серотонина, метаболизма белков и липидов и ретракции сгустка крови. Различают PAS отрицательные (PAS-) и PAS положительные (PAS+) тромбоциты. Причем их соотношение у исследованных видов примерно одинаково [Davis, 1973]. Anderson et al. (1996) провели исследование клеток крови морского окуня (L. calcarifer) и показали, что зрелые тромбоциты отличаются от незрелых распределением продукта PAS-реакции: в зрелых тромбоцитах мелкозернистый характер гранул утрачивается, и электронноплотные участки становятся гомогенными; в окрашенных мазках крови зрелые тромбоциты ("шиловидные") изредка содержат две или три крупные PAS-позитивные гранулы и четкие цитоплазматические вакуоли, а незрелые тромбоциты (круглые и овальные формы) - многочисленные PAS-позитивные гранулы.

Именно эта информация была применена при экспертной классификации микроскопических изображений тромбоцитов в настоящей диссертации.

В работе установлено три факта. Во-первых, исходя из результатов компьютерной морфометрии микроскопических изображений клеток на приборе «АСПЕК» установлено, что площадь PAS-позитивных (PAS+) тромбоцитов практически здоровых мужчин достоверно превышает площадь PAS-негативных (PAS-) тромбоцитов (9,5±3,6 кв. мкм vs. 3,9±1.3 кв. мкм, р < О, 0001, п = 21). При этом средняя пропорция содержащих более трех гранул гликогена тромбоцитов в этой группе обследованных людей составила 23,1±9,2%, (разброс 8,2-49,4%, CV = 39,5%), что совпадает с литературными данными. Так, согласно Vossen et al. (1968) приблизительно 30% тромбоцитов людей демонстрируют положительную PAS-реакцию. Во-вторых, пропорция PAS+тромбоцитов в контроле положительно коррелирует с относительной величиной параметра «Фракция незрелых тромбоцитов» (IPF, %): rs = 0,63, р<0,05 (п = 21), которая по данным анализатора Sysmex ХЕ-2100 была равна 2,1±1.0 % (разброс 0,3-4.6 %, CV = 47,6%). В третьих, по сравнению со значением контроля IPF% в пробах венозной крови как первичных доноров (п = 9), которым проводился 3-кратный ТЦА, так и кадровых (п = 10) - ТЦА на сепараторе крови MCS+ "Haemonetics" оказалась более высокой: 4.2±2.0 % (1.9-7.0), р < 0.01 и 5.1±2.5 % (1.2-8.6), р< 0004, соответственно. Значения IPF, % статистически значимо коррелировали с PAS-позитивностью незрелых тромбоцитов [rs = 0.5, п = 9 (р = 0.14) и rs = 0.6, п = 10 (р = 0.05)]. Последняя имела аналогичную тенденцию к увеличению (медиана): [группа 2: 30% (95% CI 21.6-34.2), р = 0.05 vs. 24.3% (95% CI 14.8-26.2) и группа 3: 31% (95% CI 19-36.4) vs.], отрицательно коррелируя с количеством тромбоцитов, циркулирующих после окончания процедур ТЦА: [группа 2: rs = - 0.7 (р = 0.21) и группа 3: rs = - 0.5 (р = 0.14)]. У тех, и у других

доноров после ТЦА развилась клинически незначимая тромбоцитопения (данные групп 2 и 3 после и до процедуры, соответственно): медиана 198х103/мкл (95% CI 166-227) vs. медиана 229x103/мкл (95% CI 206-267), р < 0.05; медиана 142.5 (95% CI 132-173) vs. медиана 214.5 (95% CI 196-267), р < 0.01. Также достоверными в этих группах были различия IPF, %, полученные до и после проведения ТЦА (медиана): 1.7 (95% CI 1.4-4.0) vs. 4.0 (95% CI 2.7-5.8), р < 0.05 (группа 2) и 4.0 (95% CI 2.7-6.0) vs. 5.1 (95% CI 3.3-6.9), р < 0.01 (группа 3).

Полученные результаты свидетельствуют в пользу эффективности оценки тромбоцитов с помощью световой микроскопии PAS-реакции для выявления физиологических и морфологических изменений тромбоцитопоэза в процессе донаций. Более того, подобные исследования имеют экономические преимущества, т.к. дешевле анализа незрелых тромбоцитов на SysmexXE-2100.

4,Оцепка взаимосвязи между объемом фракции незрелых тромбоцитов периферической крови первичных и кадровых доноров и показателями индуцированной агрегации тромбоцитов до и после процедур тромбоцитафереза.

Представляет большой интерес исследование функциональной активности тромбоцитов в зависимости от фракции незрелых клеток до и после тромбоцитафереза. Основная функция тромбоцитов заключается в их участии в процессе свертывания крови; это важная защитная реакция организма, которая предотвращает большую потерю крови при ранении сосудов. Агрегация тромбоцитов является наиболее доступным методом для анализа их функциональной активности. Физиологическими активаторами тромбоцитов является АДФ, высвобождающийся из поврежденных клеток и адреналин.

Для сравнения показателей агрегации и фракции незрелых тромбоцитов периферической крови были обследованы 3 группы доноров: 1) первичные доноры до и после проведения Зх-кратного тромбоцитафереза (поэтапного фракционирования трех доз крови с использованием центрифуги Sorvall RS ЗС (USA) (n=10); 2) кадровые доноры до и после Зх-кратного тромбоцитафереза (п=10); 3) кадровые доноры, которые в течение 2-3 лет регулярно проходили процедуры афереза на сепараторе крови "Haemonetics" MCS+(USA) до и после проведения аппаратного тромбоцитафереза (п=10).

У первичных доноров показатели агрегации до процедуры в пределах нормальных значений, но, снижаясь по ее окончанию, приравниваются к верхней границе нормальных показателей, а именно: исходные показатели с АДФ 74±8%, с адреналином 73±9%, а по окончанию 69±9% и 63±14% соответственно. Кроме этого, у первичных доноров отмечалась высокая положительная корреляция показателей агрегации с АДФ (rs = 0,69 до ТЦА; rs = 0,89 после) и с адреналином (rs = 0,69 и rs = 0,77 соответственно) в сопоставлении со значениями фракции незрелых тромбоцитов.

У кадровых доноров при проведении Зх-кратного ТЦА имеет место исходное увеличение показателя агрегации: с АДФ: 83±20%, с адреналином: 81±26%, при норме 55-65%, а по окончанию процедуры отмечается некоторое снижение этих значений: с АДФ до 76±22%, а с

адреналином до 72±16%, но показатели по-прежнему превышают нормальные значения. Тенденция по превышению значений агрегации как исходных, так и по окончанию на фоне снижения этих значений после процедур аппаратного ТЦА сохраняется: с АДФ до 92±13%, с адреналином 77±16%, а после 76±29% и 67±23% соответственно. Показатели агрегации до процедуры превышали нормальные значения: с АДФ до 83±13%, с адреналином 81±26%, а по окончанию процедуры снижались: 76±22% и 72±16% соответственно.

Графически описанные изменения представлены на рис.9 и рис.10.

100.00 95. СО 90.00 85.00 80.00 75,ОТ 70,00 85.00 60.00 55,00 50,00

Рис.9. Агрегация тромбоцитов с АДФ (%) у доноров тромбоцитов до (1) и после (2) тромбоцитафереза. Обозначения: синие столбики - первичные доноры, красные столбики -кадровые доноры до и после Зх-кратного тромбоцитафереза, желтые столбики - кадровые доноры до и после аппаратного афереза. Вертикальные линии обозначают стандартные ошибки средних

Рис. 10. Агрегация тромбоцитов с адреналином (%) у доноров тромбоцитов до (1) и после (2) тромбоцитафереза. Обозначения: синие столбики - первичные доноры, красные столбики -кадровые доноры до и после Зх-кратного тромбоцитафереза, желтые столбики - кадровые доноры до и после аппаратного афереза. Вертикальные линии обозначают стандартные ошибки средних значений.

Таким образом, характер изменений индуцированной агрегации in vitro у первичных и кадровых доноров существенно различался: перед процедурой ТЦА у кадровых доноров уровень агрегации был существенно выше, чем у первичных. По-видимому, это может быть связано с большим объемом незрелых тромбоцитов, циркулирующих в периферической крови кадровых

доноров. Можно предположить, что повышение исходных показателей индуцированной агрегации in vitro у кадровых доноров связано с увеличением объема фракции незрелых тромбоцитов, которые обладают высокой функциональной активностью. Снижение агрегации после тромбоцитафереза на фоне увеличения фракции незрелых тромбоцитов возможно объясняется влиянием антикоагулянта (цитрата натрия), вызывающего изменения клеточного метаболизма (активация цикла Кребса и сдвиг кислотно-щелочного баланса крови), присутствующего в крови по окончанию процедур, причем в большей степени после аппаратного.

ВЫВОДЫ

1. Оценка параметра «Фракция незрелых тромбоцитов» у доноров, проходящих процедуры тромбоцитафереза по установленным в России нормативам (1 раз в 14 дней, при отсутствии противопоказаний, но не более 10 процедур в год) демонстрирует адаптацию кроветворения к донациям, которая функционально компенсирует изъятые тромбоциты.

2. Как у первичных, так и у кадровых доноров, при проведении процедур тромбоцитафереза, количество циркулирующих тромбоцитов снижается, причем наиболее выражено после аппаратного афереза.

3. Статистически значимое (р =0,05) по сравнению с собственным контролем увеличение объема фракции незрелых тромбоцитов у первичных доноров возникает в динамике выполнения тромбоцитафереза; у кадровых повышенные значения параметра сохраняются в течения 14 дней отдыха между донациями тромбоцитов, снижаясь после процедуры афереза.

4. Анализ микроскопических изображений тромбоцитов, окрашенных на полисахариды (PAS-реакция), дополняя более дорогой метод проточной цитофлуориметрии, является эффективным методом исследования незрелых форм этих клеток.

5. Повышение агрегационной способности тромбоцитов кадровых доноров с агонистами in vitro объясняется повышенным содержанием в их крови функционально активных незрелых клеток.

Список опубликованы* печатных работ по теме диссертации:

1. Бескоровайнова В.Ю., Козинец Г.И., Погорелов В.М., Лазаренко М.И., И.Н.Наумова. Современный подход к оценке тромбоцитопоэза - фракция незрелых тромбоцитов. Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» с международным участием «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». Киров, 2010. С. 63-64.

2. Бескоровайнова В.Ю., Погорелов В.М., Козинец Г.И., Лазаренко МИ. Контрольные значения тромбоцитарных параметров, полученные на гематологическом анализаторе БуБтех ХЕ-2100 при обследовании доноров ОЗК и К ГНЦ РАМН. Лаборатория. М., 2010.-№2,- С. 13.

3. Бескоровайнова В.Ю., Погорелов В.М., Козинец Г.И., Лазаренко М.И. Цитофлуориметрические параметры тромбоцитов у первичных и кадровых доноров, полученные на гематологическом анализаторе Sysmex ХЕ-2100. Мат. III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». М., 2010.-С.5-6.

4. Чаниева М.И., Погорелов В.М., Иванова И.А., Верденская Н.В., Скедина М., Бескоровайнова В.Ю., Козинец Г.И. Автоматическое распознавание микроскопических изображений тромбоцитов на анализаторе АСПЕК. Гематология и трансфузиология. М.,

2010,- Т.55- №5,- С. 51-52.

5. Бескоровайнова В.Ю., Погорелов В.М., Козинец Г.И. Тромбоцитарные параметры у доноров при заготовке концентратов тромбоцитов. Мат. IV научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения». М., 2010.-С.10.

6. Бескоровайнова В.Ю., Погорелов В.М., Наумова И.Н., Козинец Г.И., М.И. Лазаренко. Автоматический анализ тромбоцитарных параметров в концентратах тромбоцитов. Гематология и трансфузиология. М., 2010,- Т.55- №5.-С. 38-39.

7. Погорелов В.М., Леонтьева Т.Н., Наумова И.Н., Бескоровайнова В.Ю., Скедина М.А., Емельяненко В.М., Козинец Г.И. Фракции незрелых тромбоцитов при ишемической болезни сердца. Гематология и трансфузиология. М., 2010,- Т.55- №5.-С. 47-48.

8. Погорелов В.М., Бескоровайнова В.Ю., Лазаренко М.И, Гемджян Э. Г., Уртаев Б.М., Шишканова З.Г, Точенов А.Н., Г.И.Козинец. Незрелые тромбоциты в периферической крови доноров до и после тромбоцитафереза. Вестник службы крови. М., 2011- №2 - С.29-33.

9. Бескоровайнова В.Ю., Погорелов В.М., Лазаренко М.И. Исследование фракции незрелых тромбоцитов в донорстве. Депонирование во Всероссийский институт научной и технической информации (ВИНИТИ), М., 13.07.11г № 340-В2011.-27с.

10. Бескоровайнова В.Ю., Погорелов В.М., Наумова И.Н., Уртаев Б.М., Козинец Г.И. Фракция незрелых тромбоцитов - критерий ответа кроветворения доноров на тромбоцитаферез. Гематология и трансфузиология. М., 2011- Т.56- №2.-С. 33-34.

11. Погорелов В.М., Бескоровайнова В.Ю., Лазаренко М.И., Гемджян Э. Г., Уртаев Б.М., Шишканова З.Г, Точенов A.B., Г.И.Козинец. Незрелые тромбоциты в периферической крови доноров до и после тромбоцитафереза. Методическое пособие. РИО МГМСУ. М.,

2011. 14 страниц.

12. Погорелов В.М., Уфимцева В.Ю., Козинец Г.И. Регенераторный ответ тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов. Вестник службы крови. М., 2012.-№2.-С.55-63.

13. Pogorelov V.M., Beskorovainova V.JU., Chanieva M.I, Dyagileva O.A., Naumova I.N., Scedina M.A. Periodic acid-Schiff (PAS) stating of immature platelets in donors». Platelets. - 2012,-Vol.23.- №.1,- P.51-59.

14. Погорелов B.M., Бескоровайнова В.Ю., Гемджян Э.Г., Алексанян М.Ж., Козинец Г.И. Адаптация тромбоцитопоэза доноров к процедурам тромбоцитафереза. Материалы конгресса гематологов России. Гематология и трансфузиология. М., 2012,-Т.57- №3.-С.71.

Подписано в печать: 06.10.2012 Объем: 1,0 усл. п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 680 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Актуальность исследования.

С 1960-х годов в России внедряется трансфузионная доктрина использования не столько цельной консервированной донорской крови, сколько ее дериватов, т.е. компонентов и препаратов крови, дефицитных при заболеваниях человека: эритроцитной, тромбоцитной, лейкоцитной масс, плазмы или белковых фракций [12, 33, 40]. Нередко для лечения одного пациента нужны трансфузионные среды от нескольких доноров. Поэтому донорство крови и ее компонентов — вопрос национальной безопасности и сохранения здоровья общества.

Уровень участия населения в донорском движении — это универсальный социальный индикатор развития общества и значимости в нем человеческих ценностей. Необходимо помнить о том, что развитие идей донорства будет способствовать укреплению гуманизма и взаимопонимания в нашем обществе [18]. Главным остается донорство, а в нем — добрая воля человека, готового поделиться своей кровью. Вопрос сохранения и увеличения донорских кадров является ключевым.

Взятие от донора крови и ее компонентов допустимо только при условии, если здоровью донора не будет причинен вред" [14]. Особенно актуальным это требование становится при заготовке компонентов с малым сроком хранения, в частности, тромбоцитных концентратов (ТК). Получить монодорский ТК, - высококачественный продукт, с максимальной концентрацией тромбоцитов и с минимальной контаминацией лейкоцитами и эритроцитами - можно или на рефрижераторных центрифугах 3-х кратным тромбоцитафезом (ТЦА) в строенные пластикатные закрытые контейнеры или посредством аппаратного афереза, когда при помощи сепаратора крови от одного донора заготавливается в среднем 8 доз ТК. Оптимизация режимов донорского ТЦА с получением высокодозных ТК с одной стороны способствует улучшению трансфузиологического обеспечения больных, с 6 другой - создает условия для воплощения принципа "один донор - один реципиент", т.е. становится основой уменьшения риска аллосенсибилизации и передачи гемотрансмиссивных инфекций [6]. Поэтому приоритетным становится использование методов автоматического (аппаратного) афереза, которые позволяют получать терапевтические дозы компонента в закрытой (замкнутой) системе от одного донора [16, 47]. Вместе с тем, данные о влиянии процедур ТЦА, особенно с использованием сепараторов клеток крови, на здоровье доноров продолжают быть противоречивыми. Эффекты ТЦА на тромбоцитопоэз в костном мозге доноров не изучены. Даже при убедительном доказательстве отсутствия отрицательного влияния интенсивного ТЦА на основные показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, иммуноглобулинов и обмена железа [4], детальная оценка эффективности тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов все еще остается необходимой. Самое первостепенное, это определение исходного уровня и морфофункциональных параметров тромбоцитов в крови донора перед донацией. Обычный набор лабораторных параметров в этом отношении недостаточен.

Тромбоциты периферической крови являются производными полиплоидных мегакариоцитов костного мозга. Они, как и эритроциты, -уникальный пример предельной специализации клетки, функционирующей в отсутствии ядра [36]. Тромбоциты выполняют ангиотрофическую и адгезивно-агрегационную функции, участвуют в процессах свертывания и фибринолиза, обеспечивают ретракцию кровяного сгустка, способны переносить на своей мембране циркулирующие иммунные комплексы и поддерживать спазм сосудов. Дисковидные по форме эти клетки имеют диаметр от 2 до 5 мкм, а их толщина колеблется от 0,5 до 0,75 мкм. Разнообразие циркулирующих в периферической крови тромбоцитов определяется скоростью продукции, оборота, активации и удаления этих клеток [85]. Среди них принято выделять пять морфологических групп [19]: юные с диаметром 5-5,5 мкм (3,2%), зрелые - 1,5-3 мкм (87%), старые - 0,515 мкм (4,5%), макроформы - > 5 мкм (2,8%) и формы раздражения (2,5%). Интересно, что юные, незрелые тромбоциты гемостатически более активны, инициируют образование тромба, уменьшаясь в числе на дальнейших стадиях его формирования [120].

Связь активации костномозгового тромбоцитопоэза с увеличением количества незрелых тромбоцитов в периферической крови подтверждается и в клинике, и в эксперименте [80, 104, 101, 113-114, 116, 124]. Считается, что, отражая реакцию костного мозга на запрос организма, увеличение объема фракции незрелых тромбоцитов является ранним индикатором потребления кровяных пластинок [60]. Можно предположить, что реализация резервов тромбоцитопоэза за счет незрелых тромбоцитов представляет своего рода адаптацию, которая в случае необходимости компенсирует потребленные или разрушенные тромбоциты. Поэтому большинство исследователей в настоящее время к тромбопоэтическим индексам, наряду с концентрацией тромбопоэтина, относят параметр «Фракция незрелых тромбоцитов», по которому можно судить о состоянии тромбоцитопоэза [61, 63].

Современные гематологические анализаторы, обеспечивая воспроизводимость всех известных тромбоцитарных параметров, на базе избирательной окраски РНК и проточной цитофлуориметрии оценивают еще и фракцию незрелых тромбоцитов. Эти клетки содержат РНК и окрашиваются флуорохромами. В частности, фракция незрелых тромбоцитов (IPF, %) на анализаторе "Sysmex ХЕ-2100" (Sysmex, Kobe, Japan) определяется по специальной программе «IPF Master». Параметр выражается как % от общего количества тромбоцитов (IPF,%), так и в абсолютных л значениях (IPFxlO /л). На основании анализа фракции незрелых тромбоцитов при относительной тромбоцитопении после ТЦА Stohlawetz et al. (1998) пришли к выводу о возможности мониторинга тромбопоэтической активности костного мозга у кадровых доноров тромбоцитов [118].

Следует учесть также, что незрелые тромбоциты - крупные клетки. Интересно, что крупные тромбоциты отличаются от остальных большим содержанием полисахаридов [111]. В этой связи тест на гликоген, то есть результаты микроскопии продукта Periodic Acid-Schiff (PAS) цитохимической реакции может дополнить параметр IPF при оценке степени зрелости тромбоцитов.

Таким образом, современная оценка морфофункциональных характеристик тромбоцитов периферической крови доноров актуальна и позволяет получить адекватную информацию о влиянии тромбоцитафереза на тромбоцитопоэз.

Цель исследования.

Оценить содержание незрелых тромбоцитов как индикаторов активности тромбоцитопоэза в периферической крови доноров до и после процедур тромбоцитафереза.

Задачи исследования.

1. Определить влияние процедур тромбоцитафереза на количество тромбоцитов, циркулирующих в крови доноров.

2. Провести анализ содержания незрелых тромбоцитов в периферической крови первичных и кадровых доноров до и после проведения процедур Зх-кратного и аппаратного тромбоцитафереза.

3. Определить эффективность идентификации незрелых тромбоцитов с помощью проточной цитофлуориметрии и посредством PAS-цитохимической реакции на полисахариды.

4. Уточнить характер взаимосвязи между количеством незрелых тромбоцитов в периферической крови первичных и кадровых доноров и показателями индуцированной агрегации тромбоцитов до и после процедур тромбоцитафереза. 9

Научная новизна

Впервые по совокупности морфоцитохимических характеристик тромбоцитов периферической крови практически здоровых людей (доноров тромбоцитов), изучены реакции организма на процедуры тромбоцитафереза. На основании чего дана оценка влияний тромбоцитафереза и определена эффективность использования параметра «фракция незрелых тромбоцитов» при анализе тромбоцитопоэза у доноров.

Практическая и научная ценность.

Установленный в диссертации факт того, что происходящая у первичных доноров адаптация тромбоцитопоэза, закрепляется у кадровых доноров и в течение двух недель «отдыха донора» надежно компенсирует потребности организма в тромбоцитах, служит базой оптимизации режимов донорского тромбоцитафереза с получением тромбоцитных концентратов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Относительная тромбоцитопения после тромбоцитафереза как у первичных, так и у кадровых доноров функционально компенсируется незрелыми тромбоцитами.

2. Повышенные значения параметра "Фракция незрелых тромбоцитов" можно рассматривать как результат регенераторного ответа организма доноров на процедуру тромбоцитафереза.

3. Как цитофлуорометрия, так и анализ микроскопических изображений незрелых тромбоцитов (РАБ-реакция) демонстрируют адаптированность доноров к донации тромбоцитов по установленным в России нормативам.

Апробация диссертации.

Диссертация апробирована на заседании проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ "Клинические исследования в гематологии (гемобластозы,

10 депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)" 21.05.2012г.

Материалы работы представлены на IV научно-практической конференции с международным участием «Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи» (Москва, 29-30 марта 2010г.), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 13-14 мая 2010г.), научно-практической конференции «Проблемы заместительной терапии концентратами тромбоцитов» (Москва, 19 октября 2010г.), конгрессе гематологов России (Москва, 2-4- июля 2012г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 1 в зарубежном издании, из них 10 в рецензируемых ВАК.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 114 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 22 рисунка и 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 128 источников, 54 из них - отечественных авторов и 74- зарубежных.

выводы

1. Оценка параметра «Фракция незрелых тромбоцитов» у доноров, проходящих процедуры тромбоцитафереза по установленным в России нормативам (1 раз в 14 дней, при отсутствии противопоказаний, но не более 10 процедур в год) демонстрирует адаптацию кроветворения к дотациям, которая функционально компенсирует изъятые тромбоциты.

2. Как у первичных, так и у кадровых доноров, при проведении процедур тромбоцитафереза, количество циркулирующих тромбоцитов снижается, причем наиболее выражено после аппаратного афереза.

3. Статистически значимое (р =0,05) по сравнению с собственным контролем увеличение объема фракции незрелых тромбоцитов у первичных доноров возникает в динамике выполнения тромбоцитафереза; у кадровых повышенные значения параметра сохраняются в течения 14 дней отдыха между дотациями тромбоцитов, снижаясь после процедуры афереза.

4. Анализ микроскопических изображений тромбоцитов, окрашенных на полисахариды (PAS-реакция), дополняя более дорогой метод проточной цитофлуориметрии, является эффективным методом исследования незрелых форм этих клеток.

5. Повышение агрегационной способности тромбоцитов кадровых доноров с агонистами in vitro объясняется повышенным содержанием в их крови функционально активных незрелых клеток.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С 1960-х годов в России внедряется трансфузионная доктрина использования не столько цельной консервированной донорской крови, сколько ее дериватов, т.е. компонентов и препаратов крови, дефицитных при заболеваниях человека: эритроцитной, тромбоцитной, лейкоцитной масс, плазмы или белковых фракций [12;33;40].

Взятие от донора крови и ее компонентов допустимо только при условии, если здоровью донора не будет причинен вред" [14]. Это требование стало неукоснительным при заготовке компонентов с малым сроком хранения, в частности, тромбоцитных концентратов. Получить монодонорский ТК, - высококачественный продукт, с максимальной концентрацией тромбоцитов и с минимальной примесью лейкоцитов - можно из крови одного донора с помощью 3-х кратного ТЦА или посредством аппаратного афереза при помощи сепараторов крови [39]. Последнее считается приоритетным [14,49]. Потребности в ТК постоянно растут. В свете чего, актуальна этическая проблема здоровья доноров, регулярно проходящих процедуру тромбоцитафереза. Даже при доказательстве отсутствия отрицательного влияния интенсивного ТЦА на основные показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, иммуноглобулинов и обмена железа [4], оценка эффективности тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов все еще необходима. Обычный набор лабораторных параметров в этом отношении недостаточен.

Большинство исследователей в настоящее время к тромбопоэтическим индексам, наряду с концентрацией тромбопоэтина, относят ретикулярные (только в 2009 году так они названы в 168 статьях РиЬМес!) или незрелые тромбоциты (в 51 статье РиЬМес!), по которым можно судить о состоянии тромбоцитопоэза, как и по ретикулоцитам - о состоянии эритроцитопоэза [61,63].

Жизненный цикл мегакариоцита, костномозгового предшественника тромбоцитов, в среднем занимает 10 суток [26]. Период созревания тромбоцита длится около 8 суток, ежедневная продукция составляет приблизительно 40 х103/мл крови, а средняя продолжительность пребывания в кровотоке - 9-11 суток. В циркуляции, занимая центральное или пристеночное положение, находится около 67% клеток (2/3 пула, тогда как 1/3 - в депо), причем ежедневно разрушается 30-40% (7 х109/л), из них 5% вследствие старения. Фракцию незрелых тромбоцитов (IPF) современные гематологические анализаторы, среди которых "Sysmex ХЕ-2100" (Sysmex, Kobe, Japan), обеспечивая воспроизводимость всех известных, тромбоцитарных параметров, оценивают на базе избирательной окраски РНК и проточной цитофлуориметрии. Эти клетки содержат РНК и окрашиваются флуорохромами [84]. Параметр выражается как % от общего количества л тромбоцитов (IPF,%), так и в абсолютных значениях (IPFxlO /мкл) и является индексом скорости продукции тромбоцитов костным мозгом [85].

Конечно, анализируются и другие параметры, но среди них средний объем тромбоцитов (MPV) хотя и считается адекватным для контроля появления в крови крупных тромбоцитов, но не нашел применения: масса тромбоцитов варьирует в пределах широкого интервала значений общего количества этих клеток и референсные значения показателя должны быть выражены функцией от концентрации тромбоцитов. В свою очередь параметр P-LCR (доля клеток с объемом больше 12 fl) диагностически ценен только в случае иммунной тромбоцитопении [87]. Кроме того, соли ЭДТА быстро переводят дисковидные тромбоциты в сфероиды, поэтому при кондуктометрии значения параметра в пределах 30 мин увеличиваются на 7,9%, а после 24 ч. - на 13,4%; при оптической флуоресценции они уменьшаются на 10% [61]. Агрегация тромбоцитов может исказить значения индекса P-LCR,%.

Считается, что незрелые тромбоциты - достаточно крупные клетки. Интересно, что крупные тромбоциты отличаются от остальных большим содержанием полисахаридов [73]. В этой связи тест на гликоген, то есть PeriodicAcid-Schiff (PAS) цитохимическая реакция, может дополнить параметр IPF. Интересно также и то, что незрелые тромбоциты, выполняя ангиотрофическую и адгезивно-агрегационную функции, участвуя в процессах свертывания и фибринолиза, и обеспечивая ретракцию кровяного сгустка, гемостатически более активны [120].

В настоящей работе мы сравнили количество тромбоцитов и значения IPF (%) в контроле и у доноров, при получении ТК из цельной крови путем поэтапного фракционирования и посредством процедур аппаратного афереза. Сравниваемые параметры проанализированы у первичных доноров и у доноров, сдающих тромбоциты каждые две недели в течение от 2 до 5 лет. Исходя из полученных данных, можно предположить, что за счет фракции незрелых тромбоцитов происходит реализация резервов тромбоцитопоэза и в промежутках между донациями у доноров компенсирует изъятые тромбоциты.

Действительно, в начале процедур ни первичные, ни кадровые доноры не отличались от контроля по количеству циркулирующих тромбоцитов. В динамике ТЦА как у тех, так и у других количество тромбоцитов снизилось, клинически незначимо, но наиболее выражено по окончанию аппаратного афереза. При этом, если во время Зх-кратного ТЦА у первичных доноров подъем значений параметра IPF был выявлен, начиная с забора второго контейнера, то у кадровых, не взирая на способ получения ТК, его высокие по сравнению с контролем значения сохранялись на момент последующей процедуры, в среднем через две недели после донации.

Мало что известно о влиянии долгосрочных процедур тромбоцитафереза на здоровье доноров. Lazarus et al. (2001) на основании материала обследования 939 доноров в течение 4 лет первыми сообщили о том, что регулярные ТЦА могут привести к снижению количества тромбоцитов, циркулирующих в их крови [93]. Другие авторы [77] отметили, что процедура деплеции тромбоцитов может способствовать активации тромбоцитопоэза и восстановлению тромбокрита в течение буквально нескольких дней. Попытавшись в качестве индикатора тромбоцитопоэза подсчитать ретикулярные тромбоциты в сравнительном исследовании эффектов тромбоцитафереза у первичных доноров и доноров, проходящих процедуры ТЦА каждые две недели в течение 18 месяцев, Stohlawetz et al. (1998) [118] пришли к выводу о возможности мониторинга тромбопоэтической активности костного мозга с помощью этого показателя. У первичных доноров медиана показателя начинала увеличиваться с третьего дня после афереза, а ее возврат к исходному значению происходил на четвертый день. Напротив, у кадровых доноров устойчивый, но менее выраженный прирост ретикулярных тромбоцитов наблюдался с первого по четвертый день, а средние значения показателя были достоверно ниже, чем у первичных доноров. Статистически значимых различий по общему числу циркулирующих в периферической крови тромбоцитов в сравниваемых группах обнаружено не было. По мнению авторов, многократные и частые донации тромбоцитов могут привести к относительному истощению тромбоцитопоэза.

Интересно, что средняя величина IPF в группе наших кадровых доноров, которым проводился аппаратный ТЦА, превышая контроль на 14 день после очередного афереза, сразу же после проведения процедуры значимо снижалась.

Ответ тромбоцитопоэза на современные возможности извлечения тромбоцитов был также исследован Gyongyossy-Issa (2001) [76]. Оценка количества ретикулярных тромбоцитов в периферической крови доноров до и после проведения ТЦА позволила авторам предположить, что пик значений показателя на второй день после процедуры и последующая циркуляция незрелых клеток в течение семи дней, скорее всего, связаны с их выходом из селезеночного депо.

В этой связи, стойкое увеличение фракции незрелых тромбоцитов в периферической крови наших кадровых доноров, подвергающихся регулярным ТЦА, не исключая возможности выхода незрелых клеток из депо, мы склонны объяснить адаптацией кроветворения к частым донациям.

Измененная морфология тромбоцитов позволила Bessis (1972) [59] в свое время связать появление в периферической крови крупных незрелых кровяных пластинок с регенеративным ответом костного мозга и форсированным тромбоцитопоэзом. Интересно, что сравнение полученных в нашей работе данных оценки IPF у доноров с литературными сведениями о концентрации тромбопоэтина в динамике ТЦА показало аналогичную тенденцию изменений указанных параметров (Табл.12).

При повышенном потреблении тромбоцитов Kern et al. (2000) допускают возможность реализации резервов тромбоцитопоэза путем отшнуровки их незрелых форм непосредственно от мегакариоцитов, минуя стадию протромбоцитов (левый адаптационный сдвиг) [91]. Сейчас известно, что физическая нагрузка, связанная с эмоциональными напряжениями, вызывает значительные сдвиги в составе крови: в процессе активной двигательной деятельности возможны травмы с последующим кровотечением. Программируя "с опережением" такую ситуацию, организм повышает защитную функцию системы свертывания крови. Показано, что у спортсменов 16-18 лет после напряженной мышечной работы в