Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности

Дудко, Евгений Александрович

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Дудко, Евгений Александрович Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.01.12

Автореферат диссертации по медицине на тему Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности

На правах рукописи

Дудко Евгений Александрович

ТАМОКСИФЕН КАК ПОЛИВАЛЕНТНЫМ ИНГИБИТОР МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

Специальность 14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -

2010

004610714

Работа выполнена в лаборатории медицинской химии НИИ Экспериментальь диагностики и биотерапии опухолей Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Богуш Татьяна Анатольевна Тюляндин Сергей Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Комарова Людмила Егоровна Высоцкая Ирина Викторовна

Ведущая организация:

ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования МЗ и СР РФ

Защита диссертации состоится « »_2010 г. в_часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина РАМН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан «_»_

2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Наряду с высокой токсичностью большинства противоопухолевых препаратов, врожденная и индуцированная устойчивость к лекарственной терапии является важнейшим ограничением в достижении оптимальной эффективности лечения. Одним из универсальных механизмов развития устойчивости, который затрагивает не только большинство классических цитостати-ков, но и современные таргетные препараты, является так называемая множественная лекарственная резистентность, обусловленная активацией выброса противоопухолевых препаратов из клеток. Молекулярной основой этого процесса являются белки, ассоциированные с множественной лекарственной резистентностью, самые распространённые из которых - МКР1, ВСЯР и ЬИР. Высокий уровень экспрессии этих белков в клетке приводит к уменьшению внутриклеточной концентрации противоопухолевого препарата, и в результате этого рекомендованная к применению доза лекарства становится неэффективной.

Несмотря на многочисленные и многолетие попытки исследователей и клиницистов преодолеть множественную лекарственную резистентность и повысить эффективность химиотерапии, результаты остаются неудовлетворительными. Главную причину этого мы видим в стратегически неправильном подходе к решению этой задачи. В большинстве работ оптимизируются «старые» и изучаются новые специфические ингибиторы функции одного из белков множественной лекарственной резистентности - Р£р. Но реальность такова, что этот наиболее изученный транспортёр, как упоминалось выше, не является единственным. В опухолевых клетках экспрессируются и коэкс-прессируются разные белки, ассоциированные с множественной лекарственной резистентностью, и число их увеличивается с каждым годом. Следовательно, единственно эффективным может быть лишь воздействие, подавляющее функционирование разных транспортных белков, то есть механизм лекарственной устойчивости в целом.

Анализ данных литературы позволил предположить, что таким поливалентным ингибитором множественной лекарственной резистентности может быть антиэстроген тамоксифен, который является «золотым» стандартом в лечении рака молочной железы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Учитывая сказанное, целью настоящего исследования явилось изучение

тамоксифена как поливалентного ингибитора механизма множественной ле-

карственной резистентности, ассоциированного с транспортными белками, выбрасывающими противоопухолевые препараты из клеток.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Создать алгоритм проведения иммунофлуоресцентного анализа взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с Рвр, МЯР1, ВСИР и ЬКР:

• охарактеризовать фенотип множественной лекарственной резистентности в культурах опухолевых клеток человека - Т-лимфобластного лейкоза .ГигкаС, рака шейки матки НеЬа, аденокарциномы лёгкого А549 и создать панель культур, оптимальных для изучения взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с Р§р, МКР1, ВСЯР и ЬЯР;

• определить область линейной зависимости количества специфически окрашенных клеток и интенсивности специфической флуоресценции от концентрации моноклональных антител к Pgp, МИМ, ВСКР и ЬЯР.

2. В экспериментах на культурах клеток, отобранных на предыдущих этапах исследования, изучить влияние тамоксифена на взаимодействие моноклональных антител с маркёрами множественной лекарственной резистентности - Р§р, МКР1, ВСЯР и Ь11Р.

3. Исследовать влияние тамоксифена на функциональную активность транспортных белков Р§р и МИР1:

• в культуре опухолевых клеток человека линии 1игка1;

• в опухолевых клетках, полученных из хирургического материала опухолей человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В диссертационной работе решена задача оптимизации условий поиска и изучения потенциальных ингибиторов множественной лекарственной резистентности. В частности, создан алгоритм проведения иммунофлуоресцентного анализа взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с транспортными белками - Pgp, МЯР1, ВСЯР и Ы1Р. Впервые проведена многопараметрическая характеристика фенотипа множественной лекарственной резистентности в опухолевых клетках человека разного гистогенеза - Т-лимфобластный лейкоз 1игка1, рак шейки матки НеЬа, аденокар-цинома лёгкого А549. Создана панель клеточных культур, оптимальных для изучения взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с Р§р, М11Р1, ВСЯР и ЬИР. Выявлено, что описанное в литературе взаимодействие тамоксифена с Pgp не является специфичным по отноше-

нию только к этому транспортному белку. Тамоксифен взаимодействует также и с другими белками множественной лекарственной резистентности - с МКР1, ВСЯР и 1ЛР.

Показано, что взаимодействие тамоксифена с Pgp, М11Р1, ВСЯР и ЬЯР не зависит от происхождения опухолевых клеток и проявляется в культурах клеток разного гистогенеза.

Впервые, основываясь на полученных результатах о конкуренции между тамоксифеном и моноклональными антителами за связывание с транспортными белками Pgp, МКР1, ВСЯР и 1Л1Р, сформулировано представление о тамоксифене как о поливалентном ингибиторе фенотипа множественной лекарственной резистентности.

На культурах опухолевых клеток человека продемонстрировано увеличение внутриклеточного накопления противоопухолевого препарата и флуоресцентного зонда доксорубицина при воздействии тамоксифена. Таким образом, впервые получено экспериментальное доказательство того, что тамоксифен является ингибитором функциональной активности транспортных белков, ассоциированных с фенотипом множественной лекарственной резистентности.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные данные впервые экспериментально обосновали возможность клинического применения тамоксифена по новому назначению - для преодоления лекарственной устойчивости и повышения эффективности химиотерапии. В этом безусловная практическая значимость работы, так как тамоксифен не только разрешён, но и широко применяется у онкологических больных, поэтому оценка его эффективности в качестве ингибитора множественной лекарственной резистентности не встретит никаких бюрократических сложностей. А учитывая низкую стоимость препарата, нет и никаких экономических препятствий для продвижения тамоксифена в клинику по новому назначению.

Практически значимым итогом работы является также и впервые проведённая в ходе исследования оптимизация условий для решения важнейшей методической проблемы, а именно, поиска и изучения новых эффективных поливалентных ингибиторов механизма множественной лекарственной резистентности. Разработанный алгоритм проведения такого исследования позволит использовать разработанную методологию в любой квалифицированной лаборатории.

Впервые проведённая в ходе исследования характеристика ряда клеточных культур опухолей человека позволила создать референсную панель клеток, в которых охарактеризована экспрессия маркёров множественной лекарственной резистентности Pgp, MRP1, BCRP и LRP и определена область линейной зависимости интенсивности специфической флуоресценции клеток и количества окрашенных клеток от концентрации моноклональных антител. Созданная панель включает клетки Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat, рака шейки матки линии HeLa, аденокарциномы лёгкого линии А549 и может быть использована в рутинной практике при иммунофлуоресцентной оценке фенотипа множественной лекарственной резистентности солидных опухолей человека.

ОБЪЕМ И СТРУТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментов, обсуждение результатов, выводы. Работа изложена на 126 страницах, включает 1 таблицу, 41 рисунок и 125 ссылок на литературные источники.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Апробация диссертационной работы состоялась 21 мая 2010 г. на совместной научной конференции лабораторий: медицинской химии, разработки лекарственных форм, фармакоцитокинетики, синтетических противоопухолевых веществ, химии природных соединений, фармакологии и токсикологии, радиоизотопных методов исследования, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, отделения, клинической фармакологии и химиотерапии, а также диагностического хирургического отделения РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Основные положения диссертации опубликованы в 18 научных публикациях, доложены на международных и российских конференциях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа проведена на хирургических образцах опухолей больных, оперированных в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Кроме того, использованы культуры клеток человека: Т-лимфобластный лейкоз линии Jurkat, рак легкого линий Calu-1, Н1299, Н358, А549, рак шейки матки линии HeLa.

Использованы первичные моноклональные антитела, специфичные: к Pgp, клон 4ЕЗ (Abeam); к LRP, клон LMR5 (Abeam); к MRP1, клон MRPm5 (Abeam); к BCRP, конъюгированные с РЕ, клон 5D3 (R&D). Изотипические антитела: мышиный IgG2a (Abeam), крысиный IgG (Abeam), мышиный

IgG2a, конъюгированный с РЕ (R&D). Вторичные поликлональные антитела,

меченые FITC: к мышиному IgG2a, Fc-специфичные F(ab')2 фрагменты (Sigma); к крысиному IgG. Разведения антител: Pgp - 1:10, MRP 1-1:5, LRP -1:10, BCRP - неразведённый раствор.

Измерение внутриклеточной флуоресценции проведено на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson), с программными обеспечением CellQuest 3.3 и WinMDI 2.9.

Визуализация флуоресценции клеток проведена на флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse Ti-S, с программным обеспечением ACT.

Активность транспортных белков оценена по изменению внутриклеточного накопления флуоресцентного препарата доксорубицина (Sigma) при воздействии ингибиторов функции транспортёров: верапамила (Sigma) и ге-нистеина (Sigma) - ингибиторов Pgp и MRP1 соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ПОИСКА И ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА МОДИФИКАТОРОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

Перед началом основных экспериментов был решён ряд важных методических задач.

Во-первых, проведён анализ фенотипа множественной лекарственной резистентности в культурах клеток разного гистогенеза для отбора панели клеток, экспрессирующих Pgp, MRP 1, BCRP, а также белок LRP.

Во-вторых, на отобранных для дальнейшего исследования клетках определена область линейной зависимости интенсивности флуоресцентного окрашивания от концентрации специфических антител.

Отбор клеток для исследования тамоксифена проведён в ряду культур человека - рака лёгкого (Calu-1, Н1299, Н358, А549), Т-клеточного лейкоза Jurkat и рака шейки матки HeLa. Стабильный высокий уровень экспрессии разных транспортных белков и чёткая область линейной зависимости выявлены в клетках линий Jurkat, А549 и HeLa.

Так, для клеток линии Jurkat область линейной зависимости интенсивности флуоресценции и количества клеток, специфически окрашенных антителами к Pgp, лежит в диапазоне 1,0 - 5,0 мкл антител 4ЕЗ (Abeam), что соответствует концентрациям 0,5 - 2,0 мкг/мл (рис. 1 IA и 1Б).

Рис. 1. Зависимое от концентрации антител к Р^р, МКР1, ВСКР и Ы*Р флуоресцентное окрашивание клеток линии 1игка1, НеЬа и Л549

I Количество специфически окрашенных клеток

•и =

100 80 60 40 20 0

Pgp (Jurkat)

0 0,5 1 2,5 5 1020

MRP1 (HeLa)

0,5 1 2,5

BCRP (Jurkat)

2,5 5 10 20

LRP (A549)

0 0,25 0,5 1 2,5 5 10

II Интенсивность специфической флуоресценции клеток

« S

Pgp (Jurkat)

BCRP (Jurkat)

2,5 5 10 20

LRP (A549)

0 0,5 1 2,5 5 10

0 0,25 0,5 1 2,5 5 10

Количество специфических антител, мкл

Представлены кривые зависимости количества окрашенных клеток (рис. I) и интенсивности флуоресценции (рис. II) от концентрации антител к Pgp, BCRP, MRP I и LRP. По оси абсцисс - количество антител в мкл. Области линейной зависимости параметров флуоресцентного окрашивания клеток от концентрации антител выделены кругами.

Представлены результаты одного из трёх экспериментов, типичных для каждого из транспортёров.

Линейная зависимость интенсивности специфической флуоресценции и количества клеток линии Jurkat (рис. 1), специфически окрашенных антителами к BCRP, выявлена в диапазоне 5,0-10,0 мкл антител 5D3 (R&D) (нераз-ведённый коммерческий раствор).

HeLa лежит в диапазоне 1,0-5,0 мкл антител MRPm5 (Abeam), что соответствует концентрациям 0,625; 1,25 и 2,5 мкг/мл (рис. 1).

И наконец, в клетках А549 (рис. 1) выявлена линейная зависимость интенсивности флуоресценции и количества клеток, специфически окрашенных антителами к LRP, в диапазоне количеств от 1,0 до 5,0 мкл (коммерческий раствор в разведении 1:10) антител LMR5 (Abeam).

Показано также (данные не приведены), что тамоксифен не влияет на окрашивание клеток разного гистогенеза изотипическими антителами, не имеющими антигена в этих клетках, а также на автофлуоресценцию клеток.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТАМОКСИФЕНА С БЕЛКАМИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РАЗНОГО ГИСТОГЕНЕЗА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТАМОКСИФЕНА С Pgp

Взаимодействие тамоксифена с Pgp исследовано на культуре клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jurkat. Данные, представленные на рис.3, демонстрируют влияние тамоксифена на параметры окрашивания клеток линии Jurkat при разных концентрациях моноклональных антител к Pgp. Видно, что в области линейной зависимости интенсивности флуоресценции от количества антител при воздействии тамоксифена интенсивность специфической флуоресценции клеток увеличилась. Максимальное превышение средней интенсивности флуоресценции клеток в 2,3 раза по сравнению с изотипическим контролем после инкубации с тамоксифеном отмечено при количестве антител 2,5 мкл (рис. ЗА).

На рис. 4 представлены примеры гистограмм распределения клеток по интенсивности специфической флуоресценции, демонстрирующие влияние тамоксифена на связывание моноклональных антител с Pgp в клетках Т-лимфоблаетного лейкоза линии Jurkat в области линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антител.

Отчетливо видно смещение гистограмм специфически флуоресцирующих клеток после преинкубации с тамоксифеном вправо по сравнению с клетками, инкубировавшимися только с антителами к Pgp. Это сопровождается увеличением интенсивности специфической флуоресценции клеток, подвергшихся воздействию тамоксифена, при разных концентрациях моноклональных антител к Pgp (рис. 4 А и Б) в 2,3 и 1,7 раз.

Рис. 3. Влияние тамоксифена на специфическое связывание моиоклональных антител с Pgp в клетках Т-лимфобластиого лейкоза человека линии Jurkat

Т2.3

Т1.7 ^ —■ —

|1,4

о х V -

100 80 60 40 20 0

f45% |18%

2,5

Количество специфических антител, мкл По оси абсцисс - концентрация антител в мкл. По оси ординат - средняя интенсивность флуоресценции относительно изотопического контроля (А) и количество клеток (в %) (Б), специфически окрашенных моноклональными антителами к Pgp. ф— - после инкубации с моноклональными антителами к Pgp.

•— - после преинкубации с тамоксифеном и последующей инкубации с моноклональными антителами к Pgp. Цифры и стрелки указывают изменение показателя при воздействии тамокси-фена в сравнении с аналогичным показателем без воздействия тамоксифена: f - увеличение;«-» — без изменения. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

Рис. 4. Примеры гистограмм, демонстрирующих влияние тамоксифена на специфическое связывание моиоклональных антител с Pgp в клетках линии Jurkat

Интенсивность флуоресценции

Показатель А Б

Интенсивность специфической флуоресценции Т2,3 TU

Количество специфически окрашенных клеток ?2,5 Т 1.4

По оси абсцисс - средняя интенсивность флуоресценции (усл.ед), по оси ординат - количество клеток. Рис. А и Б - при количестве специфических антител 2,5 и 5,0 мкл соответственно. Закрашенные гистограммы - интенсивность специфической флуоресценции клеток без тамоксифена, незакрашенные - после преинкубации с тамоксифеном. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

Визуализация выявленного эффекта тамоксифена (увеличение количества и интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных моноклональными антителами к Pgp) проведена методом флуоресцентной микроскопии.

На рис. 5 представлены фотографии клеток Jurkat, окрашенных антителами к Pgp, без воздействия (рис. 5А) и после воздействия тамоксифена (рис. 19Б). Можно отметить, что на рис. 5Б, по сравнению с рис. 5А, окрашены все клетки и интенсивность флуоресценции этих клеток гораздо выше. Таким

образом, эффект тамоксифена на клетки Jurkat, выявленный с помощью

флуоресцентного микроскопа, подтверждает данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии.

Рис. 5. Влияние тамоксифена на взаимодействие моноклональных антител с Р»р в клетках Т- лимфобластного лейкоза человека линии Лигка!

А - специфическое окрашивание моноклональными антителами к Pgp, без тамоксифена. Б - специфическое окрашивание моноклональными антителами к Pgp, после воздействия тамоксифена. Концентрация антител к Pgp - 2 мкг/мл, тамоксифена - 50 мкМ.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТАМОКСИФЕНА С ВСИР

Маркёр множественной лекарственной резистентности ВСКР экспресси-руется на плазматической мембране клеток и близок по структуре к Pgp. Им-мунофлуоресцентным методом ВСЮ3 выявляется во всех исследованных нами на предыдущих этапах работы клеточных культурах в небольшом проценте клеток, и высший показатель экспрессии регистрируется в клетках Т-лимфобластного лейкоза человека линии 1игка1 (см. рис. 1). Данные, представленные на рис. 6, демонстрируют влияние тамоксифена на параметры окрашивания клеток линии .Гигка! при разных концентрациях моноклональных антител к ВСШ3. Видно, что в области линейной зависимости интенсивности флуоресценции от количества антител при воздействии тамоксифена интенсивность флуоресценции клеток увеличилась. Максимальное превышение средней интенсивности флуоресценции клеток в 2,0 раза по сравнению с изотипическим контролем после инкубации с тамоксифеном отмечено при количестве специфических антител 5,0 мкл (рис. 6А).

После воздействия тамоксифена также увеличилось и количество окрашенных клеток (рис. 6Б).

Рис. 6. Влияние тамоксифена на специфическое связывание моноклональных антител с BCRP в клетках Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jurkat

5 -в

Количество специфических антител, мкл

По оси абсцисс — концентрация антител в мкл. По оси ординат - средняя интенсивность флуоресценции относительно изотопического контроля (А) и количество клеток (Б), специфически окрашенных антителами к BCRP.

$- - после инкубации с моноклональными антителами к BCRP.

•---после преинкубации с тамоксифеном и последующей инкубации с моноклональными антителами к BCRP. Цифры и стрелки указывают изменение показателя при воздействии тамоксифена в сравнении с аналогичным показателем без воздействия тамоксифена: f - увеличение; *-* -без изменения. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

Рис. 7. Гистограммы, демонстрирующие влияние тамоксифена на связывание моноклональных антител с BCRP в клетках Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat

§ и,

5 Показатель А Б

Интенсивность

специфической флуоресценции Т2,1 TU7

Количество

специфически Т27 ?15

окрашенных % %

клеток

Интенсивность флуоресценции

По оси абсцисс - средняя интенсивность флуоресценции (усл. ед.), по оси ординат - количество клеток. Рис. А и Б - при количестве специфических антител 5,0 и 10,0 мкл соответственно. Закрашенные гистограммы - интенсивность специфической флуоресценции клеток без тамоксифена, незакрашенные - после преинкубации с тамоксифеном. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

На рис. 7 представлены примеры гистограмм распределения клеток по интенсивности специфической флуоресценции, демонстрирующие влияние тамоксифена на связывание моноклональных антител с BCRP в клетках Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat в области линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антител. Отчетливо видно смещение гистограмм специфически флуоресцирующих клеток после преинкубации с тамоксифеном вправо по сравнению с клетками, инкубировавшихся только с антителами к BCRP. Это сопровождается увеличением интенсив-

ности специфической флуоресценции клеток, подвергшихся действию та-моксифена, при разных концентрациях моноклональных антител к ВС11Р в 1,8 и 1,7 раз (рис. 7 А и Б).

Таким образом, результатом взаимодействия тамоксифена с маркёрами множественной резистентности Р§р и ВСЯР является увеличение связывания моноклональных антител с этими белками. Принципиально другой эффект тамоксифена выявлен при исследовании связывания с клетками моноклональных антител с МШЧ.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТАМОКСИФЕНА С МШЧ

Изучение эффекта тамоксифена на взаимодействие специфических антител с МШЧ проведено з клетках рака шейки матки человека линии НеЬа, в которых, как упоминалось выше, выявлен высокий уровень экспрессии МИР1 (см. рис. 1).

Рис. 8. Влияние тамоксифена на специфическое связывание моноклональных антител с МКР1 в клетках рака шейки матки человека линии НеЬа

я и

о. о

и H

о щ

- 5

4 5

5 а

Количество специфических антител, мкл

По оси абсцисс — количество добавляемых антител в мкл. По оси ординат - средняя интенсивность флуоресценции относительно изотопического контроля (А) и количество клеток (Б), специфически окрашенных антителами к MRPI.

ф- - после инкубации с моноклональными антителами к MRP 1.

•---- после преинкубации с тамоксифеном и последующей инкубации с антителами к MRP1.

Цифры и стрелки указывают изменение показателя при воздействии тамоксифена в сравнении с аналогичным показателем без воздействия тамоксифена: f - увеличение; «-► — без изменения. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

На рис. 8 приведены кривые изменения параметров окрашивания моноклональными антителами к MRP1 после воздействия тамоксифена при разных концентрациях антител. Видно, что в области линейной зависимости флуоресцентного окрашивания клеток от концентрации моноклональных антител происходит уменьшение параметров окрашивания. Максимальное уменьшение средней интенсивности флуоресценции клеток в 2,1 раз по срав-

нению с изотипическим контролем после инкубации с тамоксифеном отмечено при количестве моноклональных антител 5,0 мкл (рис. 8А). После воздействия тамоксифена также уменьшилось и количество окрашенных клеток (рис. 8Б).

Рис. 9. Гистограммы, демонстрирующие влияние тамоксифена на связывание моноклональных антител с MRP1 в клетках рака шейки матки человека HeLa

Показатель А Б

Интенсивность специфической флуоресценции il,4 il,9

Количество специфически окрашенных клеток 4.23 % 142 %

Интенсивность флуоресценции

По оси абсцисс - средняя интенсивность флуоресценции, по оси ординат - количество клеток. Рис. А и Б - при количестве специфических антител 2,5 и 5,0 мкл соответственно. Закрашенные гистограммы - интенсивность специфической флуоресценции клеток без тамоксифена, незакрашенные - после преинкубации с тамоксифеном. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

Гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции, демонстрирующие влияние тамоксифена представлены на рис. 9. Смещение прозрачных гистограмм (окрашивание после воздействия тамоксифена) относительно тёмных (окрашивание без тамоксифена) влево говорит об уменьшении количества окрашенных клеток и средней интенсивности флуоресценции моноклональных антител к МЯР1 в клетках рака шейки матки человека линии НеЬа. При количестве антител 2,5 мкл процент специфически окрашенных клеток при воздействии тамоксифена снизился в 2,3 раза - с 41 до 18 % (рис. 9А), а при концентрации антител 5,0 мкл - в 2,7 раза: с 66 до 24 % (рис. 9Б). Превышение средней интенсивности флуоресценции клеток после инкубации с тамоксифеном при количестве специфических антител 2,5 мкл уменьшилось в 1,4 раза - с 1,7 до 1,2 раз (рис. 9А), а при количестве антител 5,0 мкл - в 1,9 раза: с 2,7 до 1,4 раз (рис. 9Б).

Аналогичное изменение параметров окрашивания клеток линии НеЬа выявлено с использованием флуоресцентной микроскопии. На рис. 10 представлены фотографии идентичных клеток НеЬа в световом (рис. 10 А и В) и

Рис. 10. Окрашивание клеток рака шейки матки человека линии НеЬа монокло-нальными антителами к МЯР1

А, В - клетки рака шейки матки человека линии HeLa в световом поле микроскопа. Б. Г - те же клетки после окрашивания специфическими антителами к MRP 1.

Рис. 11. Влияние тамоксифена на специфическое взаимодействие моноклональных антител с MRP1 в клетках рака шейки матки человека линии HeLa

А Б

А, В - клетки рака шейки матки человека линии HeLa в световом поле микроскопа. Б, Г - те же клетки после инкубации с тамоксифеном и последующего окрашивания специфическими антителами к MRP1.

флуоресцентном (рис.10 Б и Г) полях после инкубации с моноклональными антителами к MRP 1. Видно, что практически все клетки имеют яркое свечение, и только единичные практически не окрашены. На рис 11 показаны ана-

логичные данные после воздействия тамоксифена. Видно, что количество специфически флуоресцирующих клеток значительно уменьшилось (как и на рис. 10 отмечены стрелками). Отчётливо видно уменьшение интенсивности флуоресценции клеток, специфически окрашенных антителами к М11Р1.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТАМОКСИФЕНА С На рис. 12 приведены кривые изменения параметров окрашивания мо-ноклонапьными антителами к ЬИР после воздействия тамоксифена при разных концентрациях антител. Видно, что в области линейной зависимости флуоресцентного окрашивания клеток от концентрации моноклональных антител происходит уменьшение параметров окрашивания. Максимальное уменьшение средней интенсивности флуоресценции клеток в 1,9 раз по сравнению с изотипическим контролем после инкубации с тамоксифеном отмечено при количестве антител 5,0 мкл (рис. 12 А). После воздействия тамоксифена также уменьшилось и количество окрашенных клеток (рис. 6Б).

Рис. 12. Влияние тамоксифена на связывание моноклональных антител с в клетках аденокарциномы лёгкого человека линии А549

а С 10

Х*Ц6%

0,5

Количество специфических антител, мкл

2,5

По оси абсцисс - концентрация антител в мкл. По оси ординат - средняя интенсивность специфической флуоресценции относительно изотопического контроля (А) и количество клеток (Б), специфически окрашенных антителами к ЬЯР. О-— - после инкубации с моноклональными антителами к ЬКР.

•---- после преинкубации с тамоксифеном и последующей инкубации с моноклональными

антителами к ЬИР. Цифры и стрелки указывают изменение показателя при воздействии тамоксифена в сравнении с аналогичным показателем без воздействия тамоксифена: | - увеличение; <-» -

без изменения. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

Гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции демонстрирующие влияние тамоксифена представлены на

рис. 13. Смещение прозрачных гистограмм (после действия тамоксифена) относительно тёмных (без тамоксифена) влево говорит об уменьшении количества специфически окрашенных клеток и средней интенсивности флуоресценции специфических антител к ЬИР в клетках аденокарциномы лёгкого человека линии А549. Интенсивность специфической флуоресценции клеток, подвергшихся воздействию тамоксифена, увеличилась в 1,8 раза при количестве антител к Ь11Р 5,0 мкл, а при 10,0 мкл в 2,0 раза (рис. 13 А и Б). При количестве антител 2,5 мкл процент окрашенных клеток при воздействии тамоксифена увеличился на 24 - с 31 до 55 %, а при концентрации антител 5,0 мкл - на 36: с 48 до 84 % (рис. 13 А и Б).

Рис. 13. Гистограммы, демонстрирующие влияние тамоксифена на связывание мо-ноклональных антител с 1Л<Р в клетках аденокарциномы лёгкого человека А549

Показатель А Б

Интенсивность специфической флуоресценции 11,8 12,0

Количество специфически окрашенных клеток 124 % ¿36 %

Интенсивность флуоресценции

На рис. 14 представлены фотографии идентичных клеток А549 в световом поле (рис. 14 А и В) и флуоресцентном (рис. 14 Б и Г). При сравнении рис. А и Б можно отметить, что по интенсивности окрашивания популяция клеток А549 гетерогенна, так как отчётливо видны, как ярко, так и слабо флуоресцирующие клетки, как клетки с чётко выраженной флуоресцирующей зернистостью, так и без неё. После воздействия тамоксифена также можно видеть и окрашенные клетки, и флуоресцирующую зернистость. Но по интенсивности флуоресценции популяция становится более однородной, при практически полном отсутствии ярко флуоресцирующих клеток. В то же время, после воздействия тамоксифена зернистость появляется в большем количестве клеток и становится более яркой (рис. 14Г).

Рис. 14. Влияние тамоксифена на окрашивание клеток аденокарциномы лёгкого человека линии А549 моноклональными антителами к

¡мн

■гЩ-

'Щ*

Клетки аденокарциномы лёгкого линии А549 после окрашивания моноклональными антителами к LRP в количестве 2,5 мкл: в световом (А) и флуоресцентном (Б) поле.

Клетки аденокарциномы лёгкого линии А549 после окрашивания моноклональными антителами к LRP в количестве 2,5 мкл после преинкубации с тамоксифеном: в световом (В) и флуоресцентном (Г) поле.

ВЛИЯНИЕ ТАМОКСИФЕНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ Pgp И MRP

Для оценки влияния тамоксифена на функциональную активность белков множественной лекарственной резистентности использован метод, разработанный в нашей лаборатории, и основанный на уникальном свойстве доксорубицина как флуоресцентного зонда: при взаимодействии с ДНК интенсивность его флуоресценции значительно уменьшается. При этом увеличение аккумуляции антрациклина в ядре приводит к снижению внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, а повышение содержания препарата в цитоплазме - к увеличению.

На рис. 15 представлено влияние специфических ингибиторов Р§р (верапамила) и МКР1 (генистеина) на накопление доксорубицина в клетках линии ,1игка1;. Эффект тамоксифена по направленности и выраженности сравним с результатом воздействия на клетки верапамила и генистеина (рис. 15 А

и Б соответственно). При высоких концентрациях доксорубицина оба ингибитора в 1,5-2,0 раза уменьшили внутриклеточную флуресценцию доксорубицина, то есть значительно ингибировали функцию Р§р и МКР1, контролирующих внутриядерное накопление антрациклина. При низкой концентрации доксорубицина воздействие на клетки ингибиторов Pgp и МЯР1 приводило к увеличению внутриклеточной флуоресценции, то есть к увеличению цито-плазматического накопления антрациклина.

Рис. 15. Влияние верапамила и генистеина на внутриклеточное накопление доксорубицина в клетках Т-лимфобластного лейкоза человека линии .Тигка!

1,2 0,3 0,4

гь

1/5

Концентрация доксорубицина

"7=

1/10

По оси абсцисс - концентрация доксорубицина (за единицу принята концентрация 5 -10"7М). По оси ординат - внутриклеточная флуоресценция доксорубицина относительно показателя при максимальной концентрации антрациклина 5 -10"7М. Цифры указывают изменение показателя при воздействии верапамила (А) и генистеина (Б) в сравнении с аналогичным показателем без воздействия ингибиторов.

| | - после инкубации с доксорубииином.^ва - после преинкубации с ингибиторами.

Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

Результаты влияния тамоксифена на внутриклеточное накопление доксорубицина представлены на рис. 16. Видно выраженное изменение внутриклеточного накопления доксорубицина после преинкубации клеток 1игка1 с тамоксифеном. При высоких концентрациях антрациклина зарегистрировано уменьшение внутриклеточной флуоресценции после воздействия тамоксифена, что свидетельствует об ингибирующем воздействии антиэстрогена на транспортные белки, контролирующие внутриядерное накопление цитоста-тика. При снижении концентрации доксорубицина воздействие тамоксифена привело к увеличению внутриклеточной флуоресценции антрациклина, что

свидетельствует об ингибировании функции транспортных белков, контролирующих цитоплазматическое накопление доксорубицина.

Имея в виду конечную цель исследования - клиническое применение тамоксифена в качестве ингибитора лекарственной устойчивости, проведены эксперименты с опухолевыми клетками, выделенными из биопсийного хирургического материала опухолей человека.

Первым этапом этих экспериментов явилась характеристика фенотипа множественной лекарственной резистентности при окрашивании клеток антителами к Pgp, МИМ, ВСЯР и 1Л1Р. В опухолевых клетках, экспрессирую-щих один или несколько транспортных белков, оценено влияние на внутриклеточное накопление доксорубицина.

Рис. 16. Влияние тамоксифена на внутриклеточное накопление доксорубицина в клетках Т-лимфобластного лейкоза человека линии Лиг1;а(

1,2

2««

Ё и в g в я

а аг

3 Я > 2 So к с. в

с. о s t fc* * 5 •в- 4

0,8

0,4-

1/5

1/10

Концентрация доксорубицина

По оси абсцисс - концентрация доксорубицина (за единицу принята концентрация 5 • 10"7М). По оси ординат - внутриклеточная флуоресценция доксорубицина относительно показателя при максимальной концентрации антрациклина 5 -10"7М. Цифры указывают изменение показателя при воздействии тамоксифена в сравнении с аналогичным показателем без воздействия тамоксифена. I | - после инкубации с доксорубицином. - после преинкубации с тамоксифеном. Представлены результаты одного из трёх типичных экспериментов.

На рис. 17А и Б представлены гистограммы, демонстрирующие влияние тамоксифена на внутриклеточное накопление доксорубицина в клетках немелкоклеточного рака лёгкого. В первом случае (рис. 17А) выявлена только экспрессия Pgp, а по остальным маркёрам множественной лекарственной резистентности опухоль имела отрицательный статус. При этом тамоксифен значительно увеличил накопление в клетках доксорубицина, что видно по смещению прозрачной гистограммы вправо относительно закрашенной. Это позволяет заключить, что тамоксифен ингибирует функциональную активность Pgp. В клетках другого образца немелкоклеточного рака лёгкого, в ко-

торых выявлен высокий уровень экспрессии Pgp и MRP1 (рис. 17 Б), эффект тамоксифена регистрируется как уменьшение интенсивности внутриклеточ-

Ркс. 17. Влияние тамоксифена (Tarn) на внутриклеточное накопление доксорубицина (Dox) в клетках солидных опухолей человека с разным фенотипом множественной лекарственной резистентности

А Немелкоклеточный рак лёгкого Б

Pgp+ MRPl" BCRP" LRP~ Pgp+ MRP1+ BCRP~ LRP"

10° 10' 10: 1GJ

В Рак желудка Pgp+ MRP1+ В CRP" LRP

Г Рак молочной железы Pgp+ MRP1+ BCRP" LRP" Там

Dox

10° 10' 1P: 10

Д Рак пищевода Pgp+ MRP1+ BCRP+ LRP+

По оси абсцисс - средняя интенсивность флуоресценции (усл.ед.), по оси ординат -количество клеток. Закрашенные гистограммы - без тамоксифена, прозрачные - после преинкубации с тамоксифеном.

10* 10

ной флуоресценции доксорубицина, что говорит об увеличении накоплении антрациклина в ядре, связывании его с ДНК и, как следствие, - тушение внутриклеточной флуоресценции.

В клетках рака молочной железы с экспрессией Pgp (рис. 17Г) антиэстроген увеличил интенсивность внутриклеточной флуоресценции антрацик-

лина. На рис. 17В представлен пример эффекта тамоксифена в клетках рака желудка, в которых определен высокий уровень экспрессии MRP1. Антиэстроген уменьшил интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксору-бицина, что свидетельствует об ингибировании функции околоядерных транспортёров.

И наконец, на рис. 17Д представлены результаты исследования клеток рака пищевода, в которых выявлена экспрессия всех четырёх маркёров множественной лекарственной резистентности, для которых изучено их взаимодействие с антиэстрогеном - Pgp, MRP1 BCRP и LRP. Видно значительное смещение влево прозрачной гистограммы относительно закрашенной, что означает ингибирование транспортных белков и увеличение накопления док-сорубицина в клетках рака желудка после воздействия тамоксифена.

Итак, в результате проведенного исследования выявлено взаимодействие антиэстрогена со всеми наиболее изученными, прогностически значимыми маркёрами множественной лекарственной резистентности - с Pgp, MRPI, BCRP и LRP в опухолевых клетках разного происхождения и гистогенеза.

Результатом описанного феномена явилось ингибирование антиэстрогеном функции транспортных белков, что повышает клиническую значимость тамоксифена как поливалентного ингибитора механизма множественной лекарственной резистентности.

Ингибирующий эффект тамоксифена на функциональную активность белков множественной лекарственной резистентности проявился не только in vitro на культуре клеток, но и ex vivo в отношении опухолей человека разных локализаций с охарактеризованным фенотипом множественной лекарственной резистентности. При этом так же, как и в культурах опухолевых клеток показано увеличение не только цитоплазматического, но и ядерного накопления противоопухолевого препарата доксорубицина. Последнее наиболее важно, так как ядро и ядерные ферменты являются основной мишенью действия большинства противоопухолевых препаратов.

По существу, факт ингибирования функции Pgp, MRPI, BCRP и LRP позволил положительно ответить на вопрос, поставленный в настоящем исследовании, - тамоксифен является поливалентным ингибитором механизма множественной лекарственной резистентности и может быть использован по этому назначению в клинике.

Судя по анализу работ, результаты которых опубликованы в поисковой

системе Medline, восстановление эффективности химиотерапии после клини-

чески диагностированной резистентности может быть достигнуто при дозе тамоксифена от 40 до 80 мг/м2 в день в течение 1-2 недель до начала и затем в ходе лечения. Есть все основания считать, что в таком дозовом и временном режиме применения сможет реализоваться выявленная в настоящем исследовании активность тамоксифена как поливалентного ингибитора механизма множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с выбросом противоопухолевых препаратов из клетки.

ВЫВОДЫ

1. Разработан алгоритм иммунофлуоресцентной оценки модификаторов множественной лекарственной резистентности.

2. Тамоксифен взаимодействует с маркёрами множественной лекарственной резистентности - Р£р, М11Р1, ВСЯР и ЬЯР.

3. Тамоксифен ингибирует функциональную активность транспортных белков множественной лекарственной резистентности и увеличивает цито-плазматическое и ядерное накопление противоопухолевых препаратов.

4. Ингибирующее влияние тамоксифена на механизм множественной лекарственной резистентности реализуется не только в культурах клеток, но и в солидных опухолях человека разного гистогенеза.

5. Тамоксифен - поливалентный ингибитор механизма множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с экспрессией транспортных белков Pgp, МЯР1, ВС11Р и 1ЛР.

Список опубликованных работ

1. Богуш Е.А., Равчеева А.Б., Смирнова Г.Б., Кирсанов В.Ю., Дудко Е.А.. Штепа Л.В., Богуш Т.А. Pgp и MRP - маркеры чувствительности к тамоксифену рака молочной железы с положительным статусом эстрогеновых рецепторов. // Российская научно-практическая конференция "Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях". - Барнаул. - 2007. - 14-15 июня. - С. 6-7.

2. Богуш Т.А., Равчеева А.Б., Богуш Е.А., Ишатова Е.О., Дудко Е.А.. Лактионов К.К., Полоцкий Б.Е., Давыдов М.И.. Новый механизм регуляции внутриклеточного распределения противоопухолевых препаратов в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с функцией АВС-транспортеров. // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. - 2008. -Т. 19 №2.-С. 4-14.

3. Игнатова Е.О., Дудко Е.А.. Рыбко В.А. АВС-транспортеры, ассоциированные с механизмом множественной лекарственной резистентности, как прогностические маркеры чувствительности к тамоксифену рака молочной железы. // Материалы XLVI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск. - 2008. - 26-30 апреля. - С. 28.

4. Богуш Т.А., Дудко Е.А.. Рыбко В.А., Богуш Е.А., Чемерис Г.Ю., Давыдов М.И. АВС-транспортеры Pgp и MRP - маркеры устойчивости к тамоксифену рака молочной железы с положительным статусом эстрогеновых рецепторов. // Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - №1. - С. 35-36.

5. Богуш Т.А., Дудко Е.А.. Богуш Е.А., Барышников А.Ю. Характеристика взаимодействия специфических антител с Pgp в клетках Т-лимфобластного лейкоза линии Jur-kat. // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т.54 № 1-2. - С. 3-9.

6. Богуш Т.А, Дудко Е.А. Бёме A.A., Богуш Е.А., Полоцкий Б.Е., Тюляндин СЛ., Давыдов М.И. Экспрессия эстрогеновых рецепторов в опухолях, отличных от рака молочной железы. // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - № 7-8. - С. 41-49.

7. Дудко Е.А.. Богуш Т.А., Тихомиров М.В., Раманаускайте Р.Ю., Бурова О.С., Барышников А.Ю. Параметры иммунофлуоресцентной оценки экспрессии маркера множественной лекарственной резистентности Pgp в клетках Т-клеточного лейкоза линии Jurkat. // Материалы научной конференции «Наноонкология».- Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № I. - С. 14.

8. Богуш Т.А., Дудко Е.А., Тихомиров М.В., Равчеева А.Б., Конухова A.B., Бахтадзе Л.А., Лактионов К.К., Полоцкий Б.Е., Давыдов М.И. Молекулярные маркеры лекарственной резистентности немелкоклеточного рака легкого; научные факты и возможности их клинического применения. // Материалы научной конференции «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека». - Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина. -2009. -№1. - С. 78-79.

9. Богуш Т.А., Дудко Е.А., Богуш Е.А., Кирсанов В.Ю., Ковалева О.В., Давыдов М.И. Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности опосредованной транспортными белками Pgp, MRP1 и LRP. // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». - Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - №2. - С. 4-5.

10. Богуш Т.А., Дудко Е.А.. Богуш Е.А., Тихомиров М.В., Кирсанов В.Ю., Давыдов М.И. MRP как новый прогностический маркер эффективности тамоксифена при лечении рака молочной железы с положительным статусом эстрогеновых рецепторов. // Доклады академии наук. - 2010. - Т.430 № 5. - С. 700-704.

11. Bogush Т.А., Bogush Е.А., Kirsanov V.J., Dudko E.A.. Tchemeris G.Y., Davidov M.I. Tamoxifen as inhibitor of multidrug resistance mechanism in lung and breast cancer tumours. // 6,h European Breast Cancer Conference (EBCC-6). - 2008. - Eur J Cancer. - Vol.6 №7. -P.84.

12. Bogush T.A., Bogush E.A., Dudko E.A.. Laktionov K.K., Polotskiy B.E., Davidov M.I. MRP functional activity in non-small cell lung cancer may be adequately characterized basing on MRP gene or protein expression. // б"1 International Symposium on Targeted Anticancer Therapies. - Bethesda. - 2008. - March 20-22. - G02.

13.Dudko E.A.. Bogush E.A., Bogush T.A., Kirsanov V.J., Tchemeris G.Y., Davidov M.I. MDR-transporters, namely Pgp, MRP1 and vault protein LRP, as poor predictive of tamoxifen efficiency in estrogen receptor positive breast cancer tumours. // 20"' EORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets And Cancer Therapeutics. - 2008. - Vol.6 №12. - P.155-156.

14. Dudko E.A.. Bogush T.A., Bogush E.A., Kirsanov V.J., Davydov M.I. Tamoxifen as a polyvalent inhibitor of multidrug resistance deals with expression of transport proteins Pgp, MRP1 and LRP. // 20th ICACT International Congress On Anti-Cancer Treatment. - Paris. -2009. - 3-6 February. - P.437.

15. Bogush T.A., Dudko E.A.. Bogush E.A., Tikchomirov M.V., Beme A.A. Laktionov K.K., Vakhtadze L.A., Polotsky B.E., Davydov M.I. Overcoming the chemotherapy resistance in non-small-cell lung cancer by tamoxifen. // Материалы научной конференции «13th World Conference on Lung Cancer». - San Francisco. - 2009. - 31 July-4 August. - № 1.076.

16. Dudko E.A.. Bogush T.A. Multidrug resistence (MDR) transporters and vault protein LRP as tamoxifen molecular targets. // ECCO 15-ESMO 34. - Berlin. - 2009. - 20-24 September.-№1.034.

17. Dudko E.A.. Troyanova N.I., Kirsanov V.J., Ramanayskaite R.J., Bogush T.A. Protein kinase С delta as a molecular target of tamoxifen. //21st ICACT International Congress On Anti-Cancer Treatment. - Paris. -2010.-1-5 February. - P. 407-408.

18. Bogush T.A, Dudko E.A., Bogush E.A., Tikchomirov M.V., Juraev E.E., Beme A.A., Polotsky B.E., Davydov M.I. Expression of multidrug resistance marker P-glycoprotein (Pgp) in non-small cell lung cancer and adjacent normal lung tissue. //21st ICACT International Congress On Anti-Cancer Treatment. - Paris. - 2010. -1-5 February. - P. 442-443

Подписано в печать о г. о 8.1 о Формат 60 х 84/16 Бумага офисная «БуеШСору». Тираж 100 экз. Заказ № 638 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Дудко, Евгений Александрович :: 2010 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1-1. Тамоксифен: история создания, развитие представлений о механизме действия, клиническое применение.

1-2. Разные биологические эффекты тамоксифена: ингибирование пролиферации и ангиогенеза, активация апоптоза.

1-3. Множественная лекарственная резистентность, ассоциированная с выбросом лекарственных препаратов из клеток

1-3.1. Маркеры множественной лекарственной резистентности.

1-3.2. Подходы к преодолению множественной лекарственной резистентности и причины клинических неудач.

1-3.3. Тамоксифен как потенциальный ингибитор множественной лекарственной резистентности.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА III. РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ОЦЕНКИ МОДИФИКАТОРОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ.

ГЛАВА IV. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТАМОКСИФЕНА С БЕЛКАМИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РАЗНОГО ГИСТОГЕНЕЗА.

IV-1. Взаимодействие тамоксифена с Pgp.

IV-2. Взаимодействие тамоксифена с MRP

IV-3. Взаимодействие тамоксифена с BCRP.

IV-4. Взаимодействие тамоксифена с LRP.

ГЛАВА V. ВЛИЯНИЕ ТАМОКСИФЕНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ Pgp И MRP1.

ГЛАВА VI. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации по теме "Онкология", Дудко, Евгений Александрович, автореферат

Наряду с высокой токсичностью большинства противоопухолевых препаратов, врожденная и индуцированная устойчивость к лекарственной терапии является важнейшим ограничением в достижении оптимальной эффективности лечения. Одним из универсальных механизмов развития устойчивости, который затрагивает не только большинство классических цитостатиков, но и современные таргетные препараты, является так называемая множественная лекарственная резистентность, обусловленная активацией выброса противоопухолевых препаратов из клеток. Молекулярной основой этого процесса являются белки, ассоциированные с множественной лекарственной резистентностью, самые распространённые из которых - Pgp, MRP1, BCRP и LRP. Высокий уровень экспрессии этих белков в клетке приводит к уменьшению внутриклеточной концентрации противоопухолевого препарата, и в результате этого рекомендованная к применению доза лекарства становится неэффективной.

Несмотря на многочисленные и многолетие попытки исследователей и клиницистов преодолеть множественную лекарственную резистентность и повысить эффективность химиотерапии, результаты остаются неудовлетворительными. Главную причину этого мы,, видим в стратегически неправильном подходе к решению этой задачи. В большинстве работ оптимизируются «старые» и изучаются новые специфические ингибиторы функции одного из белков множественной лекарственной резистентности - Pgp. Но реальность такова, что этот наиболее изученный транспортёр, как упоминалось выше, не является единственным. В опухолевых клетках экспрессируются и коэкспрессируются разные белки, ассоциированные с множественной лекарственной резистентностью, и число их увеличивается с каждым годом. Следовательно, единственно эффективным может быть лишь воздействие, подавляющее функционирование разных транспортных белков, то есть механизм лекарственной устойчивости в целом.

В экспериментах на культурах клеток показано, что тамоксифен может ингибировать механизм множественной лекарственной резистентности, ассоциированный с экспрессией Pgp. Выявлено взаимодействие тамоксифена с Pgp, конкуренция тамоксифена и противоопухолевых препаратов за связывание с Pgp и увеличение накопления, цитостатиков в опухолевых клетках, экспрессирующих Pgp, после воздействия тамоксифена. По выявленным в этих экспериментах эффектам, тамоксифен был сходен с известным ингибитором Pgp - верапамилом.

Эти данные не представляли бы значительного интереса, если бы не клинические наблюдения. У тяжёлой категории больных с распространёнными стадиями заболевания, с прогрессированием болезни после хирургического лечения и многократных курсов лучевой и безуспешной лекарственной терапии показано «восстановление» эффективности химиотерапии в комбинации с тамоксифеном.

Важно, что речь идёт об опухолях на поздних стадиях развития, которые характеризуются высокой частотой экспрессии и коэкспрессии разных белков множественной лекарственной резистентности. При этом клинический результат применения тамоксифена с целью повышения эффективности химиотерапии можно назвать выразительным, а тамоксифен - потенциальным поливалентным ингибитором механизма множественной лекарственной резистентности.

Учитывая сказанное, целью настоящего исследования явилось изучение тамоксифена как поливалентного ингибитора механизма множественной лекарственной резистентности, ассоциированного с транспортными белками, выбрасывающими противоопухолевые препараты из клеток.

Задачи исследования

1. Создать алгоритм проведения иммунофлуоресцентного анализа взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с Pgp, MRP1, BCRP и LRP;

• охарактеризовать фенотип множественной лекарственной резистентности в культурах опухолевых клеток человека - Т-лимфобластного лейкоза Jurkat, рака шейки матки HeLa, аденокарциномы лёгкого А549 и создать панель клеточных культур, оптимальных для изучения взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с Pgp, MRP1, BCRP и LRP.

• Определить область оинейной зависимости количества специфически окрашенных клеток и интенсивности специфической флуоресценции от концентрации моноклональных антител к Pgp, MRP1, BCRP и LRP.

3. Исследовать влияние тамоксифена на функциональную активность транспортных белков Pgp и MRP1:

• в культуре опухолевых клеток человека линии Jurkat;

• в опухолевых клетках, полученных из хирургического материала опухолей человека.

Научная новизна и практическая значимость

В'диссертационной работе решена задача оптимизации условий поиска и изучения 5 потенциальных ингибиторов множественной лекарственной резистентности. В частности, создан алгоритм проведения иммунофлуоресцентного анализа взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с транспортными белками — Pgp, MRP1, BCRP и LRP. Впервые проведена многопараметрическая характеристика фенотипа множественной лекарственной резистентности в опухолевых клетках человека разного гистогенеза - Т-лимфобластном лейкозе Jurkat, раке шейки матки HeLa, аденокарциноме лёгкого А549. Создана панель клеточных культур, оптимальных для изучения взаимодействия ингибиторов множественной лекарственной резистентности с Pgp, MRP1, BCRP и LRP. Выявлено, что описанное в литературе взаимодействие тамоксифена с Pgp не является специфичным по отношению только к этому транспортному белку. Тамоксифен взаимодействует также и с другими белками множественной лекарственной резистентности - с MRP1, BCRP и LRP.

Показано, что взаимодействие тамоксифена с Pgp, MRP1, BCRP и LRP не зависит от происхождения опухолевых клеток и проявляется в культурах клеток разного гистогенеза.

Впервые, основываясь на полученных результатах о конкуренции между тамоксифеном и моноклональными антителами за связывание с транспортными белками Pgp, MRP1, BCRP и LRP, сформулировано представление о тамоксифене как о поливалентном ингибиторе фенотипа множественной лекарственной резистентности.

Выявленное в модельной системе на культурах клеток взаимодействие тамоксифена с транспортными белками Pgp, MRP1, BCRP и LRP и как результат - ингибирование их функции, подтверждено при исследовании опухолевых клеток, полученных из биопсийного хирургического материала опухолей человека разного гистогенеза.

Таким образом, общим итогом проведённого исследования явилось выявление нового свойства широко применяемого в клинике антиэстрогена тамоксифена, а именно -характеристика тамоксифена как поливалентного ингибитора множественной лекарственной резистентности, обусловленной выбросом препаратов из клеток.

Полученные данные впервые экспериментально обосновали возможность клинического применения тамоксифена по новому назначению - для преодоления лекарственной устойчивости и повышения эффективности химиотерапии. В этом безусловная практическая значимость работы, так как тамоксифен не только разрешён, но 6 и широко применяется у онкологических больных, поэтому оценка его эффективности в качестве ингибитора множественной лекарственной резистентности не встретит никаких бюрократических сложностей. А учитывая низкую стоимость препарата, нет и никаких экономических препятствий для продвижения тамоксифена в клинику по новому назначению.

Практически значимым итогом работы является также и впервые проведённая в ходе исследования оптимизация условий для решения важнейшей методической проблемы, а именно, поиска и изучения новых эффективных поливалентных ингибиторов механизма множественной лекарственной резистентности. Чёткое описание алгоритма проведения такого исследования позволит использовать разработанную методологию в любой квалифицированной лаборатории.

Заключение диссертационного исследования на тему "Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности"

выводы

2. Тамоксифен взаимодействует с маркёрами множественной лекарственной резистентности - Pgp, MRP1, BCRP и LRP.

3. Тамоксифен ингибирует функциональную активность транспортных белков множественной лекарственной резистентности и увеличивает цитоплазматическое и ядерное накопление противоопухолевых препаратов.

5. Тамоксифен — поливалентный ингибитор механизма множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с экспрессией транспортных белков Pgp, MRP 1, BCRP и LRP.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Дудко, Евгений Александрович

1. Богуш Е.А., Богуш Т.А., Шишкин Ю.В., Каменский А.А. Функциональная активность ABC-транспортеров в солидных опухолях человека // Вестник Московского Университета, серия 16 (биология) 2003. - №2. - С. 3-14.

2. Богуш Т.А., Конухова А.В., Равчеева А.Б. и др. Ингибирование функции АВС-транспортеров в клетках немелкоклеточного рака легкого при воздействии препаратов платины // Антибиотики и химиотерапия 2003. - том 48, №10. - С. 11-15.

3. Богуш Т.А, Дудко Е.А, Бёме А.А. и др. Экспрессия эстрогеновых рецепторов в опухолях, отличных от рака молочной железы // Антибиотики и химиотерапия 2009. -№7-8.-С. 41-49.

4. Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Дашян. Г.А. Обоснование международных стандартов лечения операбельных форм рака молочной железы // СПб.: НПО «Профессионал» 2009. — 60 С.

5. ABC-transporters and multidrug resistance / edited by A. Boumendjel, J. Boutonnat, J. Robert. -New Jersey.: John Wiley & Sons, 2009. 459 P.

6. Allen J.D., Jackson S.C., Schinkel A.H. A Mutation hot spot in the Bcrpl (Abcg2) multidrug transporter in mouse cell lines selected for doxorubicin resistance // Cancer Res. 2002. - Vol. 62, N8. - P. 2294 - 2299.

7. Allikmets R., Schriml L.M., Hutchinson A. et al. A human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is involved in multidrug resistance // Cancer Res. 1998. - Vol. 58, N23. - P. 5337 - 5339.

8. Ascenzi P., Bocedi A., Marino M. Structure-function relationship of estrogen receptor alpha and beta: impact on human health // Mol Aspects Med. 2006. - Vol. 27, N4. - P. 299-402.

9. Baekelandt M., Lehne G., Trope C.G. et al. Phase I/II trial of the multidrug-resistance modulator valspodar combined with cisplatin and doxorubicin in refractory ovarian cancer // J Clin Oncol. -2001.-19: 2983-93.

10. Baral E., Nagy E., Kwok S. et al. Suppression of lymphocyte mitogenesis by tamoxifen: studies on protein kinase C, calmodulin and calcium // Neuroimmunomodulation 2000. -Vol. 7, N2. - P. 68-76.

11. Barkhem Т., Carlsson В., Nilsson Y. et al. Differential response of estrogen receptor alpha and estrogen receptor beta to partial estrogen agonists/antagonists // Mol Pharmacol. 1998 -Vol. 54, N1. P. 105-12.

12. Batra S., Karlsson R., Witt L. Potentiation by estramustine of the cytotoxic effect of vinblastine and doxorubicin in prostatic tumor cells // Int J Cancer. 1996. - Vol. 68, N5. - P. 644-9.

13. Belinsky M.G., Chen Z.S., Shchaveleva I. et al. Characterization of the drug resistance and transport properties of multidrug resistance protein 6 (MRP6, ABCC6) // Cancer Res. 2002. -Vol. 62,N21.-P. 6172-6177.

14. Benedetti Panici P., Greggi S. et al. A combination of platinum and tamoxifen in advanced ovarian cancer failing platinum-based chemotherapy: results of a Phase II study // Int J Gynecol Cancer. 2001. - Vol. 11, N6. - 438-44.

15. Biedler J.L., Riehm H. Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro: cross-resistance, radioautographic and cytogenetic studies // Cancer Res. 1970. - Vol. 30, N4. -P. 1174-1184.

16. Blackwell K.L., Haroon Z.A., Shan S. et al. Tamoxifen inhibits angiogenesis in estrogen receptor-negative animal models // Clin Cancer Res. 2000. - Vol. 6, N11. - P. 4359-64.

17. Bunting, K.D. ABC transporters as phenotypic markers and functional regulators of stem cells / Bunting K.D. // Stem. Cells. 2002. - Vol. 20, N1. - P. 11-20.

18. Calabresi F., Di Lauro L., Marolla P. et al. Fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide plus lonidamine for the treatment of

19. Campling B.G., Haworth A.C., Baker H.M. et al. Establishment and characterization of a panel of human lung cancer cell lines // Cancer. 1992. - Vol. 69, N8. - P. 2064-2074.

20. Campling B.G., Young L.C., Baer K.A. et al. Expression of the MRP and MDR1 multidrug resistance genes in small cell lung cancer // Clin. Cancer Res. 2001. - Vol. 7, N6. - P. 17981804.

21. Chamberlain M.C., Kormanik P.A. Salvag e chemotherapy with tamoxifen for recurrent anaplastic astrocytomas // Arch Neurol. 1999. - Vol. 56, N6. -703-8.

22. Chen Y., Perng R.P., Yang K.Y. et al. Phase II study of tamoxifen, ifosfamide, epirubicin and cisplatin combination chemotherapy in patients with non-small cell lung cancer failing previous chemotherapy // Am J Clin Oncol. 2000. - Vol. 23, N1. -13-7.

23. Cheng A.L., Yeh K.H., Fine R.L. et al. Biochemical modulation of doxorubicin by high-dose tamoxifen in the treatment of advanced hepatocellular carcinoma // Hepatogastroenterology. -1998. Vol. 45, N24. - P. 1955-60.

24. Chiarion Sileni V., Nortilli R., Aversa S.M. et ah Phase II randomized study of dacarbazine, carmustine, cisplatin and tamoxifen versus dacarbazine alone in advanced melanoma patients // Melanoma Res.-2001.-Vol. 11, N2. 189-96.

25. Clarke R., Leonessa F., Welch J.N. et al. Cellular and molecular pharmacology of antiestrogen action and resistance // Pharmacol Rev. 2001. - Vol. 53, N1. - 25-71.

26. Cole M.P., Jones C.T., Todd I.D. A new anti-oestrogenic agent in late breast cancer. An early clinical appraisal of ICI46474 // Br J Cancer. 1971. - Vol. 25, N2. - 270-5.

27. Cole S.P., Bhardwaj G., Gerlach J.H. et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line // Science. 1992. - Vol. 258, N5088. - 1650-4.

28. Cordon Cardo C., O'Brien J.P., Casals D. et al. Mulfidrug resistance gene (P glycoprotein) is expressed by endothelial cells at blood brain barrier sites // PNAS. 1989. - Vol. 86, N2. - P. 695-8.

29. Cordon Cardo C., O'Brien J.P., Boccia J. et al. Expression of the multidrug resistance gene product (P glycoprotein) in human normal and tumor tissues // J. Histochem. and Cytochem. -1990. Vol. 38, N9. - P. 1277 1287.

30. Couldwell W.T., Hinton D.R., Surnock А.Л et al. Treatment of recurrent malignant gliomas with chronic oral high-dose tamoxifen // Clin Cancer Res. 1996. - Vol. 2, N4. - 619-22.

31. Croop J.M., Raymond M., Ilaber D. et al. The three mouse multidrug resistance (mdr) genes are expressed in a tissue specitic manner in normal mouse tissues // Mol. and Cell. Biol. 1989.-Vol. 9,N3.- 1346 1350.

32. Damiani D., Michieli M., Ermacora A. et al. P-glycoprotein (PGP), and not lung resistance-related protein (LRP), is a negative prognostic factor in secondary leukemias // Haematologica. -1998.-Vol. 83, N4.-290-7.

33. Dane, K. Cross resistance between vinca alkaloids and anthracyclines in Ehrlich ascites tumor in vivo /К. Dane // Cancer Chemother. Rep. 1972. - Vol. 56, N6. - 701-708.

34. De Boer A.C., van der Sandt I.C.J, and Gaillard P.J. The role of drug transporters at the blood brain barrier. Ann. Rev // Pharmacol, and Toxicol. 2003. - Vol. 43. - P. 629-56.

35. Doyle L.A., Yang W., Abruzzo L.V. et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1998. - Vol. 95, N26. - P. 15665-70.

36. Fisher G.A., Lum B.L., Hausdorff J. et al. Pharmacological considerations in the modulation of multidrug resistance // European J. Cancer. 1996. - Vol. 32, N6. - P. 1082-88.

37. Fojo А.Т., Ueda K., Slamon D.J. et al. Expression of a multidrug resistance gene in human tumors and tissues // PNAS. 1987. - Vol. 84, N1. - P. 265 269.

38. Fracasso P.M., Brady M.F., Moore D.H. et al. Phase II study of paclitaxel and valspodar (PSC 833) in refractory ovarian carcinoma: a gynecologic oncology group study // J Clin Oncol. -2001.-Vol. 19, N12.-P. 2975-82.

39. Giaccone G., van Ark-Otte J., Rubio G.J. et al. MRP is frequently expressed in human lung-cancer cell lines, in non-small-cell lung cancer and in normal lungs // Int. J. Cancer. 1996. -Vol. 66, N6. - P. 760-767.

40. Gagliardi A.R., Hennig В., Collins D.C. Antiestrogens inhibit endothelial cell growth stimulated by angiogenic growth factors // Anticancer Res. 1996. - Vol. 16, N3. -1101-6.

41. Galluzzi L., Maiuri M.C., Vitale I. et al. Cell death modalities: classification and pathophysiological implications // Cell Death Differ. -2007. Vol. 14, N7. - P. 1237-43.

42. Gonzalez V.M., Fuertes M.A., Alonso C. et al. Is cisplatin-induced cell death always produced by apoptosis?//Mol. Pharmacol.-2001.-Vol. 59, N4.-P. 657-663.

43. Gruvberger-Saal S.K., Bendahl P.O., Saal L.H. et al. Estrogen receptor beta expression is associated with tamoxifen response in ERalpha-negative breast carcinoma // Clin Cancer Res. — 2007. Vol. 13, N7. -1987-94.

44. Honjo Y., Hrycyna C.A., Yan Q.W. et al. Acquired mutations in the MXR/BCRP/ABCP gene alter substrate specificity in MXR/BCRP/ABCP-overexpressing cells // Cancer Res. -2000. Vol. 61, N18. - P. 6635 - 6639.

45. Hsu C.H., Chen J., Wu C.Y. et al. Combination chemotherapy of cisplatin, methotrexate, vinblastine, and high-dose tamoxifen for transitional cell carcinoma // Anticancer Res. 2001. -Vol. 21, N1.-711-5.

46. Hui A.M., Zhang W., Chen W., Xi D. et al. Agents with selective estrogen receptor (ER) modulator activity induce apoptosis in vitro and in vivo in ER-negative glioma cells // Cancer Res. 2004. - Vol. 64, N24. - P. 9115-23.

47. Izquierdo M.A., van der Zee A.G., Vermorken J.B. et al. Drug resistance-associated marker Lrp for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma // J Natl Cancer Inst. 1995. - Vol. 87, N16. -1230-7.

48. Jensen E.V., Jordan V.C. The estrogen receptor: a model for molecular medicine // Clin Cancer Res. 2003. - Vol. 9, N6. - 1980-9.

49. Jordan, V.C. Effect of tamoxifen (ICI 46,474) on initiation and growth of DMB A-induced rat mammary carcinomata / V.C. Jordan // Eur J Cancer. 1976. - Vol. 12, N6. - P. 419-24.

50. Jordan V.C., Dix C.J., Allen K.E. The effectiveness of long term tamoxifen treatment in a laboratory model for adjuvant hormone therapy of breast cancer // Adjuvant Therapy of Cancer. 1979.-Vol. 2.-P. 19-26.

51. Jordan V.C., Allen K.E. Evaluation of the antitumour activity of the non-steroidal antioestrogen monohydroxytamoxifen in the DMBA-induced rat mammary carcinoma model. . Eur J Cancer. 1980. - Vol. 16, N2. - 239-51.

52. Jordan, V.C. Tamoxifen (ICI46,474) as a targeted therapy to treat and prevent breast cancer / V.C. Jordan // Br J Pharmacol. 2006. - Vol. 147, Suppl 1. - P. 269-76.

53. Jordan, V.C. Tamoxifen: catalyst for the change to targeted therapy / V.C. Jordan // Eur J Cancer. 2008. - Vol. 44, N1. - 30-8.

54. Juliano R.L., Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - Vol. 455, N1. - 152-162.

55. Kickhoefer V.A., Vasu S.K., Rome L.H. Vaults are the answer, what is the question? // Trends Cell Biol. 1996. - Vol. 6, N5. - 174-8.

56. Kolli S., Zito C.I., Mossink M.H. et al. The major vault protein is a novel substrate for the tyrosine phosphatase SHP-2 and scaffold protein in epidermal growth factor signaling // J Biol Chem. 2004. - Vol. 279, N28. - P. 29374-85.

57. Labialle S., Gayet L., Marthinet E. et al. Transcriptional regulators of the human multidrug resistance 1 gene: recent views // Biochem Pharmacol. 2002. - Vol. 64, N5-6. - P. 943-8.

58. Lawn R.M., Wade D.P., Couse T.L. et al. Localization of human ATP-binding cassette transporter 1 (ABC1) in normal and atherosclerotic tissues // Arterioscler Thromb Vase. Biol. -2001. Vol. 21, N3. - P. 378-385.

59. Ling, V. Multidrug resistance: molecular mechanisms and clinical relevance / V. Ling // Cancer Chemother. Pharmacol. 1997. - Vol. 40, Suppl. - P. 3-8.

60. Litman Т., Brangi M., Hudson E. et al. The multidrug-resistant phenotype associated with overexpression of the new ABC half-transporter, MXR (ABCG2) // J. Cell. Sci. 2000. - Vol. 113,N11.-P. 2011 -21.

61. Maliepaa rd M., van Gastelen M.A., de Jong L.A. et al. Overexpression of the BCRP/MXR/ABCP gene in a topotecan-selected ovarian tumor cell line // Cancer Res. 1999. -Vol. 59,N18.-P. 4559-4563.

62. Maliepaard M., Scheffer G.L., Faneyte I.F. et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues // Cancer Res. 2001. -Vol. 61,N8.-P. 3458-3464.

63. Mao Q., Unadkat J.D. Role of the breast cancer resisnance protein (ABCG2) in drug transport // A APS J. 2005. - Vol 07, N 01. - P. 118-133.

64. Matsui Y., Kobayashi N., Nishikawa M., Takakura Y. Sequence-specific suppression of mdrla/lb expression in mice via RNA interference // Pharm Res. 2005. - Vol. 22, N12. -2091-8.

65. McClay E.F., McClay M.E., Monroe L. et al. The effect of tamoxifen and cisplatin on the disease-free and overall survival of patients with high risk malignant melanoma // Br J Cancer. -2000.-Vol. 83, N1/-P. 16-21.

66. Mechetner E.B., Roninson I.В. Efficient inhibition of Pglycoprotein-mediated multidrug resistance with a monoclonal antibody 11 Proc Natl Acad Sci USA. 1992. - Vol. 89, N13. -5824-8.

67. Mechetner E.B., Schott В., Morse B.S. et al. P-glycoprotein function involves conformational transitions detectable by differential immunoreactivity // Proc Natl Acad Sci U S A. 1997.-Vol. 94, N24.-12908-13.

68. Miyake K., Mickley L., Litman T. et al. Molecular cloning of cDNAs which are highly overexpressed in mitoxantrone-resistant cells: demonstration of homology to ABC transport genes//Cancer Res. 1999. - Vol. 59, N1.-P. 8-13.

69. Nagarkatti N., Davis B.A. Tamoxifen induces apoptosis in Fas+ tumor cells by upregulating the expression of Fas ligand // Cancer Chemother Pharmacol. 2003. - Vol. 51, N4. -284-90.

70. Nagashima S. BCRP/ABCG2 levels account for the resistance to topoisomerase linhibitors and reversal effects by gefitinib in non-small celllung cancer // Cancer Chemother. Pharmacol. -2006. Vol. 58, N5. - P. 594-600.

71. Nakanishi T. Complex interaction of BCRP/ABCG2 and imatinib inBCR-ABL-expressing cells: BCRP-mediated resistance to imatinibis attenuated by imatinib-induced reduction of BCRP expression // Blood. 2006. - Vol. 108, N2. - 678-684.

72. Oguri Т., Isobe Т., Suzuki T. et al. Increased expression of the MRP5 gene is associated with exposure to platinum drugs in lung cancer // Int. J. Cancer. 2000. - Vol. 86, N1. - P. 95-100.

73. Ozols R.F., Cunnion R.E., Klecker R.W.J, et al. Verapamil and adriamycin in the treatment of drug-resistant ovarian cancer patients // J Clin Oncol. 1987. - Vol. 5, N4. - P. 641-7.

74. Paredes Lario A., Blanco Garcia C., Echenique Elizondo M., Lobo C. Expression of proteins associated with multidrug resistance and resistance to chemotherapy in lung cancer // Arch Bronconeumol. 2007. - Vol. 43, N9. - P. 479-84.

75. Pearce S.T., Jordan V.C. The biological role of estrogen receptors alpha and beta in cancer // Crit Rev Oncol Hematol. 2004. - Vol. 50, N1. - P. 3-22.

76. Perry R.R., Kang Y., Greaves B. Effects of tamoxifen on growth and apoptosis of estrogen-dependent and -independent human breast cancer cells // Ann Surg Oncol. 1995. - Vol. 2, N3. -P. 238-45.

77. Radujkovic A. Synergistic activity of imatinib and 17-AAG in imatinib-resistant CML cells overexpressing BCR-ABL-Inhibition of P-glycoprotein function by 17-AAG // Leukemia. -2005.-Vol. 19, N7.-P. 1198-1206.

78. Robbiani D.F., Finch R.A., Jager D. et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes // Cell. -2000. Vol. 103, N5. - P. 757-768.

79. Robey R.W., Medina-Perez W.Y., Nishiyama K. et al. Overexpression of the ATP-binding cassette half-transporter, ABCG2 (MXP/BCRP/ABCP1), in flavopiridol-resistant human breast cancer cells. Clin // Cancer Res. 2001. - Vol. 7, N1. - P. 145-152.

80. Rohlff C., Blagosklonny M.V., Kyle E. et al. Prostate cancer cell growth inhibition by tamoxifen is associated with inhibition of protein kinase С and induction of p21(wafl/cipl) // Prostate. 1998. - Vol. 37, N1. - P. 51-9.

81. Roninson I.B., Abelson H.T., Housman D.E. et al. Amplification of specific DNA sequences correlates with multi drug resistance in Chinese hamster cells // Nature. 1984'. - Vol. 309, N 5969. - P. 626-8.

82. Ros J.E., Libbrecht L., Geuken M. et al. High expression of MDR1, MRP1, and MRP3 in the hepatic progenitor cell compartment and hepatocytes in severe human liver disease // J. Pathol. -2003. Vol. 200, N5. - P. 547-550.

83. Russell P.L., Sharom F.J. Conformational and functional characterization of trapped complexes of the P-glycoprotein multidrug transporter // Biochem J. 2006 Oct 15;399(2):315-23.

84. Safa AR, Roberts S, Agresti M, Fine RL. Tamoxifen aziridine, a novel affinity probe for P-glycoprotein in multidrug resistant cells. Biochem Biophys Res Commun. 1994. - Vol. 202, Nl.-P. 606-12.

85. Sampath J., Adachi M., Hatse S., et al. Role of MRP4 and MRP5 in biology and chemotherapy // AAPS Pharm.Sci. 2002. - Vol. 4, N3. - P. 14.

86. Scheffer G.L., Schroeijers A.B., Izquierdo M.A. et al. Lung resistance-related protein/major vault protein and vaults in multidrug-resistant cancer // Curr Opin Oncol. 2000. - Vol. 12, N6. -550-6.

87. Scheffer G.L., Pijnenborg A.C., Smit E.F. et al. Multidrug resistance related molecules in human and murine lung // J. Clin: Pathol. 2002. - Vol. 55, N5. - P. 332-339.

88. Scheffer G.L., Kool M., de Haas M. et al. Tissue distribution and induction of human multidrug resistant protein 3 // Lab. Invest. 2002. - Vol. 82, N2. - P. 193-201.

89. Sharif T.R., Sharif M. A novel approach for examining the anti-proliferative effect of protein kinase С inhibitors against human astrocytoma cells // Int J Oncol. 1998. - Vol. 13, N4. -P. 685-92.

90. Scheffer G.L., Schroeijers А.В., Izquierdo M.A., Wiemer E.A., Scheper R.J. Lung resistance-related protein/major vault protein and vaults in multidrug-resistant cancer // Сип-Орт Oncol. 2000. - Vol. 12, N6. - P 550-6.

91. Shen L.Z., Hua Y.B., Yu X.M., et al. Tamoxifen can reverse multidrug resistance of colorectal carcinoma in vivo // World J Gastroenterol. 2005. - Vol. 11, N7. - P. 1060-1064

92. Sugawara, I. Expression and functions of P glycoprotein (mdrl gene product) in normal and malignant tissues /1. Sugawara // Acta Pathol. Japonica. 1990. - Vol. 40, N8. - 545-553.

93. Suprenant, K.A. Vault ribonucleoprotein particles: sarcophagi, gondolas, or safety deposit boxes? / K.A. Suprenant // Biochemistry. 2002. - Dec Vol. 41, N49. - P. 14447-54.

94. Tamoxifen for the treatment and prevention of breast cancer / edited by Jordan V.C. NY.: PRR, 1999.-309 P.

95. Tavassoli M., Soltaninia J., Rudnicka J. et al. Tamoxifen inhibits the growth of head and neck cancer cells and sensitizes these cells to cisplatin induced-apoptosis: role of TGF-betal // Carcinogenesis. 2002. - Vol. 23, N10. - P. 1569-75.

96. Thiebaut F., Tsuruo Т., Hamada H. et al. Cellular localization of the multidrug resistance gene product P glycoprotein in normal human tissues // PNAS. 1987. - Vol. 84, N21. - P. 7735 7738.

97. Trump D.L., Smith D.C., Ellis P.G., et al. High-dose oral tamoxifen, a potential multidrug-resistance-reversal agent: phase I trial in combination with vinblastine // J Natl Cancer Inst. -1992.-Vol. 84,N23.-P. 1811-6.

98. Tsuruo Т., Iida H., Tsukagoshi S., Sakurai Y. Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil // Cancer Res. 1981. - Vol. 41, N5. -1967-72.

99. Van Zon A., Mossink M.H., Schoester M., et al. The formation of vault-tubes: a dynamic interaction between vaults and vault PARP // J Cell Sci. 2003. - Vol. 116, N21. - P. 4391-400.

100. Van Zon A., Mossink M.H., Schoester M., et al. Efflux kinetics and intracellular distribution of daunorubicin are not affected by major vault protein/lung resistance-related protein (vault) expression // Cancer Res. 2004. - Vol. 64, N14. - P. 4887-92.

101. Volk E.L., Rohde K., Rhee M. et al. Methotrexate cross-resistance in a mitoxantrone-selected multidrug-resistant MCF7 breast cancer cell line is attributable to enhanced energy-dependent drug efflux // Cancer Res. 2000. - Vol. 60. - P. 3514-3521.

102. Widmer, N. Functional consequence of MDR1 expression on imatinib intracellular concentrations / N. Widmer//Blood.-2003.-Vol. 102, N3,-P. 1142-1144.

103. Winer E., Gralow J., Diller L., et al. Clinical cancer advances 2008: major research advances in cancer treatment, prevention, and screening-a report from the American, Society of Clinical Oncology // J Clin Oncol. 2009. - Vol. 27, N5. - P. 812-26.

104. Yang C.H., Cheng A.L., Yeh K.H. et al. High dose tamoxifen plus cisplatin and etoposide in the treatment of patients with advanced, inoperable nonsmall cell lung carcinoma // Cancer. -1999. Vol. 86, N3. - P. 415-20.

105. Yang Ch-H., Huang Ch-Ju., Yang Ch-Sh. et al. Gefitinib Reverses Chemotherapy Resistance in Gefitinib-Insensitive Multidrug Resistant Cancer Cells Expressing ATP-Binding Cassette Family Protein // Cancer Res. 2005. - Vol. 65, N15. - 6943-6949.

106. Young L.C., Campling B.G., Cole S.P. et al. Multidrug resistance proteins MRP3, MRP1, and MRP2 in lung cancer: correlation of protein levels with drug response and messenger RNA levels // Clin. Cancer Res. 1999. - Vol. 5, N3. - P. 673-680.

107. Young L.C., Campling B.G., Voskoglou-Nomikos T. et al. Expression of multidrug resistance protein-related genes in lung cancer: correlation with drug response // Cancer Res. -2002. Vol. 62, N21. - P. 6172-6177.

108. Yu Z., Fotouhi-Ardakani N., Wu L., Maoui M., et al. PTEN associates with the vault particles in HeLa cells // J Biol Chem. 2002. - Vol. 277, N43. - 40247-52.

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности

Автореферат диссертации по медицине на тему Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности

Оглавление диссертации Дудко, Евгений Александрович :: 2010 :: Москва

Введение диссертации по теме "Онкология", Дудко, Евгений Александрович, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Дудко, Евгений Александрович

Похожие научные работы

Каталог диссертаций