Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Получение и использование в селекции и генетических экспериментах протопластов продуцента эритромицина SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA

ВСЕСОШнЫИ НАУЧНЫЙ ЩНТР ПО АНТИБИОТИКАМ ВНЦА.-ШША

На правах рукописи

КИШЧЕНКО Надежда Витальевна

(МУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СЕЛЕКЦИИ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ РОТОПЛАСТОВ ПРОДУЩНТА ЭРИТРОМИЦИНА зассканороьузройа еютнйаеа

14.00.31 - Химиотерапия и антибиотики 03.00.15 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук в форме научного доклада

Москва 1991

Работа выполнена в Филиале международной лаборатории по генетиче кой инженерии продуцентов антибиотиков во Львовском государствен ном университете им.И.Франко

Научный руководитель:

доктор биологических наук Даниленхо В.Н.

Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Федоренко В.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Полин А.Н.

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Воейкова Т.А.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский шсгиту по изысканию новых антибиотиков АМН СССР (Москва)

Защита состоится

п2о тЦДМ 1992 г. в ¡2- час 30 мин. на заседании специализированного Совета Д 098,03.01 при Всесоюзн научно-исследовательском институте антибиотиков СВНША) по адрес 113105, Москва, ул.Нагатинская, д.За.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ

Автореферат разослан »20

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат медицинских наук

С.М.Кузнецо1

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теин. Одним пз основных элементов бсотохнологп-геского производства антЕбиотияоз является высогоактивгшй штака • продуцент. Йзвшеяаа аптЕбяотдчасдой активности н улучшение дру-■пх техцологпческях показателей пггагмов-продуцентов - один пз ?лзенкх путей увеличен®! производства антпбяотпков.

фодуцеитагля бользинства известных антибиотиков» в тон чео-ю пропзводишх в црошплешшх масштабах, являзтез аитпяомкцета. ?елакцня прогжпхзц&нх пгакмов актвдомпцетов-продуцектоз еагийсо-iekob осуцествяязтся в осеовкои пря полосу индуцированного мута-.■■епзза. Однако развитЕо генетики, клеточной и генной Еязенерал Ш5Ляог,!1що2ов позволило существенно распнрать арсенал методов зоздакяя влсокоцродуктпванх Егашоз, образугщгх аеткбеттгш!. К шел?: пахёояге яерстзтшзих шдходов относятся методы юззточеоЯ яшзяорла с ЕспогБзовандеи протопластов актпяоетцетоз. В насто.г-цзе вреня усгавсшлана, что прогопластлроваяЕа культур аетиномЕ-Ictob является фактором, стгауязрувщпа пзкэкчявость ряда признаков в то:л чдслэ анткйотичзсксЭ аятгваоста л $стоЗчавости к ся-ЕПйкякаам. Сплине протопластов позволяет азгавно использовать з гонетруправапей краппленшп птакиов акзжхшшэтов геяетячео-EtyB рвкомбИпацнн особенно для sex птаьиоз, у которых отсутствуют прхродзие сествш генетического обмена шш гэ если частота рекомбинации пр. Еоаьнгацна очень низка. Кроиз того, протопласта аетляелздетов попользуются как реципиенты экзогенной ДНК н без разработки вйфазтявннх методов шгучейяя, регенерации я трансформация протопластов невозкозпо развитие геиной пнаекараи соет-Бстствувдах втшов-продуцеягаз. Установлено, что для каждого вэда актяномкЕ^тов, а во кногпх случаях к для отдельных юамиэв одного вода, необходана разработка условий получения, регенерации д сланная протопластов, а такпэ поиск путей использования протопластов в генетгаеекзе ыашщудядяях. К началу вылолшеяля настоя?-щзй работы данные о получении и использовангя протопластов

Saccharopolyspora erythxaea - ПрОМКЯЛЗННОГО продуцента Е32-

еейгаго иедшзгшосого антибиотика эритромицина, баш веста ограничены. Отсутствовала сведения об использовании методов клеточной ннаенеряи в селекция гасояоагтившп промышленных продуцентов эритромицина.

Работа выполнялась в райках ТНТП "Новейзшо направления био-инзенершГ, а также го хоздоговорной теме КГ 20-87 "Генетический контрсиь прадукцаи эргароаицяна".

Цель работы и задачи исследования. Цэяью работы являлась разработка методических подходов получения и использования в генетических манипуляциях и селекции протопластов продуцента эритромицина ЗассЪагоро1уарога ехуШгпеа.

В связи с поставленной целы) в задачи настоящего исследования входило:

I. Фдбор условий получения, регенерации и слияния протопластов промышленных штаммов-продуцентов эритромицина.

2.. Изучение влияния протопластирования и регенерации протопластов ва антибиотическую активность промышленных шташов э. егуШгаеа и оценка перспективности этого метода в их селекции.

Исследование протопластирования как фактора генетической нестабильности признаков у штаммов б.егушгаеа.

4. Слияние протопластов дивергентных штамыов-прсиышдеаннх продуцентов эритромицина и изучение возможности применения метода СЛИЯНИЯ ПрОТОПДаСТОВ В сежеКЦИИ З.егуйггаеа.

5. Исследование стабильности рекомбинантов, полученных цутем слияния протопластов.

Новизна результатов. Впервые определены условна для получения, регенерации в жизнеспособные клетки и слияния протопластов промышленных штаммов б .егу+.ьгаеа . Показана возможность отбора вариантов с повышенной антибиотической активностью среди клонов, возникших из регенерировавших протопластов. Обнаружено, что протопласты чувствительнее к действию мутагенов чем споры и ыицелиальнне клетки Б.егу-йи&еа. Возможно применение мутагенной обработки протопластов в генетических и селекционных экспериментах с продуцентами эритромицина. Впервые подучены данные о генетической нестабильности и признака антибиотической активности у промышленных штаммов з.егу-Шгаеа . Шказано, что слияние протопластов приводит к увеличению частоты рекомбинаатов по сравнению с коныогационным процесссы. Впервые с помощью слияния протопластов получены гшЗридаые штаммы-продуценты эритромицина.

Научно-практическая значимость работы. Вжазана перспективность использования процедур цротопластирования и слияния протопластов в селекции высокоактивных штаммов-продуцентов эритромицина. Установлена возможность использования в качестве генетических маркеров для контроля процесса рекомбинации мутаций устой-

квостн к антибиотикам рвфамшщияу, тдастрептояу и стре итоинцяну, в снижавдих антибеотнческуо активность штаммов з.егу-ььгаеа. азработана схема отбора рекомбинантов в коюьюгацаошшз: скрещн-анаях и при слнжиш протопластов проиншаяных штаымоэ-прадуцей-ов зрятроияцяна. С использованием этях методов гибридизации шь учада коллекция высокоактивных втакмов э.егу^ггаеа , пврспек-нвних для создания на их основе новых промышленных птаимов про-вдевтов эрнтромицвна. Разработанные в настоящей работе кетодше-кяе подходы с использованием протопластов Б.егуШгаеа внед-внн в ЦШС Курганского комбината меявиннсяпх препаратов в лзде-1й "Сйнтез".

Основные полоясная. выносяшыа аа защиту. Разработка мвтодэ-йскех подходов конструирования промышленных птаимов-продуцентов рзтромяцина с псдальзованаем протопластов э.егу-Шгаеа. [спользованяо разработанных подходов для шдучешш штвьшов з .егуьигаеа о поБшеяноЗ способностью к вродукцяя эрПТрСМЕЦОМ.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на Всесоюз-:ом сеыинаре "Современные проблемы аатлбготанорезнстентностн" 'Шсква, 1388 г./, Нэздуяародаом сшпозпуие по гаюзтдка я обра-ювашго продуктов у акгааомвцетов /Зрфурт, Германия, 1990 г./, ' НацЕопаньной конференцка по производству и щишеяениа аптпбно-!Исов /Разград, Болгария, 1990 г./, I Всесоюзной шганово-отчет-гой конференции по направлена*) "Геаяая я клеточная янзеяергя" ЛШ1 "Новейша1 методы бдоинженерии", ссшвстяых заседааиях ак-:гартного совета по здравоохранению и медицинскоцу пркборостроэ-ш> и координационного совета по црогракгз "Новая ыедицинсжая сохннка я лекарственные препарата" Гособразованяя СССР /Леянаград, январь 1990,; Харьков, ноябрь 1990;; Львов, най 1991 /,пауч-¡шх коафвренпяях Львовского университета, яаучао-практических конференциях Курганского комбината цздицннских препаратов и езде-шй "(йнтеэ".

фбликации. Ш иатериалаи выполиеяннх исследований опубликовано в работ.

ШШШ И МЕТОДЫ

Штаммы» В работе использованы штампы s.erythraea -продуценты эритромицина: изхь 2338 > ауксотрофнне производные штамма B50C2-I34S ига leu , 240? met trp phe /подучены ОТ Т.©здорова/, штаммы 3 и 5, прошедшие селекцию на повышенную антибиотическую актиааость. Устойчивые к антибиотикам мутанты ж рекомбжнааты s.erythraea , подучены в настоящей работе. Штамм Bacillus mycoidos нв2 использовали как тест-дультуру при определения антибиотической активности штаммов s.erythraea.

Среда и условия культивирования итаммов. Для выращивания и коныгацнонных скрещиваний штаммов s.erythraea использовали полноценные среда СР-6 /Ломовская и др., 1971/, r2t /Weber et ai. , 1985 /. Выделение рекоыбина нтов, полученных в сврещивани-ях, определение генетических маркеров акишомицетннх шташов, а также устойчивости этих шташов в антибиотикам доводили на синтетической среде н2ы /Weber et ai. , 1985/. Выращивание мицелия s .erythraea для получения протопластов проводили на среде sggp

/ Yamamoto et al. , 19В6/, лкзис мицэлия и другив опыты с

суспензиями протопластов - в среде Р. Для регенерации протопластов и выращивания колоний, образовавшихся и регенерировавших протопластов использовали среду R2T20 /Yamamoto et al., 1986/. В тестах по определении антибиотической активности штаммы s.erythraea выращивали на ферментационной кукурузно-соевой среде.

Определение уровня устойчивости штаммов s.erythraea к рифам пицииу, стрептомицину и тяострелтону проводили двумя методами: 1/ омючашванием штрихов роста 5-7 дневных культур на варианты сред r2m и СР-6 с антибиотиками; 2/ титрованием суспензий мицелиалышх клеток я свор 7-днааннх культур на варианты ч?ед r2m и СР-6 с антибиотиками. Анализ роста отпечатков проводили через 3 суток.

Обработку спор и мицедиальных кяэток s.erythraea и -иетил — w -нитро - it - нитрозогуаншмном /НГ/ проводили по методике, описанной Hopwood et al. /1985/.

Обработку спор и ншелиальных клеток s.erythraea и -метая- л - нитрозомочевиной /НИМ/ проводили в фосфатном буфере /рН 7,0/ при конечной концентрации мутагена 3 мг/ил.

Обработку протопластов S.erythraea НММ осуществляли следующий образом: к I мл суспензии протопластов титр 1:10®-1 10" протопластов в различных экспериментах/ добавляли раствор BSES

I F-буфере pH 7.0/ до конечной концентрации 3 мг/мл.

Облучение протопластов .ультрафиолетом проводили в пластмае-¡овнх чашках Петри диаметром 90 мм, в которые помещали 4 ил суо-внзии протопластов в среде Р с титром ГО' - ICL8 протопластов I I мл, при постоянном перемешивания. Для облучения использова-[2 5®-ламду BL tf-I2 фирш " Medio or " /ВНР/. Расстояние от источника JJS Д° поверхности суспензии - 20 см.

Коныгациояное скрещивание штаммов s.erythraea проводи-си путем совместного их выращивания на среде 52Т на протяжении г-7 суток до наступления споруляции. Споры высевали на селективна среда / Е2Ш/ с различными вариантами добавок аминокислот. Luohh, образовавшиеся на селективных средах, пересевали на сзоди •акого же состава для проверки их рекомбинантного фенотипа. Заем устанавливали их при помощи метода реплик. Анализ гаплоидных вкомбааантов проводили го методике, описанной Hopwood et ai. '1985/.

Выделение мутантов s.erythraea . устойчивых к аатибиота-ам проводили цутем высева обработанных цутагенами спор, мвде-гиальных клетск ила протопластов на среды, содержащие антябяэте-я и последующего выращивания в течение 7-1(1 дней. Штаммы, ва-¡астаюци® на среде о антибиотиками при повторных проверках, счо-оди устойчивыми.

Аятибяотнесауи активность КУЛЬТУР S.erythraea проводили I условиях глубинного культивирования в .лидкой ферментационной рвде, а также по методу Triiii.

Оценку влияния аротопяастировани^ а регенерации на аятябко-ячесяую активность проводили следующие образом, колонна регеви-вровазших на среде R2.T2Q протопластов переносили уколам на фер-[ентацвонную среду. Чашки инкубировал*. в термостате при 34°С на [ротяжеяаа 48 часов. Затем их заливали 0,72 агаром, содержащим дары тест-культуры B.mycoides „ Через IB часов определяли даметр зон угаетенга роста тест-куаыурн в вычисляли иядеко цро-уктавностя /ВД/ /отяошэние диаметра зоны угнетения роста таст-¡ультуры к диаметру колонии иесгецуемых штаммов/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЛЩЕЖЕ

I. Оптимизация условий получения и регенерации протопластов штамма З.егуЫагаеа 5 и его мутантов

Разработка методов получения протопластов, способных к реген« рации, генетической трансформации и трансфекции является важнейшю этапом в генетической и клеточной инженерии актиноыицетов. Используемые в настоящее время методики получения и регенерации протопластов базируются на'процедуре, разработанной 0кап1зЬ1 е-ь а1. /1974/. Однако развитие клеточной и генетической инженерии ахтино-миде то в, вовлечение в число ее объектов все новых штаммов г-Ьгер-■Ьошусез , КосагсНа и др. адтидамицегов показывает, что условия выделения и регенерации протопластов отличаются не только для разлет ных видов, но и для различных штаммов одного и того же вида.

В своей работе по оптимизации условий получения и регенераци: протопластов промышленного штамма з.егуйггаеа 5 и его мутантов м исходили из имеющихся данных литературы /Уатато^о н^ а1.1986, Захарова Г.М. и др. 1988/.

Проведен подбор условий культивирования промышленного штамма его рифампицин-устойчивого мутанта 5-621, а также генетически мар рованных ауксотрофными мутациями штаммов 1346 и 2407 с целью выде ления протопластов, способных к эффективной регенерации. Для итак мов 5 и 5-621 использовали следующие варианты выращивания на сре,п заар трое суток без внесения глицина; трое суток с добавлением 0,1% или 1,0% глицина в момент посева; двое суток без глицина с п реносом на свежую среду с 0,1% глицина и дополнительное выращивав в течение суток. Данные о регенерации протопластов исследуемых пи мов приведены в табл.1. В предварительных опытах мы обнаружили вь соцую чувствительность штаммов 1346 и 2407 к действию лизоцима и поэтому их выращивали на среде без глицина.

Показано /табл.1/, что наибольшие титры регенерировавших прс пластов штаммов 5 и 5-621 были подучены при выращивании в течение трех суток при внесении глицина в момент посева /0,1%/. Титр про1: пластов, способных к регенерации при этом достигал 2,1хЮ®клеток> /штамм 5/ и 0,9хЮ®клеток/мл /штамм 612/. При этом наблвдался дис фузный рост культуры. Электронно-микроскопический анализ,подучен в таких условиях суспензий протопластов показал,что они в основн! однородны по своим размерам /рис.1/. Однако показано,что в суспе! зиях присутствуют мелкие протопласты/от I до 5% в различных опыт /рис.1/.

Таблица I

Регенерация протопластов штаммов З.егу-Иагаеа, выращенных в различных условиях

! Штамм } Способ выращивания куль-|Титр сегене- \% фрагментов \ туры ¡рировавших ¡мицелия

I

протопластов

5 3 сут. с 0,1% глицином

5 . 3 сут. с 1,0% глицином

5 3 сут. без глицина

5 2 сут.+1 сут.с 0,1%

глицина

5-621 3 суг. с 0,1% глицином

5-621 3 сут.с 1,0% глицином

5-621 3 сут. без глицина

5-621 2 сут.4* I сут.с глициноы

1346 3 сут. без глицина

2407 3 сут. без глицина

2,1-10° 0,8.Юб 4,0« Ю6 2,7-Юб

0,9. Ю6 3,Ы06 1,5.106 5,0« Юб

5,5-Ю8 2,2'Ю6

0,4

5.1

7.2

8,9

0,6

4.3 5,7 6,2

1,5 0,1

Рис.1. Протопласты итамла Б.егуйггаеа 5 /Ув. 10.000 /

- ГО -

Другие варианты выращивания давали существенно визкий титр протопластов, способных к регенерации /0,8-5 х 10"®/ для обоих штаммов /табл.Г/. Подученные данные показывают, что для получения способных к регенерации протопластов дивергентных штаммов 5,5-G2I и 1346, 2407 /производные ВТСО-2/ необходимы различные условия выращивания культуры.

Затем методика цротопяастирования была модифицирована цутеы добавления в среду для лизиса 0,1$ дшетилсульфоксида / ДМОО ,

" Sigma '"/.

Как видно из данных табл.2, это позволило стабилизировать цротопласты в 3-4 раза для производных штамма ВТСО-2 и в 2-3 раза для штаммов 5 и 5-621.

Из результатов, приведенных в табл.2 видно, что эффективность регенерации протопластов исследуемых шташов зависит и от способа посева протопластов аа регенерацвонцую среду. При посеве протопластов в 0,% среду К^Гзд и последующей заливке чашек с 2$ агаром /двуслойным методом/ повышается эффективность регенерации Lporoпластов в I, 5 - 2 раза по сравнению с поверхностным посевом протопластов.

Таким образш проведанные наш исследования позволяют сделать вывод о том, что оптимальными условиями для получения и регенерации протопластов исследованных высокоактивных штаммов 5 и . £Н21 является их выращивание в среде SGGI> с 0,1$ глицина. Добавление в среду Р, в которой происходит лизис мицелия и двуслойный лосов протопластов с использованием 0,7? среды В ¿Тэд увеличивает эффективность регенерации протопластов.

Д. Влияние протопластироваяия и регенерации протопластов На аНТИбИОТИЧеСКУВ аКТИВНОСТЬ ШТаШОВ S.erythraea.

Известно, что у некоторых актиноывдетов протсшласт^ованио и регенерация протопластов догу? быть факторами увеличивающими изменчивость и стимулирующих утрату некоторых признаков, в частности антибиотической активности / Bait г t 1978; Родионова и Данияеико, 1968/.

Ш провели эксперименты по изучению влияния протошастиро-вания и регенерации цротопластов иа антибиотическую активность длух различных партий штадоа s.erythraea 5, обозначенных как 5-1 в 5-2, характеризующихся близкими уровнями антибиотической активности. Для сравнения определяли антибиотическую активность отдельных клонов этих партий, не прошедших протопласткрованхе.

Таблица 2

Эффективность регенерации протопластов й.егуььгаеа в заэисшовти от использования ДМСЮ и способа их посева не регенерационцую среду З^Тэд

; : Концентрация: Концентрация регенерировавших протопластов в мл_

ц^п: ШТ£ММ ! ЬТпжто»!®8««2 посвв ; с О,Й ДЖО в среде Р : даусл0&1ый шввв

I/ .-™-II/1 '■■ ■ ■ —

. 1 _ титр_ _ ± _ ЭР_ 1 _:__титр__:__ЭР___:__титр_ _

в ыл

ЭР

1. 5

2. 5-621

3. 1346

4. 2407

10'

8

,8

1.3 • Юэ 2,1

2,3 • Ю9 0,9 • 10'

2,2 • Ю9 5,5 • Е>8

3.1 • Ю9 2,2 • 10?

1,6 -Ю-1 5,25 • Ю8 4,0 • Ю"*1 3,4 • К? 2,6 «Ю-1

0,4 -ЮГ1 2,8 • Ю8 1,2 • КГ1 Г,7 • 108 0,7 -Ю""1

0,5 -К"1 1,65 • Ю9 0,75 1,1 • Ю9 0,5 I

0,7 -Ю-1 8,8 • Ю? 2,8 . ВТ1 4,6 • Ю8 1,5-БГ1 и

Цэимечание; I/ концентрация подученных протопластов определялась цутеа подсчета в камере Горяева; 2/ ЭР - эффективность регенерации.

Полученные данные приведены на рис.2 /а. б/. Как видно т рисунка, протопластирование культуры 5-1 приводит к увеличению ее: изменчивости по признаку аншбиотикообразования.

фи анализе 367 регенерантов доказано, что образуется клонов с минимальной антибиотической; активностью, которые отсутствуют в нелротопластированной культура. В то se время образует-; ея 17,51 шлос-вариантов с антибиотической активностью, цревыжаи>-шей значение M+2aJ , против 8,0% таковых в яецротошгастирован-ной культуре.

При изучении антибиотической активности 182 отдельных клонов культуры s.erythraea относящейся к партии 2 оказалось, что ока характеризуется наличием больного числа ни з ко продуктивных клонов /рис.2 г /. 5% исследованных клонов этой культуры проявляли Ery" фенотип. Эти данные показывают, что различные партии штамма 5 существенно отличавтся по антибиотической активности составляющих ях клетск и что обнаруживаются партии, характеризующиеся спонтанной нестабильностью признака антибиотикооб-рззавання. Явление спонтанной утраты с высокой частотой, способности s.erythraea продуцировать эритромицин обнаружево нами гпараые. Эта частота соответствует частотам утраты генетически нестабильных признаков актиношщетов / cuiium j. f j9S4; Фе-доренко В.А. и др., IS85 /. Интересно, что у низкоактявного лабораторного штамма s.erythraea nrii. 2338 признак антибиотической активности генетически стабилен, фи анализе 8055 независимых клонов этого штаииа мы не обнаружили спонтанных - Егу~ -вариантов. На стабильность Егу+ фенотипа у штамма 2338 ука зивают а данные полученные другиш авторами / Weber et ai. « I®5 /. Проявление генетической нестабильности егу+ -фенотипа у штамма, в от лечи е от шташа дикого типа 2338, вероятно связано с тем, что штамм 5 прошел многочисленные мутагенные обработки и циклы отбора.

На антибиотическую активность тестированы 302 регенеранта культуры 5-2 прошедшей протопластирование. Результаты приведет на рсс.2 /. Как задяо яз предсгавлэнннх данных процентное со отношение клонов с нвдексаып продуктивности больше 10 несколько вше среда рзгенерантов, чеа среди, клоноз нецротоштастврованной культуры / 28,4 и % соответственно/. Цротопластирование таксе. приводило к образованию 2,3,3 клонов с иаксгаальнсй продуктивностью, которые отсутствуют в кецротопластнрованноа культуре.

зо го го

за го ю

(о

50 40

за го

70 -

си

« • 30

го ю

б 9 >г /з /щ гг 24 ! •

в 9 гг п /г

Иь.

30 10 ¡0

и

4 9 а а ^

а г* гт

е э л? и гг г* гтз»

[Ъ

а> го

40

зо 20 10 ■

сьи

з в 9 п *5 гв и

з е 9 г г /5 /<?

Рис.2. Влияние протоплаетировакия на антибиотическую

активность культур з.етуШгаевк По оси абсцисс-л11, ло оси ординат-процент клонов.

1) 5-1 - непротопластивованная культура; Б) регенеранты протопластов 5-Г; В) регенеранты штамма ИЗО; Г) непротопластированная культура 5-2; Д) регенерал-ты штамма 5-2; Е} регенеранты штамма Еб.

Среди регенерантов щютодластов культуры 5-2 Егу1" - варианты составляли 7,2?. Таким обравсм, протошисхщювание в регенерация протопластов «ультур 5-1 и 5-2 не индуцируют штери Бгу+ -фенотипа у исследованных культур Б .егу^таеа.

Вред ст являло интерес изучить эффект повторного протопласта* рования регенерантов культур 5-1 и 5-2 на их антибиотическую активность.

На рис. 2 /в,е/ приведены данные об антибиотической актав-ности отдельных клонов возникших при протодластировашш культур--рэгенерантов шташа 5-1 /КЗО/ и штамма 5-2 /86/. Как ввдно из этих данных после повторного протопластировашя культуры рогенз-ранта 530 уменьшается число плюс-вариантов /до 4,9?/, а такие не обнаруживаются шшуо-варианты. В то же время уве вшивается число шзяоактдвных клонов с МП меньшими 12 - до 63,52 против 34,5$ после первого лротапластирования. Шдобная картинацаблюдазтся б среди регенерантов культуры Н6. Клоны с ИП нижа 12 составляют 96,3$. Однако в отлична от непротодшстярованной культуры и клонов регенерантов, полученных после первого протошгастирования, отсутствуют Егу" и шщуо-варианты, а также ютзс-варианты. Излученные результаты; показывают, что повторное яротопластированяе регенерантов ^ з.егугьтеа уленьиает изменчивость культуры го признаку антибиотикообразоганЕя. Происходит определенная стабилизация культуры в рамках значений антибиотической активности

Представленные в этом разделе данные свидетельствую® о теш, что протопластироваше различных партий штамма 5 приводит к увеличению изменчивости признака продукции эритрокацина среди рагенерантов. Эффект цротопластировааия различен у различных партий птаима 5, но во всех случаях обнаруживаются клоны с максимальной антибиотической активностью /от 2,3 до 17,£$/, отсутствующе в Еепротопластированной культуре. Это свидетельствует о перспективности использования процедуры протопла «жирования и регенерации протопластов в отборе вариантов промышленных культур э.егу-№гаеа , слеющих повышенную антибиотическую активность.

Доведены эксперименты по изученаю влияния мутагена -сетил- 11 - штрозомочевшы /Ш&У па протопласты промышленных вультур з.ехуЫивеа . в опытах учитывали Еыживание и частоту возникновения мутантов, устойчивых к рЕфампицаку поело воздействия мутагенов на протопласты и сравнивали етн показателя с

шиыми о воздействии мутагенов на мнцелиальные клетки з. егу-ат.еа . НШ использовалась в конечной концентрации 3 мг/ш ш рН7,0 . Время обработки варьировало от 10 до 60 мин. В 1бл.З приведены данные об обработке протопластов и мицелиальннх веток НШ. Из ' зтяг дашшх ввдно, что протопласты значительно гвствительнее к НШ, чем ыицеляалыше клетки, Так, выживание »топластов в 23 раза ниже, чем выживание мицелиалышх

неток Щ)н этой же дозе мутагена/ при эксгозиции 40 мин./.

Таблица 3

Влияние БММ на протопласты и иицелиальнне клетки

Э.егукЬгаеа.

в :время об-: % выжявандя

>прото- иащелиаль-::

:частота -мутантов при обработке_

:пластов яых клеток; протодластовгмицелиальннх клеток

. а- /контроль/ 100 100 0,8 . 10'

10 41,2 78,5 2,3 • 10'

20 7,0 35,6 5,7 • Ю'

30 1,8 20,8 2,1 • Ю'

40 0,6 13,9 0,7 • 10'

I. 60 0,05 3,2 1,3 • И"

г«"

гб

Г® Г5 "5

гб

2,0 3,4

3,6 6,8 0,5 1,0

Ю

ЯГ

та:

гв

10'

го и ГО

Г? Г? -6 гб

№ табл.3 также следует, что максшадьная частота появления Гг - мутантов устойчивнх к Г0 ыкг/млрифампицине достигается же при обработке протопластов НШ в дозе 30 мин. го же время дя увеличения до максимальной частоты г!£г - мутантов, равшшой с получаемой пря обработке протопластов, необходима брабогка мяцелиальих клеток в течение 60 пик. Фдученные давне позволяют сделать вывод о цреидуществах цротошсастов шрзд яцелжальнныи клетками для мутагешвации з.егуъьгаев • Оптн-1алвяой, судя по чаототе возникновения г11г - мутантов, сле-увт считать дозу НШ, дагаую около 1% выживяняя протопластов.

Дредставляло интерес изучить эффект мутагенной обработки Ш протопластов г.егу*Ьгаеа на антибиотическую активность паша. 3 качестве объекта а этих экспериментах исгользовалд щин из устойчивых крифампицину мутантов штамма Б.егуЗДгаеа 5 , >бозжаченныа как 3-20. На рис. 3 приведены данные о распредела-

7.

40

го

</0

го

» Г

е 9 12 fS fi 2f 14 ¿7 (vrr)

: S S /2 /s /р 2/ Î7 fu/ij

g И-"M*-

40

20

1

I

J e S 12 1S rs ?t 2* (c/f? )

Б

Рис.3. Результаты обработки Ниш протопластов штамма

S.erythraea 3-20. По оси абсцисс -Ш, по оси ординат - число клонов в %.

A) регенеранты протопластов, не обработанных Hi,ii; Б) регёнеранты протопластов, обработанных п^;

B) клоны неппотопластированной культуры о. обработанной (выживание клеток око;ло I/o).

■¡ии клонов регенерантов итеыма 3-20 ло антибиотической активности в варианте эксперимента,- когда протопласты не подвергались об-заботке №¿.1 /а/ и в варианте,.в котором протопласты обрабатыва-1И /3 мг/мл, 30 мин./ /б/. Проанализирована антибиотическая активность соответственно .157 и 172 культур регенерантов.

Представленные на рис.3 данные свццетельствуют о том,что >бработка протопластов Hi.li приводит к появлению большего числа линус-вариантов - по сравнению с 11,0% среди регенерантов,

возникших из протопластов, не подвергшихся действию №¡11. Умень-аается также и число плюс-вариантов - 3%, при обработке Hi.Ii и И% - без обработки мутагеном. Среди регенерантов, полученных из збработанных Н1.Л.1 протопластов, увеличивается число низкоактивных вариантов: клоны с ИЛ, меньшими 12 составляют 60,0>, против ^7,3% таковых среди необработанных Ш-,1 клоков. Следует, однако, этметить, что характер воздействия Нх.ъ.. на протопласты в целом соответствует его влиянию на мицелиальные клетки э.егуЫггаеа 'рис.3, В/. Среди клонов, образовавшихся из подвергнутой Ш.-ш не-1ротопластировачной культуры так же возрастает число минус- и {изкоактивных вариантов по сравнению с отдельными клонами непро-гопластированной культуры 5-1 /рис.2.А/. Это позволяет сделать зывод, что перераспределение клонов после воздействия НЛ* в сторону увеличения низкоактивных вариантов определяется не объектом яутагенной обработки /протопласты или клетки/, а самим мутагеном.

Таким образом, приведенные в данном разделе результаты юзволяют сделать вывод о том, что процедура протопластисования 1 регенерации протопластов увеличивают изменчивость промышленной £ультуры Б.егуШгаеа по признаку антибиотической активности I может использоваться в селекции штамма на повышенную продукцию )ритромицина.

3. Использование конызгационных скрещиваний и слияния протопластов в селекции штаммов-продуцентов эритромицина

Получение и использование генетических рекомбинантов - один из перспективных методов конструирования и селекции промышленных штаммов- актиномицетов. Коныгациошшй процесс известен у многих актиномщетов-цродуцентов антибиотоков / Rhodes , 1985/. Однако в коньнгационных скрещиваниях актиномицетов рекомбинаяты обычно возникают с очень низксй частотой, а у многих промышленны штатов, прошедших многочисленные мутагенные обработки, коньюга-ционный процесс отсутствует. Слияние протопластов лишено этих не достатков, поскольку рекомбинанты в этом случае возникают с огно сительно высокой частотой даае при использовании родительских шт мов, не сзфевдвающихся при совместном росте / Hopwood, Wright 1978,* Illing et al. , 1989 /. У" ШТЭММОВ S.erythraea / S.erythremia / конькгационннй процесс описан, однако отсутствуют дан ные об его использовании в селвкцш высокоактивных продуценте© эритромицина. В литературе отсутствуют такяе данные о генетической рекомбинации при СЛИЯНИИ протопластов s.erythraea и воз-ышности использования этого процесса в селекции продуцентов эри тромшщна. Слияние протопластов и получение при этом генетически рекомбинантов описано для ряда штаммов актиномицетов / Hopwood 7/right , 1978; Bait а . 1978; Ochi et al. , 1979; Ogata et al. » IS85; Подгорская и др., 1985; Kohler , Dariana , IS88; niing et al. . 1989 /. Во всех методиках слияния прот пластов актиномицетов общими подходами являются выращивание мице лия штаммов, хранение и посев полученных протопластов в условиях обеспечивающих максимальную ux регенерацию, а также использована палиэталенгликоля различной молекулярной массы как вевдетва, инд пвдующего слияние протопластов. Данные об условиях, необходимых для эффективной регенерации протопластов исследуемых штаммов s.erythraea приведены в разделе I данной работы. Для индукции слияния протопластов мы использовали полиэтиленгликоль /ШГ/-4001

. " -т т. и

/ -"J-uiMi д поскольку в литературе тлелись данные об эффективна! использовании ПЗГ с близкой молекулярной массой в опытах по трансформации протопластов s.erythraea / Yamamotо et al.

иве/.

Для слияния протопластов s.erythraea мы применили следу] п®ю методику. Смешивали по I мл суспензии протопластов родительских, игаммов ОДКГ5КОВОЙ плотности / ОТ I-IQ8 До I-I09 протопласт.

- Г9 -

в мл в различных опытах/. Смешанную суспензию осаздали центрифугированием при 3000 об/мин 7 мин. Супернатант сливали. Осадок осторожно ресуспэнднровали в оставшейся в центрифужной пробирке жидкости о Затем добавляли 5 мл среда Р и снова центрифугировали при 3000 об/ман 7 ыин. Супернатант сливали, осадок просушивали., стряхивая капли оставшейся нвдкости. Сгусток протопластов осторожно разбивали, а затем добавляли 0,8 мл 50$ раствора иолиэтиленгликоля ГИГ 4000 / Р1ика / и смесь немедленно шшетировали I раз. Сус-пзнзню выдерживали с полиэтилаягликолем на протяжной 2 мин. при комнатной температуре. Суспензию протопластов без разведения я в разведениях Ю-1- - 10~3 высевала на регеяерацгонную среду Р^Тзд а песубяровали 7-10 суток до наступления сгоруляцш.

Электронномикроскопическай. контроль процесса слияния црото-пластов штамма 5 показал, что после добавления ГОГ-4000 сначала образуется сгусзха протопластов /рис.4а/, а затем наблвдается •^явление крупных протопластов, которые, вероятно, являются результатом слияния нескольких шш даге десятков протопластов /ряс.46/. Аналогичную картину ш наблюдали п при использовании предлелминого нами метода для слияния протопластов штаммов 240,7 и 1345/. Таким образом, макроскопический анализ указывает на аффективное ть избранной, нами методики слияния протопластов э.егу-

•Шгаеа.

Важным критерием эффективности применяемой, методики слияния протопластов является возникновение в скрещиваниях:, осуществляемых таким путем, генетических рекомбинантов. ГЬоводеняе скрещЕ-ганий в: свою очзрздь требует подбора соответствующих родительских штаммов. Если в модельных экспериментах возможно использование- н> качестве родительских штакмов пшша$ютрофных производных з. егу^птаеа , то применение такого подхода для промышленных штаммов неприемлемо, поскольку у ауксотрофных мутантов э.егу-гьгаеа - сильно снияена антибиотическая активдасть /Пзнчева и др., 1977/. №этому в качестве генетических маркеров для скрещивания промышленных штаммов з.егу-ььгаеа ми использовали вдтацш устойчивости к антибиотиком рафампицпцу, тяоегрептону и стрептомицину. Это обусловлено рядом причин. Во~первых, ш обнаруаилд, что исходные штаммы э.егу^аса 5, 3 и 233 являются шеоко-чхветвахеяванмя к рафамппцяяу и июсгрептоцу. Везшие спор и мицелпальных клеток эгях атгимоз в пределах 50т-10С$ наблюдается лазь на падзоцзняых среда:: СГ-в л н^ , содергавдх иепеа I мгег/ал рефашащина, г'енее 0,5 мкг/ыл тдсстроотопа з евкаа

Рис.4. Слияние протопластов штамма з.егу^гаеа 5 под действием ШГ-40."0

V Образование сгустков протопластов; Б/ образование слившихся протопластов.

мкг/мл стрептомицина. Данные о частоте возникновения спонтанных : индуцированных НГ мутантов штаммов 5 и 3, устойчивых к указанным нтибкотикам, приведены в табл.4. Полученные результаты показыва-iT, что спонтанная частота возникновения uifp , Тзгг и !trr мутантов исследованных штаммов низка и увеличивается вЮ00-аз при действии НГ в дозе, дающей около вызывания клеток.

Таблица 4.

Частота возникновения мутантов s.erythraea 3 и 5, устойчивых к антибиотикам

!ласс концентрация: Штамм 5 Штамм 3

|утан- 'ОВ ■: антибиотика,: :к которой устойчив мутант :мкг/мл : спонтанные: НГ iспонтанные : НГ • •

ü£r 10,0 4,0-10-7 0,9. Ю~5 6,3-10-7 5,1-10-5

:згг 2,5 5,1. КГ7 9,5-I0~S 2,0«Г0-7 ?,2-Ю"6

!trr 500 1,2-КГ5' 3,5'ГОГ3 0,5-10"

Важной особенностью части исследованных иг1* , тзгг и stгГ - мутантов э.егу1:йгаеа является то, что они характер»-уются антибиотической активностью на уровне исходного штамма или ише /табл.5/.

Таблица 5.

Характеристика антибиотической активности мутантов штамма 5, устойчивых к антибиотикам.

Класс (утантов :число изу- : гчшаых му- : % мутантов с антибиотической активность»

. тантов . на уровне штамма 5 : вше, чем у штамма 5.

Rifr 138 55,6 9,7

Тагг 32 16,5 20,0

Strr 30 15,7 29,6

Нами отобраны стабильные мутанты штаммов 5 и 3 с указанными зеяотипамя, которые в дальнейшем использованы как родительские в [оньжгацяонянх скрещиваниях и скрещиваниях, производимых посред-!ЕВШ слияния протопластов /раздел 3.2/. Низкая частота возникно-¡знет , и з-ьгг - иутацзй, легкость тестирования

фенотипов устойчивости и чувствительности к антибиотикам, стабильность и сохранение частью мутантов высокого уровня антибиотической активности позволяет использовать эти мутации в качестве генетических маркеров S.erythraea.

Для сравнения генетической рекомбинации при конъюгации и слиянии протопластов у штата s.erythraea нами цроведены скрещивания генетически маркированных штаммов - производных BtGC2:I34E leu I ига I и 2407 met I trp 3 phe X . Проведен отбор 9 классов гаплоидных рекомбинантов как после конызгащюняаго - скрещивания, так и после слияния протопластов. Частоты возникновения этих классов гаплоидных рекомбинантов приведены в табл. 6.

Частота возникновения гаплоидных рекомбинантов при кольюгацид И СЛИЯНИИ протопластов ШтаММОВ S.erythraea

В.ЦХ32 1346 leu I ura I х 2407 met I trp 3 phe I.

Таблица 6

J№

a/a

Частота рекомбинантов

Класс рекомбинантов

: при конъюгации :при слиянии vpo-:_: то пластов

7. leu+ trp* phe4"

8. leu* met+ phe+

9. leu"1" trp+ ¡aet+

1. leu+ met+

2. leu+ trp+

3. leu+ phe+

4. ura+ ¡net+

5. ura+ trp+

6. ura+ phe+

3,7 • TO"5 0,9 • ICf3

2.1 • КГ3 3,5 • IO"2

1.2 • Ю"4 4,1 • IO'3 0,5 • IO"3 Q/,8 • IO"2 6,0 • IQ"4 Q ,,7 • IO"2 0,7 • IO"3 1,2 • IO"2 1,0 • IO-5 4,6 • ПГ3 ü,6 • IO"5' 2,1 • IO"4 0,8 • IO"5 0,8 • ЕГ3

Таблица 7

Генотипы рекомбинантов, образовавшихся в скрещиваниях штаммов Н1СС2 1346. ieu I ига I х 2407 met I trp I phe I. а/ Селектируемые маркеры ieu i* и phs i+ /рис.5 а,б/

Л № ц/п

Генотипы ига met trp

Конькгацм

Слияние протопластод

число :кроссш!го- :число :вер в облас-t

_:ти 2'_:

:кроссинговер :в области

I. + + + 90 2,5 20 2,5

2. ига met trp - - '12 1.2,3,4

3. ига + 9 1,5 7 1,5

4. + net trp 6 3,4 5 3,4

5. + met + 4 3,5 4 3,5

S. ига + trp I 1,4 4 1,4

7. + + trp 53 2,4 23 2,4

8. ига met + - - 28 1,2,34

Всего

163

103

б/ Селектируемые маркеры

ига I

met 1+ /РИС.5 в,Г/.

и

Конъюгация_.'Слияние протопластов

гкроссинго- : :кроссинговер

таело :вер в об- .-число :в 0(5ласти

_ласти ' :_:_

I. + + + 18 2,5 7 2,5

2. leu trp phe 5 1,2,3,5 15 1,2,3,5

3. leu + + 13 1,2 6 1,2

4. + trp phe 88 2,3 21 2,3

5. + trp + 28 2,4 9 2,4

a. leu + phe 5 1,2,34 5 1,2,3,4

7. + + phe ID 2,3,45 E) 2,3,45

3. leu trp + - - 6 1,2,4,5

№5 ' Генотипы

" leu trp phe

Всего 167 79

Штжзеяе: I/ обозначения областей на ряс.5 а, б;

2/ обозначения областей на ряс. 5 в,г.

Рис.5. Аллельные отношения анализируемых генетических марке среди рекомбинантов, полученных в скрещиваниях s,етз raea 1346 ига 1 leu 1 х 2407 met 1 trp 1 phe 1 (табл.7). I

Примечание:- I. Треугольниками обозначены селектируемые алле

2. Внешнее кольцо - хромосома штамма 2407, внутренне кольцо - хромосома штамма 1346;

3. а и в - рекомбинанты получены в коньогационном скрещивании;

4. б й г - рекомбинанты получены при слиянии протопластов.

Как эддао из представленных в табл.6 результатов частота возникновения всех выделенных классов рекомбинантов значительно выше цри слиянии протопластов, чем при конъюгации. Следует, однако, отметить, что частота рекомбинантов, возникающих при слиянии протопластов s.erythraea , не достигает таких высоких значений, как это описано ДЛЯ S.coeliclor АЗ/2/ (Hopwood, Wright, 1978). Из полученных данных следует, что для изученных штаммов s.erythraea невозможен тотальный отбор рекомбинантов после слияния протопластов без селекция по диким аллелям генетических маркеров.

В табл.7 приведены результаты анализа генотипов гаплоидных рекомбинантов, полученных в скрещиваниях 2407 х 1346 при селекции по маркерам leu l+ и phe l+ , а также ига х+ и met i* .

В коньюгациояных скрещиваниях при селекции по маркерам leu х+и phe i+ выделено 6 классов, а при селекции по маркерам-ига х+ н met i+ - 7 классов рекомбинантов из 8 возмоаных. фи слиянии протопластов в обоих случаях образуется максимальное число классов рекомбинантов - по 8. фи слиянии протопластов s.erythraea возрастает и число рекомбинантов, возникающих за счет множественных кроссияговеров. Так, все Г К? leu i+ phe i+ pe-ясмбкнанга, подученных при коньгггации, образовались за счет двойного кроссинговера. В то же время для 38,8$ leu l+ phe l+ рекомбинантов, возникших при слиянии протопластов, необходимы мно-нественнне кроссинговеры /табл.7а/. Подобная картина наблвдается и среди ura I* met i+ - рекомбинантов /табл.7 б/. Множественные кроссинговеры необходимы для образования 11.9$ ига i+ met l+ рекомбинантов при коньнгации и 45, - при слиянии протопластов. Отличия наблкщаются и в аллельных откоте-н¡ш неселекгируемых маркеров среди рекомбинантов подученных при конъюгации я слиянии протопластов /рис,5/. фи конъюгация имеется выраженный градиент наследования не селектируемых маркеров /рис.5 а, в/, который, вероятно, обусловлен направленным переносом хромо с сш. Такой градиент отсутствует у рекомбянантоз, воз-некеях при слиянии протопластов /рис.5 б, г/. Полученные результаты указывают, ЧТО слияние протопластов S.erythrp.ea на только дает большую частоту рекомбинантов, но и увеличивает их разнообразие. Большое число рекомбинантов, возникши за счет множественных кроссияговеров, п отсутствие градиента наследования неселек-тируемнх маркеров монат свидетельствовать о том, что в рекомбинацию вовлекается большее число генов родительских штаммов / н°р~ wood, Wright, 1978 /.

Доведены эксперимент по определению стабильности рекомбинантов, полученных при слияния протопластов штаммов 1346 и 2407. По 5 независимых рекомбинантов с одинаковым генотипом были рассеяны на полногрнаую среду СР-6 для получения отдельных колоний. Затем проверяли генотипы не менее 300 отдельных колоний, образовавшихся при рассеве культуры каждого рекомбинанта. Все проверенные на этом этапе колонии сохраняли фенотип исходных рекомбинантных штаммов. Затем по одной культуре каждого класса рекомбинантов, подученных из колоний на СР-6, вновь рассевали на эту же среду и проверяли генетические маркеры не менее 300 колоний. Шказано, что и в этом случае все полученные колонии сохраняли фенотип исходного рекомбинантного штамма.

Таким: образом, в экспериментах с генетически маркированными производными э.егугьгаеа получены данные об увеличении частоты и многообразия рекомбинантов полученных при слиянии протопластов, а также об их стабильности. Шлученные результаты свидетельствуют о перспективности этого метода выделения рекомбинантов Б.егуЪЬгаеа и послужили основой для применения слияния протопластов для гибридизации высокоактивных промышленных штаммов продуцентов эритромицина.

Слияние протопластов и коньдгационные скревдвания дивергентных штаммов- промышленных продуцентов эритромицина

Проведены эксперименты по слиянию протопластов и коныгацион-ныы скрещиваниям высокоактивных промышленных штаммов з.егу^Ьгаеа. В качества; родительских использованы цутанты штаммов з.егу^гаеа 5 и 3, устойчивые к антибиотикам: 5-621 , 5-523 -ьаг ,

5-155 зЪг , 3-21 га* , 3-31 Я1;г » Эти штаммы не отличались по морфологии от исходных штаммов 5 и 3 и характеризовались высокой антибиотической активностью: штамм 5-621-11452, 5г523-ГО£$ и 5-155-110? от активности штамма 5, а штаммы 3-21 и 3-31 - 105£ и 1Ш/£ от активности штамма 3,соответственно. Исходные штаммы 5 я 3 прошли независимую селекцию на повышенную антибиотическую активность.

Цэозедзны и проанализированы следеедие скрещивания: 1/ 5-155 зЪг х 3-21 ; 2/ 5-523 tsr з. 3-21 ;

3/ 5-621 т х 3-31 . Отбор рекомбинантов в коныгадиоа-

ных скрещиваниях вела после совместного роста родительских штаммов на среде СР-6 в течение Ю дней я высева на селективную среду для выделения клонов, несущих две мутации антибиотякорезиотентиоо-ти. Слияние протопластов указанных родительских штаммов проводили

по методике, отработанной для штаммов 1346 и 2407. Олесь обработанных ШГ4000 протопластов родительских штаммов высевали на ре-генерационную среду В?, инкубировали 10 дней, а затем сшры, рб-разовавпшеся на газоне регенерировавших протопластов, высевали на селективные среды для отбора рекомбинантов имеющих два маркера антибиотикорезистентности и учета клонов с родительским фенотипом. В табл.8 приведены данные о частотах образования рекомбинантов в коньигационгшх скрещиваниях и при слиянии протопластов, а в табл.9-частоты образования спонтанных мутантов родительских штаммов, несущих вторую мутацию устойчивости к антибиотику / tsгI> - у штамма 3-21; 3+гг У штаммов 5-621 и 3-21, г±£г У штаммов 5-155, 5-523 и 3-31/.

Таблица 8.

Частоты возникновения рекомбинантов в коньигационных скрещиваниях и при слиянии протопластов мутантов, устойчивых к антибиотикам.

Щ ц/п

Скрещивание

Фенотип рекомбинантов

Частота рекомбинантов

при конью- :цри слиянии гации :протоплас-: тов

1- 5-155 з-кг х 3-21 гхГ

2- 5-523 гаг х 3-21 гхГ 3. 5-621 т±£ х 3-31 з^

■г иг1. 1,1-Г0"5 1.7.10"3

■г ВИТ 2,4.Ю~6 5,2-ГО"3

■г 5tгг 8,1-ГО"3 4,-5-Ю~2

Таблица 9.

Частота возникновения спонтанных, устойчивых к антибиотикам мутантов, у штаммов, используемых в качестве родительских в скрещиваниях э.егу«1гаеа /табл.8/.

Штамм_:^№тантоваШШХ I Частота^

5-155 Згг г1Г 2,5 • Ю-7

5-523 tsг г±£ 1.3 • Ю-8

5-612 г!Г зЪг- 1.7 ' Ю"6

3-21 пг вЪг 2,8 • ЯГ6

3-31 з1л- г!Г 1,3 • ГО"7

3-31 Ю-8

Как ввдно из приведениях в табл.8 и 9 данных, рекомбинанты, имеющие два маркера резистентности, возникают и в коншгационных скрещиваниях и при слиянии протопластов - их частота существенно превышает частоту спонтанных мутантов с аналогичным фенотипом. Частота рекомбищнтов в коныагацяонных скрещиваниях колеблется от 8,1»10~® до 2,4«1СГ® в зависимости от скрещивания. Во всех случаях частота образования рекомбинантов при слиянии протопластов выше, чем цри конъюгации. Это свидетельствует о том, что при слиянии протопластов высокоактивных промышленных штаммов стимулируется генетическая рекомбинация, хотя круг отбираемых гекотишпеских классов рекомбинантов в проведенных экспериментах ограничен.

Для определения возможностей слияния протопластов в селекция высокоактивных штаммов s.erythraea проведены насколько вариантов экспериментов: I/ индукция ШГ слияния протопластов одного и того ж&: штамма 5; 2/ индукция 1ВГ слияния протопластов штамма 5 в сочетании с облучением ультрафиолетом; 3/ слияние протопластов двух различных мутантов штамма 5-5-621 rif и 5г523 tsr ; 4/ слияние протопластов мутантов дивергентных штаммов, прошедших независимую селекцию: 3-21 rif и 5-155 str • В первых двух сдучаях проводили тотальный отбор колоний регеиерантов и определение их антибиотической активности. В двух последующих вариантах опытов /3 и 4/ отбирали рекомбинанты по маркерам антибиотикорезис-тентности / rifr strr / и определяли их антибиотическую активность. Обработка ультрафиолетом в дозе, при которой выживает около 20$ протопластов применялась как фактор, который, возможна, стимулирует рекомблгацшз / Hopvroo& D. , v/right к. , 1979/. В вариантах экспериментов I и 2 проанализирована антибиотическая активность соответственно 245 и Е72 культур регекераатов. Полученные данные приведены на рис.6а,в. Для сравнения на этом рисунке показано распределение по антибиотической активности отдельных клонов регеиерантов штамма 5, облученных ультрафиолетом /рис,6 б/. Из приведенных данных видно, что облучение протопластов штамма 5 ультрафиолетом, приводящая к падению их выживания до 20%, вызывает ¿¡величание числа регенерантов с низкими значениями ЙП /от 20 до 80% контроля/ - 37,2$ со сравнению с 13,5$ регеиерантов с такими значениями ИП, подученными при цротопластироваиии без 75- обработки. При обработке протопластов полиэтиленгликолем, стимулирующем их слияние при тотальном анализе регеиерантов без селекции рекомбинантов наблвдается увеличение изменчивости рэгенераятов по про-

зо го го

зо 20 ю

40 30 20 10

го ео /оо /+о /го гго 2еа зоо 5

X

3-

20 ео /99 /40 /ЗО ¿20 £90

в

У.

20 £0 /00 МО /99 229 2(0 990

Рис.б. Распределение клонов регенесантов З.егу-Шгаеа (штамм о} после обработки ПЭГ 4000 и ультрафиолетом.

A) протопласты обработаны ПЭГ 4000^ Б) протопласты облучены УФ;

B) протопласты облучены УФ и обработаны ПЭ1 4000;

По оси абсцисс - антибиотическая активность (%). За 100% принята средняя антибиотическая активность штамма 5. По оси ординат - процент клонов.

знаку антибиотикообразования и появление 2регенерантов с мак-симальныли значениями ИП / > 2ЭД& контроля /. фи З^-облучении с последующей обработкой голиэтяленгликолем подучено 3,1% клонов с такими Ев высокими значениями ИП. Однако, если сравнить число регенерантов с ИП 200^ от контроля, полученных в кавдом из вариантов эксперимента, то ввдао, что их количество существенно не отличается / 6,5 - Ш,3* исследованных клонов регенерантов/.

Гй лученные результаты позволяют сделать вывод о том, что обработка ШГ в комбинации с ЗФ-об лучением или без него и тотальный случайный отбор регенерантов баз селекции генетических рекомби-нантов не имеет очевидных преимуществ перед протопластированием и регенерацией без указанных обработок в выделении высокопродуктивных штаммов регенерантов.

Проведены эксперименты по слияшш протопластов двух различных мутантов штамма 5:5-621 , устойчивого к рифампицйну и 5-523 , устойчивого к тиострептону. В контрольных экспери-

ментах рекомбинанты г!£г tsrг за счет конвенционального скрещивания не получены /с частотой 10~® а более/. Частота образования спонтанных га.£г -мутантов у штамма 5-523 составила около 1.10"®, а гзгг -вдтанты у штамма 5-621 не выявлены /табл. 9/. Рекомбинанты tsгг г1Гг после слияния протопластов указанных штаммов обнаруживались с частотой от 1,5. Ю-4 до 2,8-Ю"4. Та кил образом, слияние протопластов э.егу^гаеа дает возможность получить рекомбинанты между различными мутантами одного штаила, которые не скрещиваются при совместном росте. Данные об антибиотической активности непротопласт1фованных клоков родительских штамме® 5-523 и 5-621 отдельных регенерантов протопластов штамма 5-621 и рекомбинангов тагг э^1, , годученных цри слиянии протопластов приведены на рис.7 /а-г/. На рис.7д показано распределение по антибиотической активности клонов рекомбинантов аи^г подученных при слиянии цротопластов дивергентных штаммов 3-31 и 5-621. Как видно из данных, приведенных на рис.7, наибольшее число плюс-вариантов наблюдается среди рекомбинантов по маркерам ан-тибиотико-резистевтяости, полученных при слиянии протопластов мутантов дивергентных штаммов /3855/. В то же время в таком скрещивании возникают и минус-варианты /2% /, то есть наблюдается значительная изменчивость по признаку антибиотикообразования среди рекомбинантов.

Таким образом,слияние цротопластов и отбор рекомбинантов по маркерам устойчивости к антибиотикам является эффективным методом отбора клонов э.егу^аеа с повышенной антибиотической активностью.

го ю

зо 20 /О

*

I I I I

мае

«

/в I I I

г/ 2( 27

/г /з

/в I

г/ г* Р7

/5

м

I

г/ гг (ил)

еъ£1

з е у м & & м р* г? А I . I

-1

з в з /г /а л и ¿7

)

Рис.7. Распределение клонов рекомбинантов Э.егуШгаеа по антибиотической активности, полученных после слияния протопластов. По оси абсцисс - антибиотическая активность (ЙП), по оси ординат - процент клонов. А) клоны непротопластированной культуры 5-621; Б) клоны непротопластированной культуры 5-523; В) клоны регенерантов штамма 5-621; Г) клоны рекомбинантов, полученных' при слиянии протопластов штаммов 5-621 и 5-52.3; Д) клоны рекомбкнантов, полученных при слиянии протопластов штаммов 5-621 и 3-31.

Проведено определение антибиотической активности 162 независимых рекомбинантов, подученных в коньюгационных скрещиваниях 5-612 пггх-3-31 б-Ьг1". Данные о распределении рекомбинантов по антибиотической продуктивности А4Ц/ приведены на рис.8. За 100^ принят средний ИП 30 независимых клонов штамма 612 характеризующегося более высокой антибиотической активностью, чем штамм. Как видно из данных, приведенных на рисунке, 5,6% клонов рекомбинантов при первичном анализе характеризуются антибиотической активностью превышающей 100%, Большинство отбираемых рекомбинантов -75,9 характеризуются активностью от 40 до 60%.

___ бо во т /¿о

Антибиотическая активность

Рис.8. Антибиотическая активность рекомбинантов, полученных в коныопяционных скрещиваниях штаммов э .егу-Штаеа 3-31 з-ьг и 5-621 По оси абсцисс - антибиотическая активность (%), по оси ординат - процент клонов рекомбинантов.

Сравнение данных, приведенных на рис.7 и 8, показывает, что изменчивость н±гг з1;гг - рексмбиаантов по признаку антибиотической активности выше среди рекомбинантов, полученных цри слиянии протопластов, чем сроди ракшбинантов с таким же фенотипом, полученных при конъюгация. Это, возможно, обусловлено тем, что при конъюгации возникает меньиае. разнообразие генотипов рекомби-нангов, тем цри слиянии протопластов /габл.7/.

сведено изучение стабильности признака повышенной антибиотической активности у 5 независимых плюс-вариантов отобранных среди рекомбинантов, возникших при слиянии протопластов штаммов 5-621 и 3-31 цри выращивании. Данные об антибиотической активности э.тих вариантов цри культивирования их в глубинных условиях в ферментационной среде приведены в табл.10. Определялась антибиотическая активность первичных культур-рекомбинантов, отобранных сразу после слияния, а также.-через 2 и 5 генераций культур в неселективных условиях на среде СР-6. За ТОО?! принимали антибиотическую активность ытамма 5-612.

Т&блица 10

Стабильность антибиотической активности рекомбинантов, подученных при слиянии протопластов штаммов 5-621 И 3-31 Э1;:гг

Л :_антибиотическая активность %_

культуры ; после дииящс- : 2 генерацш : 5 генераций

I 135 130 115

2 140 132 120

3 147 140 135

4 122 117 П6

5 П5 108 97

Из цриведеаяых з таблице 10 данных, видно, что антибиотическая активность рекомбинантоз в генерациях при выращивании в не-салективных условиях снижается. Это снижение менее значительна, например, у вариантов 3 и 4 /на 12^ и соответственно/ и более существенно у штаммов I и 2 /на 20$ /. Однако четыре варианта из пяти сохраняют после пятя генераций антибиотическую активность преяаиахяцр) таковую у родительского штамма 5-512. Полученные дан-газ указывают на необходимость проведения селекции ояобрашых сервачшх рекомбинантоз на повышенную антибиотическую активность.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны условия получения и регенерации протопластов штаммов э. егуЬЬгаеа » в том числе высокоактивного промышленного продуцента эритромицина и его мутантов. Оптимальными условиями являются: выращивание мицелия штаммов в течение 72 час. при внесении 0,1% глицина в момент посева, добавление 0,1? дкметилсульфокси-да в среду Р и посев протопластов в 0,?? регенерационцую среду К2Т20.

2. Показано, что протопластирование и регенерация протопластов приводит к увеличению изменчивости Б.егу-Шгаеа по признаку антибиотической активности. С использованием этого метода получены клоны с повышенной антиодатической активностью. Это позволяет использовать протопластирование для получения высокоактивных вариантов-продуцентов эритромицина.

3. Обнаружено, что отдельные партии высокопродуктивного штамма

Б. егуЫггаеа 5 характеризуются необычно высокой генртической нестабильностью признака антибиотической активности, проявляющейся в появлении с высокой частотой /до Ъ%/ вариантов не образующих эритромицин.

4. Показаны преимущества использования протопластов перед мицели-альными клетками для мутагенизации з.егу-Нзгаеа. Определены условия мутагенной обработки протопластов Б.егуШгаеа н -метил- н нитрозомочевиной.

5. Разработан эффективный метод слияния протопластов Б .егу-ььгаеа

и получения при этом генетических рекомбинантов. Установлено, • что при слиянии протопластов увеличивается по сравнению с конъюгацией частота и число классов рекомбинантов. Показана перспективность использования слияния протопластов штаммов, маркированных мутациями устойчивости к антибиотикам ,в селекции высокоактивных штаммов продуцентов эритромицина.

6. Установлена высокая генетическая стабильность рекомбинантов , изолированных при слиянии протопластов у э.егу-ььгаеа • Штаммы рекомбинантов, полученные при слиянии протопластов, сохраняют повышенный уровень антибиотической активности в течение пяти генераций в неселективных условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.- Кириченко Н.В., Федоренко В.А., Ходурский А.Б., Настасяк И.Н., Босак Н.П. Множественная устойчивость к антибиотикам у

з. erythreus» Тезисы докладов Всесоюзного семинара "Современные проблемы антибиотико-резистентности", Москва, 19Ь8, с.48.

2. Кириченко Н.В., Назазнш С.М., Федоренко В.А., Настасяк И.Н., Миронов В.А., Даниленно В.Н. Генетический и биохимический контроль биосинтеза махролидных антибиотиков. Антибиотики и химиотерапия, 1990, № 12, т.35, с.34-38.

3. Кириченко Н.В., Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Дониленко

B.Н. Получение и характеристика рифампицинустойчивых »мутантов у штагама з.erythreua . Антибиотики и химиотерапия, 1990, № 12, т.35,

c.II-I3.

4. Кириченко Н.В., Заворотная С.А., фуре А.Р., Настасяк И.Н., Василия Л.И., Коновалова Т.В., Федоренко В.А. Создание рекомбинант-ных штаммов-продуцентов антибиотика эритромицина. I Всесоюзная планово-отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", Пущина-на-Оке, 1990, 163-164.

5. Кириченко Н.В., Федоренко В.А., Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Василия Л.И. Генетический контроль биосинтеза эритромицина штаммом s.erythreus • УП ыа Национална конференция по производству и приложение на ангибдагици,'Разград, 1990, II.

6. Kirichenlco II. ,Danilenko V., Ilastnsjak J., ?cdoi"on!co V. Llutant formation and characteristics of tlie rifampicin-resistance mutants in streptomycea erythreus. Abstracta of Int.Symp.oxi Genetics and Product formation in strcptonyces, 3rfurt,1990,p.19.

7. Кириченко Н.В., Федоренко В.А.. Генетический контроль продукции эритромицина. Отчет о НИР, № гос.регистрации 01.87.00.17789, 1990.

МГП "Атомполигра?сервис"

Т;:р.150 Подписано е печать 28.12.91. Заказ 2150