Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Использование клеточной инженерии актиномицетов для получения продуцентов новых антибиотиков

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков

Г Г 3 од

__ (] ^997 На праЕах рукописи

МАЛАНИЧЕВА Ирина Алексеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ АКТИНОМИЦЕТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ НОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

14.00.31 - химиотерапия и антибиотики

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в НИИ по изысканию новых антибиотиков Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель.- член-корреспондент РАМН

ДУДНИК Ю. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор САЗЫКИН И.О. кандидат биологических наук ВОЕЙКОВА Т.А.

Ведущая организация: Московский Государственный Университет,

Биологический факультет (кафедра микробиологии)

Защита диссертации состоится "19" 1997г.

)Ч

в __£ часов на заседании Специализированного Совета

Д.001.05.01 при НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН по адресу: 119867, Москва, ул. Большая Пироговская, д.11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН.

Автореферат разослан 1997г.

Учёный секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук хТ. А.Успенская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на обилие и разнообразие имеющихся сейчас антибиотических препаратов, потребность з новых антибиотиках остаётся актуальной в связи с приобретением патогенными микроорганизмами и опухолевыми клетками устойчивости к применяемым антибиотикам. побочным действием антибиотиков нз макроорганизм и появлением новых инфекционных заболеваний. Для создания новых антибиотиков существует несколько способов; наиболее результативными являются скрининг продуцентов новых природных веществ и химическая трансформация известных антибиотиков. Но пока не найден способ получения идеальных антибиотиков, и поэтому любой новый подход к этой задаче вызывает интерес.

Самым богатым биосинтетнческин потенциалом среди известных продуцентов антибиотиков обладают актиноницеты. Методы клеточной инженерии, разработанные для актиноиицетов в 70-е годы японскими [Okanishi, 1974] . английскими [Hop-wood, 1977] и американскими [Salta, 1978] учеными, значительно расширили методические возможности изучения этих микробов, которые ранее ограничивались мутагенезом и штамноспецифичной и неэффективной конъюгацией. Слияние протопластов обеспечивает высокую частоту генетической рекомбинации, что, в частности, позволяет использовать немаркированные штаммы. Регенерация протопластов может вызывать разнообразные изменения генома.

По предположению разработчиков, одним из многочисленных приложений методов должно было стать получение новых антибиотиков пут&м создания их рекомбинантных продуцентов. Возможны две категории новых антибиотиков - гибридные и антибиотики молчащих генов. Если рекомбинация произойдет в области структурных биосинтетических генов, то могут образоваться вещества, в молекулах которых сочетаются фрагменты молекул исходных антибиотиков. Для создания таких химических "гибридов" необходимо, чтобы в молекулах исходных антибиотиков присутствовали общие структурные фрагменты.

например, сахара. Если же рекомбинация произойдёт б области регуляторных генов биосинтеза антибиотиков, чья продукция в норме подавлена у родительских штаммов, то эти гены иогут экспрессирсваться. Химическая природа антибиотиков молчащих генов и исходных антибиотиков может быть совершенно разной. Для получения антибиотиков молчащих генов сочетание структур исходных антибиотиков не имеет значения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение новых антибиотиков путем создания их продуцентов методани клеточной инженерии актиномицетов и оценка целесообразности применения этих методов для названной цели. В сбязи с этим требовали решения следующие задачи:

- разработка условий для осуществления эффективных протопластирования, слияния (внутри— и межвидового) и регенерации протопластов продуцентов амнногликозидньгс и макролидных антибиотиков;

- отбор регенерировавших штаммов с измененной антибиотической продукцией и сравнительное изучение полученных и исходных штаммов по различным характеристикам;

- выделение, очистка, изучениие физико-химических свойств

и химическая идентификация антибиотиков из полученных штаммов;

изучение воздействия слияния и/или регенерации протопластов на продуцент небрамициноЕого комплекса и неактивные штампы стрептомицетов.

Научная новизна работы. Разработаны условия работы с протопластами (образование, инактивация, слияние, регенерация протопластов) штампов БЪгер'Ьотусез топотус!п1 ИНА 1465, Б.капатусе-Ьз.сиБ ИНА К-13, Б^гасНае ЫС1В 8233, ШШЬ 12494, ИНА 00708, ИНА 00709 и Б^ер^аНоЪез-сЬиз Бр.

Продемонстрирована высокая частота появления продуцентов неизвестных антибиотиков не только в результате слияния протопластов большинства проверенных активных и неактивных штаммов стрептомицетов (1,3-26,8%), но и в результате простой регенерации протопластов этих штаммов (1—20%).

При слиянии протопластов Б-Ьгер-Ьотусез mon.omyci.ni ИНА 1465 и Б.капатусе'Ысиз ИНА К-13 получен новый продуцент альбофунгина - штамм 344.

В геноме штамма Streptomyees monomycin! ИНД 1465 обнаружен фрагмент хроносомной ДНК из 20 т.п.н., на которой, по-видимому» расположен (полностью или частично) .кластер генов биосинтеза мономицина (структурные и/или регуляторные гены, а также ген/гены устойчивости к мономицину).

В геномах штаммов Streptoinyces monomycin! ИНА 1465 и 344 обнаружена низкокопийная экстрахромосомная ДНК размером не менее 60 т.п.н.

При слиянии протопластов S.fradiae АТСС 19609 и NCIB 8233 получен новый продуцент многокомпонентного

бензантрахинонового комплекса - штамм 195-34.

Практическая значимость работы. Показано, что в подавляющем большинстве случаев методы клеточной инженерии не обеспечивают получение стабильных продуцентов антибиотиков, но могут быть с успехом использованы для обнаружения молчащих генов биосинтеза антибиотиков у активных и неактивных штаммов актиномицетов.

Результаты работы указывают на богатство скрытого биосинтетического потенциала актиномицетов, для реализации которого требуется либо сочетание методов клеточной инженерии со стабилизацией штаммов, либо разработка иных подходов к получению стабильных продуцентов антибиотиков молчащих генов.

Показано, что универсальные условия работы с протопластами подходят 20% штампов стрептоницетов из случайной выборки.

Создана осноеэ для молекулярно-генетического изучения штамма Streptomyees monomycini ИНА 1465 и клонирования кластера.генов биосинтеза мономицина.

Апробация работы. Апробация работы была проведена на заседании межлабораторного коллоквиума отдела микробиологии НИИНА РАМН (1997). Результаты диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Молодые учёные - биотехнологии", Москва (1989); материалы работы были представлены на 20-й конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (FEBS), Будапешт (1990); на 10-и Мировом Междисциплинарном Конгрессе по антимикробным и противоопухолевым средствам "Будущие направления химиотерапии", Женева (1992) и на 9-м Международной Симпозиуме по биологии актиномицетов,Москва(1994) .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, список которых приведён в конце автореферата. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа излажена на 240 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 18 таблиц. Библиография включает около 250 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы. Подробно охарактеризованы методические аспекты получения, слияния, инактивации и регенерации протопластов. Рассмотрены фенотипические и генетические изменения штаммов, .вызываемые регенерацией и слиянием их протопластов. Обсуждение использования иетодов клеточной инженерии в фундаментальных и прикладных исследованиях актиномицетов, и, в частности, получения новых антибиотиков с применением этих методов, а также нерешённых проблем клеточной инженерии и возможностей их устранения вынесены в Приложение -

Материалы и методы.

Штанмы микроорганизмов. Объектами исследования были штаммы Б-Ьгер-ЬотусеБ топотусЗЛ! ИНА 1465, Б.ka.namycet.icu5 ИНА К-13, 8.£гасИае ЫС1В 8233, ИЕКЬ 12494, АТСС 10745; АТСС 19609; ИНА 00708, ИНА 00709 и 3-Ьгергоа1:!^ед.сЬиз ар. из коллекции НИИНА РАМН; 51 штамм БЪгер'Ьогйусеа зр. , выделенный из почвенных образцов и любезно предоставленный д.б.н. Л.П.Тереховой (НИИНА РАМН); штаммы 344., 195 и 195-34, полученные в настоящей работе. Тест-микроорганизмами были различные граиположительные и граиотрицательные бактерии, а также дроаЕЕИ.

Среды и условия культивирования никроорганизиов.

(Плотные среды). Для выращивания актиномицетав использовали среду ДО2 Гаузе [Гаузе, 1983]. Для регенерации протопластов использовали среды Е2 [0кап1аЫ, 1974] и среду N2 Гаузе с такими же осмотически активными компонентами, как в среде Н2- Для выращивания тест-микробов использовали среды

N2 Гаузе, N2 с пептоном, и N20. (Жидкие среды). Для вегетативного роста актиномицетов использовали среды N2 Гаузе. TSB; Gz-5. Для работы а протопластами использовали среду р [Okanishi, 1974]. Для биосинтеза антибиотиков использовали среды N 1 [Моткова, 1982] , Г, OJI, 2663.

Культивирование проводили при температуре 2S-37°C; жидкие культуры выращивали не качалке.

Методы клеточной инженерии. Использовали известные методы [Okanishi, 1974; Hopwood, 1977; Baltz, 1978; Shirahama, 1981]. Критические параметры этих методов устанавливали эмпирически для каждого штамма.

Отбор рекомбинантов и ревертантов. Через 2 суток, после высева протопластов на регенерационную среду их заливали тонким слоек этой .же среды с селективными агентами. В контроле протопласты регенерировали на неселективной среде.

Отбор продуцентов неизвестных антибиотиков среди фузан-тсз и регенерактов родительских штампов проводили по различию хроматографической подвижности исходных и полученных, антибиотиков. В работ.е с . немаркированными родительскими штаммами проводили тотальный отбор, а в работе с - маркированными родительскими штаммами отбор проводили среди рекомбинантов.

. Биосинтез антибиотиков проводили в пробирка:-: и колбах с полноценными органическими средами на качалке в течение 4-5 суток при 28-37°С.

ХСХ антибиотиков и биологическое,проявление аронатограии Использовали пластинки Silufol, "Kavalier", ЧССР и "Merck", Германия; хроматографию проводили в системах 3,85% ацетат аммония и хлороформ : метанол : 25% аммиак =1 .■ 3 . : 2. Тест-микробами были Bacillus subtilis АТСС 6633; B.mycoidea R-357; Escherichia coli АТСС 25922 и Saccharomyces cerevisiae FL-200-

Общую антибиотическую активность штаммов определяли методом диффузии в агар [-Егоров,. 1963] .

:-. Спектр антимикробного действия штаммов определяли, методами штриха и серийных разведений.

Уровни устойчивости штампов к антибиотикам определяли

методой серийных разведений.

Выделение тотальной ДНК проводили методами [ Хантер.1988] (высокомолекулярная ДНК) и [ Зотчев, 1990] (интактная ДНК).

Рестрнкционное расщепление ДНК. Рестрикционные зндонук-леазы получали из ИПЭ "Ферментас" (Литва) и использовали в условиях, рекомендованных производителей.

Электрофорез ДНК в агарозных гелях в постоянном поле проводили, как описано в руководстве [Нор\тоо<1, 19853 ; пульс-электрофорез проводили в аппарате "Диапульс" (НКПО "Диагностику«", СССР).

Выделение и очистка антибиотиков штаииов 344 и 195-34 были выполнены М. Ю. Новожёновыи (НИИНА РАМН) по специально разработанным индивидуальна схемам.

Идентификацию антибиотиков штаииов 344 и 195-34 выполнили к.х.н. Н.П.Потапова и к.х.н. З.И.Лажко (НИИНА РАМН) на основании спектров ЯМР, а также данных УФ- и ИК-спектроско-пии. Масс-спектры электронного удара были получены и любезно предоставлены к.х.н. Б.В.Розыновым (ИБХ им. М. М.Шемякина).

Результаты исследований и их обсуждение.

Поскольку с большинством выбранных штампов клетачно-инженерные работы ранее не велись, то для получения достаточных уровней регенерации протопластов каждого штамма были подобраны специфичные значения концентрации глицина в среде для выращивания культур, длительности культивирования, концентрации лизоцима и длительности обработки культур лизоцином; теипертуры и длительности прогревания протопластов (в тех случаях, когда использовались инактивированные протопласты); степени дегидратации регенерационной среды, молекулярного веса и марки ПЭГ и др. В подобранных оптимальных условиях частота регенерации протопластов в зависимости от иггакма составила 0,8-70%.

Скачала планировалось получение гибридных антибиотиков, поскольку в то время не существовало методов обнаружения у штаммов молчащих генов биосинтеза антибиотиков. Среди практически важных антибиотиков выбрали представителей аминогликозидов и макролидов, т.к. в молекулах тех и других есть шестичленный углеводный фрагмент.

Межвидовое слияние и/или регенерация протопластов немаркированных цгтаинов Streptomyces monomycini ИНД 1465 (ионоиицнн4") и S.kanamyceticus ИНА К-13 (канамицин-). Из 1500 проверенных фузантов было отобрано 20. Большинство из них было нестабильно по изучаемому признаку, однако 7 штаммов сохранило образование неизвестных антибиотиков на протяжении 4-6 пересевов. 6 штаммов по внешнему виду были похожи на продуцент канамицина, и кроме разных неизвестных антибиотиков образовывали канамицин. 7-й штамп по внешнему виду был похож на продуцент нононицина и образовывал только неизвестное вещество (Табл.1).

Среди регенерантов S.monomycin! и S.kanamyceticus продуценты различных неизвестных антибиотиков появлялись с частотой 2% и 1%, соответственно. Все отобранные регенеранты родительских штаммов были нестабильны (Табл.1).

Табл.1. Образование неизвестных антибиотиков клонами-продуктами межвидового слияния и/или регенерации протопластов

штаммов S.iaonornycini ИНА 1465 (Моп+) и S.kanamyceticus ИНА +

К-13 (Кап ) (в скобках результаты представлены в %) .

Вариант опыта Проверено Первично отобрано Стабильно /' после 1-6 перёсевов Примечание

Слияние 1465 и К-13 1500 (100) 20 (ЬЗ) \ 7 (0,47) среди прочих штамм 344

Регенер. 292 6 0

1465 (100) (2)

Регенер. 300 3 0

К-13 (100) (1)

Для подробного изучения был выбран самый активный из стабильных фузантов - штамм 344. Рассев этого штамма показал, что он является гетероклоном. Однако, 77% линий из

Рис.1. Хроиатографическая подвижность антибиотиков штаммов S.monomycini ИНА 1465, S.kanamyceticus ИНА К-13 и 344 (Silufol /"Kavalier". ЧССР/, 3,85% ацетат аммония; тест-бактерия В.subtilis).

рассева сохранили образование неизвестного антибиотика (Рис.1). С использованием одной из этих линий провели сравнительное изучение штамма 341 и родительских штампов.

По внешнему виду колоний штамм 344 походил на неопуш&н-ный вариант продуцента мономицина (воздушный мицелий не образовывался у штамма 344 на 7-ми проверенных плотных средах).

По антимикробному действию штамм 344 отличался от родительских штаммов отсутствием активности в отношении грам-отрицательных бактерий (Табл.2) .

Табл. 2. Антимикробное действие штаммов 344, S.monomycini ИНА 1465 и S.kanamyceticus ИНА К-13 (зоны подавления роста тест-микроорганизмов, мм)

TecT-MHKpoopraHH3M штамм

1465 К-13 344

Bacillus subtilis 28 0 6

Bacillus mycoides > 30 9 2

Staph.aureus 209P 20 5 5

Staph.aureus 209F/y®2 > 30 16 11

Micrococcus luteus 17 5 7

Escherichia coli 21 0 1.5

Pseudomonas aeruginosa 0 0 0

Coxnamonas terrigena 16 11 0

Providencia s-tuartii 22 0 0

Saccharomyces cerevisiae 6 0 5

. Устойчивость к антибиотикам. Штамм 344 чувствительнее к мономицину в 5 раз, а к неомицину в 4 раза, чем продуцент мономицина (Табл.З).

Рестрикиционный анализ тотальной ДНК показал,что штамм 344 имеет сходство только с S.monomycin,!, но не с S.kana-myceticus. На PvuII-фингерпринте штамма 344 отсутствует .уникальный фрагмент из 20 т.п.н., который есть на FvuII-Фингерпринте продуцента мономицина. Полученные данные свидетельствуют о близком родстве штаммов 344 и 1465 и

Табл.3. КПК(икг/мл) различных антибиотиков для штаммов 344, S.monomycini ИНА 1465 и S.kanamyceticus ИНА К-13 (на плотной среде N 2 Гаузе).

антибиотик штамм

1465 К-13 344

кананицин S00 3 000 500

мономицин 1 500 5 300

неомицин 1 200 30 300

ристомицик 12 3 i2

линкомицин 125 250 125

рубомицин 25 12 25

брунеомицин 3 1П 3

оливомицин 5 10 10

ставят под соннение предполагаемое реконбинантное происхождение штаима 344, хотя и не могут полностью его исключить. Вероятно, причиной возникновения штамма 344 стала перестройка генома 1465, индуцированная регенерацией его протопластов, например, элиминация плазииды. Для проверки этого предположения провели пульс-электрофорез интактной ДНК штаммов 344 и 1465. Полученная злектрофореграниа показала, что в геномах обоих штанмов имеется одинаковая низкокопийная экстрахроиосомная ДНК размером не менее 60 т.п.н. (Рис.2). Следовательно, изменение фингерпринта штамма 1465 вызвано какой-либо перестройкой хромосомной ДНК. На основании стабильности штамма 344 на протяжении нескольких лет можно предположить, что этой перестройкой является делеция.

Химическая идентификация активного вещества шггаииа 344, проведбнная сотрудниками отдела химии НИИНА РАМН Новожйновым М. Ю. и Потаповой Н.П., показала. что этот штамм образует альбофунгин и хлоральбофунгин в соотношении 95:5 и не образует аминогликозидов (Рис.3).

Рис.2. Схема пульс-электрофореграммы интактной тотальной ДНК штаммов 344 (лунка 3) и S.monomycini ИНА 1465 (лунка 2). В лунках 1 и 1 - ДНК фага \cI857. Электрофорез проведён в 1% агарозном геле в буфере 0,5хТВЕ [Hopwood, 1985] с .использованием аппарата "Диапульс"; время импульса 100 с, напряжение 150 В, тенпература 8°С.

12 3 4

49 т. п. н.

Рис.3. Структура альбофунгина (Х=Н) и хлоральбофунгина (Х=С1)

Причина индукции биосинтеза альбофунгина у штамма 344 неясна. Ею может быть предполагаемая деления хромосомы штамма S.monomycini и/или точковая мутация в геноме этого штамма, которую с помощью рестрикционного анализа обнаружить нельзя. Поскольку нет однозначных доказательств нутантной природы штамма 344, то не исключено, что такой причиной стала рекомбинация вггамнов S .monomycitii и S. kanamyceticus-

Иа характера отличий штамма 344 от S.monomycinl (отсутствия мономнцина и одновременного снижения устойчивости к нононицину и неоницину) следует, что хромосомная перестройка затронула кластер генов биосинтеза нононицина. Полученные данные можно использовать для клонирования генов из этого кластера.

Внутривидовое слияние и/или регенерация протопластов Streptomyces fradiae MRRL 12494 (неоиицин"*"; MonrLnka)

и ИНА 00709 (тилозин*; MonsLnkr).

TJ"

Частота рекомбинации составляла 0.75.1Q , а частота реверсий у родительских штаммов - порядка Ю (Табл.4).

Из 172 проверенных рекомбинантных штаммов 46 образовывали различные неизвестные антибиотики в сочетании с неомицинои. Среди регенерантое продуцента тилозина не было обнаружена продуцентов неизвестных антибиотиков, а среди регенерантов продуцента неомицина 23 штамма также образовывали различные неизвестные вещества в сочетании с неомицинои. По-видимому, синтез неизвестных антибиотиков у рекомбинантов был вызван не рекомбинацией, а регенерацией протопластов родительского штамма. Все реконбинанты и регенеранты,' образующие неизвестные антибиотики, были нестабильны по рассматриваемому признаку (Табл.4).

Табл.4. Образование неизвестных антибиотиков клонами-продуктами внутривидового слияния и/или регенерации протопластов штаммов s.fradiae NRRL 12494 CNeo+> MonrLnkS5 и ИНА 00709 CTyl+, MonSLnkr>-

СВ скобках результаты представлены в процентах}

вариант опыта проверено клонов фенотип первична отсбрзно стабильно после 1-6 пересевов примечание

12494 Neo+ * 4 00709 Tyl 172C1Q03 MonrIinkr 46 (26,8) 0 Частота рекомбинации 0,75.10~4

регенерация 12494 Neo4 112(100) Mon.rLnks 23 (20) 0 Частота реверсий 0,17. Ю-7

регенерация 00709 Ту1+ 93(100) Mon3Lnkr 0 0 Частота реверсий < 10"7

Внутривидовое слияние н/или регенерация протопластов немаркированных штампов Б-Ьгер-Ьотусеа з?гас11ае ЫС1В 8233 (неоницин4; неоницкн") и ДТСС 19609 (тилозин""; тилозин4).

Провели 2 варианта этого опыта, придавая каждому штамму поочередно статус донора и реципиента путём тепловой инактивации протопластов донорного пгтамма перед слиянием. Донорами были активные линии штаммов, а реципиентами -неактивные. Использованная схема эксперимента позволяла отбирать рекомбинантные штаммы по активности. блокировать системы рестрикции-модификации донора, исключить образование антибиотика донорного штамма (Табл. 5). В каждом варианте опыта около 4?£ фузантов образовывали неизвестные антибиотики.

В I варианте все 13 фузантов кроне различных неизвестных антибиотиков образовывали тилозин. В рассевах 5-ти фузантов образование неизвестных антибиотиков не сохранилось. Среди регенерантов продуцента тилозина не было обнаружено продуцентов неизвестных антибиотиков.

Во И варианте опыта 31 фузант синтезировал по 1, а 4 -по 2 неизвестных антибиотика. Стабильными оказались 9

Табл.5. Образование неизвестных антибиотиков клонаки-продук-тапи внутривидового слияния и/или регенерации протопластов

штаииов S.fradiae NCIB 8233 CNeoJ и АТСС 196Q9 (Tyl).

СВ скобках результаты представлены в процентах).

вариант опыта донор / /реципиент проверено клонов первично отобрано стабильно после 1-6 пересевов примечание

t X 8233 Neo+, '19609 Tyl ' 333 (100) 13 (3.9) 13 (3,9)

рег-я 19609 Tyl 120 (100) 0 0

II 9609 Ту1+/ /8233 Meo' 795 (100) 35 (4.4) 9 (1.1) среди : прочих штамп 195

рег-я 8233 190 (100) 4 (2) 0

*Для получения донорного штамма его протопласты перед слиянием инактивировали нагреванием.

фузантов. Среди регенератов продуцента неоницина 4 штамма образовывали неизвестные антибиотики, но они были нестабильны.

Таким образом, продуцент неоиицина оказался более интересный реципиентом» чем продуцент тилозина. Возможно, это связано с наличием у последнего нескольких систем рестрикции-кодификации.

Для подробного изучения был выбран саный активный из стабильных фузантов Ц варианта опыта - штамм 195. Рассев зтого штамма показал, что он является гетероклоном. Самая активная линия из его рассева (195-34) сохраняла образование неизвестного антибиотика на протяжении нескольких дет (Рис.4), тогда как штамм 195 со временем перестал вылеплять линии с образованием неизвестных антибиотиков и образовывал только антибиотик реципиентного штамма - неоницин.

Рис.4. Хроматографическая подвижность антибиотиков штаммов S.fradiae NCIB 8233 (Neo), АТСС 19609 (Tyl) 195 (при первичном отборе) и 195-34 (Silufol /"Kavalier", ЧССР/, хлороформ: метанол: 25% анниак=1:3:2, тест-бактерия В.subtilis)-

в-©"

мицин

8232

195

195-34

19609

тило-зин

нео

Сравнительное изучение штампов 195-34, 195, образующего неокицин, S. fradiae NCIB 8233 и АТСС 19609 показало, что полученные штаимы имеют очень мало общего с родительскими штаммами и друг с другой.

По таксономическому положению полученных штаинов, определённому д.ё. н. Д.П.Тереховой (НИИНА РАМН), штамм 195 относится к виду Streptomyces albogriseolus, а штамм 195-34 - к виду Streptomyces sporocinereus.

Антимикробное действие штамма 195 совпадает с таковым штампа 8233, т.к. они оба образуют неомицин, и отличается от антимикробных спектров штамма 19609 и 195-34, близких между собой (Табл.6).

Табл.6. Антимикробное действие штаммов 195, 195-34, S. fradiae АТСС 19609 и NCIB 8233 (диаметр зон подавления роста тест-микроорганизмов, мм)

TecT-MHKpoopraHH3M ш т а к и

19609 8233 195 195-34

Bacillus subtilia 15 21 24 12

Bacillus mycoides 15 23 26 15

Staph.aureus 209P 13 13 14 12

Staph.aureus 209P/y®2 14 23 26 14

Micrococcus luteus 13,5 12 15 13

Escherichia coli 0 14 17 0

Pseudomonas aeruginosa 0 0 0 0

Comamonas terrigena 0 12 15 0

Providencia Stuartii 0 15 18 0

Saccharomyces cerevisiaé 0 10 12 0

Устойчивость к антибиотикам. Штаммы 19609, 195 и 195-34 обладают одинаково низкой устойчивостью к аминогликозидным антибиотикам. Штаимы 195 и 195-34 одинаково высокоустойчивы к брунеоиицину и оливомицину (Табл.7).

Табл.7. МПК (ИКГЛ1Л) различных антибиотиков для штаммов 195, 195-34, S.fradiae АТСС 19609 и NCIB 8233 (на плотной среде Линденбайна ) ,

штамм антибиотик^___ 8233 19609 195 195-34

мономицин 2. 500 Q.Q8 0,08 0.08

кеоницин 625 0.32 0,08-0,16 0,04-0.0

кананицин 10 - г 0 5 0.32 0.02-0,0

эритромицин 1,25-2,5 20 - 40 20 2.5

линког-шцин 20 - 40 40 - 80 160 20

тилозин 40 10-20 20 - 40 20

ристомицин 5-10 5-10 0,6-1.2 5-10

рубомицин 1 2 1 1

брунеонишш 6,2 3.1 25 50

ОЛИЕОМИЦИН 8 16 2. 000 1. 000

Рестрикционный анализ тотальной ДНК показал отсутствие сходства полученных штаммов с родительскими и друг с другом.

Химическая идентификация активного вещества штамма 195-34. проведенная сотрудниками отдела химии НИИНА РАИН Новожйновым М. Ю. и Лажко Э.й. , показала, что этот штамм образует 4 бензантрзхиноновых антибиотика в соотношении 4:2:1:1 и не образует аииногликозидов и иакролидов (Рис.5).

Результаты сравнительного исследования 4-х штаммов, за исключением общности биосинтеза неомицина у штамнов 195 и 8233, а также уровней устойчивости к аниногликозидным и противоопухолевым антибиотикам у штамнов 19609, 195 и 195-34, отвергают родственные отношения между исходными и полученными штаммами. Косвенным доказательством родства исследуемых штаммов может служить присутствие в генофондах штанмоь S.fradiae и S.albogriseolus генов биосинтеза урдами-цинов и винеоиицинов, соответственно, относящихся к тому же химическому типу, что и бензантрахиноны [Drautz, 1936; Ohta,

Рис.' 5. 195-34-1 и SM:196 ВЧ Wink, 1988] "(1) , 195-34-Ц и Х-14881Е [Maehr, 1982] (2) ,' 1P5-34-III и 6-дезокси-8-0-ме-тилрабелоницин [Wink, 1988] (3), 195-34-IV и 8-0-метйлрабе-ломииин [ Shigihara, 1988] (4).

Н3СО

Н3СО

Н3СО

Н3СО

1981]. Кроме того известны работы [Grein, 1980; Li, 1991] . в которых описано существенное ..изненение таксономических признаков исследуемых штаниов..в. результате их мутагенеза. С учётом этих данных вопрос о родстве штаммов 19609, 8233, 195 и 195—34. становится сложным , и противоречивым. Для его решения требуются дополнительные, исследования.

Таким образом, при слиянии протопластов продуцентов аминогликозидов и иакролидов вместо предполагаемых продуцентов гибридных антибиотиков были получены продуценты антибиотиков совершенно другой (по отношению к исходным антибиотикам) химической природы. Аналогичные результаты описаны и в других работах [Yamashita, 1985; Singh, 1987-88; .■Okamura, 1989; Орлова, 1991] . Причиной этого явления считают активацию молчащих генов биосинтеза антибиотиков, . исходно присутствовавших в родительских геномах. . Образование .альбофунгинав и бензантрахиноноЕ штаммами 344 и 195-34 и высокая частота появления неизвестных антибиотиков среди фузантов и регенерантов активных и неактивных .. штаммов

указывали на возможность обнаружения иолчапдах генов с помощью методов клеточной инженерии. Поэтому был предпринят новый этап исследований по индукции с помощью названных методов синтеза антибиотиков молчащих генов у активного и неактивных штанное.

Регенерация протопластов 51:гер£оа11о1:е1сЬиз эр., продуцента небракицинового комплекса.

Среди 135 регенерантов исследованного штамма не было обнаружено продуцентов неизвестных антибиотиков. Отмечено снижение общей активности (у всех регенерантов) и изменение компонентного состава небрамицинового комплекса (у 11% регенерантов). Все обнаруженные изменения были нестабильны.

Внутривидовое слияние и/или регенерация протопластов немаркированных штаммов Бйгерготусев :£га<Иае АТСС 10745 (неомицин"1"; донор) и ИНА 00708 (неактивен; реципиент).

Активные фузанты появлялись с высокой частотой, причём большая их часть синтезировала неомицин (Табл.8). Казалось, что образуется антибиотик, донорного штамма, на регенерация протопластов и рассев спор штамма ИНА 00708 показали, что гены биосинтеза неомицина происходят из генома рецилиентного штамма, который сказался криптическим продуцентом неомицина. Кроме неомицина образовывались разнообразные неизвестные антибиотики, но все отобранные штаммы были нестабильны.

Регенерация протопластов неактивных штаммов Б'Ьгер'Ьогоусвз зр-

Проведён поиск продуцентов антибиотиков молчащих генов среди 51 неактивного штамма ЗЪгер-Ьотусез Бр., забракованного при традиционном скрининге. Индивидуальные условия регенерации протопластов не подбирались, поскольку моделировалось поточное использование метода (эта часть работы была выполнена сотрудником отдела микробиологии НИИНА РАИН Беловой А.Ю.).

25 штаммов не росли на жидкой среде, из 36 оставшихся штаммов протопласты образовались у 20, а регенерзция осуществилась только у 10 из них. Активные клоны появлялись

TaSjiJS. Образование антибиотиков клонами-продуктами внутривидового слияния протопластов штаммов S.fradiae АТСС 10745 (Neo+) и ЙНА 00708 (Ant'), регенерации протопластов и рассева опор штамма ИНА 00708 (Ant) (все клоны нестабильны).

Св скобках результаты представлены в процентах}

вариант проверено клонов, клонов.

• опыта клонов образующих неомицин образующих неизвестные антибиотики

слияние протопластов 10745/донор*/ 452 5 11

и 00703 (100) (1,1) (2,4)

/реципиент/

регенерация протопластов 00708 657 , (ЮО) 76 (11,6) 11 (1,7) '

рассев спор .... 126 61 19 .

00708 (100) (48,4) (15,0)

Для получения донорного штамма его протопласты 1 перед слиянием йнактивировали нагреванием.

-среди регенерантов 4-х 'штаммов с частотой 1,3-10,156 (Табл.9). Активность бсех клонов была низкой и не сохранилась при пересевах'. Следовательно, отсутствие подбора условий работы с протопластами для каждого штамма исключило из исследования более 80% тестируемых штаммов.

Таким образом, результаты проделанной работы и литературные данные говорят о том, что использование методов клеточной инженерии является очень хорошим способом обнаружения биосинтетичесхого потенциала молчащих фрагментов генома актинокицетов, но применять их необходимо только в сочетании со стабилизацией получаемых штаммов, поскольку

Табл.9 Образование неизвестных антибиотиков регенерантами неактивных штампов рода БЬгвр^шусеа.

неактивный штамм проверено клонов количество активных клонов Частота активных клонов, % Диаметр зоны подавления роста В.эиЪ-Ь. к. ж. активных клонов, мм

4487 143 3 2,1 10-13

4811 150 2 1 .3 11

5019 170 19 10,1 12-17

8312 185 6 3,2 11-16

генетическая нестабильность уничтожает почти все ценные качества, которые штамм приобретает в результате обработки этими методами. Без выполнения этого условия применение названных методов для получения новых антибиотиков нецелесообразно, на что указывает крайне ограниченное числа публикаций по обсуждаемому направлению исследований.

Выводы

1. Разработаны оптинальные условия работы с протопластами (образование, инактивация, слияние, регенерация протопластов) штаммов БЪгер'Ьотаусез топотусап! ИНА 1465. Б.капатусеЪ5.сиз ИНА К-13, Б.ГгасНае ШЛВ 8233, КИНЬ 12494, ИНА 00703, ИНА 00709 и Б1гер-Ьоа11оЪе1сЬиз зр; показана, что универсальные условия работы с протопластами подходят для 20% пггаммов стрептомицетов из случайной выборки.

2. Продемонстрирована высокая частота появления продуцентов неизвестных антибиотиков в результате слияния (1,3 -26,8%) и простой регенерации (1-20%) протопластов большинства проверенных активных и неактивных штаммов стрептомицетов.

3. При слиянии протопластов БЪгер'Ьотусез тапотусгп! ИНА 1465 и Б. капату сессий ИНА К-13 получен : новый - продуцент альбофунгина - штамм 344.

4. При слиянии протопластов Б^гасНае АТСС 19609 и ЫС1В 8233 получен новый продуцент бензантрахинонового комплекса -- штамм 195-34.

5. Показано, что слияние и регенерация протопластов существенно влияют на образование исходного антибиотика (отмечены колебания, потеря и восстановление активности, а также изменение компонентного состава антибиотического комплекса) и культурально-морфологические признаки (внешний вид колоний, образование пигмента и др.) у продуцентов.

6. На основании изучения более 3250 фузантов и 1910 ре-генерантов установлено, что эти штаммы, за редким исключением,, ..отличаются крайней генетической нестабильностью по признаку образования антибиотика (исходного или неизвестного) и быстро теряют все приобретенные ценные изменения этого признака , поэтону использовать слияние и регенерацию протопластов для получения продуцентов новых антибиотиков без одновременной стабилизации этих продуцентов нецелесообразно, но их можно с успехом применять для -обнаружения 'молчащих генов биосинтеза антибиотиков у активных и неактивньк штаммов.

7. В геноме штамма Б-Ьгер-ЬотусеБ топотус1п1 ИНА 1465 идентифицирован фрагмент хромосомной ДНК из £0 т:п.н.¡на котором, по-видимому, расположен (полностью или частично) кластер генов биосинтеза мономицина (структурные и/или регуля-торные гены, а также ген/гены устойчивости к мономицину).

8. В геномах штаммов БЪгерЪоюусее тапотусз.п1 ИНА 1465 и 344 обнаружена ннзкокопийная зкстрахроиосопная ДНК размером не менее 60 т.п.'н.

9. Создана- основа для'; молекулярно-генетического изучения пггамма Б-ЬгерЪотусез топотусгпх ИНА 1465 и клонирования кластера генов биосинтеза мономицина (разработаны условия образования-и регенерации протопластов, получен реципиентный штамм • (344), на основании изменения фенотипических признаков штамма 1465 идентифицирован фрагмент его генома, связанный с биосинтезом мономицина).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Маланичева И.А. , Новожёнов М. Ю. Изменение способности образовывать антибиотики в результате кеззэндового слияния протопластов стрептомицетов-продуцентов мономицина и канамицнна. Сб. тезисов докладов Всесоюзной конференции "Молодые учёные - биотехнологии", Москва, апрель 1989. - М. , 1989. с. 38.

2. Новожёнов Н. Ю. , Даже о Э. И. , ¡Маланичева Й.А. Физико-химичесЗкие свойства и строение антибиотиков из штамма 34, полученного при слиянии протопластов двух штаммов Streptomyces fradiae. Сб. тезисов докладов Всесоюзной конференции "Молодые учёные - биотехнологии", Москва, апрель 1939. - М. , 1989, с. 84.

3. Маланичева И. А. , Козьмян Л.И. Влияние образования и регенерации протопластов на продукцию нейраиицинового комплекса у Streptomyces cremeus subsp. tobramycin!. Антибиотики и химиотерапия, 1990, 35(7), с.3-5.

4. Malanicheva I.A.*, Koamyan L.I., Dudnik Y.V., Novoahenov М.У. , Ьауко A.V., Potapova N.P. "Albofungin producer generated by protoplast, fusion of aminoglycoside producing streptomycetes". Abstracts of the 20th Meeting of the Federation of European biochemical societies (FEBS), Budapest, Hungary, August 19-24, 1990, P-Th 445, p.321.

5. Маланичева И. A. , Козьмян Л. И. , Дудник Ю. В. » Новожёнсв М. Ю. , Лайко А.В., Потапова Н.П. Образование альбофунгина штампом, полученным в результате слияния протопластов продуцентов аминогликозидных антибиотиков. Антибиотики и химиотерапия, 1991. 36(5), с.5-8.

6. Dudnik Y.V.*, Malanicheva I.A., Kozmyan L.I., Strocailova L.I., Novozhenov M.Y. , Lazhko E.X.. "New antibiotic obtained by intraspecific protoplast fusion of Streptomyces fradiae". Abstracts of the 10th interdisciplinary world congress on antimicrobial and anticancer drugs "Future trends in chemotherapy", Geneva, 30 March - 1 April 1992, abs.37.

7. Маланичева Й.А. , Козьмян Л.И. , Дудник Ю.В. , Флорова Г.Я., Орехов А.В. Сравнительное изучение стрептомицетов-продуцентов

аминогликозидных антибиотиков мсномицина и канамицина и штамма 344, полученного при слиянии их протопластов, методой рестрикционных фингерпринтов тотальной ДНК. Антибиотики и химиотерапия, 1992, 37(5), с.5-7.

8. Маланичева И.А.,"Козьмян Л.И., Дудник Ю.8., Стромилова Л.И., Новоженов М.Ю. Слияние протопластов штаммов Streptomyces fradiae, продуцентов неоницина и тилозина. Антибиотики и химиотерапия, 1992, 37(10), с.3-7.

9. Лааасо Э. И. , Новожёнов М. Ю. , Маланичега И. А. Антибиотики из штамма 34, полученного при слиянии протопластов двух штаммов Streptomyces fradiae- Биоорганическая химия, 1992, 18(12), с.1515-1527.

10. Маланичева И.А., Козьмян Л.И.. Белова А.Ю., Дудник Ю.В. Использование иетода слияния и регенерации протопластов для поиска продуцентов антибиотиков среди неактивных штаммов стрептомицетов. Антибиотики и химиотерапия, 1993,''38(6)» с. 8-11. " :: •'' ; '•■'" "

11. Malanicheva I.A.*, Kozmyan L.I., Dudnik Y.V. "Streptomyces cell engineering as a mean of antibiotics silent genes activation". Theses of the 9th International Symposium on the Biology of actonoinycetes, July 10-15, 1994, Moscow, Russia, P2-17, p.169.