Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Разработка методов селективного выделения из почв актиномицетов редких родов-потенциальных продуцентов антибиотиков

российская академия медицинских наук .

ШЮТИГЭТ ПО ИЗЫСКАНИЮ НОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

на правах рукописи

АЛФЕРОВА Ирина Вадимовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СЕЛЕКТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ ПОЧВ АКТИНОМИЦЕТОВ РЕДКИХ РОДОВ - ПОТЕНЦИАЛЬШХ ПРОДУЦЕНТОВ АНТИБИОТИКОВ

• 14. 00.31 - химиотерапия и антибиотики

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте по изысканию новых антибиотиков РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук Л. П. Терехова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В. Д. Кузнецов

кандидат биологических наук Г. М. Зенова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: НАУЧНЫЙ ЦЕНТР - ШИИА

Защита состоится <<1&» ЛлМф*"^ 1992 года в часов на васедании Специализированного Совета Д. 001.05.01 при Институте по изысканию новых антибиотиков РАМН по адресу: 119867, Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института по изысканию новых антибиотиков РАМН.

Автореферат разослан «¿С» 1992 года.

Учёный секретарь

Специализированного Совета

кандидат биологических наук т. А. Успенскг

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ - -"Актуальность проблемы.

.Проблема изыскания новых антибиотиков как для медицинского, так и немедицинского применения в настоящее время не потеряла своего значения. Большая часть используемых в медицине антибиотиков выделена из культур актиномицетов. Помимо антибиотиков актиномицеты образуют и другие биологически активные вещества, такие как витамины, гормоны, ферменты, иммуномодуляторы, инсектициды, гербициды и др. Основываясь на современных исследованиях как советских, так и зарубежных ученых, мы имеем все основания полагать, что возможности актиномицетов как поставщиков биологически активных веществ далеко не исчерпаны.

Первым шагом на -пути к созданию новых природных антибиотиков является выделение микроорганизмов - потенциальных продуцентов новых антибиотиков из природных мест обитания. Перспективным источником получения новых соединений являются новые и' редкие культуры актиномицетов. Поэтому создание новых методов преимущественного выделения актиномицетов редких родов Из природных мест обитания представляет собой актуальную задачу. Исследования по теме диссертации выполнялись по планам НИР ВНИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР на 1988, 1989, 1990 г.г. (И госрегистрации темы 0188.0010304), а таютз по союзной проблеме "антибиотики" на 1986 -1990 годы.

Цель и задачи исследования.

Делью нашего исследования являлась разработка и исследование методов выделения из почвы актиномицетов в процессе изыскания продуцентов антибиотиков. Для реализации этой цели в процессе исследования разрешались следующие экспериментальные задачи:

1)Изучение методов предварительной обработки образцов почз,

качественных и количественных закономерностей выделения актиномицетов кз обработанных образцов.

2)Изучение чувствительности культур различных родов порядка Асипотусе1а1ез к ряду антибиотиков и химических агентов для их оценки как селектиьных агентов.

3) Исследование закономерностей выделения различных родсв актиномицетов на средах с этими соединениями.

4) Выделение актиномицетов с помощью комплексного метода, за-лючающегося в посеве предварительно обработанного почвенного образца на селективную среду с несколькими антибиотиками различного характера действия.

5) Исследование антагонистических свойств выделенных культур актиномицетов и отбор культур, перспективных для изыскания новых антибиотиков.

6) Изучение таксономических характеристик выделенных актиномицетов и определение их родовой и видовой принадлежности.

7) Изучение строения пептидогликана и ДНК-ДНК гомологии у новых культур, выделенных в результате исследований и относящихся к редким родам актиномицетов.

Научная новизна

Впервые детал но изучена чувствительность актиномицетов различных родов к тобрамицину, налидиксовой кислоте, гелиомицину и к диоксидину с целью оценки возможности использования их в качестве селективных 'агентов. Установлено, что наиболее подходящим агентом для выделения актиномицетов из почв и подавления роста сопутствующих бактерий, обладающих стелющимся характером роста, является на-лидиксовая кислота, которая особенно благоприятна для изоляции

редких родов актино"ицетов Amycolatopsis, Micromcnor-ora, Streptosporangium и Saccharothrix.

Разработан комплексный метод выделения актиномицетов из предварительно обработанных карбонатом кальция образцов почвы, посеянных на селективную среду с несколькими антибиотиками (налидиксовой кислотой,тобрамицином, ристомицином или новобиоцином, нистатином).

При использовании разработанных селективных методов из ..очвы выделены культуры актиномицетов, являющиеся представителями ноеых видов редких родов актиномицетов: Glycomyces roseoluteus sp. nov. и Saccharothri x orenburg-is sp. nov. Были выделены тагасе культуры itreptomyces enissocaesilis 4281a- ноеый продуцент антибиотика антимицина А и Streptomyces mísaraensts 4284/85 - новый продуцент антибиотика нетропсина.

Практическая ценность.

Разработан комплексный метод выделения актиномицетов из поч-гы, в результате применения которого- получена возможность изолиро-зать преимущественно редкие-роды а.тиноющегов, пр« ставляюцие терспективньгй источник получения новых антибиотиков.

Подготовлена матрица для идентификации родов актиномицетов на основании морфологических и хемотаксономичееких признаков,которая юсле программной обработки'может быть использована для ускоренной идентификации родов актиномицетов.

■В результате проведенной работы выделено 5195 культур актино-йщетов и собрана большая коллекция культур, относящихся к редким зодам актиномицетов, которая исгэльзуетсн в настоящее время для взыскания продуцентов антибиотиков и таксономического исследования ^которых групп актиномицетов. Из 64 выделенных штаммов актиномице-

тов во ВНИИ по изысканию ноеых антибиотиков АШ СССР получены антибиотики-сырцы, лечебные свойства которых изучены или изучаются в настоящее время.

Результаты диссертации использованы в методическом пособии кафедры биологии почв ф-та Почвоведения МГУ им. IL Е. Ломоносова "Почвенные актиномицеты", вошли составной частью в коллективную монографию "Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов".

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференциях молодых ученых ВНИИ по изысканию новых антибиотиков АШ СССР (1986,1988 г. г.),на 1-ом советско-американском симпозиуме по антибиотикам и химиотерапии (Москва, 1988), Всесоюзном семинаре по направленному поиску антибиотиков и других биологически активных веществ (Москва, 1987) и Всесоюзном семиьаре по актуальным направлениям поиска антибиотиков" (Алма-АтаД989).

Публикации. Основное содержание работы опубликовано в 8 печатных трудах.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, 4-х глав экспериментальных исследований, обсуждения ре зультатов и выводов; изложена на 176 страницах машинописного текста. В указателе литературы приводится 236 источников, из них - 59 отечественных и 177 -. иностранных авторов, иллюстрирована 26 табли цами, 4 рисунками и 8 фотографиями.

- 5 -

ОСНОРмОЕ СОДЕГЯШШЕ PADOTLÍ.

Работа состояла из нескольких этапов: исследования методов предварительной обработки почвы, подбора селективных сред для выделения актиномицетов и, наконец, разработки на основании результатов этих исследований комплексного метода выделения актиномицетов из почва Исследования были направлены на создание условий для 7реимущественного роста актиномицетов редких родов при их вьцэле-1ИИ из почв.

Первоначально были изучены методы предварительной обработки эбразцсв почвы химическими и физическими факторами. Нами был выбран i модифицирован метод предварительной обработки почвы карбонатом ыльция во влаиных условиях. Модификация касалась выбора пита^.-ль-юй среды и способа посева обпазцов обработанной почвы.

Роль кальция в развитии ara лномицетов значительна, в литера-■уре имеются данные относительно способности ионов калыш влиять ta процессы регуляции - способность к образованию 'вопдумного мице-ия, а также на инициацию прорастания спор. Другим (¿актором повышена числа- выделенных культур молет быть изменение рН почвы в про-lecce инкубации ее с карбонатом кальция во влалных условиях.

Как показали наши опыты (табл. 1), обработка почвы карбонатом алыия во влажных условиях увеличивает количество Еыделятаихся ил очвы микроорганизмов, .в том числе и актиномицетов, на два порядка о сравнению с посевом необработанной почвы. Инкубация почвы во лажных условиях (без добавления карбоната кальция) увеличивает оличестзо выделяющихся микроорганизмов, но в меньшей степени примерно в 10 рад).

Таблица 1

Количество микроорганизмов, выделяющихся из обработанных

глрбонатом ¡¡вльция почвенных образцов._______

_______КОЕ / г почвы_х1о!_^

_условия опыта одноклеточных бактерий ______актиномицетов.

контроль

(без обработки) 1,7 + 0,9 45,5 + 0,2

обработка почвы

карбонатом кальция 11ЯО + 98 1980 +_ 985

во влаяшх условиях.__________________________________________

Примечание: КОЕ - количество колониеобразуицих единиц. Повышение количеств: выделяемых из п'чвы культур при ее обработке кароонатом кальция связано, по нашему мнению, с увеличением числа проросших спор в популяции.

Роль карооната кальция в увеличении численности выделяющихся актиномицетов подтверждена нами не только "- лабораторных опытах, но и е посевах известкованных почв., В посеве известкованной почвы выделялос стрептомицетов на 09% больше в сравнении с неизвестно-ванной почвой того же типа Го есть при отборе образцов почвы для выделения иг них актиномицетов следует отдавать предпочтение известкованным почБам.

о.метив значительное увеличение общего числа актиномицетов, выделяющихся из обработанных глрбонатом кальция образцов почв и иг образцов известкованных почв мы заинтересовались влиянием предварительной обработки образцов почв, о которой шла речь выше, на разнообразие выделяющихся актиномицетов (табл. 2).

Тчблицл 2

Выделение актиномицотов рапных родов из почвенных образцов,

обрабс^ашых _ка^бска.том кальция во влажних условиям.____

необработанная почга_______об^аботашая. почва

РОДЫ „число_____ У число У

Всего 2003 100 3479 100

Б1гер1ошусез 1936 96,65 ор оо 94,3

Ас1лпошс1ига 2 . 0,1 3 0,23

Атусо1а1:орз1з ' 8 0.4 49 1,4

ШсгоЫзрога - - 1 0,03

МЮготопозрога 49 2,45 108 3,1

Косагс11орз1з 2 0,1 3 г ,08

Ргогшсгогпопозрс 1 3 0,15 6 0,17

БЬгерЬозрогапг!ат 3 . 0,15 7 0.2

БЬгерЬоуегЬюШ 1иш _______1 _______ 0.С5 7 ______о.

Соотношение культур редких родов актиномицотов и культур рода ЗЬгерЬотусез, выделенных из необработанных почв, сс.ранястся при выделении-актнномицетов из обработанных карбонатом кальция почвенных образцов. Так, доля выделенных культур стрептомицетов из необработанных образцов составляла 96,7% от всех культур актиномицетов, из обработанных - 94,3V, микромоноспор из необработанных -2,45%, из обработанных - 3,1%; актиномадур из необработанных -д,17„ из обработанных - 0,23%.

Предварительная обработка почвы карбонатом кальция не увеличивала долю выделяющихся антиби чгаески активных культур. Однако в :вязи с тем, что значительно возрастало общее количество актинсми-цетов при выделении из обработанных образцов, то, соответственно,

к общее количество культур, образующих антибиотики, существенно увеличивалось. Благодаря этому возрастает вероятность обнаружения продуцентов новых антибиотиков.

Из физических факторов воздействия на образцы почвы нами вперЕые была предпринята попытка применить лазерный луч для обработки почвенных образцов с целью выделения из них актйномицетов. Оказалось, что гелий-неоновый лазер в видимой области спектра не оказывал воздействия на микрофлору почвы. Тем не менее представляется целесообразным продолжение исследований в зтом направлении в других условиях опыта и при использовании луча с другими характеристиками. Из образца почвы, обработанного лазерным лучом, был выделен пггамм актин.омицета, отнесенный нами к БЬгер1отусе5 етззосаез!2и который является новым продуцентом антибиотика антимицина А.

В дальнейшем мы решили предварительную обработку почвенных образцов карбонатом кальция во влажных условиях использовать в сочетании с посевом их на селективные среды, содержаще ингиб'ггоры роста. Обработка почвы увеличивает количество выделяющихся актиномицетов, позволяя, таким образом, обнаружить культуры, обычными методами не выделяшиеся из-за небольшой их численности в почве. Применение селективных сред с ингибиторами роста позволило бы подавить рост одноклеточных бактерий, затрудняющих выделение актиномицетов в чистую культуру, а такде элиминировать нежелательные и направленно выделять нужные таксоны актиномицетов.

Поэтому нами были проведены исследования с целью подобрать ингиоитсры 'роста бактерий, применение которых в качестве селективных агентов позволило бы добиться преимущественного-выделения ак-

тююмицетов в целом, а гаюке выделения отдельных таксонов, перспективных в отношении антибиотикообразования. ■ Первым из исследованных нами веществ была налидиксовая кислота, обладающая активностью в отношении грамотрицательных бактерий и уже использованная японскими исследователями для выделения из почвы грамположительных бактерий. О чувствительности хе разных родов актиномицетов к налидиксовой кислоте и закономерностях выделения их из почв при п-пользовании ее в качестве селективного агента данных в доступной нам литературе не было.

Сначала методом градиентных чашек бы.а исслодована чувствительность к налидиксовой кислоте коллекционных культур актиномицетов и некоторых одноклеточных бактерий; являющихся типичными представителями почвенной биоты. Актиномицегы 22 исследованных родов, за исключением некоторых представителей родов АсЬшор1апез и М1сгопюпозрога, не чувствительны к налидиксовой кислоте в. концентрации 10 мкг/мл. Одноклеточные, т бактерии, особенно обладающие стелющимся характером роста, которые затрудняют выделение актиномицетов .в чистую культуру, чувствительны к налидиксовой кислоте в этой концентрации.

На следующем этапе работы была проведена серия опытов по выделению актиномицетов из почвы, обработанной карбонатом кальция на селективной среде с налидиксовой кислотой. Из таблицы 3 видно, что под влиянием предварительной обработки почвы возрастает не только количество выделяющихся из почвы актиномицетов, но и одноклеточных бактерий, фи использовании в качестве селективного агента налидиксовой кислоты в концентрации 10 мкг/мл полностью подавляется рост одноклеточных бактерий, обладающих' стелющимся характером роста.

Таблица 3

Выделение актиномицетов на селективной среде с 'налидиксовой

кислотой и нистатином из предварительно обработанной карбонатом

кальция почеы.______

6

нал)1/<ик- _;_\К0Е / 1 г почвы х!0_ 7. зараяен-

обработка совая одноклеточные бактерии актино- ных колоний почвы кислота всего со стелющимся мицегов актиномице-

мкг/мл ростом тов от всех _выросших

к0нт1 оль (без обработки) 0 4,3 + 1,4 0,32 + 0,2 0,66 + 0,2 37,2

СаСОз во 0 240 ь 56 1,6 +1,5 165 + 75,'4 47,4

влажных 10 210 + 92 0 160 + 33,4 4,9

условиях 20 206 + 79 0 160 + 90 3,9

Примечание: концентрация нистатина в среде составляла ,50 мгг/мл.

Эта комбинация оказалась эффективной для выделения из почвы практически всех родов актиномицетов. Предварительная обработка .почвенных образцов, значительно увеличивая общее количество актиномицетов, не дает преимущества какому-либо роду и налидиксовая кислота в малых концентрациях, подавляя рост некоторых бактерий, не' ингибирует рост подавляющего большинства актиномицетов.

Для выделения из почвы редких таксонов актиномицетов было необходимо подобрать в качестве селективного фактора комплекс антибиотиков, отличающихся характером действия на различные роды актиномицетов, подавляющих развитие банальных представителей порядка

- И -

'АсЬ1потусеЬа1ез. Поэтому мы поставили задачу оценить гелномишш, диоксидин и тобрамицин в качестве селективных агентов. Ранее они не применялись для таких целей.

Сначала была изучена чувствительность коллекционных культур актиномицетов разных родов и одноклеточных бактерий к этим антибиотикам. Исследования показали, что гелиомицин при добавлении его в среду не оказывал никакого влияния ни на культуры актиномицетов, ни на культуры изученных одноклеточных бактерий. К диоксидину было устойчиво большинство стрептомицетов, а большая часть представителей редких родов актйномицетов была к нему чувствительна.

Анализ чувствительности актиномицетов к тобрамицину показал, что большинство изученных культур актиномицетов рода БЬгерЬотуоез чувствительны к низким и средним С 5 - мкг/мл) концентрациям этого антибиотика в среде. Среди редких родов наиболее устойчивыми к действию тобрамицина оказались представители родов АтусоХаЬорзгз, 5асс1~агоро1узрога, К^осЗососсиэ, Ргогисготопозрага,' большинство штаммов рода М1 сготопозрога, некоторые штаммы родов АсИпотас1ига, МосагсНорБ13, Асипор1апез, они были устойчивы к высоким - более 50 мкг/мл концентрациям тобрамицина

Полученные результаты предполагают возможность использования тобрамицина в качестве селективного агента для преимущественного выделения редких родов актиномицетов.

Делее нами были проведены опыты по выделению актиномицетов из почвы на селективных средах с диоксидином, тобрамнцином, цефтриак-соном и новобиоцином.

• Диоксидин при добавлении в среду в концентрации 10 мкг/мл не оказывал существенного влияния на выделение актиномицетов, а в -

концентрации 50 мкг/мл ингибировал рост- культур редких родов, не влияя на количество выделяющихся штаммов рода 31гер1огоусез. Ни один из редких родов не получил преимущества при выделении на среде с диоксидином по сравнению с контролем (среда без антибиотика). Следовательно, диоксидин непригоден к использованию в качестве селективного агента при выделении из почвы актиномицетов редких родов.

Таб/чца 4

_Выделение актиномицетов разных родов на ср^де о тобрамицином.

контроль (среда _среда с тобрамицином___

РОД без антибиотика) 10 мкг/мл__50 мкг/мл.

число % число X число %

Всего: 787 100 375 100 113 100

51герЬогоусез 731 92,9 259 69,1 55 48,7

АЛШотзсЗцга 9 1,1 9 2,4 6 5,3

Асипор1апез 2 0,3 1' 0,3 1 0,9

Ашусо1аЬорз1з 13 1,7 25 . 6.9 .31 27,4

ГаегИа 3 0, 4 ■ - - - . -

31усоггусез 1 0,1 1 0,3 - - "

Мютоггопоэрога . и 1.8 42 11,2 И 9,7

МосагсНа . - - 3 9,7

Ргогп) сгоггопозрога 1 0.1 - - . 3 2, 7 .

ЗассИаготопозрога • 1 0,1 1 0,3 - . -

БассЬагор 1 узрог а 2 0,3 3 0,8 ■ -

ЗассЬагоЬ1тг1х - 6 0,7 .13 3,5 3 2.7

31герЬозрогапдШт 3 0,4 20 5,3 - -

31гер^уегЬ1с Ш1ит ... 1 _____0,1_____ - - - -

При добавлении в среду тобрамицина (табл. 4) в концентрации О мкг/мл количество выделенных представителей редких родов воз-астало в 2 раза по сравнению с контролем (116 и штаммов соот-етственноЧ При повышении концентр дни тобрамицина в среде до 50 кг/мл доля актиномицетов редких родов от всего числа выделенных ктиномицетов увеличивалась с 7,1% ( в кгчтроле) до 51,3%. Тобра-иция особенно благоприятствовал выделению культур родов ¿сгоггопозрога, Атусо1а1орз1г, 31г&р1озрогапе1иш, 5accharot.hr ¡х.

На основании исследования закономерностей выделения из почвы ктиномицетов различных родов на селективных средах с тобрамицингм диоксидином показана четкая корреляция данных по чувствитель-ости актиномицетов к этим соединениям с результатами выделения ктиномицетов из почвы. Таким образом, предварительное изучение увствительности представителей различных родов актиномицетов к елективному агенту позволяет предположить с большой вероятностью е только комплекс таксономических групп актиномицетов, ::оторые одно- выделить с применением этого агента, но и концентрации анти-икробного вещества, наиболее пригодные для этой цели.

Опыты по выделению актиномицетов на среде с цефгриаксоном об-аружили,что в концентрациях 10 и 50 мкг/мл он подавляет рост как ктиномицетов рода ЗЬгерЬопусез, так и актиномицетов редких родов.

Бовобиоцин (табл. 5} оказался ценным селективным агентом для ыделения из почвы не только микромоноспор, что утке отмечалось ра-ее другими исследователями, но и актиномицетов рода Атусо1а{,орз1з, то отмечено наш впервые. Новобиоцин можно использовать для нап-авленного выделения из цочвы относящихся к этому роду продуцентов нтибиотиков группы ванкомицина-ристоцетина и рифамнцина.

Таблица 5.

Выделение актиномицетов разных родов на среде с новобиоцином.

контроль (среда ..„среда с новобиоцином_

РОД без антибиотика) 10 мкг/мл 50 мкг/мл!

число % число % число

Всего: 615 г.. 100 68 100 56 100

БЬгерЬошусез 450; , 73,2 27 39,8 18 32,2

Асипота<1ига 41 6,7 4 5,9 - -

Агоусо1а1орз13 14. 2,3 2 2,9 4 7.1

Мшг.отопозрога 57 9,3 22 32.4 30 3,6

КосагсН01с!е= - - 10 14,7 - -

Ргогш сготопоэрога 1 0,2 3 4,4 - -

ЗассЬагоЬЬПх - - - 3 5,4

5Ьгер1озрогап?1ш 2 0,3 2 2,9 1 1,8

Неидентифицированные

штаммы 50 8,1 - - - -

( не ЗЬгерЬошусез)

Включение налидиксовой кислоты в среду 'для выделения из почв; актиномицетов позволяет ограничить рост бактерий,- обладающих стелющимся характером роста и таким образом увеличить количество актиномицетов, выделяющихся в чистую культуру. Тобрамицин, использованный в качестве селективногс агента, ограничивает рост актиномицетов рода 31гер1оя\усез. и некоторых одноклеточных бактерий. Однако достаточно полного подавления роста одноклеточных бактерий при применении этих антибиотиков достичь не удается, напротив, при подавлении части бактериальной микрофлоры устойчивые к этим анти-

- 15 - .

логикам бактерии растут лучше, чем при посева на среду без селек-теных агентов. Наиболее типичные из устойчивых бактерий, вьграстав-,« в посевах всех исследованных образцов почв были выделены в чис-/ю культуру. На основании исследов"ния их чувствительности к 13 ззличным антибиотикам отобраны для использования в качестве селек-лвных агентов с целью подавления бактериальной микрофлоры антибио-ики новобиоцин и ристомицин (в комплексе с тобрамицином и нанидик-овой кислотой).

В результате нами был разработан комплексный метод выделения етиномицетов из почвы, включаюиий предварительную обработку почвы арбонатом кальция и высев почвенной суспензии на селективную сре-у с налидиксовой кислотой (в концентрации 3 мкг/мл), тобрамицином 3 мкг/мл), леворином (50 мкг/мл) г новобиоцином (в концентрации 1 кг/мл) в первом варианте. Во втором.варианте новобиоцин заменили а ристомицин в концентрации 3 мкг/мл (табл. 6).'

Вариант среды с новобиоцином позволяет выделить и изучить все олонии актиномицетов, выросшие при посеве обработанных образцов очвы. При замене новобиоцина на ристомицин только. 1 - 27, актиноми-етов невозможно выделить в чистуй культуру вследствие их заражения дноклеточными бактериями, тогда как в контроле- таких актиномице- -ов более 50%.

В таблицах 7 и 8 отражены результаты оценки родового разнооб-азия актиномицетов при выделении их из ттчвы комплексным методом с рлменением в качестве компонентов селективной среды нескольких ан-ибиотиков, как это было показано выше. Разница между вариантами етода состоит в применении в качестве дополнительного антибиотика овобиоцина или ристомицина Кроме того, в качестве основы селек-

тивной среды были использованы органическая среда 2 Гаузь-- или ,лин! ральная среда 127.

Таблица 6

Выделение микроорганизмов из почвы комплексным методом

„на органической среде 2 Г"узе.__;_

антибиотик % заражении

■Г

обработка мкг/мл КиЕ / 1 г почвы (х!0 ) колоний акт; почвы бактерий актин"мицетов номицетов 6: __'_всех вьгосш

без без 32,8 + 12,6 обработки антибиотика_

6,2 + 2,9

58,9

обработка леворин Г 50)

налидиксовая единичные карбонатом кислота (3) колонии

, тобрамицин (3) кальция „новсоиоцин (1)_:_

25,5 + 7,5

.во влажных леворин (50) . -налидиксовая

условиях кислота (3) 18,3 + 7,0 32,6 + 9.6

тобрамицин С 3) ._ _ристомицин (1)___

1.8

На органической среде 2 Гаузе (табл. 7). явное преимущество ' получают культуры рода Ашусо)а1ор?1з, которые составляют 6,19% от всего числа выделенных культур.актиномицетов в варианте с ристоми цином и 5,95% - в варианте с новобиоцином ( при 2,49% в контроле) Число представителей рода Шсготопозрога было выше в контрол (1,46%) и в варианте с новобиоцином (1,95%), чем при высеве почвы

О

Габлиш 7

Выделение актиномицетов различшга родов комплексным методом в двух вариантах на органической с¿еде 2 Гаузе.__.___

РОЛ

леворин

налидиксовая

кислота

тобрамицин

новобиоцин

леворин

налидиксовая

кислота

тобгамицин

ристомишш

без

аитибиоти"а

( контроль )__

ЧИСЛО /о ЧИСЛО <У /о ЧИСЛО %

Всего 1798 100 1680 100 481 100

ЗЬгерЮшусез 1634 90,83 1557 92,68 452 93,97

Асипотас)ига 11 0,61 1 0,06' - -

Атусо1аЬорэ1з 107 5,95 104 6,19 12 2,49

М1 сготопоэрога 35 1,95 4 0.24 7 1.46

Ыосаг^о1с1ез 1 0,06 Ч 0,06 3 0,62

Мосагс11орз13 3 0,17 - - -

Ргогп! сготопоБрога 6 0,33 12 0,71 0,62

2асс1таготопозрага - 1 0,06 - -

St.reptovert.ici Шит 1 0,05 - '' - 4 0,84

на селективную среду с ристомицином (0.242). Это связано с ингиби-руюгцим действием ристомицина на культуры рода МЮгопюпозрога.

На синтетической среде 127 (табл. 8) в варианте с новобиоци-ном разнообра-ие выделяющихся культур редких родов несколько огра-кичено по сравнению с контролем, однако н ней выделяется значительно большее '■<лсло представителей редкого рода .Вгонисготопозрога [8,58%), чем в контроле (0.762) или в варианте с ристомицином (0,142). В варианте с'ристомицином на этой среде удается выде-

Таблица &

Выделение актиномицетов различных родов комплексным методом в ,вух вариантах на минеральной среде 127.__

РОД

леворин налидиксовг 1 кислота тобрамицлн новобиоцин

леворин ' налидиксовая кислота тобрамишш

без

антибиотика

( контроль ).

число % число % число Г,

Всего 1922 100 701 100 524 100

31гер1отусез 1330 69,20 630 89,87 501 95,61

Ас(лпота<1ига 9 0,47 3 0,43 - -

ашусо1а1орз1б 399 20,75 59 8,42 12 2,29

О1усотусез - - 1 0,14 О -

М1сготопозрога 18 0,94 1 0,14 6 1,14

МосагсНоиЗез - - 2 0,28 -

Иосагс11орз1з 1 0,05 - - 1 0,19

Ргогтсгишпозрога 165 8,58 1 0,14 4 0,76

5ассЬагст..озрога - - 4 . 0,57 - -

лить культуры, относящиеся к родам ЗассЬагоро1узрога, Иусолтусез, МосагЦю^ез, не выделявшиеся ни в контроле (при высеве необработанной почвы на среду без селективных агентов), ни в варианте с но-вобиоциком.

Предложенный комплексный метод используется в настоящее время в лаборатории изыскания продуцентов ИНА РАМН. Он может служить моделью для выделения из почвы желаемых таксонов актиномицетов. Изменяя различные параметры этой модели (характер и условия предва-

1редварительной обработки образцов почвы, используемые селективные 1генты с разным механизмом действия) м~хно подобрать условия для правленного выделения любого рода актинсшцетов, что будет спо-;обствоать дальнейшему повышению эф|, ,ктивности поисковой работы.

В настояцл- время все больше исследователей обращав внимание {а разработку комплексных методов выделения микроорганизмов. Призером этому могут служить предложенные после начала наших работ комплексные методы выделения .ктиномицетов из почв, заключающиеся в обработке почвенши образцов различными агентами и использовании ¡елективных сред [Ыопотига П. е1 Науака\га М. ,1983,0тига 5. ,1988].

В процессе исследований нами было выделено около -"ТОО культур актин^мицетов, в том числе и представителей редких родов. Собранная в результате работы коллекция может быт*- весьма полезна как 1ля таксономических исследований, так и для направленного поиска 1родуцентов антибиотиков среди актинсшцетов отдельных родов, ко-"орые уже известны так продуценты этих антибиотиков.

Среди актиномицетов, выделенных на селективных средах и при различных методах обработки образцов почвы, оыли найдены 2 культу->ы, интересные с точки зрения образуемых ими антибиотиков. На ос-юванпи исследования их морфологии, наличия И.-ДАПК в гидролизатах 1елых клеток (I тип клеточной стенки по Лешевалье) и отсутствия ;иагоностичес1 ::х Сахаров они были отнесены к роду 51гер1отусез. >то культуры: БЬгерЬошусез егиззосаез1113 4_31а, новый продуцент лтимицина А, выделенный из почвы, обработанной лазерным лучом и ^гер^птусеэ п^заъгаег^з 4284/85, новый продуцент нетропсина, впяленный на среде с новобиоцином.'

Кроме того, были выделены редкие культуры, интересные с так-

сономической точки зрения. Одна из них - штамм 6091 - была выделена на селективной среде с тобрамицином. На основании морфологии культуры и данных хемотаксономических исследований - наличия в гидролизатах целых клеток мезо-ДАПК и ОН-ДАПК в равных количествах (11 тип клеточной стенки), присутствие диагностических Сахаров -галактозы, глюкозы и арабинозы - она была ггнесена к редкому роду Glycomyces.

В настояйэе время в этот род входят три вида - G. tenuis, G. rutgersensis и G. harbinensis. Различия в культуральных и физиологических свойствах этих культур позволяют заключить , что штамм 6091 является новым видом этого рода. Данные ДНК-гомологии подт-вервдаюг это заключение, так как степень гибридизации штамма 6091 и типоеых штаммов наиболее близких к нему видов G. rutgersensis и G. harbinensis между собой сост^ляет 40 - 53Т. (в качестве контроля была использована ДНК Escherichia coli).Содержание гуанина-цитозина всех т~ех штаммов составляло 67,3 %. На основании приведенных выше иследований мы описываем новый вид рода Glycomyces - g. roseoluteus sp. nov. Типовой штамм ИНА 6091'.

На селективной среде с налидиксовой кислотой и нистатином нами был выделен штамм 3212а. В гидролизатах целых, клеток этого штамма была обнаружена мезо-ДАПК и диагностические сахара -глюкоза, галактоза и раыноза (III тип клеточной стенки).фссфзлипи-ды типа II. Воздушный и субстратный мицелий штамма фрагментировал-ся. Поэтому птамм был отнесен к роду Saccharothrix. Было проведено сравнение культуральных и физиологических свойств штамма 3212а с наиболее близкими представителями этого рода, а также проведена ДНК-ДНК гибридизация с типовым штаммом типового вида рода - S.

- 21 - .

lustral lensis (степень гомологии'ДНК составляла 18%). Содержание уанина-цитозина штамма 3212а - 70,8%. На основании этих данных ггамм описан как новый вид рода Saccharothrix, которому дано наз-;ание S. orenburgis sp. nov. Типовой штамм ИНА 3212.

Из мицелия этого штамма была получена очиценая клеточная стенка и охарактеризован пептидогликан, который относится к типу .1 (согласно классификации Шлейфера). Тейхоевых кислот в клеточной тенке не обнаружено, что характерно для представителей рода • Saccharothrix в отличие от культур близкого к нему рода ocardiopsis.

Saccharothrix orenburgis sp. nov. штамм ИНА 3212 в опытах in itro на твердых питательных средах был активен как против рамположительнкх, так и против грамотрицательных микроорганиз-ов. В жидкой культуре (в лаборатории.микробиологическиго изучения родуцентов ВНЖНА АМН СССР) он обладал невысокой активностью в тношении грамположительных микроорганизмов, был активен в отноше-ии Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, и не активен в отноше-ии Candida albicans.

Установление таксономического положения выделенных из почвы ктиномицетов представляет собой довольно сложную задачу. Для об-егчения родовой идентификации составлена матрица, характеризующая злее чем 50 родов порядка Actinomycetales по таксономическим ризнакам - морфологическим и хемогаксономическим, включая тип гптидогликана, клеточной стенки, состав фоефолипидов, менахино-;в, жирных кислот, диагностических сахароз и содержание гуани-. а-цитозина в ДНК. После п'рограмшой обработки ее можно использс-эть для ускоренной идентификации родов активошцетов с помощью

персонального компьютера.

Таким образом, нами разработан и апробирован комплексный метод выделения актиномицетов из почвы, включаювдй предварительную' обработку почвенных образцов карбонатом кальция во влажных условиях и использование для высева образцов селективной среды с комплексом антибиотиков. Этот метод дает возможность изолировать жла-емые, преимущественно редкие роды актиномицетов, представляющие перспективный источник получения новых антибиотиков.

ВЫВОДЫ

1.На основании проведенных исследований показано, что обработка почвенных образцов карбонатом кальция во влажной камере приводит к увеличению количества актиномицетов, выделенных из 1 г почвы, на 2 порядка (при сохранении соотношения культур разных родов).

2.Исследована чувствительность актиномицетов различных родов к нал .дикеовой кислоте, тобрамицину, гелиомицину и диоксидину. Показана четкая корреляция между данными по чувствительности культу] актиномицетов к антибиотику и результатами выделения их из почвы на селективных средах с этим антибиотиком. '

3. Результаты изучения чувствительности разных родов актино-шщотов к налидиксовой кислоте показали, что большинство актиномицетов, за исключением актиномицетов родов Асипор1апез и Мюготопозрога, не чувствительны к этому агенту, а почвенные бактерии, обладающие стелющимся характером роста, чувствительны к на лядиксоеой кислоте в концентрации 10 мкг/мл. При посеве образцов почвы на селективную среду с налидиксовой кислотой рост бактерий, обладаниях стелющимся характером роста, полностью подавляется.

- £3 - .

4. При изучении чувствительности культур аетиисмицетог. к тоб-)амицину била показана . пригодность тобрамищша в качестве се-1ек;ивного агента для выделения актиномицетов редких родов Imycolatop-is, Gaccharopolv:5pora, Miorcirkwiospora, Actinomadura, locardiopsis. В опытах пз выделению актнномицетов из почвы на се-1ективной среде > тобрамицином преимущество получают в основном «тиномицеты тех же родов.

5. Показано, что гелиомицин и диоксидин непригодны к исполь-юванию в качестве селективных агентов для выделения культур ред-мх родов.

6. В опытах по выделению актнномицетов из почвенных образцов ia селективной среде с новобиоцином подтверждена ценность этого ттибиотика для выделения культур рода Micromonospora, впервые по-азана целесообразность применения его для выделения из почв пред-тавителей рода Amycolatopsis.

7. Разработан комплексный метод выделения актиномицетов из очвы, Еключаюшлй предварительную обработку образцов почвы карбо-атом кальция во влажных условиях и посев обработанной почвы на елективную среду с несколькими антибиотиками. При использовании елективной среды с тобрамицином, налидиксовой кислотой, леворином

новобиоцином или ристомиданом количество зараженных актиномице-ов не превышало 1 - 2%, тогда как в контроле количество заражен-ых актиномицетов доходило до 501.

9. Проведето сравнение эффективности использования синтети-еского агара 127 и органического агара 2 Раузе в клчестве основы елективной среды. Применение органического агара 2 Гаузе для вы-еления актиномицетов из почвы позволяет выявить большее разнооб-

разие редких родов актиномицетов (при использовании одних и тех ж селективных агентов). Синтетический агар 127 с добавлением тобра-мицина, налидиксовой кислоты, леворина и ристомицина является Подходящей селективной средой для выделения из почвы актиномицетов редкого рода Promicromonospora.

10. В результате проведенной работы выделено 5195 культур ак-тиномицетов и собрана большая коллекция культур, относящихся к редким родам актиномицетов. Коллекция представляет интерес для изыскания продуцентов антибиотиков и таксономических исследований некоторых групп актиномицетов.

11. Описаны выделенные селективными методами новые виды редких родов актиномицетов: Glycomyces luteoroseus sp. nov. (штамм JUL 6091) на среде с тобрамицином и Saccharothrix orenburgis зр.

nov. (штамм ИНА 3212) на среде с налидиксовой кислотой и нистагино) и новые продуценты антимицина A (Streptomyces emssocaesi 1 is шт. 4281а и нетропсина (Streptomyces"misawaensis nrr. 4284/85).

12. На основании литературных данных составлена матрица родовой идентификации актиномицетов. После программной обработки ее. мохно будет использовать для ускоренной идентификации родов актиномицетов с помощью персонального компьютера.

Список публикаций по теме диссертации.

•1. Алферова К Р , Терехова JLIL , Праузер X. Селективная среда с налидиксовой кислотой для выделения актиномицетов-продуцентов антибиотиков. //Тезисы докладов Первого советско-американского симпозиума по антибиотикам и химиотерапии, Москва, 1988, стр. 5-6

2. Алферова И. Е. .Терехова Л. IL Применение, метода обогащения почвы карбонатом кальция с цель» выделения актиномицетов//Антибио

!ки и химиотерапия. 1988..- 33(12).- стр. 883 890

3. Алферова И. В.', Терехова JL П. ,Праусер X. Селективная среда с шидиксовой кислотой для выделения актиномицетов-продуцентов ан-[биотиков//Антибиотики и химиотерапия, - 1989,- 34(5).- стр. 344 -.7.

4. Аристов А. Li. , Воловик A.C. , Алферога IL В. .Преображенская

IL Состав возбудителей парши обыкновенной Streptomyces зрр. при вестковании почвы в Московской области. // Депонирована во ВНИЛ -М под No 585/55 ВС 89, реферат опубликован в серии "Картофель" -1989 г. , стр.8

5. Галатенко О. А. .Терехова Л. IL , Алферова И. В. | Преображенская П. Изучение возможности использования тобрамицина, лонгацефа и оксидина в качестве селективных агентов.// Тезисы докладов II есоюаного семинара "Актуальные направления поис1са антибиоти-в". - Алма-Ата, 1989

. 6. Терехова Л. П.. Галатенко O.A. .Алферова И. В. Принцип:: селек-вного выделения продуцентов антибиотиков// Тезисы докладов II есоюзного семинара "Актуальные направления поиска антибиотиков". -ма-Ата, 1989

7. Терехова Л. Е , Галатенко 0. А. , Алферова И.В. .Преображенская П. Использование селективных сред для выделения актиномицетов.

Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких ров. - "Гылым", Алма-Ата - 1990,- стр. 5

8. Терехова ... П. .Алферова И. В. Комплексный метод выделения из чвы актиномицетов-антагонистов. // Поиск продуцентов антибиоти-

в среди актиномицетов редких родов.-"Гылым" .Алма-Ата.-1990. -

р. 20