Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Получение и характеристика мутаций у штаммов Saccharopolyspora erythraea, влияющих на биосинтез антибиотика эритромицина

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО АНТИБИОТИКАМ В Н Ц А - ВНИИ А

На правах рукописи УДК 615. 33: 577. 182. 621. 012. 6: 579. 873. 71

НАСТА С ЯК Иван Николаевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИЙ У ШТАМПОВ Saccharopolyspora erythraea, ВЛИЯЩИХ НА БИОСНТЕЗ АНТИБИОТИКА ЭРИТРОМИЦИНА

14.00.31 - Химиотерапия и антибиотики 03. 00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

if Москва - 1992г.

-К"-' / "г

Работа выполнена в филиале Международной лаборатории генной инженерии продуцентов антибиотиков при Львовском-университете.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик АМН СССР Навашин С. М доктор биологических наук, старший научный сотрудник Даниленко В.

Научный консультант-.

кандидат биологических наук, доцент Федоренко В. А. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дудник Ю. В. ,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Орехов А. I

Ведущее учреждение:

кафедра генетики биологического факультета Московского университе

во Есееоюгном научном центре по антибиотикам ( ВНЦА-ВНИМА ) по адресу 113105, г.Москва, ул. Нагатинская, д. За.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦА.

Зашита диссертации состоится

года в

часов на заседании специализированного совета Д 098. 03. 01

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

jJ ВВЕДЕНИЕ,

• •,'., . толя. К числу Hastíate в широко применяемых тт-

—-Шйз«пх льтксиотгчоз аятпногягцйтпого происхождения пркгадлекит эрптрогяцзя - ялсосэтйокзй продстататоль. макролидннх аигмсаотя-:<оп. Это один аз наибояоо поропокшэшх ангабвотикоа, что слизано с ого яхтиепооткэ кап протпв гра/лолоеттольных, так и ряда грцо^пздгй'олнжх tsíKpooyr'GHHS'.OB, и, чео особенно валко, - против ¡'лнопдгазм, логпополл, апаэробшх тонкое, клострлдпй. По оценкам спопгллтатоз в сглпл о потрэбностяка зяракюхрэтнля н нас-тояцее вредя- сущоатсуог необходимость н -уселячении. производства орптро.тапша. Одеты из путей доатиг.зшш этого является получанно biicokcoktilbkhx ытаимоз-продуцвнтов эрктро.чшпна.

Прожппленные культуры продуцентов антпбаотисон (в том числе и эр:таро:,ащииа) получепк в основном при помогая шщтарованкого мутагенеза. Однако а настоящее время такой подход становится пса ¡чопое офТ^ктлеш-л.:. Зто обстоягалютво ставит задачу поиска ноекх генетических и гошошк.Э!19ршх ксгояоэ к оксазд лроваюш вксокоах-тиншяс продуцентов эрзуро-тяцика.

Мсолодоезнял: псслсштх лет показали, что шоекпй уровень баосштеза антпбаотака об?словлен кэ только экспрессией генов баосянтооа, но в знатагоягьной мере зависит и от геков резистент-ноого как а продуцируемо!;?, тал и к прута: антибиотикам. Поотсцу янтонсиззко проводятся раоотц по получению к характеристика шик иласооз антибиотик сромстентных мутантов и их иопсльзоелшш в оолеацзп промышленных продуцентов антибиоттлоз.

Изучение мутанте устойчивости к антибиотикам, влиякщих ка процессы траюирипщл, трансляции и транспорта антибиотиков позволяет пдзнтифпщровать некоторое механизма регуляции биосинтеза антибиотиков и его связь о верпэткщ метаболизмом.

Одной из сазных проблем гзгатжи ахтннсмицетов является нестабильность признаков устойчивости к антибиотикам. В ряде случаев установлено, что нестабильность признаков"? антзяомщетоз обусловлена ярушша пороотройяаии в их геноме. Изучояяо иехаппэ-мов нестабильности Eazao не только для понимания организации и фук<цхошроваяш1 генома акткномзцетов, ко п для поиска гештачоа-кнл методов стабилизации промкилешшх птачэдв. Продуцент орясро-.'■'.ицяиа в отнопзппя генетической нестабильности изучен очэнь сясбо.

Идентификация и изучение ашшфшдарующихоя последовательностей ДНК актиношщетов имеет большую практическую значимость, поскольку она является важным'элементом для создания ишетративных векторов с переменим количеством копий на геном при конструировании высокоактивных штаммов-продуцентов антибиотиков.

Работа выполнялась в рамах ГНТП "Новейшие методы биоинкене-

раа".

Цель таботн и задачи исследования. Целью настоящей работы я» ляпась разработка методов генетического конструирования высокоакти: них штаммов-продуцентоЕ эритромицина о использованием мутаций усто чивссти. к антибиотикам.

В связи с поставленной целью предстояло решить следущае задачи :

- провести изучение признаков устойчивости штаммов Б.егуШга к различным по механизму действия антибиотикам;

- отобрать мутанты штаммов &«егу№гаеа , устойчивые к рифам-пнцину, хлорамфеняколу и тиострептону;

- изучить стабильность сохранения признаков антибиотикорезис гентнооти у выделенных мутантов;

- охарактеризовать Еыделеннве мутанты в отношении изменений их морфологических признаков а устойчивости к другим антибиотикам;

- провести ажлиз изменчивости признака антибиотикообразова-ння в популяциях К1гг-,Ст1г- и т§гг - мутантов;

- разработать методические подходы к стабилизации высокого уровня антибиотической активнооти. у антибиотикорезистентных мутантов;

- выделить мутанты, отабальнш превшаэдие по своей антибиотической активности исходны! штамм 5;

- провести изучение коллекции Стх1' - штаммов Б.егу-Иггаеа на наличие в их геноме перестроек и внехромссомных молекул ДНК;

- локализовать детерминанты устойчивости к• рифамшщину и хлорамйе николу на генетической карте з.егуйигаеа-.

Новизна результатов. Впервые получены и охарактеризованы кш лекции мутантов продуцента эритромицина з.егуИггаеа , уотойчшаш: з рафампицшу, хлорамфекиколу и тиострептону.

Иопользуя эта коллекции, показана перспективность селекции высокопродуктивных шташов-дродуцентов эритромицина среди антибиотик ope зи стен тных мутантов. Впервые в геноме мутантов s.erythraea, устойчивых л хлорамфешколу, идентифицированы две различные ампли-фицирующиеся последоватальности. Установлено, что экзогенный хло-рамфеникол индуцирует у штаммов s.erythraea устойчивость к амино-гликозидным антибиотикам.

Картированн два различных детерминанта устойчивости к ряфампи-цину, а такяе детерминант устойчивости к хдорамгоенинолу и ¿-мутация, ' блокируя® ая биосинтез эритромицина.

Научно-пгактическая звзчтаость таботы. Разработаны подходы в селекции штаммов s.erythraea^ повышенной антибиотической активностью при использовании мутантов, устойчивых к рифампицину, хло-рамфениколу я тиостраптону. На осноЕе этого получены варианта, являющиеся материалом для дальнейшего конструирования высокопродуктивных штаммов продуцента эритромицина.

Установлен факт высокой нестабильности признаков устойчивости к хяорамфениколу и тиострепгояу. Показано, что эта нестабильность сказывается на нестабильности признаков продукции эритромицина. Разработаны методики стабилизации повышенной антибиотической активности мутантов, устойчивых к антибиотикам. Идентифицированные амшшфицирующиеоя последовательности могут быть использованы при конструировании векторов с целью создания генно-инженерного продуцента эритромицина. Мутации устойчивости к антибиотикам могут быть использованы в качестве маркеров при картировании и других генетических и генно-инженерных процедурах со штаммами s.erythraea.

Структура твбота. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей обсуждение результатов, заключение и выводы . Материл надежен на страницах машинописного текста. Диссертация включает рисунков и таблиц. Список использованной литературы включает источников.

Публикации. По материалам выполненных исследований опубликовано s работ.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Современные проблемы антибиотик ореззстентяости" / Москва, 1989/, на Мезщународноы симпозиума "Генетика и образование продуктов у акгияомщегоЕ" / Германия, Эрйурт, 1990/ на 7-й национальной конференции по производству и применению антибиотиков /Болгария, Разград, 1930,/ щ 8-ом Международном симпозиуме ко биологии актиномицегов /США, Медиоон, 199.0/, научных конференциях Львоеокого университета (I988-I9SI), m научно-практических конференциях Курганского комбината медицинских препаратов и изделий "Синтез" (I989-1991), I Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пушно-т-Сйе ,1991),

Материалы и методы.

Штаты. В работе попользованы шташы-продуценты эритромицина: S.crythraea 3,S.erythraea 5§erythraes IffiKL ¿558 f полученные из коллекции культур ВШША, а также s.crythraeaЕГСС 2, его аук-сотрофные и Егу ~ -мутанты, получение от д-ра Т.Тодорова ( М ЕАН, г. София). Уотойчязые к антибиотикам мутанты штаммов s.eryt-hraea выделены В настоящей работе. Культура Bacillus r-ycoides . НВ2 использовалась как тест-организм при определении способности шташов s.erythraea продуцировать эритромицин.

Среди д условия культивирования шшаоа« Для выращивания шташов актиномвдетов, определения их монологических признаков, а также для скрещиваний производных s.erythraea к дая регенерации протопластов использовали полноценные среды н 2Т ( Weber et al , 1985) е GP-6 (Досовская к др., 1971). Выделение рекоыбищн-тов, полученшх в скрещивании, определение генетических шриероэ актиношщетных шташов проводили на минимальной среде к 2Ш ( Weber et ai , 1985). Для получения протопластов, Еыделения тотальной и плазмцдной ДНК зз птаммов. s.erythraea использовали средне Okanishi et al . 1974) И KSGP ( Jamamoto et al , I9S6) • Штамм B.mycoides KBg выращивали ка агаризованной среде Хоттин-гера при 34°С. Культуры антанонщетов выращивали при 30-35°С, а npi тестировании фенотипа тврмочувствитальностй - при 42°С.

Определение устойчивости итатасв s-m^h^na к антябкотякак проводили тремя кетодаш: методом да^зии в агар с использование

дисков с антибиотиками (двухслойный метод), метод отпечатков, а также титрование суспензий оползти мацелиальшх фрагментов исследуемых штаммов на агарнзованной срзде с одним из антибиотиков.

Штагостуробработку клеток актияомицеткнх штаммов нитрозо-гуанидшгом СНГ) проводила по методу Делича и соавторов ( Dgüo al al, 1970). Обработку шдалиалышх суспопзиП исследуемых штаммов нптрозоэтилепдочвЕпиой (1Ш) проводили при конечной концентрации мутагена 0,025;* на прозихенин I часа, а дкнитробензпиреленом (ДКШ)-np't конечно;'! концентрации вдтагена 100 мкг/мл в О,ИЛ Фосфатном буфере на протяжении 10 шн.

Получшгде г,т)отопластов проводила до методу Okaninhi et al (1974) с некоторой кодификацией для o.erythraea/ uwamnoto et Выделение резистентных к антибиотикам мутантов у штаммов S.erythraea проводили путем высева суспензий их спор ( Ю - 10^ опор/мл) или мзцелиальшх фрагментов m полноценную среду, содержащую антибиотик в возрастающих концентрациях. Отбирали колонии, вырастайте е таких условиях, и проводили повторную проверку еыизлвн-mix клонов на резистентность. Выделение антибпотикоустоЗчивых мутантов, индуцированных мутагенами или протошгастированием, проводили аналогичны!.", образом.

Антибиотическуго активность штаммов определяли двумя способа®:

1). в условиях глубинной ферментации (Дмитриева, Семенов, 1965);'

2). в условиях роота отдельных колоний на агаризованнсй среде

( Veurnakin ^ blander , 1983). В основе обоих споообов лекит биологический метод диффузии антибиотика в агар с тест-культурой Вас.myoide s НВ2.

Внделение тотальной ,ЩК из актиномицетов прово,дили по ыопифици-рованной методике Marmur (1961) .

Выделение плазмицной ДНК из актиномицетов проводили'модифицированным методом щелочного лизиса Birnboim, Doly (1979).

Электрофорез ДНК проводили в горизонтальной 1,0$ агарозном геле в трисацетатном буфере / Маниатис и др., 1984/.

Ресттжкгооннне зндонуклеазн получета из НПО "Фердент" (г.Еиль-iroo) и использованы в условиях, рекомендованных изготовителем.

Скрещивания производных; з.ег-ушгаеа осуществляли по методике, описанной Хопнудоы ( Нориоо<1,, 1967), с последующим- анализом гаплоидных реноыбинантов,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЩЕНШ.

I. Характеристика шгашов ЬасеЬагорсауарога егу№гаеа по признакам устойчивости к антибиотикам.

Три шташа з»егу-№гаеа ( различающиеся по антибиотической активности - лабораторные штаммы кигь 2338 и ВТСС 2, и шташ 5, п< вертевшийся селекции на повышение уровня продукции эритромицина , были изучены в отношении признаков устойчив ости к различным антибиотикам. Показано, что исследованные штаммы имеют идентичные спез ры устойчивости. Они устойчивы к высоким дозам ыакролиднкх антибш тиков и линкомицша, то есть обладают природной ^ьз -резистентно! тю. Все штаммы устойчивы также к новобиоцану, полимлксину, ампигр лину, бензилпенициллину и оксациллину и чувствительш я хлорамфек колу, рзфампицину, неошщаяу, тетрациклину и карбенициллину. При титровании спор штамма 2338 на антибиотик о со дерзание среда пока®!: что.50-100$ выживаемость спор штамма наблюдается при следующих ко: центрациях антибиотиков: стрептомицина - менее 100 мкг/мл, канами цана - менее I мхг/ш, рифампщина - менее I мкг/мл ж тиострептон - менее I мкг/мл. Высокая выживаемость спор ктаммов з.егу-ььгаеа (100Я наблюдается на средах с тилозином, ояеандомицкном и линком цином, содержащих менее 500 мкг/мл антибиотика. Однако, устойчивость их вше к эритромицину, чем к другим ггакролндам. При содерн ша эритромицина в среде от 100 до 4000 мнг./шг наблюдается 100$ шзшванае спор. Хотя изученные теша имеют обгее происхождение, существуют определенные отличия в уровнях устойчивости к некоторы атябиотЕкам. Так, ряаашвцг-н полностью инглбпровал рост штаммов 3 и 2338 при концентрации 30 жгЛи, а атамлог 5 и НГСС 2 - щи 50 каг/кл, то есть штага: 2338 чувствительнее штаммов 3, 5 и ВТСС г: рнфаапицкну (ряс. 1,В). и-тамм 2338 устойчивее пс сравнзиию со шамкаш 5 и ВТСС 2407 к таострзптоку и теградаклищ, но чувствительное к хлора'лфзгсЕолу (рлс. I, А}.

концентрации антибиотиков в среде. По оси абсцисс - концентрация антибиотиков в среде, мкг/мл; по оси о Едина т - выживание клеток, • %. I - 2333,2 - итамм 5,3 - ВГСС 2407 , 4 - штамм 3.

А - среда с хлорамфениксяом, Б - рифампвдином, С - тио-отрептоном.

- Ö -

Был такае изучен спектр устойчивости к антибиотикам шести firy" производных штамма ВГСС 2 с нарушениями различных этапов биосинтеза зр!троыицина. Все изученные 2гу~ -мутанты не- утратили устойчивости, но при этом наблюдаются множественные изменения признаков устойчивости к другим антибиотикам.

Таким образом, исследованные штаммы-продуценты эритромицина устойчивы не только к этому антибиотику и другим макролидам, но и к ряду .других антибиотиков. В этом отношении они подобны другим изученным штаммам антжношцетов / Даннленко и др., 1977/.

Отмечена высокая чувствительность штаммов s.erythraa^ рифам-пицину, хлорамфешколу и тнострепгону. Это позволяет получать и использовать в генетическом анализе и селекции мутации устойчивости к этим антибиотикам.

2, Получение и характеристика мутантог з.erythraea, уСТОЙЧИЕЫХ к рифампицину ( Eifr ). Показано, что спонтанные Rifr - мутанты штамма s.erythraea 2338 отбираютоя на средах с 5-20 мкг/мл антибиотика с частотой

о А

0,S*IQ~° - 3,0*10 . На средах с более высокими концентрациями ри-фампвдина спонтанные üifr _ мутанты этого штамма не обнаруживались.

Частота спонтанных Hifr -мутантов у штаммов КГСС 2,3 и 5 выше на 1-3 порядка в зависимости от используемой концентрации рифампицина в среде. Обработка клеток культур s.erythraeaHF или НЭМ приводила к увеличению частоты Rifr-Myтактов на 1-2 порядка. В 2-3 раза увеличивалась частота таких мутантов после протоплаоти-рования. %юме того, эти обработки позволяли выделить Bifr -адтант: на средах с более высокими концентрациями антибиотика (30-70 мкг/мл В результате проведенной работы была создана коллекция из НО Bi£r -мутантов штамма 5, свойства которых изучались в дальнейшем. Изученные мутанты разделены на три гд>пны по уровню устойчивости к рифампицину: высокоуотойчивые, растущие в отпечатках на среде СР-6 с 200-300 мнг/мл рифампицина (I группа) - 60$ от числа исследованных культур; П гцшаа - мутанты со средним уровнем устойчивости (100-125 мкг/мл) (15,555)и группа - низкорезлетентнке мутанты (не более 50 мкг/мл) (24,5$). Кривые выживания трех мутантов, относящихся к различным группам по уровню резистентности к рщгашициву, 621 (I группа), IC-20 (П группа) и 3-20 (№ группа) представлены на рис. 2,

- а - Таблица I

Свойства -г-г/.утантов штамма 3 . 01-уЛГЗ еа

Уровень устойчивости к тайРам-пицину, гаг/мл Абсолютное число штаммов ¡Фенотип ¡Отсутст- | } термочувст-г вие ЬтЯи0тт ; вательнос-; воздушно-,' -1 ;ти, I) ;го шгаэлия :'> ' • > £> *

200 - 300 66 60,0 0 0,9 0,9

100 - 125 17 15,5 6,4 9,1 8,2 .

не более 50 27 24,5 12,7 11,8 10,9

Всего: НО 100,0 19,1 21,8 20,0

Примечание: I) прошит от общего числа исследованных

мутантов.

Показано, что сретж 110 тг^члутентов штамма 5-19,1% - это мутанты, которые не способны, в отличив от исходной культуры, расти при 42°С (табл. I), 21,8$ исслздованшх -¿^-мутантов стабильно утратили способность образовывать воздушный мицелий, а 20,0;; - способность синтезировать катании. !-е1~ и "фенотипы, как и терма-чувствительность роста встречаются лишь у мутантов со средней и низкой степенью устойчивости (табл. I). 4,3% от общего числа исследованных —мутантов характеризовались одновременным отсутствием воздушного мицелия и термочуЕствительностью роста. Изучен спектр устойчивости к антибиотикам II -мутантов штаммов 2338 и 5. Показано, что мутанты характеризуются индивидуальными спектрами. Однако, все изученные гаг1' -мутанты стали устойчивыми к стрептомицину. Отмечено также повышение резистентности мутантов I и П групп к у^-лактамным антибиотикам. Все мутанты I группы были чувствительнее к тетрациклину, у гигантов из II и III групп существенных изменений в устойчивости н тетрациклину не наблюдалось.

Представляло интерес изучить влияние мутаций устойчивости к рифампицину на антибиотическую активность з.сгуШгаеа , поскольку известно, что таяиё мутации способны оказывать плейотропный эйфект на ряд признаков, в том числе и биосинтез антибиотиков.

Pao. 2 Влияние рифашвдина на выживание Rifr -^мутантов штампа S.erythraea 85-1 ¿

По оси абсцисс - концентрация рифампицина в среде, мкг/мл; по оси ординат - выживание клеток, ig %. I - штамм 85 - Г,2 - 3-20, 2- 10-20, 4-621.

При селекции спонтанно возникших Яэ-^-мутантов наблюдается положительная корреляция ыевд повышением концентрации антибиотика •среде, на которой отбираются кутанты, и увеличением числа минус-вариантов С г =0,669), а также отрицательная корреляция с увеличением числа плюс-вариантое ( 1^0,547) (рис. 3).

Обработка клеток НГ и последующий отбор на средах с рифашици ном приводили к сущэственному увеличению средних значений антибиотической активности СМ) изученных Rifr -мутантов, как по срагнеш с таковой среди выживших вариантов на неселективноЭ среде после ос работки НГ, так и по сравнению со спонтанными Rifr -мутантами и исходной культурой. Кроме того, среда индугарованных КГ Rifr -

антибиотическая активность (индекс продуктивности - Ш). А - спонтанные мутанта; 3 - индущро ванные HT Rifr-MyTaa-ты. Концентрцяя рифамшщина: 1а, 16-5,0 гаг/мл; 2а, 26 - 10 мкг/мл; За, 36 - 20 мкг/мл; 4а, 46 - 30-мкг/ мл; 5 - контроль; S - обработка НГ.

мутантов отмечена тесная положительная корреляция мевд увеличением концентрации рифамшщина в селективной среде от 0 до 10 мкг/мл и числом плюс-вариантов { г =0,967). При. отборе о более высоких концентраций такая корреляция отсутствовала (рис. 3)

Таким образом, эффективным следует признать отбор индуцированных '-мутантов из среды, содержащей 10 щг/мл рзфашшцина, где наблюдается максимальная частота появления плюс-вариантов и увеличение значения М. Отбор как спонтанных, так и индуцированных 81£г-мутантов со сред, содержащих 5-10 мкг/мл рифампацина, может исполь-зоеэться в практике для стабилизации культуры продуцента з.егу№-гаеа 5 на уровне высокой антибиотической активности, поскольку при этом отбирается больше высокоактивных вариантов, чем в исходной культуре, и уменьшается число минус-вар1антов.

Для отбора наиболее активных мутантов мы в-дальнейшем изучали не только плис-варианты, но и варианты, превышающие по антибиотической активности средние значения Ы в контроле более, чем на 20$ (всего 12%). При ферментации в глубинных 'условиях семь К1ГГ -кутан-тое (9,7$) превышали исходный шташ 5 по своей антибиотической активности. У сорока вариантов способность продуцировать эритромицин была на уровне контроля или на Ю-20$ншсе. Остальные мутанты продуцировала менее 50$ антибиотика по сравнению с исходным штаммом. Однако, пересевы в неселактивных условиях и длительное хранение на неселективной среде при 4°С приводили к снижению антибиотической активности высокопродуктивных й^^мутантов ш 10-30$?, что говорит о нестабильности признака антибиотической активности у выделенных мутантов. Эффективность поддержания высокого уровня продукции эритромицина у -мутантов повышается, если эта штаымы поддерживать на среде с рифашицином или периодически проводить рассевы на среду содержащую максимальную концентрации рафаыпицина, при которой наблюдается 100$ выживание штамма. При этом наблюдается увеличение числа щгос-Еариантов.

Необходимо также отметить, что падение антибиотической активности у изученных наш семи Е^г-мутантов не связано с изменениями в уровне их устойчивости к ра^амшцину.

Таким образом, получена и охарактеризована большая коллекция независимых ^¿мутантов штаммов з. егу^гаеа . Сравнительное изучение свойств полученных Н1Гт-мутантов и исходных культур показало, что наиболее часто фенотиаическае изменения обнаруживаются у

штага/,ог с ни жим уровнем устойчивости к риФампицину, а отбор индуцированиях îiT ш.?г-мутаитов, устойчивых к Ю мкг/мл антибиотика, перспективен для отбора вариантов с повышенно'! способностью к продукции о ритромицана.

3, Получение и характеристика мутантов

0. erybhraea,УСТОЙЧИВЫХ К ХЛОраМфОНИКОЛУ ( Си1г) .

Спонтаншю Сп1Г}(утантн шгаы/л 2338 возникали на средах с 1020 г.от/мл хлора1.'£зшшола с частотой 3,3-10-7 - 8,1*10 . Такие же мутанты штаммов 5 и 2407 отбирались с частотой на 1-2 порядка вишо. Обработка клоток культур H5Î.1 приводила к увеличения частоты Си1 ~ щчаячав аейяедуекых штаиков на оган-пва порядка. При изучении свойств выделенных мутантов обнаружено, что огойткегат раатичный уро-вонь устойчивости к хлорамфениколу и могут быть отнесены к пяти группам (тасл. 2).

Таблица 2

Распределение Ся1-куталтсв шташа s.erythraeaS по уровню устойчивости к хлораиТхзшжолу (при посеве штрихом).

Группа кутантов

Уровень устойчивости, мкг/мл

количество штаммов _ г_-

абс. число

I 40,0 3 6,5

п 30,0 8 17,4

ш 20,0 12 26,1

1У 15,0 18 ■ 39,1

У 10,0 5 10,9

сего: 46 100,0

Показано, что признак устойчивости к хлорамфенкколу характеризуется генетической нестабильностью. Нестабильность проявляется как в потере а высокой частотой (0,6-15£) признака хлорамйеникол -резистентности, так и в появлении спонтанных мутантов с повшенной устойчивостью (до 100 мкг/мл) при ступенчатой селекции путем после дона тельного пересева на среды с лсЕниающикися концентрациями антибиотика.

Ует1г-мутантов штамма ВГСС 2407 обнаружено два различных фенотипа термочувствительноств роста: зависимый и независимый от экзогенного хясрамфеникола. В первом случае 62,1$ изученных мутантов проявляли ъз -фенотип на среде с 15 ыкг/мл хлорамфешкола при 42°С независимо от наличия антибиотика в среде. Чаще всего ts -фенотип проявлялся среди низкоустойчивых Спаг-мутантоЕ.

Установлено, что уровень устойчивости Сш1г -мутантов к хлорам-¿ениколу тесно коррелирует с устойчивостью к линхошцкну: штаммы более устойчивые к хлорамфениколу оказались и более устойчивыми к ливкомицину.

У мутантов с различным уровнем устойчивости к хлорамфе николу проявляются различия и в экспрессии устойчивости к аминогликозид-нш антибиотикам. Так, в присутствии хлораыфеникола возрастала чувствительность исходного штамма 5 и низкорезистентного Сп1г- мутанта С24 к канашздину, гентагвщину и неомицину, а у высокорезистентного мутанта С45, наоборот, увеличивалась устойчивость к этим . антибиотикам. У этих.штаммов отмечена индукция хлорамфенинолом резистентности к стрептомицину. Показано, что хяорамфеникол индуцирует устойчивость к канамицину штаммов 5 и С24 при использовании хдорамфеникола в концентрации 30 мкг/диск, а канамицина 10 мкг/мл. Такая индукция не наблюдалась у штамма С45.

Исследован/Г способность продуцировать антибиотик в глубинных условиях культивирования у 46 Спа1"-мутантов шташа 5. На первом этапе исследований было проведено по три ферментации каждого из мутантов. Показано, что антибиотическая активнооть 20 Ст1£-мутан-тов (43,5$) была ниже, а 26 мутантов (56,5$) - выше активности исходного штамма. Полученные данные свидетельствуют об эффективности отбора высокоактивных штаммов продуцентов эритромицина среди Ст1г-мутантов. Однако, для отбора наиболее активных сп1г-му шнтое мы в дальнейлеы изучала только 6 плюс-вариантов, стабильно превышаюиюс контроль по антибиотической активности на 20$ и выше. При пассажах в неселектинных услоеиях (4 пересева) и при длительном хранении при 4°с (от 3 до 6 месяцев) показано, что четыре штамма сохраняли в этих условиях повышенный уровень продукции эритромицина, два мутанта расцеплялись и образовывали варианты, антибиотическая активность которых составляла 80-30% от таковой у штамма 5. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о необходимости подпер-

зсивающей селекции высокоактивных Сга1г-мутантов. Мы использовали два подхода для стабилизации высокого уровня продукции эритромицина у -мутантов: I) паосани штаммоЕ в присутствии низких концентраций хзгорамфеникола; 2) добавление хлораифенинола в таких зе концентрациях в ферлентационную среду. Показано, что у всех изученных СшХ^вдтактов пассажи в среде о хяорамфениколсм приводили к значительному поЕшению их антибиотической активности как по сравнению с исходным штаммом, так и по сравнению с пассажами в неселе-ктпвных условиях. Второй же подход неэффективен, поскольку ведет к падению антибиотической активности исследованных штаммов.

Был проведен сравнительный реотрикционный анализ тотальной ДНК 21 Ся!1Г-мутанта штамма S.erythraea t которые были получены с помощью селекции в один этап и отличались между собой по уровню устойчивости к хлорамфениколу. Тотальную ДНК каядого из изученнных мутантов обрабатывали эндокуклеазами рестрикции: HI, Pvuif Pvu П, Bgl п, Pstl, Xhol, R-pal, Sna If Sal G Sac Электрофоретический анализ рестриктов тотальной ДНК показал, что в геноме 9 Си1г -мутантов (I группа мутантов) не обнаружено крупных перестроек (ашлифихашй, деамплификаций, делеций или вставок). Можно предположить, что мутации в гене(ах), контролирующих хдорам-фешгколуотойчивооть этих мутантов, связаны с иными механизмами, которые идентифицировать данным методом не удалось. Однако, при обработке тотальной ДНК других СшХ^мутантов (П группа) ферментами Sal Gl u Sad был обнаружен фрагмент размером около 18 т.п.н., число копий которого выше, чем у исходного штамма 5 и мутантов I группы. Этот фрагмент присутствовал и у штамма С24 (Ш группа), однако копийность его значительно превышала число копий у мутантов I и П групп. Расщепление тотальной ДНК Ст1Г -мутантов ферментами öir.a I, Pvu П, Pst I и Xho I показало наличие одного амплкфици-роЕаяного фрагмента размером около 16 т.п.н. у штаммов П группы, и двух фрагментов (18 т.п.н. и 16 т.п.н.) - у штамма С24 (Ш группа). После обработки этими рестриктазама фрагмент размером 18 т.п.н. обнаруживался также у исходного штамма 5 и других мутантов. Однако, у штамма С24 его копийность была значительно вше. Фрагмент размером 16 т.п.н. присутствовал в одинаковом числе копий как в ДНК штамма С24, так- и мутантов П группы. У мутантов I группы фрагмент выявлен в неаьтлифзцнрованном состоянии.

мы предположат, что амтшьунцироЕанннй фрагмент размером около 18 т.п.н, - это плазыидная ДНК. Плазмиды подобных размеров (18,1 т.п.н.) ранее были выделены из з.егу-ьнгаеа ( Егсжп ос е!,/щ. Однако, нам не удалось выделить ни у одного из восьми исследованных мутантоЕ (е том числе и 024) плазмидную ДЖ методом щелочного лизиса. Не исключено такке, что обнаруженные фрагменты ш.пдкфицпрованн е составе хромосомы-

При рестрикцаонном анализе тотальной ДНК 9 мутантов, проездах ступенчатую селекция на повышенную устойчивость к хяоргыфекикаяу, в геноме одного из них (С322) обнаружены фрагменты высокой кспиякос-ти, свидетельствующие о наличии аыгшяфидаров энной последоюгаяыюс-ти. Сумма размеров фрагментов составляет от 70 до 78 т.п.н.. Б этих пределах, по-видимому, находится размер повторяющейся послодоватсдь-ности в геноме мутанта 0322. Наличие амплификации не коррелирует с уровнем устойчивости к хлорамфениколу.

Таким образом, у продуцента эритромицина з.егу№гаеа идентифицированы амплифицарующиеся последовательности ДНК. Однако, корреляции между их появлением и мутационными изменениями детергатанта(о'е) устойчивости к хлорамфеникоду не установлено.

4. Получение и характеристика мутантов э.егуъьгаеа, устойчивых к таосгрептону ( ТзгГ ).

Отбор спонтанных 'гэг1'-мутантов итамма 5 веди на агаризованной среде СР-6 с тиост^ептоном в концентрации 2,5 мкг/мл. Они возникали с частотой 5,1*10"'. Спонтанная частота возникновения -мутантов штамма 2338 на среде с 2Д5 мкг/мл антибиотика составляла 1,9*10"; а штамма ВТСС 2407 - 2,6-Ю-0, что на 1-2 порядка выше, чем у итамма 5. Кроме того, эти штаммы способны спонтанно образовывать Тзгг-мутанты, устойчивые к более высоким концентрациям тиострептона (5 и 10 мкг/мл).

Использование для индукции мутаций тиострептонустойчивости. натрозогуанидина ели протопластированвд клеток с доследующей их регенерацией увеличивало частоту образования мутантов у штамма 5 примерно на порядок и дозволяло выделять мутанты, устойчивые к 5 и 10 мкг/мл тиострептона. Более сильный эффект вызывала обработка клеток штамма 5 НГ с поолодушкм подращиванием в теченва-18 часов в жидкой ерзде 2 .

Пра тестировании ^енотшгаческих признаков установлено', что коллекция первичных Тег1" -мутантов очень гетерогенна как по уровню устойчивости к хлорамфениколу, так и по характеру роста. Большинство мутантов (68,7$) были способны расти в среде, содержащей 20 мкг/ мл тиострептона. 18,8$ мутантов были устойчивы к 5-10 мкг/мл, а 12,5$ - к 2,5 ляг/мл тиострептона. При посевах штрихом на среду ОР-6, содержащую тиострептон, на седьмые сутки наблюдалось появление отдальннх больших колоний на штрихе, а в последующе дни возни-ката еще и мелкие колонии, число которых возрастало до 20 суток роста и зависело от концентрации тиострептона в среде. Показано, что 9 вариантов из 52 изученных имеют фенотип термочувствительное-ти. Признак термочувствительности реке проявлялся у высокоустойчивых ?згг -мутантов (5,7$) и часто - у низкоустойчивых (57,1$). 5,8$ выделенных наш мутантов характеризовались отсутствием воздушного мицелия, а 26,9$ - -:е1 - фенотипом. Все эти мутанты относятся к числу низко-исреднеустойчивых. У Т£5гГ -мутантов наряду о этими произошли изменения и в спектре устойчивости к другим антибиотикам.

Таким образом, мутации тиострептонустойчивости , как и rif _ мутации, оказывают плейотропное Елияние на ряд морфологических признаков и приводят к множественным изменениям в устойчивости к другим антибиотикам, Ыутанты, у которых произошли множественные изменения морфологических признаков, особенно интересны, поскольку они оход-ны с reí С мутантами, описанными ранее у актиномицетов и Bacillus subtilis / Ochi , 1990/.

Идентифицирована нестабильность признака устойчивости к тиост-рептону у штамма s.erythraea 5. Показано, что часть клонов, выросшая на среде с тиострептоном, состоит из трех групп (рис. 4): ■I) группа А - стабильные Тзгг_мутанты (0,8$); 2) группа В - нестабильные Tsr1— мутанты (94,8$), которые способны снова раощеп-ляться с образованием колоний о различными морфологическими признаками; 3) груша С - клены, которые вырастают при первом посеве на среду с тиострептоном, но при повторном посеве на те яе среды не растут (4,4$). Показано, что нестабильные Тзгг-мутанты возникают и у штаммов HRRI2338 (TU) и ВТСС 2407 (Т20).

Были провздены эксперименты по количественной оценке гетерогенности размеров колоний нестабильного штамма Т523 (группа В), образовавшихся на среде СР-5 с 5 мкг/мл тиострептона. Оказалось, что 30-38$ выживших клонов образовывали крупные колонии на 7 сутки.

Штамм 6

Обработка НГ, посев на СР - 6 с У тпоогрепгоном {5 жт/нл)

Т$Гг~ КАОНЫ

ПоЕгорннй переев на СР-6

тиострептонш

94,8% ^

Тггг/ста&ммш/ Тзгг/„еста?шшыг/ Таг* «лги», мутанты щюанти 'Уклоны

Рас. 4 Расцепление по признаку тиострептсн-устойчиЕости у Тзгг-вдтантов штамма З.егуЬЪгаеа.

В течение последующих 10 суток появлялись колонии мелких размеров (62-70% от.общего числа колоний). Вышшгае га ерз ~ де с таострептоноы клоны, образующие колонии крупных и мел;их таз-мэров, составляет в суше около 1% высеяншх клеток. Такт! образом, значительное большинство (о!?оло 99Я популяции клеток нестабильного мутанта Т523 составляет Тзг3-клетки.

Мы обнаружили также, что' среди клонов нестабильного штамма

О т»

Т523счаатотой1,8-10 способны возникать стабильные Тэг-мутанты, что в 2 раза вше, чем среди первичных тиострептонустойчивнх клонов,

Как видно из гистограмм (рис. 5) в популяции спонтаншх мутантов в сравнении с естественной популяцией исходной культурп значительно сукена изменчивость уровня антибиотикообразошния ( су =26,7$). В то же время обнарукено, что степень вариации уменьшилась за счет снижения числа плюс-вариантов (20,0- 3,7%). В популя цаях ицдупдрованшх НГ Тзг^ч^тактсв, отобраншх из сред с 2,5 ыкг/ыл и 5,0 мкг/мл таострептона, снижается число плюс-вариантов по сравнению со спонтанной популяцией, а увеличивается число низкоакти нше и минус-вариантов.

Таким образом, более эффективной следует признать селзкщш спонтанных Тзг-мутактов, поскольку при этом наблюдается максимум вас ок^ о активных шпос-эарвантов.

у

'о

во-

4020-О

- 19 -

М- 2о'

-гН

4020-О

2

40200

3

40 20 ^ О

40 А

20-О

—г-И

—1—

15

—I—

19

О

23

2?

Рис. 5. Изменчивость признака антабиотикообразования 7

спонтанных и индуцированных НГ ^г^ыутантов штамма

3. егу-Шгаеа.

По оси ординат - количество вариантов (.%), по оси абсцисс - активность антибиотик ообразования (индекс продуктивности). I - контроль; 2 - обработка НГ;

3 - отбор на 2,5 мкг/мл таострептона; Обработка НГ-»

4 - отбор на 2,5 .таг/мл тзострепте;^; 5 - отбор на

5 к;г/ч-; етострептойа.

/

5

Проведено изучение антибиотической активности 55 —-гигантев в условиях глубинного культивирования. Среди них были стабильными Tsrr -мутанты, продуцирующие эритромицин на уровне доходного штамма и выше. У 34,5/» изученных атаммов уровень антибиотической активности составлял I0Q-I40& до сравнению с контролем. Однако, после трех пересевоЕ в неоалеигавных условиях антибиотическая активность этих мутантов снижалась до 60-80$ по сравнении с исходным штаммом 5. Посев мутанта Т523 на среда с тиострелтоном (от 2,5 до 10 мкг/мл) приводит к значительному увеличению среднего значения антибиотической активности (М), возрастает число плюо-Еаряантов и исчезают мину с-варианты.

Таким образом, нестабильность высокого уровня антибиотической активности у ^si-1* -мутантов тесно связана с нестабильностью признака тиострептонрезистеатности у них. Для поддержания высокого уровня активности таких штаммов требуется их выращивание в присутствии тиострептона или периодический рассев на среды с этим антибиотиком.

5. Локализация детерминантов устойчивости к рифаыпшдяу И хлорамфевиколу у S.erythraea.

Важное значение для установления закономерностей генетическог

КОНТРОЛЯ признаков УСТОЙЧИВОСТИ К аНТИбИОТИКаМ У S.erythraea

имеет определение локализации генов, детерминирующих эти признаки.

Локализацию детерминантов резистентности к рифамшщину и хлор фениколу проводила в скрещиваниях мавд устойчивыми и чувствительк ми к этим антибиотикам производными s.erythraea 1345, 2407 и 460с Один из Hif1' -мутантов в 5.1 характеризуется высоки,! уровнем устойчивости к ри^ампицину (300 ыкг/мл), a R 8.2 - средним уроввэ! (100 мкг/мл). Cnir -мутант штамма 2407, обозначенный как В45, также характеризовался высоким уровнем резистентности к хлораыфенз колу (40 мкг/мл).

При локализации детерминантов устойчивости к рифампицину мы использовали данные о взаимном расположении маркеров ауксотрофнос на генетической карте штамма ВГСС2, полученные Тодоровым с соав' / Todorov , 1984/. Данные о градиенте наследования рекомбинантами маркеров ауксотрофности ( leu-I, ura-I.met _1э phe -I И trp-3) полученные в наших скрещиваниях, хорошо согласуются о их локализа цаей, установленной этими авторами. Однако, анализ рекомбишнтов, проведенный наш, показал, что более вероятным являетоя располоке ние маркера «rv -I мевду локусами lcu -I в -X (по градиенту аллелей), а не мету net-I и ura-I, как это показано Тодоровым

00ЭЕТ. / l'odorov , 1984/.

Отличительным особенностями проанализированных скрещиваний являются: низкая частота возникновения гаплоидных рекомбинантов на селективных средах (от Г.б'Ю-^ до 7,5'М-5) и наличие градиента аллель-ных отношений маркеров, наблюдаемого при анализе гетотипов рекомбинантов .

Результаты скрещиваний между штаммами I34S и " 8.2 приведены на рис. 6. Аллельные состояния маркера "rif" обозначены как rif + (чувстЕитатьность к рцрампвдину) и rif (устойчивость к антибиотику).

При использовании в качестве селективных маркеров leu -I+/phe было выделено и проанализировано 226 гаплоидных рекомбиштов, которые отнесены к 12 генотипическим классам. Среди рекомбинантов наблюдается градиент аллельшх отношений анализируемых маркеров. Большинство реномбинатов является резистентными к рпьампицину, тс есть унаследовали R -8 маркер штамма R 8.2. Исходя из градиента аллельннх отношений анализируемых маркеров (рис. 6) маркер rif -в можно расположить на хромосоме s.erythraea в двух позициях между маркерами ura-I и met-I и меяду маркерами р'пе-I и trn -3, Однако, локализация этого маркера на хромосоме мегщу маркерам phe_l и trp-з" маловероятна. При такой локализации 25 рекомбинантов двух классов с генотипами rcet -I rif -8 и устойчивых к риФампщину прото-троФов, составляющих 11,1% всех полученных в скрещивании рекомбинантов, могут возникать только за счет множественных кроссинговеров. Рекомбинанты с такими гено'типаш при локализации маркера rif -8 мезвд лакусама ura -I и net -I могли бы возникать за счет двойных кроссинговеров. Множественные кроооинговеры необходимы и для возникновения 15 рекомбинантов (6,6$) с генотипами net -I tr? -3 rif -8+ и ura -I trp _з rif-8, если маркер rif _8 локализуется в районе генетической карты между маркерами ura-I и mst-I. Исходя из принципа минимума множественных кроссинговеров, требуе!.шх .для образования рекомбинантов, можно сделать еывод о том, что более вероятна локализация маркера rif -3 на хромосоме штамма ¿.ervthraeaв районе, ограниченном локу сами ura —I я net Л (рпс. 6).

Этот вывод подтверждается данннет селективного анализа с использованием г кзчестве селектируемых маркеров ira-I и oet -I. Пря этом бияо проанализировано ¿4 рекомбинанта, которые отнесены к .14 класса«. Кая и р претаяупеи случае исходя :;з градиента «лледша сткглат "-.аркерсв я пришла кянлкума таспсрстзвяшл тз-моиетозо^ов

локализации мутации rif _8 Е районе хромосомы между каркераш ига-и raet-I следует считать предпочтительной. Показано, что судеотЕу-ет корреляция между наследованием локуса met -I и кутании rif -8, что свидетельствует об их сцепленности.

Скрещивания между штаммами 5.1 ( Ura-I leu -I rif -5) и 24С ( net -I trp-3 phe-i rif_5+) ¿щщ. проведены .для локализации маркера rif -5. Рассев потомства от скрещиваний производили на три варианта селективных сред (селекция по следующим парам маркеров): a) leu -I И trp -3; б) leu -I и Phe -I; В) leu -I к -I).

При этом выделены и проанализированы соответственно 76,81 и 48 ре-коыбивантов.

Учитывая принцип шаимадьного числа множественных кроссингове-ров, локализация маркера rií -5 медду маркерами u^a _1 д. net _i в этом случае также более вероятна. На рис. 6 приведены данные акали; сегрегации неселектируемых аллелей в .данном окрепивании. Показано, что существует корреляция между сегрегацией ига -I и мутацией rif • В то же время такая корреляция отсутствует в случае сегрегации кар керов raet-I n rif

Для локализации детерминанта устойчивости к хдорамфениколу у s.erythraea проведен ряд скрещиваний с использованием ь качестве р дательских штаммов КГСС 4608 и Сга1Г -мутантаВ45.

На рас. 6 представлены результаты селективного анализа такого скрещивания. Лллельные состояния шркера cmi обозначены как cmi -4 (чувотштвльность к хдорамфениколу) и сш1-4 (уотойчивооть к хло рамфеникоду). На селективных средах (селектируемые маркера leu-I phe-I, leu -I и trp-3, leu_X Е net_X(Ura_l Z met _1) выделен соответственно 169, 49, 52 и 200 рекомбинантов.

На основании критерия минимального числа множественных к рос си говеров кар;ер cal-4 не может быть локализован медду маркерами leu-I и trp-3 или же ыегду phe-I и trP -3, а только мезду ига-1 и met -I. Этот вывод основан на тек, что в случае такого его разме ния дая образования 30 (селекция leu-I/ phe-I), 10 (селекция leu met -I) и 38'(селекция ига-I/met -I) рекоыбааантов доданы произс ти множественные кроссинговэры пра локализации мутации ся1_4 медг маркервыи ieu_i и trp -3 или phe-I и trp -3 в двойные - при раз?, щешш ее ыеаду шга -I и met -I.

Таким образом, результаты проанализированных скрещиваний пок; зывают, что обе мутации eral-4, rif-8 z rif_5 наследуется как

/зэ

met

met

met

_Sfi.tfmct цга*цга

rif-Bt79 8 52 35

rif-3 59 50 108 31

г 0,5 -0,2

X2 52,6 8,3

rif-518 3I38II rif-5 29 3 13 19 г -6,5 0,4 X2 23,1 11,3

cni-'«>71 8 65 itf cml-4- 82 8 84 6

r -0,02 0,1

X2 0,06 2,1

Рис. 6 Возможная локачизавдй детерминантов устойчивости

штаммаs.erythraeа к рифампицину и хлорал¡фекиколу з скрещиваниях: а) 1345 rif -8+ х к 8.2 rif -8; б) Е 5.1 xif -5 х 2407 rif-5+; в) В 45 cal-4 х 4608 cnl -4+.

хромосомное маркера и локализуются в одной области хромосома s.erythraea.ограниченной локусами ига -Г и met -I. Получен® е данкке свидетельствувт о сцепленностп маркеров rif -8 и met -I, а так.7.е rif -5 и ига -I. Эти данные указывают на то, что rif -8 и rif -5 - мутации возникла, вероятно, в различных генах, о чем свидетельствуют и различая в их фенотдплчесяом проявлении, йута-ция cmi—4 не сцеплена ки с одам маркером ауксотрсфкостз, ш с кутацпяю. rif -5 s rif -8.

ВЫВОДЫ.

1. Проведен сравнительный анализ штаммов s.crythraea . различающихся между собой по уровню антибиотической активности, в отношении признаков устойчивости к антибиотикам. Показано, что eco изученные птаммы, в том числе и их Kry ~ - производные, обладают сходными спектра!,я устойчивости к антибиотикам, но различаются по уровню устойчивости к ркрампшину, стрептомицину, хяорамфеши олу, тио-стрептону и тетрациклину.

2. Разработаны подходы к селекции адгантов различных штаммов s.erythraca , устойчивых к ркфамдшияу, хлорамфениколу и тпостреп-тону. Показано, что некоторые классы rifr , cmir , ter1- ~ '¿Ута-цим оказывают плейотропный эгфект, проявляющийся в изменении спектра устойчивости к другим антибиотикам, потере способности образовывать воздушный мицелий и маланин, терлочу ветви тел ьности роста мутантов ;

3. Показана перспективность ;елекции выоокоактишых штшыов-продуцентов эритромицина среда индуцированных HT Rifr-i.tyTaHToE, устойчивых к Ю мкг/мл рафамшщина, спонтанных 'Гзг1' -мутантов, устойчивых к 2,5 мкг/мл тиострептока и различных классов индуцированных НЭМ Сп1г-мутантов.

4. Получена коллекция Riir, Cnir - и тзг" -мутантов, обладающих повышенной способностью к образованию эритромицина и стабильностью, перспективных дая создайся на их основе промышленных продуцентов этого антибиотика.

5. Установлено, что для мутаций резистентности a.erythraea к хлоращюяиколу и тиоетрептону характерна генетическая нестабильном] проявляющаяся в потере с высокой ; частотой признаков устойчивости

и в появлшии спонтанных Cmlr-мутантов с повышенной устойчивостью при ступенчатой селекции на средах с повышающимися концентрациями антибиотика.

6. Обнаружено, что генетическая нестабильность признаков устойчивости к хлорамйениколу и тиоетрептону коррелирует с нестабильностью высокого уровня продукции эритромицина Сш1г и ïsrr -мутантами. Разработанны методы, стабилизации повышенной антибиотической активности этих мутантов.

7.'Продемонстрирована способность экзогенного хлорамфеникода индувдровать устойчивость штаммов s.orythraea» аыиноишкозидным антибиотикам.

8. В геноме хлораифениколоустойчивых мутантов s.erythraea обнаружены дво различные а'/ллифицзрушиеоя последовательности с размерам около 18 т.п.н. и 70-78 т.п.н.

Э. В экспериментах по генетическому картированию показано наличие двух различных детерминантов устойчивости к рифамшщину. Они локализуются в районе хромосомы з.егу^гаеамедду маркерами пга-±и net

10. Детерминант устойчив оста у. erythraeaK хлорамфеииколу локализуется па хромосоме медау мазерами ига -I и net -I и не сцеплен

с каа.

Список работ, опубликованшх по теме диссертации:

1. Hastasiak I., Jedorenko V.A. , iiirichenko п. , JJanilenko V., Mutant formation and. characteristicsofthe rifampicin-resistance mutants in Streptcmyces erythraeus// Genetics and product formation

in bL ьог.усеу апд Bacillus: Abstracts, Symp. 4-9 Kay, 198?. -

Veiaar, (И)R, 198?. P. 19.

2. Настасяк И.H., Ходу реки ft А. Б., Босак Н.П., Кириченко Н.В. Множественная устойчивость к антибиотикам у Streptomycee erythraea // Совреггешше проблемы антибиотлкорезистентности: Тез. докл. Все-сст:2. семпн. - Москва, 1988, С 48.

3. Настасяк И.Н., Зедо'реняо В.А., Кдрячепко Н.В., Данилекко В.Н. Получение л характеристика ряфашшшноустойчивых мутантов у штамма

Streptonyces erythraeus // АиТИбНОТИКИ И ХЕМИОТераПИЯ, - 1990. т.35, л 12. - С. II-I3.

4. Настасяк И.Н., Навашин С.М., Федорекко В.А., Миронов В.А., Кириченко Н.В., Данилзяко В.Н. Генетический и биохимический контроль биосинтеза какролдднж антибиотиков // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. - Т.35, tf 12. - G. 34-38.

5. Настасяк И.Н., Зедорошю В.А., Кириченко Н.В., Зазоротаая С.А., Басглзя Л.'1. ГепсткчссзиЯ контроль биосинтеза эратроидцава гпаакеа stiwptoay. s s er»t:.r-teus // Too. дорл. 7 ма Клциспалкл кс~3. ас произв. з прис:'. пс оптт'бистшктя 20-22,09.1990 т. - Раг.грзд, 1£9Э, с.г:,

IT- 'J1T3 П'Г? П* ')Л 'TQ Q 3», '2,4 р >'JI ; Г- -г Q . !-*J ----

Streptoayces erythraeus'/ Тез. доял. 7 ma Национална нснф. по произв. и прилок. на антибитшдаге 20-22.09.1990, С.21.

7. Kastasiak Т.Н., ?edor-enko V.A., Kutants of Saccharopcly-spora erythraea résistants to thiostrepton // Abstr. 8 th Jnt. Symp.on Eialogy of Action. - Madison, USA., Ï99I, P. I-I54.

8. Бастасяк И.H., Яаворотная С.А., Фуре А.Р., Василия Л.И., Кириченко Н.В., Коновалова Т.В., Федоренко В.О. Создание реком-бинантных шташов-продуцентов антибиотика эритромицина // Генная и клеточная инженерия: Тез.докл. I Бсес. планово-отчетная конф., ноябрь 1990 г., Пущино-на-Оке. - Москва, 1991, С. 163-164.

Тир. 100__Подписано в печать 14.01.92

Зак. 15

¡ДТП "Атомполиграфсервис"