Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Т-клеточная клональность в диагностике лимфопролиферативных заболеваний

На правах рукописи

Сидорова Юлия Владимировна

Т-клеточная клональность в диагностике лимфопролиферативных заболеваний

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении -Гематологическом научном центре Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

к.б.н. Судариков Андрей Борисович к.м.н. Никитин Евгений Александрович Официальные оппоненты:

д.м.н. Туркина Анна Григорьевна

д.б.н., член-корр. РАН, проф. Габибов Александр Габибович Ведущее учреждение:

Научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи

Зашита состоится "_"_2004 г. в "_" часов на заседании

диссертационного совета Д 001.042.01 в Гематологическом научном центре РАМН, по адресу 125167, Москва, Новозыковский проезд, д.4а

Автореферат разослан "_"_2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Реук В.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Традиционные методы диагностики: цитология, гистология, иммунофенотипирование и иммуногистохимия во многих случаях не позволяют провести дифференциальный диагноз между опухолевой и реактивной Т-клеточной пролиферацией. Т-клеточные опухоли часто протекают в виде микропролиферативных процессов и при небольшой массе опухоли и скорости роста могут проходить под маской апластических синдромов, аутоиммунных цитопений, гиперэозинофилии. Т-клеточный лейкоз из больших гранулированных лимфоцитов нередко развивается на фоне ревматоидного артрита, системной красной волчанки, системной склеродермии. Клинические проявления лимфомы (увеличение лимфоузлов, селезенки, развитие цитопений) бывают трудно отличимы от проявлений коллагеноза. В дерматологической практике введен термин псевдолимфома кожи, - это группа реактивных дерматозов, характеризующаяся клиническим, гистологическим, часто иммуногистохимическим сходством с Т-клеточной лимфомой кожи, но отличающаяся доброкачественным течением с тенденцией к спонтанному регрессу. Таким образом, многие заболевания с реактивным лимфопролиферативным компонентом требуют дифференциального диагноза с Т-клеточными лимфомами и применения методов, подтверждающих наличие опухолевых лимфоцитов в тканях. Иммунофенотипически можно выявить патологическую популяцию Т-клеток, если опухолевые Т-клетки имеют аберрантный фенотип, т.е. утрату одного или нескольких из общих Т-клеточных маркеров, а также в случаях, когда фенотип опухолевых Т-клеток соответствует ранним, внутритимическим стадиям дифференцировки.

Одним из вспомогательных методов, подтверждающих наличие опухоли, является определение клональности. В-клеточная клональность традиционно оценивается по рестрикции легкой цепи, то есть по

рсс. ;'\ч:;онадьиая

• Г Г КЛ

преобладанию в испытуемой популяции клеток, экспрессирующих каппа или лямбда цепь иммуноглобулина. В случае Т-клеточных опухолей такого иммунофенотипического маркера клональности нет, и Т-клеточную клональность можно оценить только с помощью молекулярных методов. Методы молекулярной диагностики Т-клеточной клональности основаны на наличии одинаково перестроенных генов вариабельного региона Т-клеточных рецепторов (TCR) в опухолевых Т-лимфоцитах. Появление клона Т-лимфоцитов при опухоли сопровождается появлением популяции клеток с одинаковой перестройкой генов TCR. Однако, наличие клональности не обязательно означает наличие опухоли. В ходе нормального иммунного ответа появляется множество клонов Т-клеток, но размеры этих клонов, как правило, не велики и не достигают пределов чувствительности традиционных молекулярных методов. Исключения из этого правила возможны. Так, показано, что в острой фазе инфекционного мононуклеоза до 10% CD8+ клеток могут быть моноклональны. Однако эта пролиферация не имеет ничего общего с опухолью.

Т-клеточная клональность традиционно оценивается с помощью двух методов - Саузерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции. Саузерн-блоттинг — трудоемкий метод, требующий большого количества геномной ДНК высокого качества и радиоактивной метки. В связи с этим Саузерн-блоттинг редко применяется для рутинной диагностики и в настоящее время чаще используется как контрольный метод при отработке других молекулярных методов. Наибольшее распространение для оценки Т-клеточной клональности получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая широко используется в клинической практике с начала 90-х годов. Ранее в нашей стране молекулярные методы определения Т-клеточной клональности не использовались для диагностики зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний.

Актуальность данной работы обусловлена распространенностью заболеваний, требующих дифференциального диагноза с Т-клеточными лимфомами, востребованностью в клинике метода определения Т-клеточной клональности, и при этом отсутствием опыта его применения и диагностических результатов.

Цель

Оценить возможности метода определения Т-клеточной клональности при помощи ПЦР в диагностике Т-клеточных опухолей.

Задачи

1) Определить чувствительность метода, т.е. минимальную примесь моноклональных клеток, при которой выявляется Т-клеточная клональность методом

2) Провести исследование Т-клеточной клональности методом РСК-БЗСР-ТСЯу при Т-клеточных лимфомах, В-клеточных лимфомах и прочих гемобластозах, при различных неопухолевых заболеваниях и гематологических синдромах. Определить специфичность метода и ограничения в его использовании.

3) Сформулировать показания к определению Т-клеточной клональности методом ПЦР.

Научная новизна и практическая ценность исследования

Доказана эффективность молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности, выявлены оптимальные условия проведения метода, ограничения в его использовании, сформулированы критерии интерпретации результатов и практические рекомендации для врачей. Метод апробирован на большом количестве материала, в работу включены не только пациенты с опухолевыми лимфопролиферативными заболеваниями Т- и В- клеточной природы, но также обширная группа сравнения - пациенты с реактивными (неопухолевыми) заболеваниями и гематологическими синдромами, здоровые люди. Показана возможность

использования метода полимеразной цепной реакции для проведения дифференциального диагноза между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями, определения принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточной линии, диагностики лимфобластных лейкозов, контроля ремиссии Т-клеточных опухолей. Полученные данные свидетельствуют о необходимости включения метода определения Т-клеточной клональности в протоколы обследования пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями.

Апробация работы

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии «Кроветворение в норме и патологии, молекулярная биология и биотехнология» Гематологического научного центра РАМН с участием членов Ученого Совета от 27.05.2004 г.

Внедрение в практику

Метод определения Т-клеточной клональности при помощи полимеразной цепной реакции внедрен в практику и вошел в протоколы обследования больных в Гематологическом Научном Центре РАМН (ГНЦ РАМН). Метод был также востребован в других клиниках г. Москвы.

Материалы работы доложены на конференции Гематологического Научного Центра РАМН (Москва, апрель 2002 года).

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в российских журналах, 1 статья принята к публикации.

Объем и структура работы

Материалы диссертации изложены на 95 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, практических рекомендаций для врачей, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы содержит 133 наименования. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и содержит 17 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клинический материал и методы исследования.

Пациенты

В работу включено 290 пациентов с диагнозами: Т-клеточные опухоли (п-90), В-клеточные опухоли (п-27), лимфогранулематоз (п-20), острые лейкозы и недифференцированные лимфосаркомы (п-З), различные неопухолевые заболевания и гематологические синдромы (п-150) и 20 здоровых доноров. Средний возраст здоровых доноров составил 31 год (от 20 до 44). Средний возраст пациентов составил 42 года (от 4 до 78), 146 мужчин и 144 женщины, соотношение полов примерно 1:1. В основном в исследовании фигурировали взрослые пациенты старше 16 лет, за исключением пациентов с инфекционным мононуклеозом, ангинами, ОРВИ (средний возраст 8 лет, от 4 до 14), и пациентов с Т-ОЛЛ (средний возраст 4 года, от 2 до 7). Было выполнено 397 исследований различных тканей и органов:, периферической крови (п-252), костного мозга (п-41), лимфатических узлов (п-48), селезенки (п-12), кожи (п-24), опухолей средостения (п-14), желудка (п-1), тонкой кишки (п-1), легких (п-1), миндалины (п-1), плевральной жидкости (п-2). Большинство пациентов с опухолями лимфатической системы, различными гематологическими синдромами наблюдались в отделениях ГНЦ РАМН. Наблюдение пациентов проводилось, совместно с Кравченко С.К., Меликян А.Л., Виноградовой Ю.Е., Пивником А.В. Кровь от здоровых доноров была получена на СПК ГНЦ РАМН. Пациенты с Т-ОЛЛ наблюдались в РДКБ. Пациенты с инфекционным мононуклеозом и ОРВИ наблюдались в отделении инфекционного мононуклеоза 1 Инфекционной Клинической Больницы г. Москвы. Пациенты с ревматоидным артритом и сопутствующими гематологическими нарушениями наблюдались в ревматологическом центре, консультировались и были обследованы в поликлиническом отделении Боткинской больницы. Пациенты с

различными заболеваниями и псевдолимфомами кожи наблюдались совместно с д.м.н. Олисовой О.Ю. (ММА им. Сеченова).

Контроли

В качестве положительного (клонального) контроля использовали клеточную линию Jurkat (Т-ОЛЛ), имеющую биаллельную перестройку TCRy. В качестве поликлонального контроля использовали мононуклеары периферической крови здоровых доноров.

Для определения Т-клеточной клональности использовался метод PCR-SSCP-TCRy (полимеразная цепная реакция с последующим анализом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов по реарранжировкам гамма-цепи Т-клеточного рецептора).

ДНК выделяли из мононуклеаров периферической крови или измельченной ткани. Для ПЦР применяли праймеры к V и J генам гамма-цепи Т-клеточного рецептора (TCRy). ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл в буфере, включавшем 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 200 mkM dNTP, 2mM MgC12, 1,5 Ед TAQ-полимеразы и 40 pmol каждого праймера. В одну реакцию брали 500-1000 нг ДНК. В случае каждого исследования проводили 4 реакции. В каждую реакцию брали смесь J праймеров, и Vyl-8, Vy9, VylO и Vyll праймеры, соответственно. Условия ПЦР: 30 циклов - 94° (30 сек), 55° (ЗОсек), 72° (30 сек). Результаты реакции выявляли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Клональный характер перестройки устанавливали, анализируя конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов ДНК (single strand conformational polymorphism — SSCP). Данный метод основан на предварительном денатурировании (разделении) двухцепочечных молекул ДНК, и последующего анализа одноцепочечных фрагментов в полиакриламидном геле. Одноцепочечные молекулы ДНК в полиакриламидном геле приобретают индивидуальную конформацию (форму), образуя "шпильки" и участки спаренных нуклеотидов, что

позволяет разделить даже одинаковые по длине молекулы в зависимости от их нуклеотидного состава В работе использовали модификацию метода LIS-SSCP, проводя денатурацию ДНК в растворе с низкой ионной силой 5 мкл ПНР продукта разводили в 15 мкл LIS-solution (10% раствор сахарозы + 0,01% бромфеноловый синий), полученную смесь инкубировали в течение 5 минут при температуре 99°, а затем быстро охлаждали во льду до 0° в течении 2-х минут и наносили на гель Электрофорез проводили в 8% полиакриламидном геле (соотношение акриламид/бисакриламид - 39/1) размером 20 на 20 см в 0,5х ТВЕ (Tns 45мМ, Bone acid 45мМ, EDTA 1мМ) буфере при 50 V в течение 18 часов при 4°С Гель окрашивали серебром (Рис 1)

Рисунок 1 Результат полиакриламидного гечъ-эяектрофореза, анализа конфориационного полиморфизма одноцепочечныхфрагментов ДНК(single strandconformationalpolymorphism — SSCP)_

Для определения чувствительности метода Т-клетки из мононуклеаров периферической крови выделяли с помощью магнитных носителей, коньюгированных с антителами к CD3 ^у^спу Biotec), на колонках MS (работа проводилась на базе Кардиологического научного центра РАМН, совместно с Пекло М, Власик Т Н)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Чувствительность метода (нижний порог выявляемости

моноклональных клеток)

Минимальное количество ДНК клеточной линии 1игка1 и

поликлональной ДНК, выделенной Т-клеток периферической крови

здорового донора, требуемое для успешной ПЦР составило 20 нг на

реакцию, что косвенно соответствует 4000-6000 клеток. Для определения

чувствительности метода РСЯ-ББСР-ТСКу ДНК клеточной линии Тшка (Т-

ОЛЛ) смешивали в разных пропорциях с ДНК Т-клеток периферической

крови здорового донора Чувствительность метода

составила 10-15%, те. клональность выявляется при наличии 10-15%

моноклональных клеток от общего количества Т-клеток в образце (Рис. 2)

Рисунок 2. Чувствительность РСЯ-ББСР-ТСКу метода. В процентах обозначена примесь клоналъных клеток в образце. Чувствительность составила 10-15%, т е. клональность выявляется при наличии 10-15% клоналъныхклетокот общего количества Т-клетоквобразцеа) продукты амплификации спраймерол¥у1-8, б)продуктыамплификацииспраймером Уу11.

Критерии интерпретации результатов PCR-SSCP-TCRy

Было выделено четыре варианта результатов исследования, которые соответствуют той или иной чувствительности РСИ-ББСР-ТСКу (Табл. 1).

Таблица 1. Вариантырезультатов исследова н и nPCR-SSCP-TCRy.

Вариант Чувствительность Характерная картина

poly <10% Поликлональный результат - в соответствующих дорожках полиакриламидного геля полосы отсутствовали, т.е. наблюдался поликлональный фон в виде размытого мазка. Характерен для реактивных процессов.

oligo <10% Олигоклональный результат - картине наблюдается множество полос во всех дорожках. Характерен для реактивных процессов.

monolO-20% 10-20% Сомнительный моноклональный 10-20% результат - имеются две отчетливые полосы, которые не четко доминируют на поликлональном фоне. Характерен для - Т-клеточных опухолей с небольшим (10-20% от общего количества Т-клеток) количеством опухолевых клеток в образце, и реактивных процессов

топо>20% >20% Моноклональный >20% результат - видны две (четыре) отчетливые полосы, доминирующие на общем фоне. Характерен для Т-клеточных опухолей.

Секвенирование ПЦР продуктов

Специфичность получаемых ПЦР продуктов была подтверждена секвенированием, т.е. определением их нуклеотидной последовательности. Во всех случаях последовательность ПЦР-продуктов соответствовала реарранжировкам ТС11у локуса и была уникальна. Длина CDR3 участка в исследованных образцах составила 13-25 нуклеотидов, в среднем различия

по длине составили 4 нуклеотида (Таблица 2).

Таблица 2. ДНК последовательности области соединения V и J генов, полученные врезультате секвенирования._

Сегменты, участвующие а перестройке Участок V сегмента Область соединения (CDR3) Участок J сегмента

УЗ- Л/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGACGGGCCGA TATTATAAGAAACTCT

У2-Л/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGACCGGCGGAG TTATAAGAAACTCT

V3- J1/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGACAGGCCACCCA TATTATAAGAAACTCT

V10-J1/2 GCCGTTTACTACTGT GCTGCGTGGACTAGAAGT ATAAGAAACTCT

V2-J1/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGACGGGTATTGAATA AGAAACTCT

V5- J1/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGTA GAATTATTATAAGAAACTCT

V2-J1/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGACGGGCCG ATTATAAGAAACTCT

V10-J1/2 GCCGTTTACTACTGT GCTGCGTGGGTTATATAA GAAACTCT

V2-J1/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGAGCCGTTCA AACTCT

V2-J1/2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGACGGGTATTGAATA AGAAACTCT

V2-Jp2 GGGGTCTATTACTGT GCCACCTGGGACGGCGT TAGTGATTGGATCAAGACGT

V4-Jpl GGAGTCTATTACTGT GCCACCTGGGATACCACTGGT TGGTTCAAGAT

V4-Jpl GGAGTCTATTACTGT GCCACCT GGGGCCTCGGAG ACCACTGGTTGGTTCAAGAT

Частота использования V генов 1, 2, 3 и 4 семейства в клональных перестройках генов Т-клеточного рецептора

Исследование показало, что чаще в клональных реарранжировках участвовали V гены 1 семейства (V2,V3,V4,V5,V7,V8) - 61,3%, на V гены 2, 3, 4 семейства (V9, V10 и VII) приходилось 16,1%, 17,5% и 5,1% реарранжировок, соответственно. У 15 из 83 пациентов (18%) в клональных реарранжировках участвовали только V гены 2, 3, 4 семейства, поэтому мы сочли не рациональным отказываться от их исследования, что значительно снизило бы выявляемость Т-клеточной клональности при Т-клеточных опухолях.

Определение Т-клеточной клональности здоровых доноров и Т-клеточных линий методом PCR-SSCP-TCRy

Нами была протестирована периферическая кровь 20 здоровых доноров и Т-клеточных линий: Hut 102, МТ-4, MOLT, Hut 78, Jurkat. У всех протестированных Т-клеточных линий была найдена клональная реарранжировка тогда как у всех здоровых доноров картина крови

поликлональная.

Выявляемость клональности методом PCR-SSCP-TCRY при Т-клеточных лимфомах и лейкозах. Контроль ремиссии и диагностика рецидивов методом PCR-SSCP-TCRv.

Всего было обследовано 90 пациентов с Т-клеточными опухолями (Таблица 3).

Таблица 3. Результаты определения Т-клеточной клональностиметодом

приТ-клеточныхлимфомахилейкозах.

РСЯ^СР-ТСЯу ... Т+ Т- Всего

т-олл 4 1 5

Т-лимфобластная лимфома 4 - 4

БГЛ (Т/1ЧК- клеточный тип) 10 1 11

БГЛ (Т-клеточный тип) 16 - 16

Грибовидный микоз 7 - 7

Синдром Сезари 6 - 6

Т-клсточная лимфома кожи 2 - 2

Т-клеточнав лимфосаркома кожи Сй8+ 1 - 1

Гепатолиенальная гамма-дельта лимфома 1 - 1

Периферическая Т-клеточная лимфома СБ4+ 11 3 14

Периферическая Т-клеточная лимфома (лимфома Леннерта) 2 - 2

Периферическая Т-клеточная лимфома СБ8+ 1 1 2

Т-пролимфоцитарный лейкоз 5 - 5

Т-клеточная лимфома СБ4+ с поражением костного мозга 3 - 3

Т-клеточная лимфома желудка 1 - 1

Т-клеточная опухоль средостения - 2 2

Т-крупноклеточная лимфосаркома СОЗО-АЬК-СП8+ 2 - 2

Т-крупноклеточная анаплазированная лимфома СОЗО+АЬК- - 2 2

Т-крупноклеточная анаплазированная лимфома СБ30+АЬК+ " 1 1

Ангиоиммунобластная Т- клеточная лимфома 2 - 2

Экстранодальная лимфома (Т-1ЧК клеточный тип) 1 - 1

Всего 79 11 90

'Т+' - обнаружен клон методом РСГ1-88СР-ТСЯу 'Т-' - не обнаружен клон методом РСК-ББСР-ТСКу

Частота выявления Т-клеточной клональности при доказанных Т-клеточных опухолях составила 88% (79 из 90), т.е. частота ложноотрицательных случаев - 12%. Вероятными причинами отрицательных результатов определения Т-клеточной клональности по гамма-цепи TCR при доказанных Т-лимфомах считаются отсутствие перестроенных генов гамма-цепи TCR в опухолевых лимфоцитах и

аллельный полиморфизм генов гамма-цепи Т-клеточного рецептора, изменяющий область посадки праймеров.

Т-клеточная клональность по реарранжировкам ТСЯу был а выявлена у 89% (у 8 из 9 пациентов) с Т-ОЛЛ и Т-лимфобластными лимфомами. Сравнение результатов РСЯ-ББСР-ТСКу и иммунологической степени зрелости опухолевых Т-лимфобластов показало, что локус TCRy перестроен уже на самых ранних этапах развития Т-клетки (пре-Т лимфоциты), что позволяет выявить Т-клеточную клональность как при CD3-, так и при CD3+ острых Т-лимфобластных лейкозах и лимфомах. При билинейных острых лейкозах (миелобластных/Т-лимфобластных) ни в одном случае (у 3-х из 3-х пациентов) не была обнаружена Т-клеточная клональность по реарранжировкам TCRy, что указывает на то, что их клетки-предшественники имеют иное происхождение и не имеют перестроенных генов Т-клеточного рецептора.

Повторные исследования методом у пациентов с

Т-клеточной опухолью позволяют оценить эффективность терапии, контролировать ремиссию и вовремя выявлять рецидивы заболевания.

Нелегитимные перестройки генов Т-клеточного рецептора. Определение клональности при В-клеточных опухолях.

Клональные реарранжировки TCRy были обнаружены у 4-х из 27

пациентов (15%) с В-клеточными опухолями (Таблица 4).

Таблица 4. Результаты определения Т-клеточной клональности при В-клеточныхлимфомах илейкозахметодом___

Диагноз ГСК-ЫСГ-ТСКу. г+ Всего

В-ХЛЛ 2 1 3

В-клеточная лимфосаркома кожи - 1 1

Лимфома маргинальной зоны селезенки - 1 1

В-клеточная лимфосаркома 16 1 13

В-клеточная опухоль средостения 3 - 3

В-клеточная лимфома с поражением костного мозга 1 1

Волосатоклеточный лейкоз 1 - 1

| Всего 1 23 | * | 27

'Т+' - обнаружен клон методом РСЯ-вЗСР-ТСЯу 'Т-'- не обнаружен клон методом РСЯ-ЭЗСР-ТСКу

Наличие нелегитимных реарранжировок снижает ценность метода

при определении принадлежности опухоли к Т- или В-линии.

Определение Т-клеточной клоиальности методом PCR-SSCP-TCRy при лимфогранулематозе

Исследовано 20 случаев лимфогранулематоза, при которых потребовалось провести дифференциальный диагноз с Т-клеточной лимфомой или лимфосаркомой. Клональная реарранжировка ТСЯу была выявлена только в одном случае лимфогранулематоза, который характеризовался обилием клеток Ходжкина и экспрессией на них Т-клеточных маркеров (CD2+ и CD3+).

Определение Т-клеточной клональности методом PCR-SSCP-TCRy при реактивных (неопухолевых) процессах и гематологических синдромах, при острых инфекционных процессах

В гематологической практике часто возникает необходимость дифференциального диагноза реактивных (неопухолевых) процессов и Т-клеточных опухолей. По результатам нашей работы можно определить

следующие часто встречающиеся диагностические трудности:

Т-клеточные опухоли Неопухолевые состояния со сходной клиникой

Т-клеточный лейкоз, протекающий с цитопенией или апласгаческим синдромом Иммунные цитопении, апластические синдромы, миелодиспластические синдромы с рефрактерной анемией

Т-клеточные лимфатические опухоли, протекающие с эозинофилией Реактивная эозинофилия, гиперэозинофильный синдром

Грибовидный микоз, Т-клеточные лимфомы кожи Псевдолимфомы кожи (группа реактивных дерматозов, характеризующаяся клиническим, гистологическим, часто иммуногистохимическим сходством с Т-клеточной лимфомой кожи, но отличающаяся доброкачественным

течением с тендендией к спонтанному регрессу).

Лейкоз из больших гранулированных лимфоцитов, протекающий с ревматоидным синдромом, спленомегалией, нейтропенией Ревматоидный артрит, протекающий с имунной нейтропенией и относительным лимфоцитозом, спленомегалией

Т-клеточная лимфома на фоне системного заболевания соединительной ткани Системные заболевания соединительной ткани (СКВ, склеродермия, васкулиты, с-м Шегрена), протекающие с иммунным цитопениями, относительными лимфоцитозами, реактивными лимфаденопатиями и т.д.

Периферическая Т-клеточная лимфома Лимфогранулематоз с Т-клеточным преобладанием, В-клеточная лимфома с обилием Т-клеток, реактивный лимфаденит

Т-крупноклеточная анаплазированная лимфосаркома Болезнь Ходжкина с саркомной трансформацией

Для абсолютного большинства случаев реактивной, не опухолевой

лимфопролиферации была характерна поликлональная или олигоклональная картина, однако у 8,5% (9 из 106 пациентов) был выявлен доминирующий Т-клеточный клон (Таблица 5).

Таблица 5. Результаты определения Т-клеточной клоналъности при реактивных (неопухолевых) процессах и гематологических синдромах методом_

Цип™^ ГСК-ИИСМСКГ- Иссяед. ткань Т- Т+ Всего

Аутоимунная гемолитическая анемия км, сел 2 0 2

Апластическая анемия кр, км 4 0 4

Ремиссия волосатоклеточного лейкоза кр 14 1 15

Тимома (эпителиальная, лимфоэпителиальная) оп ср 3 0 3

Парциальная красноклеточная аплазия кр,км 8 1* 9

Псевдолимфомы кожи, мелкобляшечный парапсориаз, атопический дерматит, эритродермии и т.д б кожи кр 15 2* 17

Нейтропении, анемии, тромбоцитопении предположительно имунного генеза кр 8 0 8

Ревматоидный артрит кр 5 0 5

РА, нейтропения, спленомегалия кр 3 0 3

РА, панцитопения, спленомегалия кр 1 0 1

Реактивный лейкоцитоз кр 4 0 4

Реактивный Т-клеточный лимфоцитоз кр 5 1* 6

Реактивный лимфаденит лу 5 0 5

Реактивный плевральный выпот плж 2 0 2

Анастомозит тонкой кишки б киш 1 0 1

Склеродермия кр 0 1* 1

СКВ. С-м Шенгрена. Панцитоиения. кр, км 2 0 2

Гиперэозинофильный синдром кр 2 0 2

Реактивная эозинофилия кр, км 3 2* 5

Аденокарцинома, плоскоклеточный рак минд, кожа 2 0 2

Саркоидоз лу 1 0 1

Гемохроматоз км 1 0 1

МДС, рефрактерная анемия, 5с|- синдром. кр 1 0 1

МДС, рефрактерная анемия, 7ч- синдром. км 0 1* 1

МДС. Апластический вариант. кр 3 0 3

МДС с избытком бластов кр 2 0 2

Всего 97 9 («♦+!) 106

* - отмечены сомнительные моноклональные варианты (тою 10-20%). Т+' - обнаружен клон методом РСЯ-БЗСР-ТСКу, 'Т-' - не обнаружен клон методом РСЯ-БЗСР-ТСЯу,

пк - периферическая кровь, км- костный мозг, лу- лимфатический узел, оп ср- опухоль средостения, пл ж - плевральная жидкость, б киш - биоптат кишечника, сел - селезенка

Исследование периферической крови при острых инфекционных процессах показало, что в абсолютном большинстве случаев (у 19 из 20 пациентов) при инфекционном мононуклеозе методом РСК-БЗСР-ТСЯу были выявлены один или несколько доминирующих Т-клеточных клонов, что свидетельствует о выраженном клональном иммунном ответе при этой инфекции. У 8 пациентов с инфекционным мононуклеозом картина крови сомнительная моноклональная (mono<20), у 11 - олигоклональная, у 1 -поликлональная. Не было найдено зависимости между результатом PCR-ЗБСР-ТСКу (oligo или mono<20) и возрастом/полом, тяжестью заболевания, лабораторными показателями, количеством атипичных мононуклеаров в крови и временем от начала клинических проявлений, которое в среднем составляло 7,5 дней (от 2 до 16). При ОРВИ, лакунарных ангинах преимущественно наблюдалась поликлональная картина (у 19 из 21 пациента) см. рисунок 3.

Рисунок 3. Примеры результатов исследования (амплификаты Уу1-8 праймера). 1 - Клеточная линия Jurkat (моноклоналъный контроль); 2, 3, 5, 9-ОРВИ; 4,6, 7,8-ИМ.

1 2 .3 4 5 , б , * 7*"' 8 '9

Характерные черты опухолевых и реактивных клонов, выявленных методом РСК-88СР-ТСКу

Исследование показало, что для опухолевых клонов было характерно

1) Большойразмер клона.

У 64 из 79 пациентов с Т-клеточными опухолями и выявленной методом РСК-88СР-ТСКУ моноклональностью, обнаруженный клон соответствовал примеси моноклональных клеток более 20% от Т-лимфоцитов. При этом лишь у 2 пациентов из 18 с реактивными заболеваниями (Табл.17) выявленный клон был более 20% от Т-лимфоцитов (р<0,01).

2) Наличие одинаковогоклона вразличныхтканях.

У 11 из 19 пациентов с Т-клеточными опухолями, когда одновременно исследовались несколько тканей методом РСК-88СР-ТСКу, был обнаружен одинаковый клон в различных тканях и органах. Тогда как при реактивных процессах одинаковый клон в различных тканях был обнаружен только в одном из шести случаев (р=0,093).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гены Т-клеточного рецептора (TCR) в моноклональных Т-лимфоцитах перестроены одинаково. Эта особенность использована нами в качестве основы молекулярного метода определения Т-клеточной клональности. Для выявления моноклональных Т-клеток применяли метод PCR-TCRy-SSCP (амплификация при помощи полимеразной цепной реакции (PCR) гамма цепи Т-клеточного рецептора (TCRy) и последующий анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP)).

Было показано, что чувствительность метода PCR-SSCP-TCRy, т.е. минимальное количество моноклональных клеток, при котором выявляется клональность, составляет 10-15% от общего количества Т-лимфоцитов в образце. Клиницистам необходимо учитывать возможность отрицательных результатов на начальных стадиях Т-клеточной опухоли, когда количество опухолевых клеток в образце невелико.

Выделено четыре варианта результатов определения Т-клеточной клональности методом ПЦР, которые должны быть представлены в заключении: поликлональность, олигоклональность, сомнительная моноклональность, моноклональность.

В работе исследовано 90 пациентов с Т-клеточными опухолями и определено, что Т-клеточная клональность методом выявляется у 88% (79 из 90). Наиболее вероятная причина ложноотрицательных случаев - отсутствие в опухолевых клетках перестроенных генов гамма цепи Т-клеточного рецептора.

Повторные исследования у пациентов с Т-клеточной опухолью позволяют контролировать ремиссию и вовремя выявлять рецидивы заболевания.

Т-клеточная клональность по реарранжировкам была

выявлена у 8 из 9 пациентов (89%) с Т-ОЛЛ и Т-лимфобластными

лимфомами. Сравнение результатов РСЯ-ЗБСР-ТСКу и данных иммунофенотипирования показало, что локус ТС11у перестроен уже на самых ранних этапах развития Т-клетки (пре-Т лимфоциты), что позволяет выявить Т-клеточную клональность как при СБ3-, так и при СБ3+ острых Т-лимфобластных лейкозах и лимфомах. При билинейных острых лейкозах (миелобластных/Т-лимфобластных) ни в одном случае (у 3-х из 3-х пациентов) не была обнаружена Т-клеточная клональность по реарранжировкам ТСЯу, что указывает на то, что их клетки-предшественники имеют иное происхождение и ненесут перестроенных генов Т-клеточного рецептора.

Установлено, В-клеточные опухоли могут иметь нелегитимные (недозволенные) клональные реарранжировки так Т-клеточная

клональность выявляется у 4 из 27 пациентов (15%) с В-клеточными опухолями. Выявление Т-клеточной клональности методом РСЯ-88СР-при В-клеточных лимфомах снижает диагностические возможности метода при определении принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточной линии, и должно быть учтено клиницистами при интерпретации результатов исследования.

Т-клеточная клональность не обязательно означает наличие опухоли. Особенности нормального иммунного ответа предполагают появление множества клонов Т-клеток при вирусной инфекции, различных аутоиммунных и воспалительных заболеваниях. Размеры этих клонов, как правило, не велики и не достигают пределов чувствительности традиционных молекулярных методов. Однако, доминирование одного Т-клеточного клона может приводить к ложноположительным результатам при этих заболеваниях. В нашем исследовании Т-клеточная моноклональность была обнаружена у 8,5% (у 9 из 106 пациентов) при реактивных (неопухолевых) процессах. Отдельно рассматривается инфекционный мононуклеоз, при котором выявляемость моноклональных

Т-лимфоцитов достигла 40% случаев (8 из 20 пациентов), что свидетельствует о выраженном клональном иммунном ответе при этой инфекции.

Таким образом, Т-клеточная клональность методом PCR-SSCP-TCRy была выявлена в 88% (у 79 из 90 пациентов) при Т-клеточных опухолях и только в 8,5% (у 9 из 106 пациентов) при реактивных (неопухолевых) процессах, что позволяет с высокой точностью (90%) проводить дифференциальный диагноз между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями: На опухолевую природу Т-клеточного клона указывает размер более 20% от общего количества лимфоцитов (р<0,01), наличие его в нескольких тканях (р=0,093).

Наше исследование показало, что метод является

важным вспомогательным методом для проведения дифференциального диагноза между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями, для определения принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточной линии, для контроля ремиссии Т-клеточных опухолей и диагностики рецидивов. Молекулярный метод определения Т-клеточной клональности необходимо включать в протоколы обследования пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ

Рекомендовано внедрение метода определения Т-клеточной клональности при помощи полимеразной цепной реакции в протоколы обследования пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями.

Показания к определению Т-клеточной клональности методом

ПЦР:

1) Дифференциальный диагноз реактивной и опухолевой Т-клеточной л имфопролиферации:

- если по данным морфологического и иммунофенотипического исследования биоптата лимфоузла/органа не удалось разграничить реактивную и опухолевую пролиферацию,

- при дифференциальной диагностике длительных цитопений и апластических синдромов,

- при длительном лимфоцитозе, нейтропении, спленомегалии, лимфаденопатии, гиперэозинофилии, лимфоидной инфильтрации кожи неясного генеза.

2) Определение принадлежности опухоли к Т- и В-клеточным линиям,

3) Контроль ремиссии Т-клеточной опухоли и диагностика рецидивов.

При интерпретации результатов метода необходимо учитывать следующие возможности:

- отрицательные результаты на начальных стадиях Т-клеточной опухоли, когда количество опухолевых клеток в образце невелико (менее 10-15% от общего количества Т-лимфоцитов);

- отсутствие Т-клеточной клональности при наличии Т-клеточной опухоли (количество ложноотрицательных результатов при Т-клеточных лимфомах и лейкозах составляет 12%);

- ложноположительные результаты при реактивных (неопухолевых) процессах воспалительного, инфекционного или аутоиммунного генеза (в 8,5% случаев);

- выявление Т-клеточной клональности при В-клеточных опухолях (наличие нелегитимных клональных реарранжировок в 15% случаев).

Интерпретировать клональные перестройки Т-клеточного рецептора (положительный результат) следует с учетом данных клиники, морфологии и иммунофенотипирования.

ВЫВОДЫ

1. Метод полимеразной цепной реакции, основанный на перестройках гамма-цепи Т-клеточного рецептора, выявляет моноклональность в 88% доказанных Т-клеточных лимфом.

2. Минимальная примесь моноклональных клеток, при которой возможно достоверное определение клональности данным методом, составляет 10-15% от общего количества Т-лимфоцитов.

3. Определение Т-клеточной клональности при помощи ПНР позволяет с высокой точностью (90%) провести дифференциальный диагноз между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями.

4. Наличие нелегитимных клональных реарранжировок снижает ценность метода при определении принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточным линиям.

5. На опухолевую природу Т-клеточного клона, выявленного методом

указывает размер более 20% от общего количества Т-лимфоцитов и обнаружение его в нескольких тканях.

6. Клональные перестройки Т-клеточного рецептора следует интерпретировать с учетом данных клиники, морфологии и иммунофенотипирования.

Список публикаций по теме диссертации

1) Олисова О.Ю., Сидорова Ю.В., Судариков А.Б.. Истинная псевдолимфома кожи. Гематология и трансфузиология 2002; №6: 2529

2) Сидорова Ю.В., Никитин Е.А., Пекло М, Власик Т.Н., Самойлова Р.С., Кравченко С.К., Меликян А.Л., Виноградова Ю.Е., Пивник А.В., Судариков А.Б.. Опыт использования ПЦР для определения Т-клеточной клональности. Терапевтический архив 2003; №7: 48-52

3) Сидорова Ю.В., Никитин Е.А, Меликян А.Л., Пивник А.В., Судариков А.Б. Определение Т-клеточной клональности при инфекционном мононуклеозе методом PCR-SSCP-TCRy. Гематология и трансфузиология 2004; №6. Принято к публикации.

Используемые в автореферате сокращения

БГЛ - лейкоз из больших гранулированных лимфоцитов

В-ХЛЛ - В-клеточный хронический лимфатический лейкоз

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИМ - инфекционый мононуклеоз

МДС - миелодисплатический синдром

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - ревматоидный артрит

СКВ - системная красная волчанка

Т-ОЛЛ — Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз

СD- кластер дифференцировки

LIS - раствор с низкой ионной силой

NK - натуральный киллер

PCR-SSCP-TCRy - полимеразная цепная реакция с последующим анализом

конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов по

реарранжировкам гамма-цепи Т-клеточного рецептора

SSCP - анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных

фрагментов ДНК

TCR - Т-клеточный рецептор

Принято к исполнению 08/09/2004 Исполнено 10/09/2004

Заказ № 311 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www. autoiefeiat. iu

|И 62 9 в

Актуальность проблемы

Во многих случаях классические методы цитологии, гистологии и иммуногистохимии не позволяют провести дифференциальный диагноз между опухолевой и реактивной Т-клеточной пролиферацией. Т-клеточные опухоли часто протекают в виде микропролиферативных процессов и при небольшой массе опухоли и скорости роста могут проходить под маской апластических синдромов, могут быть причиной упорных цитопений, гиперэозинофилии, ревматоидных синдромов. В дерматологической практике введен термин псевдолимфома кожи, - это группа реактивных дерматозов, характеризующаяся клиническим, гистологическим, часто иммуногистохимическим сходством с Т-клеточной лимфомой кожи, но отличающейся доброкачественным течением с тенденцией к спонтанному регрессу. Иммунофенотипически можно выявить патологическую популяцию Т-клеток только, если опухолевые Т-клетки имеют аберрантный фенотип, т.е. утрату одного или нескольких из общих Т-клеточных маркеров, а также в случаях, когда фенотип опухолевых Т-клеток соответствует ранним, внутритимическим стадиям дифференцировки. Одним из вспомогательных методов, подтверждающих наличие опухоли, является определение клональности. В-клеточная клональность традиционно оценивается по рестрикции легкой цепи, то есть по преобладанию в испытуемой популяции клеток, экспрессирующих каппа или лямбда цепь иммуноглобулина. В случае Т-клеточных опухолей такого иммунофенотипического маркера клональности нет, и Т-клеточную клональность можно оценить только с помощью молекулярных методов. Методы молекулярной диагностики Т-клеточной клональности основаны на наличии одинаково перестроенных генов вариабельного региона Т-клеточных рецепторов (ТСЯ) в опухолевых Т-лимфоцитах. В норме в каждом Т-лимфоците гены ТСЫ перестроены уникально, а появление клона Т-лимфоцитов при опухоли сопровождается появлением популяции клеток с одинаковой перестройкой генов ТСЫ. Однако наличие клональности не обязательно означает наличие опухоли. В ходе нормального иммунного ответа появляется множество клонов Т-клеток, но размеры этих клонов, как правило, не велики и не достигают пределов чувствительности традиционных молекулярных методов. Исключения из этого правила возможны. Так, показано, что в острой фазе инфекционного мононуклеоза до 10% СБ8+ клеток могут быть моноклональны. Однако эта пролиферация не имеет ничего общего с опухолью.

Т-клеточная клональность традиционно оценивается с помощью двух методов — Саузерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции. Саузерн-блоттинг - трудоемкий метод, требующий большого количества геномной ДНК высокого качества и радиоактивной метки. В связи с этим Саузерн-блоттинг редко применяется для рутинной диагностики и в настоящее время чаще используется как контрольный метод при отработке других молекулярных методов. Наибольшее распространение для оценки Т-клеточной клональности получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая широко используется в клинической практике с начала 90-х годов. Ранее в нашей стране молекулярные методы определения Т-клеточной клональности не использовались для диагностики зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний. Актуальность данной работы обусловлена распространенностью заболеваний, требующих дифференциального диагноза с Т-клеточными лимфомами, востребованностью в клинике метода определения Т-клеточной клональности, и при этом отсутствием опыта его применения и диагностических результатов.

Цель

Оценить возможности метода определения Т-клеточной клональности при помощи ПЦР в диагностике Т-клеточных опухолей.

Задачи

1) Определить чувствительность метода, т.е. минимальную примесь моноклональных клеток, при которой выявляется Т-клеточная клональность методом РС11-88СР-ТСКу.

2) Провести исследование Т-клеточной клональности методом РСЯ-88СР-ТСЯу при Т-клеточных лимфомах, В-клеточных лимфомах и прочих гемобластозах, при различных неопухолевых заболеваниях и гематологических синдромах. Определить специфичность метода и ограничения в его использовании.

3) Сформулировать показания и практические рекомендации для врачей к определению Т-клеточной клональности методом ПНР.

Научная новизна и практическая ценность исследования

Доказана эффективность молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности, выявлены оптимальные условия проведения метода, ограничения в его использовании, сформулированы критерии интерпретации результатов и практические рекомендации для врачей. Метод апробирован на большом количестве материала, в работу включены не только пациенты с опухолевыми лимфопролиферативными заболеваниями Т- и В- клеточной природы, но также обширная группа сравнения - пациенты с реактивными (неопухолевыми) заболеваниями и гематологическими синдромами, здоровые люди. Показана возможность использования метода полимеразной цепной реакции для проведения дифференциального диагноза между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями, определения принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточной линии, диагностики лимфобластных лейкозов, контроля ремиссии Т-клеточных опухолей. Полученные данные свидетельствуют о необходимости включения метода определения Т-клеточной клональности в протоколы обследования пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями. Внедрение в практику

Метод определения Т-клеточной клональности при помощи полимеразной цепной реакции внедрен в практику и вошел в протоколы обследования больных в Гематологическом Научном Центре РАМН (ГНЦ РАМН). Метод был также востребован в других клиниках г. Москвы.

Материалы работы изложены на декаднике Гематологического Научного Центра РАМН 26.04.2002.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в центральных журналах, и 1 статья готовится к публикации. Объем и структура работы

Материалы диссертации изложены на 95 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, практических рекомендаций для врачей, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы содержит 133 наименования. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и содержит 17 таблиц.

выводы

1. Метод полимеразной цепной реакции, основанный на перестройках гамма-цепи Т-клеточного рецептора, выявляет моноклональность в 88% доказанных Т-клеточных лимфом и лейкозов.

2. ' Минимальная примесь моноклональных клеток, при которой возможно достоверное определение клональности данным методом, составляет 10-15% от общего количества Т-лимфоцитов.

3. Определение Т-клеточной клональности при помощи ПЦР позволяет с высокой точностью (90%) провести дифференциальный диагноз между реактивными и опухолевыми Т-клеточными лимфопролиферациями.

4. Наличие нелегитимных клональных реарранжировок ТСЛу снижает ценность метода РО^^СР-ТСЛу при определении принадлежности опухолевых клеток к В- и Т-клеточным линиям.

5. На опухолевую природу Т-клеточного клона, выявленного методом РСК-88СР-ТСЯу, указывает размер более 20% от общего количества Т-лимфоцитов и обнаружение его в нескольких тканях.

6. Клональные перестройки Т-клеточного рецептора следует интерпретировать с учетом данных клиники, морфологии и иммунофенотипирования.

Благодарности

- сотрудникам лаборатории Молекулярной Гематологии ГНЦ РАМН за помощь и поддержку в трудную минуту

- всем врачам ГиИТ и других отделений ГНЦ РАМН

- сотрудникам 1 Инфекционной Клинической больницы г. Москвы

Огромная признательность: Самойловой P.C., Пивнику A.B., Виноградовой Ю.Э, Воробьеву И.А., Воробьеву А.И.

Список публикаций по теме диссертации

1) Сидорова Ю.В., Никитин Е.А., Пекло М., Власик Т.Н., Самойлова Р.С., Кравченко С.К., Меликян A.JL, Виноградова Ю.Е., Пивник А.В., Судариков А.Б. Опыт использования ПЦР для определения Т-клеточной клональности. Терапевтический архив 2003; №7: 48-52

2) Олисова О.Ю., Сидорова Ю.В., Судариков А.Б. Истинная псевдолимфома кожи. Гематология и трансфузиология 2002; №6: 25-29

3) Сидорова Ю.В., Никитин Е.А, Меликян А.Л., Пивник А.В., Судариков А.Б. Определение Т-клеточной клональности при инфекционном мононуклеозе методом PCR-SSCP-TCRy. Гематология и трансфузиология. Готовится к публикации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ

Рекомендовано внедрение метода определения Т-клеточной клональности при помощи полимеразной цепной реакции в протоколы обследования пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями.

Показания к определению Т-клеточной клональности методом ПЦР:

1) Дифференциальный диагноз реактивной и опухолевой Тклеточной лимфопролиферации:

- если по данным морфологического и иммунофенотипического исследования биоптата лимфоузла/органа не удалось разграничить реактивную и опухолевую пролиферацию,

- при дифференциальной диагностике длительных цитопений и апластических синдромов,

- при длительном лимфоцитозе, нейтропении, спленомегалии, лимфаденопатии, лимфоидной инфильтрации и гиперэозинофилии кожи неясного генеза

2) Определение принадлежности опухоли к Т- и В-клеточным линиям,

3) Контроль ремиссии Т-клеточной опухоли и диагностика рецидивов.

При интерпретации результатов метода необходимо учитывать следующие возможности:

1) отрицательные- результаты на начальных стадиях Т-клеточной опухоли, когда количество опухолевых клеток в образце невелико (менее 10-15% от общего количества Т-лимфоцитов);

2) отсутствие Т-клеточной клональности при наличии Т-клеточной опухоли (количество ложноотрицательных результатов при Т-клеточных лимфомах и лейкозах составляет 12%);

3) ложноположительные результаты при реактивных (неопухолевых) процессах воспалительного, инфекционного или аутоиммунного генеза (в 8,5% случаев);

4) выявление Т-клеточной клональности при В-клеточных опухолях (наличие нелегитимных клональных реарранжировок ТСЯу в 15% случаев).

Интерпретировать клональные перестройки Т-клеточного рецептора (положительный результат) следует с учетом данных клиники, морфологии и иммунофенотипирования.