Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Дифференциальные возможности молекулярно-генетических методов определения клональности в диагностике злокачественных лимфом кожи, псевдолимфом кожи и парапсориазов

На правах рукописи

Грознова Анна Александровна

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛОНАЛЬНОСТИ В ДИАГНОСТИКЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОМ КОЖИ, ПСЕВДОЛИМФОМ КОЖИ И ПАРАПСОРИАЗОВ.

14.01.10 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

гшн т

Москва 2014

005550211

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич

Официальные оппоненты:

Баткаев Эдгем Абдуллахатович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической микологии и дерматовенерологии ФПК медицинских работников ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов" Министерства образования и науки РФ

Бутов Юрий Сергеевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры кожных болезней и косметологии Факультета усовершенствования врачей ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.Е. Евдокимова» Минздрава России

Защита диссертации состоится в _часов на

заседании диссертационного совета Д.208.040.10 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49 и на сайте Первого МГМУ им. И.М. Сеченова www.mma.ru

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Кандидат медицинских наук, доцент

Чебышева Светлана Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Актуальность проблемы лимфом кожи (JIK) обусловлена не только нарастанием частоты Т- и B-клеточных лимфом кожи (Т- и BKJIK), но и сложностью их ранней дифференциальной диагностики с другими кожными заболеваниями [Молочков A.B. и соавт., 2012; Burg G et al, 2005].

Последнее десятилетие оказалось важным для понимания природы JIK и принятия новой классификации B03/E0RTC (2005) [Willemze R et al, 2005] на основе клинико-морфологических, иммунофенотипических и молекулярно-генетических особенностей. Причем, использование последних двух методов существенно повысило точность выявления Т- и ВКЛК и трансформации крупнобляшечного парапсориаза в JIK [Simon М. et al.,1997; Theriault С. et al., 2000; Klemke C.D. et al., 2002; Nihal M. et al., 2003].

Выявление моноклонального типа пролифераций лимфоидных клеток позволяет заподозрить развитие JIK на ранних сроках болезни и, в этой ситуации, при отсутствии гистологически подтвержденного диагноза, рассматривать пациентов, как «группу риска» [Овсянникова Г.В., 2009; Assaf С. et al, 2005; Sekulovic L.K. et al, 2007].

Использование с целью дифференциальной диагностики метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP), обеспечивает эффективность диагностики в 63% случаев [Овсянникова Г.В., 2009]. Однако, данные результатов исследования с его использованием оказались менее информативными на ранних стадиях JIK [Assaf С. et al, 2000; Simon М. et al., 1998], по сравнению с разработанным и используемым в настоящее время ПЦР-методом фрагментного анализа.

В связи с этим, разработка нового метода на основе реарранжировок генов гамма цепи TCR и IgH с помощью фрагментного анализа (автоматизированной высокоразрешающей полимеразной цепной реакции анализа фрагментов ДНК) приобретает особую актуальность в диагностике ранних стадий ЛК.

Цель исследования

Повышение точности диагностики ЛК на ранних сроках развития на основании использования метода фрагментного анализа с помощью полимеразной цепной реакции со стандартизированным праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936.

Задачи исследования

1. Определить значение применения молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам гамма цепи Т-клеточного рецептора с помощью Фрагментного анализа с праймером BIOMED-2 Concerted Action ВМН-4-СТ98-3936 в биоптатах пораженной кожи пациентов в ранней дифференциальной диагностике Т-клеточных лимфом кожи.

2. Определить чувствительность молекулярно-генетического метода исследования с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа.

3. Оценить эффективность молекулярно-генетического метода исследования определения Т-клеточной клональности с помощью фрагментного анализа с праймером BIOMED-2 Concerted Action ВМН-4-СТ98-3936 в биоптатах пораженной кожи у пациентов с Т-клеточной лимфомой кожи на ранних сроках заболевания.

4. Оценить эффективность молекулярно-генетического метода исследования определения В-клеточной клональности по генам тяжелой цепи иммуноглобулина с праймером BIOMED-2 Concerted Action ВМН-4-СТ98-3936 с помощью фрагментного анализа у пациентов с В-клеточной лимфомой кожи в биоптатах пораженной кожи.

5. Определить структуру лимфомы кожи в регионе Москва и Московская область с использованием иммуногистохимических и молекулярно-генетических методов исследования.

Научная новизна

1. На основе изучения клинико-морфологических и молекулярно-генетических признаков больных региона Москва и Московская область был исследован спектр лимфопролиферативных заболеваний кожи, включающий Т- и В-клеточные лимфомы кожи, парапсориаз, а также доброкачественные псевдолимфомы кожи.

2. Доказано преимущество выявления Т-клеточной клональности лимфоидных клеток в биоптатах пораженной кожи по гамма цепи Т-клеточного рецептора с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа с праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936, по сравнению с методом одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) в дифференциальной диагностике Т-клеточных лимфом кожи.

3. Доказана эффективность молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток в биоптатах пораженной кожи с помощью полимеразной цепной реакции

методом фрагментного анализа на ранних стадиях Т-клеточных лимфом кожи^ что позволяет сформировать «группу риска» пациентов по развитию лимфомы кожи.

Научно-практическая значимость

1. Обосновано использование молекулярно-генетического метода исследования для выделения «группы риска» по развитию Т-клеточной лимфомы кожи у пациентов с крупнобляшечным парапсориазом, имеющих моноклональную реарранжировку лимфоидных клеток генов Т-клеточного рецептора в биоптате пораженной кожи.

2. В работе использовался современный и стандартизируемый метод определения клональности лимфоидных клеток - фрагментный анализ в с праймером BIOMED-2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936.

3. Выявлены оптимальные условия проведения метода фрагментного анализа, ограничения в его использовании, сформулированы критерии интерпретации результатов и практические рекомендации для врачей.

4. Применение молекулярно-генетического метода на основе фрагментного анализа исследования позволит сформировать «группу риска» пациентов по развитию лимфомы кожи.

Положения, выносимые на защиту

1. Использование молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам гамма цепи Т-клеточного рецептора с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа с праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936 повышает точность диагностики TKJIK.

2. Молекулярно-генетический ПЦР-метод фрагментного анализа имеет высокую чувствительность, при которой можно достоверно определить Т-клеточную клональность лимфоидных клеток.

3. Применение молекулярно-генетического ПЦР-метода фрагментного анализа на начальный стадиях TKJIK в комплексе с праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936 повышает эффективность ранней и дифференциальной диагностики.

4. Применение молекулярно-генетического ПЦР-метода фрагментного анализа в комплексе с праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936 повышает точность диагностики BKJ1K.

5. Определена структура лимфом кожи у больных региона Москвы и Московской области с учетом классификации WHO/EORTC (2005 г.).

Внедрение в практику результатов исследования

Результаты исследования внедрены в отделении дерматовенерологии и

дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимироского и московском областном

5

клиническом кожно-венерологическом диспансере. Результаты используются в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии ФППОВ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Апробация диссертации

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на:

заседании Московского городского общества дерматовенерологов (Москва 2011 г).

- заседании Первого Московского форума «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики» (Москва 2011г).

- VI Международном форуме дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2013г.)

совместном заседании отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии ГУ МОНИКИ им.М.Ф. Владимирского, кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, кафедры кожных и венерических болезней Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 18.11.201 Зг). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 7 - в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий...», рекомендуемых ВАК Российской Федерации. Личный вклад автора

Настоящее диссертационное исследование проводилось автором в его полном объеме с формированием базы данных, осуществлением статистической обработки и последующим обобщением полученных результатов. Автором лично проведено молекулярно-генетическое исследование всех пациентов, включенных в работу, а также изучены и проанализированы данные, полученные в настоящем исследовании. Объем и структура работы

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 11 рисунками и 15 фотографиями. Указатель литературы включает 30 отечественных 162 и зарубежных источника.

Соответствие паспорту научной специальности.

В соответствии с формулой специальности 14.01.10 - кожные и венерические болезни (медицинские науки), охватывающей проблемы изучения этиологии, патогенеза и диагностики различных дерматозов, в диссертационном исследовании научно обоснован и разработан методический подход к

повышению точности диагностики и дифференциальной диагностики ранних стадий лимфом кожи. Краткое содержание работы.

Работа выполнена на основании обследования 181 человек с патологическим процессом, требующий отличия его от Т- и В-клеточных лимфом кожи, парапсориаза, псевдолимфомы кожи и хронических доброкачественных дерматозов. Настоящее исследование проводилось в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии и в отделении патологической анатомии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского (база кафедры кожных и венерических болезней ИПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова), отделении патологической анатомии и лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ Гематологического научного центра Министерства здравоохранения РФ в период с 2009 по 2013 гг.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на основании обследования 181 человек с патологическим процессом, требующем отличия его от Т- и В-клеточных лимфом кожи, парапсориаза, псевдолимфы кожи и хронических доброкачественных дерматозов. Диагноз лимфомы кожи устанавливался в соответствии с международной классификацией лимфом кожи Ю/ПОПТС (2005г). Объектом исследования являлись биоптаты пораженной кожи, взятые с наиболее инфильтрированного участка. Все пациенты жители Москвы и Московской области, среди которых было 101 (55,8 %) мужчин и 80 (44,2%) женщин, возраст от 27 до 87 (в среднем 57 ± 4,9 лет). Соотношение мужчин и женщин 1,2:1. Соотношение мужчин и женщин 1,2:1. При появлении первых признаков заболевания к врачу обратились 127 (66,3%) пациентов, остальные 54 (33,7%) -в сроки от 3 до 9 месяцев от начала болезни.

При поступлении в отделение всем больным проводилось комплексное обследование, включавшее исследование периферической крови, общий анализ мочи, биохимические анализы плазмы крови, ЭКГ. При наличии показаний проводилась рентгеноскопия органов грудной клетки, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, консультации смежных специалистов. Диагноз заболевания в каждом случае устанавливался на основании анамнеза, клинической картины, результата патоморфологического исследования, а также молекулярно-генетического и иммуногистохимического методов исследования.

Гистологическое исследования биоптатов кожи из очагов поражения.

Для осуществления патоморфологического исследования кожи проводилась биопсия пораженного участка ткани с области плеча и живота пациента под местной анестезией 2% раствором лидокаином и обработка ее стандартными методами. Биоптат пораженной кожи фиксировали в 10% растворе формалина, забуференном по Лилли при рН - 7,4, затем заливали в парафин по обычной методике, серийные срезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические препараты просматривались в светооптическом микроскопе при увеличении х10,х40, где оценивались общая структура ткани и морфологические изменения.

Иммуногистохимический (ИГХ) метод исследования

1. Нанесенные на предметные стекла со специальным адгезивным покрытием парафиновые срезы нагревают в течение 30с. до температуры, несколько превышающей температуру плавления парафина, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 24 часов, затем погружают в ксилол для растворения парафина, после чего проводят по батарее 100%, 95% и 80% спиртов. После депарафинизации срезы переносят в дистиллированную воду, затем - в ТРИС- или фосфатный буфер (рН - 7,4-7,6).

2. Для подавления эндогенной пероксидазной активности клеток срезы в течение 20 минут обрабатывают 3% раствором перекиси водорода в метаноле, после чего стекла отмывают в ТРИС- или фосфатном буфере. Далее проводят демелирование антигенов при нагревании в водяной бане (температура 98°С) (рН - 6,0 или рН - 9,0) 2 раза при использовании рр1 или обработке протеолитическими ферментами в течение 30 мин при температуре 37 °С, после чего стекла также промывают в ТРИС-буфере.

3. Затем на срезы наносятся первичные антитела, с которыми они инкубируются 30 мин. при 37 °С, после чего их тщательно промывают в нескольких порциях буфера.

Для визуализации использовали высокочувствительную полимерную систему ВюСепех. ИГХ исследование проводилось с использованием линейно ограниченных и дифференцировочных антигенов.

4. Далее срезы докрашивают гематоксилином Майера и дифференцируют в щелочном растворе до получения голубого окрашивания.

5. По стандартной методике стекла обезвоживают и заключают в бальзам для последующего исследования.

6. Результаты ИГХ исследования оценивают и ставят окончательный диагноз.

Молекулярно-генетический метод для определения реарранжировок Т-клеточного рецептора (TCR) лимфондных клеток.

Материально-техническое обеспечение лаборатории соответствует стандартам проведения ПЦР-диагностики, для метода фрагментного анализа необходимо наличие секвенатора ABI PRISM 3130.

Взятие образцов, выделение ДНК из биопсийного материала

Биопсийный материал помещается в чистую пробирку с физиологическим раствором.

Из биопсийного материала ДНК выделяли методом лизиса в аммиаке и высаливали белки в уксусной кислоте. Фрагмент ткани 2x2x2мм помещали в пробирку с закручивающейся крышкой, добавляли 900 цЬ NH40H 25% и 100 p.L 10% SDS. Инкубировали при 55-57°С в течение 1-2 суток при постоянном помешивании. Жидкую часть (900 цЬ) переносили в новую пробирку. К жидкой части добавляли 300 pL 17М уксусной кислоты, перемешивали 10 минут, центрифугировали 10 минут при 13000g. К супернатанту добавляли 3 объема этанола. Центрифугировали при 13000g 10 минут. Осадок ДНК дважды промывали 70% спиртом, высушивали на воздухе, растворяли в 50 цЬ воды.

При выделении из парафинового блока ткань предварительно депарафинизировали. Для этого 3 среза по 10 микрон помещали в пробирку, ее нагревали 10 мин при 95°С в буфере STExl. Центрифугировали 30 сек при 5000g, оставляли на льду на 10 мин. Удаляли скальпелем парафиновый диск. Кусочки депарафинизированной ткани переносили в чистую пробирку.

Условия полимеразной цепной реакции.

Определение Т-клеточной клональности проводили на основе анализа перестроек вариабельного региона TCRy. Определение В-клеточной клональности проводили на основе анализа вариабельного региона IgH. Для мультиплексной ПЦР определения клональности по реарранжировкам генов TCRy применяли два набора праймеров: 1) смесь праймеров Ту, последовательности которых опубликованы в протоколе Biomed-2; 2) смесь праймеров Туу, последовательности которых опубликованы в работе Greiner.

Оба набора праймеров представляют собой, смесь из четырех прямых праймеров к четырем семействам V регионов TCRy и трех меченных флуоресцентной краской (FAM) обратных праймеров к J регионам генов у-цепи TCR.

Для ПЦР анализа генов тяжелых цепей иммуноглобулинов использовали три набора праймеров FR I, FRII, FR III.

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров для анализа реарранжировок гамма цепи Т-клеточного рецептора и генов тяжелой цепи иммуноглобулина.

Название Прямые праймеры Обратные праймеры

TCRy Vylf 5-GGAAGGCCCCACAGCRTCTT-3' (R - A OR G) Vy9 5-CGGCACTGTCAGAAAGGAATC-3" VyIO 5-AGCATGGGTAAGACAAGCAA-3' Vyl 1 5'-CTTCCACTrCCACTTTGAAA-3' Jyl.3/2.3 5'-FAM-GTGTrGTrCCACTGCCAAAGAG-3' Jy 1.1 /2.1 5'-FAM-TrACC AGGCG AAGTTACTATG AGC-3'

TCRyy Vy 2 5'-TACATCCACTGGTACCTACACCAG-3' V y9 S'GAAAGGAATCTGGCATTCCGTCAGO' VyIO 5-AAGCAACAAAGTGGAGGCAAGAAAG-3' V yl 1 5-AGTAAAAATGCTCACACTTCCACTTC-3' Jl/2 5'-FAM-TACCTGTGACAACAAGTGTrGTTC-3' Jp 5'-FAM-AAGCTTTGTTCCGGGACCAAATAC-3' Jpl/2 5'-FAM-GAAGTTACTATGAGCYTAGTCCCTr-3'

IglI FRt V„1 -FRI 5-GGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAG-3' VH2-FR1 5'-GTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCC-3' VH3-FR1 5-CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG-3' V„4-FR1 5'-CTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG-3' V„5-FR1 5'-CGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGT-3' v116-FRI 5'-TCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTG-3' Jh consensus 5'-FAM-CTTACCTGAGGAGACGGTGACC-3'

IgH FRII V„1-FR2 5'-CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA-3' V„2-FR2 5'-TGGATCCGTCAGCCCCCAGGG AAGG-3' V„3-FR2 5'-GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAA-3' Vh4-FR2 S'-TGGATCCGCCAGCCCCCAGGG AAGG-3' Vh5-FR2 5'- GGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGG-3' V„6-FR2 5'-TGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAG-3' VH7-FR2 5'-TTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA-3' J11 consensus 5'-FAM-C1TACCTGAGGAGACGGTGACC-3'

IgH FRIII Vh1-FR3 s'-tggagctgagcagcctgagatctgao' V„2-FR3 5'- CAATGACCAACATGGACCCTGTGGA-3' VH3-FR3 5'-TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCC-3' V„4-FR3 5'-GAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACG-3' Vi(5-FR3 5'-CAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGC-3' V„6-FR3 5'<jTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTG-3' VH7-FR3 5'- CAGCACGGCATATCTGCAGATC AG-3' J11 consensus 5'-FAM-CTTACCTGAGGAGACGGTGACC-3'

ПЦР проводили на автоматическом термоциклере (Perkin Elmer Cetus). Реакционная смесь в конечном объеме 20 мкл включала: 200 нг ДНК, 10 мкл 2х смеси для ПЦР (PCR Master Mix Promega, Германия), 5 пмоль каждого праймера.

Условия ПЦР: для генов TCRy и генов IgH — предварительная денатурация 95°С (5 мин), 35 циклов ПЦР - 92°С (35 сек), 60°С (35 сек), 72°С (35 сек), окончательная пролонгация - 72°С (10 мин). Размеры ПЦР продуктов для праймеров Ту составляли - 80 - 255 п.н., Туу - 90 - 280 п.н., Tß - 240-285 п.н., IgH FRI -310-360 п.н., IgH FRII - 250 - 295 п.н., IgH FRIII -100- 170 п.н. Результаты реакции выявляли в 2% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. При успешном ПЦР проводили очистку ПЦР продуктов и фрагментный анализ.

Очистка ПЦР-продуктов и фрагментами анализ амплификатов.

Для очистки ПЦР-продуктов в каждую пробирку добавляли по 100 мкл смеси для осаждения ДНК (ацетат аммония, этиловый спирт, вода), инкубировали 20 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 13000g. Осадок ДНК дважды отмывался 70% спиртом, высушивался при комнатной температуре, разбавлялся дистиллированной водой 30 мкл. Концентрация очищенных продуктов проверялась в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В зависимости от интенсивности свечения ПЦР-продукты разводились в 10-40 раз. Разведенные продукты смешивались с формамидом (2 мкл продукта, 10 мкл формамида, 0,05 мкл внутреннего стандарта Genescan 500LIS (Applied Biosystems, Германия)). Денатурировались при 95°С в течение 2 мин и помещались в лед на 10 мин. 10 мкл денатурированного продукта наносилось в плашку автоматического секвенатора. Для фрагментного анализа использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, Германия) и компьютерное обеспечение GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, Германия).

Контроли молекулярно-генетнческого метода

В качестве положительного (моноклонального) контроля TCRy использовали клеточную линию Jurkat (линия клеток Т - лимфобластного острого лейкоза), имеющую клональную перестройку генов TCRy. В качестве положительного контроля для B-клеточной клональности по генам IgH использовали лейкоциты периферической крови пациентов с B-клеточным хроническим лимфолейкозом. В качестве поликлонального контроля использовали лейкоциты периферической крови здоровых доноров и образцы кожи, полученные в ходе пластических операций у здоровых людей.

Критерии интерпретации результатов.

Результат фрагментного анализа был виден как набор пиков в области амплификации Ту - 80 - 255 п.н., Туу - 90- 280 п.н., IgH FRI - 310 - 360 п.н., IgH FRII -250-295 п.н, IgH FRIII - 100-170 п.н.

Отрицательный (поликлональный) результат определяли при наличии множества пиков ПЦР-продукта. Результат считался положительным (моноклональным) при наличии одного или двух четких доминантных пиков ПЦР-продукта (в случае биаллельной реарранжировки). При этом пики ПЦР-продукта должны были преобладать и превышать поликлональный фон более

чем в 3 раза. Если имелось более 3-х четких пиков, то результат оценивался как

И

олигоклональный. При наличии одного или двух четких пиков, которые превышали поликлональный фон в 2-3 раза, результат оценивался как сомнительный моноклональный (рис.1).

200 300 А) Результат поликлональный

600 500 . J iJill L

12000 4000 Б) Результат моноклональный.

Рисунок 1. Выявление клональности с помощью ПЦР по генам TCRy методом фрагментного анализа

Определение чувствительности метода ПЦР-метода фрагментного анализа по генам гамма цепи Т-клеточного рецептора .

Было определено минимальное количество ДНК, требуемое для успешного проведения ПЦР. Для этого в ПЦР реакцию брали различные (бОООнг, 2000нг, ЮООнг, 500нг, ЮОнг, 50 нг, 20 нг, 5 нг, ] нг) количества ДНК клеточной линии Jurkat и поликлональной ДНК, выделенной Т-клеток периферической крови здорового донора. Для определения чувствительности метода PCR-FA-TCRy ДНК клеточной линии Jurkat смешивали в разных пропорциях с ДНК, выделенной из различных из Т-клеток периферической крови. Выделение Т-клеток из мононуклеаров периферической крови осуществляли с помощью магнитных носителей, коньюгированных с антителами к CD3 (Myltenyi Biotec), в соответствии с протоколом производителя, на колонках MS. Во всех опытах использовались стандартные методы выделения ДНК, условия ПЦР и фрагментный анализ. В реакцию ПЦР брали ЮООнг поликлональной ДНК и различное количество ДНК клеточной линии Jurkat.

Статистические методы анализа данных

Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием пакета прикладных программ STATISTICA (StatSoft Inc. США, версия 6.0). Учитывая небольшие объемы выборок и распределения,

12

отличающиеся от нормального, были использованы непараметрические методы анализа данных. Сравнение независимых групп по качественным признакам осуществлялось путем анализа таблиц сопряженности с использованием двухстороннего точного критерия Фишера для несвязанных групп или критерия

с поправкой Йетса в зависимости от ожидаемых частот признака. Уровень критической значимости р<0,05.

Соотношение между результатом исследования диагностических признаков и верным диагнозом характеризовали с помощью чувствительности (БЕ), специфичности (БР), прогностической ценности результата (РУ+/-) и отношения правдоподобия (ЬЯ+/-) результата теста.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для постановки диагноза в каждом случае мы использовали данные анамнеза пациента, клинической картины, результата патоморфологического исследования, а также (при установлении диагноза ЛК для ее верификации формы и стадии) иммуногистохимического исследования биоптата пораженной кожи и молекулярно-генетического метода фрагментного анализа для определения Т-клеточной клональности биоптатов кожи очагов поражения.

I этап дифференциальной диагностики проводился на основе клинических особенностей болезни у 181 пациента, на основании которой были выделены 5 патогномоничных признаков, позволяющие заподозрить у этих больных лимфопролиферативное заболевание кожи.

Все обследованные пациенты были разделены на 3 группы: 1 (ТКЛК 1ст, парапсориаз и экзема) группа характеризовалась наличием только пятен, 2 (ТКЛК 2ст., парапсориаз, атопический дерматит и ТПЛК) группа — папулами и бляшками, 3 (ТКЛК Зет., ВКЛК и ВПЛК) группа - узлами.

В 1 группу было включено 64 пациентов, которым требовался дифференциальный диагноз между 1 стадией ТКЛК, парапсориазом и экземой (табл. 2).

Таблица 2

Клинические признаки заболеваний у пациентов 1 группы.

—-—_ЛСлинические признаки ТКЛК, 1 ст. пп Экзема

Диагноз ' ---------- п=24 п=20 п=20

Пятна 24(100%) 20(100%) 20 (100%)

Зуд 24(100%) 16(80%) 20 (100%)

Как видно из табл. 2, при ТКЛК 1 стадии и экземе пятна и зуд присутствовали в 100% случаев, а при парапсориазе пятна были в каждом случае, а зуд в 80% случаев. Статистически значимых различий в частоте встречаемости этих симптомов выявлено не было (р>0,05). Таким образом, поскольку различия между указанными признаками при сравниваемых заболеваниях были не значимы, использовать их в качестве дифференциально диагностических было невозможно.

Во 2 группу было включено 94 пациентов с заболеваниями, клиническая картина которых требовала дифференциальной диагностики между 2 стадией ТКЛК, парапсориазом, атопическим дерматитом, псориазом и псевдолимфомой кожи (табл.3).

Таблица 3

~~~~~^~1$линические признаки ТКЛК ПП АД Пс Т-ПЛК

2 ст. п=20 п=20 п=20 п=10

Диагноз п=24

Бляшки 24 (100%) 20 (100%) 20 (100%) 20(100%) 10 (100%)

Пятна 23 (77%) 10 (40%) 9 (45%) 0 0

Зуд 24 (100%) 12 (60%) 20 (100%) 20(100%) 10 (100%)

Лимфоаденопатия 24(100%) 0 0 0 0

Клинические признаки заболеваний у пациентов 2 группы.

Как видно из табл. 3, при 2 стадии ТКЛК бляшки, лимфоаденопатия и зуд присутствовали в 100%, а пятна - в 77% случаев. При крупно- и мелкобляшечном парапсориазе бляшки отмечались в 100% случаев, пятна и зуд в 40% и 48% случаев соответственно. При атопическом дерматите, псориазе и Т-ПЛК бляшки и зуд были в 100%, а пятна - только в 45% случаев.

Таким образом, различия между представленными группами были статистически большими, чем в 1 группе пациентов (р<0,05) и использование этих клинических признаков позволяло поставить диагноз 2 стадии ТКЛК с большей вероятностью, по сравнению с больными 1 группы (р<0,05).

В 3 группу было включено 23 больных, клиническую картину которых было необходимо дифференцировать между 3 стадией ТКЛК, ВКЛК и ВПЛК (табл. 4).

Таблица 4

~~ ~~——_____ Клинические признаки ТКЛК, 3 ст. ВКЛК В-ПЛК

п=11 п=9 п=3

Диагноз """""----

Пятна 4 (36%) 0 0

Бляшки 10(91%) 4 (44%) 0

Узлы 11 (100%) 5 (56%) 3 (100%)

Лимфоаденопатия 11 (100%) 9(100%) 0

Зуд 11 (100%) 0 2 (67%)

Клинические признаки заболеваний у пациентов 3 группы.

Как видно из табл. 4, при ТКЛК 3 стадии узлы, лимфоаденопатия и зуд присутствовали в 100% случаев, а пятна и бляшки были у 36% и 91% пациентов, соответственно. Клиническая картина при ВКЛК характеризовалась присутствием узлов в 56%, бляшек в 44% и лимфоаденопатии в 100% случаев. Клиническая картина при ВПЛК характеризовалась наличием только узловых элементов и зуда в 100% и 67% случаев, соответственно.

Таким образом, различия между представленными группами были статистически большими, чем в 1 группе пациентов (р<0,05) и использование этих клинических признаков позволяло поставить диагноз 3 стадии ТКЛК с большей вероятностью, по сравнению с больными 1 группы (р<0,05).

Проведение дифференциального диагноза между I стадией ТКЛК, парапсориазом и экземой на основании предложенных клинических признаков не представлялось возможным без использования дополнительно гистологического исследования биоптатов пораженной кожи.

На II этапе исследования была изучена диагностическая эффективность гистологического метода исследования биоптата пораженной кожи в дифференциальной диагностике лимфом кожи, парапсориаза, псевдолимфом кожи и ХДЦ (рис. 2).

Диагноз не установлен

>™ ~6о1

13~|

40 1

Ш

24 |

13 I

10 20 30 40 50 60 70 КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ

Рисунок 2. Гистологическая характеристика обследуемой группы больных.

На 1 стадии ТКЛК гистологический метод позволил установить диагноз только в 13 (54,16%) случаях, тогда как при 2 и 3 стадиях ТКЛК и ВКЛК - в 100% случаев. При псевдолимфомах кожи и ХДД патоморфологический метод позволил установить диагноз в 100% случаев.

Таким образом, по результатам клинико-гистологического исследования у 59 пациентов с ТКЛК диагноз установлен на 2 и 3 стадиях в 100% случаев, тогда как на 1 стадии ТКЛК диагноз верифицирован только в 22,03% случаев (р<0,05).

На III этапе исследования всем пациентам с клинико-морфологически подтвержденным диагнозом ЛК было проведено ИГХ исследование опухолевого пролиферата биоптата пораженной кожи (таб.5).

плк

Парапсориаз ВКЛК ТКЛК, 3 ст ТКЛК, 2 ст ТКЛК, 1 ст

Таблица 5

Гистологическая и иммуногистохимическая характеристика обследуемой

группы больных

Кол-во пациентов Форма Ж Иммунофенотип ЛК

N=57

33 Грибовидный микоз CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD45RO+-.

3 Грибовидный микоз CD3+, CD4+, CD8+, CD7+, CD45RO+

4 Грибовидный микоз CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7-

оо 1 • Педжетоидный CD4+, CD5+, P-F10, CD8+

с ретикулез

* 1 • Фолликулотропный ГМ CD3+, CD4+, CD8+, CD7+, CD45RO+

1 Первичная кожная CD3+, CD4+, CD5+, CD30+, CD20+,

о анапластическая лимфома TIA-1+, Ki-67+ 30-40% клеток, CD56+,

2 кожи единичные CD7+ клетки;

К 1 Первичная кожная CD3+, CD4+, CD30+, CD20-, Ki-67+ 30-

е§ X анапластическая лимфома 40% клеток

О кожи

<D 1 Лимфоматоидный папулез CD3+, CD4+, CD30+, HLA-DR

Н 1 Синдром Сезари CD3+, CD4+, CD5+, CD7-. CD8+

1 ЫК/Т-клеточная лимфома, CD2+, CD16+, CD45+, CD56+, Ki-67

назальный тип

1 С08+ цитотоксическая лимфома кожи CD2-, CD3+, CD4-, CD5-, CD8+, CD7-

1 Лимфоматоидный CD20+, CD3+

* гранулематоз

1 Первичная кожная диффузная CD20+, CD79a, CD 10-, Bcl-2+, Bcl-6+,

о В-крупноклеточная лимфома MuM-l+

-©< кожи, тип нижние конечности

§ t 6 Первичная кожная лимфома CD20+, CD3+m, CD4+, CD5+, CD7+,

из клеток фолликулярного CD8+, Perforin+, CD 10+/-, Bcl-2+, Ki-67

т о центра составляет до 20-30% позитивных

клеток

СО 1 Диффузная крупноклеточная CD20+, Bcl-2+, CD 10-, CD5-, Ki-67

лимфома кожи составляет до 5-7% позитивных клеток

Исходя из полученных данных, ИГХ метод исследования позволяет установить иммунофенотип опухолевого пролиферата в соответствии с классификацией ВОЗ/ЕСЖТС (2005) и установить нозологическую форму ЛК, что позволяет разработать индивидуальный подход к лечению каждому из обследованных пациентов (рис.3).

Диффузная крупноклеточная лимфома кожи |

Первичная кожная лимфома из клеток... ИШМ Первичная кожная диффузная В-... I Лимфоматоидный гранулематоз 5

к

а

то С08+ цитотоксическая лимфома кожи 1

и

£ МК/Т-клеючная лиг/.фома кожи, назальный тип |

га

СП

Синдром Сезари 1 Лимфоматоидный папулез I Первичная кожная аналластическая лимфома... ■

Грибовидный микоз ^■■■■■■ШНКННШШЭДШШШШН^В^Н

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Количество пациентов

Рисунок № 3. Распределение больных с ЛК кожи по нозологическим формам в соответствии с классификацией ВОЗ/ЕОЯТС (2005).

Таким образом, при использовании традиционно применяемого диагностического комплекса, включающего общепринятые на сегодняшний день клинические, гистологические и иммуногистохимические методы исследования диагноз лимфомы кожи удалось установить у 57 (83,82%) пациентов от 2 до 25 лет (в среднем 6,3 ± 0,8 года).

На IV этапе диагностического поиска для верификации диагноза у 11 больных с подозрением на ТКЛК в дополнение к гистологическому методу нами было использовано молекулярно-генетическое исследование с помощью ПЦР на основании фрагментного анализа (РСЯ-БА) определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам у-цепи Т-клеточного рецептора (ТСЯу), с использованием праймера ВЮМЕЭ-2 ВМН4-СТ98-3936, который, по данным литературы, позволяет определить клон опухолевых клеток на ранней стадии заболевания.

Моноклональность лимфоидных клеток была выявлена у 10 (90,9%) больных (со сроком заболевания 7,3 ± ОД месяцев). Гистологическая верификация диагноза ТКЛК у этих пациентов была осуществлена позже в сроки от 6 и до 20 месяцев - в среднем на 14,6 ± 0,5 месяца.

Всем 10 пациентам также было проведено ИГХ исследования с установлением нозологической формы и определением тактики лечения.

У 1 пациента со сроком заболевания 10 месяцев диагноз до сих пор верифицировать не удалось, в связи с чем, он находится под динамическим

18

наблюдением на симптоматическом лечении (с рекомендацией проведения 1 раз в 3 месяца гистологического исследования биоптата пораженной кожи). Этот пациент длительно и бессистемно применял наружно глюкокортикостероидные мази, действие которых могло повлиять на результаты диагностических методов исследования.

Ранее нами было продемонстрировано определение клональности другим методом PCR-SSCP-TCRy (метод конформационного одноцепочечного полиморфизма) у 12 пациентов также с подозрением на TKJIK и моноклональность лимфоидных клеток была выявлена лишь у 4 (33,3%) больных (со средним сроком заболевания 10,7 ± 0,3 месяцев). Однако, гистологическая верификация диагноза ТКЛК у этих пациентов была осуществлена на более поздних сроках болезни (в среднем на 18,1 ± 0,4 месяцев), чем в представленной выше группе. Однако, при исследовании этих же пациентов методом PCR- FA -TCRy моноклональность была выявлена во всех 12 (100%) случаях.

Таким образом, Т-клеточная клональность методом PCR- FA -TCRy у пациентов с подозрением на ТКЛК была выявлена в 91,0 % случаев (у 10 из 11 пациентов, со средним сроком заболевания 7,3 ± 0,1 месяцев) при равных интервалах проведения молекулярно-генетического обследования.

Таким образом, данные нашего исследования позволяют с большой достоверностью (р > 0,05) рекомендовать метод PCR-FA-TCRy для проведения ранней диагностики лимфом кожи.

В качестве контроля метода PCR- FA -TCRy нами было обследовано - 48 пациентов с ТКЛК, из которых моноклональность лимфоидных клеток выявлена в каждом (100%) случае. Из 40 пациентов с гистологически установленным диагнозом парапсориаз у 39 в биоптате пораженной кожи определена поликлональность лимфоидных клеток, у 1-моноклональность лимфоцитов, что послужило последующему динамическому наблюдению данного пациента с повторным проведением гистологического исследования, результат которого был подтвержден через 3 месяца картиной ГМ. С установленными патоморфологически диагнозами у 60 пациентов с ХДЦ и у 13 — с ПЛК в 100% случаях результат был поликлональным.

В результате определения чувствительности молекулярно-генетического исследования ПЦР-методом фрагментного анализа было установлено, что нижний порог чувствительности метода PCR-FA-TCRy, т.е. минимальное количество моноклональных клеток, при котором выявляется клональность,

составляла 10-15% или 200-300 опухолевых Т-лимфоцитов на количество Т-лимфоцитов в образце, равное 2000.

Таблица 6

Сравнение диагностических критериев гистологического и молекулярно-генетического методов исследования

Заболевание

Присутствует Отсутствует

Тест Положительный 57 11 68 +PV=0,838

Отрицательный 1 113 114 -PV=0,009

58 124 182

Se=0,983 Sp=0,911 Р=0,319

+LR= 11,045 -LR=0,019

Чувствительность (Se) теста — 0,983 Специфичность (Sp) теста — 0,911

Прогностическая ценность положительного результата теста (PV+) — 0,838 Прогностическая ценность отрицательного результата теста (PV-) — 0,009 Отношение правдоподобия положительного (LR+) результата теста — 11,045 Отношение правдоподобия отрицательного (LR-) результата теста - 0,019 Распространенность (Р) заболевания в группе больных — 0,32

Таким образом, из полученных данных следует, что диагностическая эффективность молекулярно-генетического метода статистически значимо выше, чем гистологического метода исследования, т.к. чувствительность (Se 0,983) и специфичность (Sp 0,911) молекулярно-генетического метода достоверно выше чувствительности гистологического. Распространенность заболевания в группе больных составляет 0,32.

Обнаружение Т-клеточной клональности лимфоидных клеток на самом раннем сроке развития ГМ, то есть еще при отсутствии гистологических критериев этого диагноза, позволяет использовать метод PCR- FA -TCRy для выявления ранних стадий ТКЛК, а также необходимость обоснованно рассматривать таких пациентов, как «группу риска» по развитию лимфопролиферативного заболевания.

Выводы

1. Использование молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам гамма цепи Т-клеточного рецептора с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа с праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936 позволило выявить моноклональность лимфоидных клеток в биоптатах пораженной кожи у 67 (98,5%) пациентов с TKJIK (на сроках от 3 месяцев до 25 лет, в среднем 5,7 ± 3,7 месяцев).

2. Чувствительность молекулярно-генетического метода, при которой возможно достоверное определение Т-клеточной клональности с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа составляет 200-300 опухолевых Т-лимфоцитов на 2000 всех Т-лимфоцитов исследуемом образце ДНК (или 10-15% от всех Т-лимфоцитов в исследуемом образце ДНК).

3. В группе пациентов с подозрением на Т-клеточную лимфому кожи на ранних сроках (от 3 до 10 месяцев) заболевания методом с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа по генам гамма цепи Т-клеточного рецептора удалось установить наличие моноклональности лимфоцитов биоптатов пораженной кожи в 10 из 11 случаев, тогда как, при использовании метода одноцепочечного конформационного полиморфизма на сроках заболевания от 4 до 25 месяцев - она выявилась в 4 из 12 случаев, что характеризует метод фрагментного анализа, как высоко чувствительный и специфичный (Se 99,5%; Sp 91,1%, р<0,05).

4. Разработанный метод определения В-клеточной клональности лимфоидных клеток с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа по генам по генам тяжелой цепи иммуноглобулина с праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936 позволил установить наличие моноклональности в биоптатах пораженной кожи у 9 (100%) пациентов с ВКЛК.

5. С помощью современных иммуногистохимических и молекулярно-генетических методов была определена структура лимфом кожи у 67 больных региона Москвы и Московской области, из которых - у 58 (86,6%) пациентов была диагностирована Т-клеточная лимфома кожи: в том числе, грибовидный микоз 52 (89,6%) и его варианты: педжетоидный ретикулез — 1 (1,9%), фолликулотропный ГМ — 1 (1,9%), а также синдром Сезари - 1 (1,7%), лимфоматоидный папулез - 1 (1,7%), первичная анапластическая крупноклеточная лимфома кожи — 2 (3,5%), NK/T-клеточная лимфома кожи, назальный тип — 1 (1,7%), CD8+

цитотоксическая лимфома кожи - 1 (1,7%), и у 9 (13,4%) пациентов В-клеточная лимфома кожи, среди которых лимфоматоидный грануломатоз - 1 (11,1%), диффузная крупноклеточная лимфома кожи - 1 (11,1%), диффузная крупноклеточная лимфома, тип нижние конечности — 1(11,1%), лимфома из клеток маргинальной зоны - 1 (11,1%), лимфома из клеток фолликулярного центра - 5 (55,6%).

Практические рекомендации

1. Применение молекулярно-генетического исследования с помощью метода фрагментного анализа в комплексе с праймером BIOMED -2 Concerted Action ВМН4-СТ98-3936 позволяет повысить эффективность ранней диагностики Т-клеточной лимфомы кожи и может быть рекомендовано для использования в клинической и амбулаторной практике врачей дерматологов и гематологов.

2. Применение молекулярно-генетического метода позволяет формировать «группу риска» по развитию Т-клеточной лимфомы кожи, для осуществления мониторинга и профилактики развития заболевания.

3. Дифференциальная диагностика хронических доброкачественных дерматозов и злокачественных лимфом кожи наиболее эффективна при использовании комплексного обследования пациентов, включающего клинико - морфологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов исследования.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Тарасенко Г.Н., Кузьмина Ю.В., Овсянникова Г.В., Ковригина A.M., Грознова A.A., Бобров М.А. Педжетоидный ретикулез // Российский журнал кожных и венерических болезней-2008.- №5. - с.4-6.

2. Молочков В.А., Снарская Е.С., Овсянникова Г.В., Сурикова Н.С., Грознова A.A., Терпигорьев С.А., Ковригина A.M. Генерализованный саркоидоз, осложнившийся развитием анапластической CD30+ крупноклеточной Т-лимфомы кожи // Российский журнал кожных и венерических болезней-2009 - №5 - с. 15-20.

3. Молочков В.А., Ковригина A.M., Снарская Е.С., Овсянникова Г.В., Сурикова Н.С., Грознова A.A., Федоровская A.B. К диагностике особых форм Т-клеточных лимфом кожи// Материалы конференции «Герпес и инфекции передаваемые половым путем», Москва, 27-28 мая, 2009г., с.96-101.

4. Овсянникова Г.В., Федоровская A.B., Грознова A.A. Анапластическая крупноклеточная CD30+ лимфома кожи// Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» Москва, 2728 мая, 2010г.-с.13-17.

5. Молочков В.А., Овсянникова Г.В., Федоровская A.B., Грознова A.A. К дифференциальной диагностике эритродермии при псориазе и грибовидном микозе// Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии», Москва, 27-28 мая, - с.59-61.

6. Молочков В.А., Сидорова Ю.В., Грознова A.A., Овсянникова Г.В., Федоровская A.B., Молочков A.B., Судариков А.Б. Роль молекулярно-генетических методов определения Т- и B-клеточной ¡атональности в диагностике злокачественных лимфом кожи// Вестник дерматологии и венерологии - 2011 - №3 — с. 52-57.

7. Молочков В.А., Ковригина A.M., Казанцева И.А., Овсянникова Г.В., Грознова A.A., Федоровская A.B., Бобров М.А. Лимфоматоидный гранулематоз// Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2011.-№1.-с.4-6.

8. Молочков В.А., Молочков A.B., Меньшикова Г.В., Грознова A.A., Федоровская A.B. Методы определения клональности опухолевого пролиферата в диагностике лимфоматоидного грануломатоза// Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии», Москва, 26-27 мая, 2011г., - с.75-78.

9. Федоровская A.B. Молочков A.B., Грознова A.A., Меньшикова Г.В. Эффективность молекулярно-генетических методов определения клональности в диагностике злокачественных лимфом кожи// Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии», Москва, 2627 мая, 2011г., -с.155-157.

10. Молочков В.А., Молочков A.B., Грознова A.A., Федоровская A.B. Применение молекулярно-генетического метода при определении Т- и В-клеточной клональности в диагностике злокачественных лимфом кожи// I Московский Форум «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики», Москва, 11 — 12 октября 2011 г. Тезисы докладов. - с.72.

11. Молочков В.А., Ковригина A.M., Молочков A.B., Овсянникова Г.В., Федоровская A.B., Грознова A.A. К вопросу о трудностях диагностики эритродермических вариантов Т-клеточных лимфом кожи // Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2011.-№3.-с.4-6.

12. Молочков В.А., Ковригина A.M., Меньшикова Г.В., Грознова A.A., Федоровская А. В., Ефимович И.В. К диагностике и лечению первичной анапластической крупноклеточной лимфомы кожи// Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии», Москва, 2425 мая, 2012г.,-с.59-61

13. Молочков В.А., Ковригина A.M., Молочков A.B., Караулов A.B., Меныцикова Г.В., Федоровская А. В., Ефимович И.В., Грознова A.A. Применение количественных способов оценки активности заболевания в диагностике и лечении Т-клеточных лимфом кожи// Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии», Москва, 24-25 мая, 2012г., - с.65-67

14. Молочков В.А., Сидорова Ю.В., Меньшикова Г.В., Грознова A.A., Федоровская A.B., Ефимович И.В. Различные подходы к определению клональности при Т-клеточной лимфоме кожи// Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2012 - №5 - с.8-9

15. Молочков В.А., Ковригина A.M., Сидорова Ю.В., Меньшикова Г.В., Грознова A.A., Федоровская A.B. Молекулярно-генетическое определение Т-клеточной клональности лимфоидных клеток// Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2013 - №2 - с.4-6

Список сокращений:

BKJ1K - B-клеточная лимфома кожи

ВПЛК - B-клеточная псевдолимфома кожи

ГМ - грибовидный микоз

ЛК - лимфомы кожи

ПЛК - псевдолимфом кожи

МБП - мелкобляшечный парапсориаз

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТКЛК - Т-клеточные лимфомы кожи

ТПЛК - Т-клеточная псевдолимфома кожи

Подписано в печать 09.06 2014 Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 18584 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39