Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Свойства везикулярных форм транспорта холестерина желчи при билиарной патологии

1 п Р ц •)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИНСТИТУТ УСОВЕРЙЕНСТВОВАНИЯ ВРПЧЕИ

На правах рукописи

ПРИГУН Наталья Павловна

СВОЙСТВА ВЕЗИКУЛЯРПНХ ФОРМ ТРАНСПОРТА ХОЛЕСТЕРИНА !ЕЛЧИ ПРИ ШИАР110И ПАТОЛОГИИ.

(14.00.05 - внутренние болезни)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Минск 1992

Работа выполнена в Пинском ордена Трудового Красного Знамени государственной медицинском институте.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор медицинских наук,профессор

И.И.Гончарик

ОФИЦШЫШЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор медицинских наук.профессор И.Н.Броновец Доктор медицинских наук,профессор В.С.Камышников

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕ1ДЕНИЕ : Гродненский медицинский институт

Зачита состоится ^ г, часов на заседа-

нии специализированного совета К 071.24.01 Оелорусскиго института усовершенствования врачей.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусскиг института усовервенствованиа врачей.

Автореферат разослан

Ученый'секретарь

специализированного совета,

кандидат медицинских наук С.Л.Петров

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Холестериновый холелитиаз на сегодняшний день составляет от 70 до 80% всех случаев желчнокаменной болезни (ЖКБ) в индустриально развитых стран Запада (Дедерер, 1981;Мансуров ,1985;Weisberg,1984;GREPC0,1988) и представляет собой серьёзную медико-социальную проблему,составляющими которой являются: 1) недстаточное знание патогенеза ЖКБ, 2) отсутствие надежных диагностических критериев на ранних стадиях заболевания,а также при его латентном течении,3) необходимость оперативного лечения в большом проценте случаев,4) высокий процент стойкой и временной нетрудоспособности, 5) необходимость разработки новых нехирургических методов лечения ЖКБ,в основе которых лежит фрагментация и растворение желчных камней,и поиска новых профилактических средств.

Открытие новой немицеллярной формы транспорта холестерина желчи - везикул желчи (Somjen.Gilat,1983,1985; Pattlnson, 1986;Peled et al. ,1986; Lee et al. ,1987) существенно изменило представления о патогенезе ЖКБ. Согласно современной теории холестеринового холелитиаза причиной возникновения желчных камней является сочетание нескольких дефектов: гиперсатурации (перенасыщение желчи холестерином), застоя жйлчи в желчном пузыре и нуклеации кристаллов холестерина, пусковым механизмом которой является агрегация везикул желчи (Мараховский,1990; Kibe et al. ,1984; Hal pern et al. ,1986; Carey, 1988; Shriever, Jungst,1990).Однако,в настоящий момент процесс агрегации везикул желчи,его интимные механизмы,факторы, воздействующие на этот процесс (нуклеирующие и антинуклеирующие) являются наименее изученными. Нет исчерпывающих данных по морфологическим и физико-химическим свойствам основной формы транспорта холестерина желчи - везикул желчи.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: определение физико-химических свойств везикулярной формы транспорта холестерина желчи - везикул желчи и их патогенетической роли в процессе холестеринового холелитиаза

ЗАДАЧИ: 1. Определение физико-химических свойств везикул желчи при хроническом калькулёзном и хроническом бескаменном холециститах.

Z. Изучение влияния потенциальных нуклеирующих факторов на агрегационную способность везикул желчи при хроническом калькулёзном и хроническом бескаменном холециститах .

3. Изучение влияния потенциальных антинуклеирующих факторов на агрегационную способность везикул желчи.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Для исследования физико-химических свойств везикул желчи ( размеры, седиментационная плотность, соотношение ХС: ФЛ, способность к агрегации) нами впервые применялись фотон-корреляционная спектроскопия,ультрацентрифугирование в градиенте плотности перкола, преципитация везикул желчи дигитонином. Впервые предпринята попытка сравнить везикулы желчи при хроническом калькулёзном и хроническом бескаменном холециститах (ХБХ и ХКХ) на клиническом материале (большинство известных работ носит чисто экспериментальный характер и выполнено на искусственной желчи). Применение метода фотон - корреляционной спектроскопии позволило нам моделировать патологически^ процесс в нативной желчи in vitro при непосредственном воздействии потенциальных нуклеирующих (ионы кальция,перекиси липидов) и антинуклеирующих факторов.

Применение биохимических и биофизических методов исследования операционной и "дуоденальной" желчи (полученной при дуоденальном зондировании) позволило оценить информативность исследования последней.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Разработанные нами методики позволили адаптировать методы фотон-корреляционной спектроскопии, ультрацентрифугирования в градиенте плотности перкола и преципитации дигитонином к ранее не исследуемой среде - нативной желчи человека и могут быть рекомендованы для дальнейшего исследования её. Полученные результаты о размерах и других физико-химических свойствах везикул желчи представляют собой дополнительную информацию к относительно малочисленным сведениям о везикулах желчи при' ХКХ и ХБХ . Изучение влияния потенциальных нуклеирумцнх и антинуклеирующих факторов на везикулы желчи даёт представление об одном из важнейших ввеньев холестеринового холелитиаза - нуклйации кристаллов холестерина-моногидрата.

Метод преципитации везикул желчи с последующим определением молярного соотношения холестерин-фосфолипиды (ХС:ФЛ) в преципитате может быть испольвован для диагностики холелитиаза на ранней (биофизической) стадии и в силу своей простоты и доступности может быть рекомендован для биохимических лабораторий клинико-поликлинического звена.

Метод преципитации дигитонином в применении к Сыворотке крови может служить для диагностики гипербилирубинемии хо-лестатического генеза.

При исследовании воздействия веществ растительного происхождения установлен стабилизирующий эффект на вевикулы желчи, что позволяет рекомендовать их для дальнейшего изучения с целью перспективного применения для профилактики и лечения ЖКБ (медикаментозной литотрипсии).

Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать при комплексном лечении XXX и ХБХ применять препараты с выраженным антиоксидантным эффектом, а также препараты, предотвращающие ускоренную агрегацию везикул желчи.

: Результаты работы внедрены в практику работы гастроэнтерологических отделений 1 клинической больницы г. Минска, в учебный процесс на 1-ой кафедре внутренний болезней Минского государственного медицинского института.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 и подано в печать 3 научных работ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования докладывались на клинической конференции профессорско-преподавательского состава 1-ой кафедры внутренних болезней МГМИ .

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, обзора литературы,клинической характеристики больных, описания методов исследования, главы собственных результатов, состоящей из 5 разделов,обсуждения, выводов,практических рекомендаций и списка использованной литературы и изложена на 157 страницах машинописного текста Работа иллюстрирована 15 таблицами, 13 рисунками и 2 фотографиями. Список литературы включает 124 отечественных и 196 иностранных источников.

МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ

Особеностью клинического материала,положенного в основу настоящей работы,явилась специальная выборка больных, основным требованием к которой была высокая достоверность диагноза ХКХ и ХБХ. Критериями отбора служили клиническая картина, УЗИ-признаки, биохимия желчи,макроскопическая картина желчного пузыря во время операции, морфология стенки желчного пузыря и др. Благодаря такому подходу к подбору больных и применению сложных и высокоинформативных методов исследования получены достоверные

статистические результаты в относительно малочисленных клинических группах.

Клинический материал представлен 62 больными в возрасте от 20 и до 76 лет. Основные две группы составили больные ХКХ-34 человека и ХБХ - 8 человек. Дополнительную группу составили 10 человек о синдромом гиперСилирубинемии при различной гепа-то-билиарной патологии. Контрольной группой служ;ли больные хроническим гастритом с сохраненной, секреторной функцией и хроническим гастродуоденитом - 10 человек. Абсолютное большинство больных ХКХ и ХБХ (30 из 42 чел) представлено больными хирургического стационара,поэтому некоторые наши эпидемиоло-гичсекие показатели отличаются от общепринятых. Например,в группе больных ХКХ распределение по полу представлено соотношением М:Ж равным 1:33, что приближается к данным по хирургическому стационару - 1:29 (Турчина, 1987).

Обращает на себя внимание небольшой "стал" заболевания (менее 1 года - 26,БХ,менее 3-х лет - 22,4%.. 4-6 лет -26,БХ).который также объясняется особенностью хирургического стационара, где по мере возможности соблюдается принцип раннего хирургического лечения калькулезного холецистита. В группе ХБХ наиболее встречающийся "стаж" заболевания представлен 6-10 годами (37,5Х).Как правило,в этой группе преобладал доклинический "стаж",когда длительное время на поликлиническом этапе обследования хронический холецистит не был распознан (25%).Вместо диагноза ХБХ выставлялись диагнозы язвенной болезни, хронического гастрита, дуоденита, панкреатита, кардиологической патологии и др. Анализ подобной ситуации ещё раз подтверждает, что постановка диагноза ХЕХ и на сегодняшний день является трудной клинической задачей.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ '

В настоящей работе все исследования выполнялись с помощью общеизвестных методов клинико-лабораторной диагностики. Допол-■ нительно осуществлено более детальное изучение состава желчи у больных ХКХ и ХБХ. При этом проводился биохимический и биофизи-лский анализ желчи.

Биохимический анализ проведен в двух основных направлениях: определение литргенных свойств желчи и показателей, характеризующих воспалительный процесс в билиарном тракте. Литоген-

ные свойства желчи оценивались по содержанию в ней основных липидных компонентов (холестерин, желчные кислоты,фосфолипи-ды). Для характеристики степени насыщения желчи холестерином применялись как абсолютные значения этих показателей, так и относительные - молярность липидов, • а также литогенный индекс, рассчитанный по Thomas et Hofïtann (ИЛ). Для оценки воспалительного процесса в билиарном тракте в желчи определялись перекиси липидов/

Биофизический анализ. Так как именно размеры везикул и их изменение являются важной характеристикой .отражающей агрега-ционные изменения,происходящие в коллоидной системе,для их определения мы применяли метод фотон-корреляционной (ФКС)или динамической лазерной спектроскопии. Данный метод позволяет определить дисперсию, средние размеры везикул (их гидродинамический радиус), а также функцию распределения частиц по размерам, что крайне важно при исследовании подобной гетерогенной системы как желчь.

Для выделения везикул желчи и определения их седиментаци-онной плотности мы применяли метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности перкола. С целью выделения везикул желчи он использован впервые. В отличие от других градиентных жидкостей, применяемых для этих целей,перкол обладает способностью к быстрому формированию градиента плотности и является совершенно интактным по отношению к биологическим мембранам. Возможность использования 10 видов цветных фирменных маркеров плотности обеспечивает быстрый, простой и надежный способ измерения уровней плотности.

Для осаждения везикул желчи и последующего определения в них соотношения ХС: ФЛ применялся метод преципитации дигитони-ном.

Для визуализации и морфологичской характеристики везикул желчи применялась трансмиссионная электронная микроскопия (GEM - 1200, GE0L, Япония) с применением методики негативного контрастирования препаратом - Р.7. раствор фосфорно-вольфрамовой-кислотн.

У больных с гигтербилирубинемией при различной гепато-би-лиарной патологии применялся метод прецитиции дигитонином применительно к сыворотке крови.

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании операционной пузырной желчи больных ХКХ и ХБХ нами установлено, что размеры везикул желчи (ВЖ) колебались в широких пределах от 94 нм до 200 нм в диаметре и в среднем составляли 133.0+10,6 нм. Учитывая значительную гетерогенность ВЖ по размерам, наш условно было выделено 3 группы больных, желчь которых достоверно различалась по размерам частиц (р <0,01, р , <0,01): 1 группа - больные с преимущественным содержанием в желчи мелких ВЖ (средний диаметр менее 100 нм); 11 группа - ЕЖ средних размеров (средний диаметр 100-120 нм) и 111 - крупных ВЖ (со средним диаметром более 120 нм).

Сопоставление биохимических показателей желчи в этих группах выявило, что ВЖ проявляют различные физико-химические свойства в зависимости от размеров. Нами установлено, что размеры М увеличиваются по мере накопления перекисей липидов (ПЛ) в желчи больных. Существование крупных' везикул в желчи с достоверно (р<0,001) более высоким соотношением ПЛ/ФЛ может быть следствием адгезии и слияния мелких Ш под воздействием продуктов переписного окисления липидов желчи. С другой стороны, само существование крупных везикул приводит к возрастанию • ПЛ в желчи, поскольку они обладают большим субстратом для свободно-радикального окисления, однако первое представляется нам более вероятным.

По нашим данным у лиц с крупными ВЖ определялась достоверно (р <0,05, р <0,01) наименьшая длительность заболевания. Краткий анамнеь заболевания с момента клинических проявлений до оперативного вмешательства свидетельствует об остроте воспалительного процесса, что, как правило, сопровождается высокими показателями ПЛ в аозлчи. Обнаруженный факт может служить еще одним подтверждением того, что именно продукты пере-кисного окисления липидов играют важнейшую роль в изменении размеров ВЖ, способствуя их агрегации и слиянию. Индекс лито^ генности в отличие от ПЛ на размеры ВЖ существенно не влиял.

Обнаружена тенденция к повышению молярной доли холестерина на 1 моль фосфолипидов при укрупнении ВЖ, что указывает на большее насыщение крупных ВЖ холестерина. Известно, что включение 25-30 мол2 холестерина почти не влияет на размер везикул, однако, при концентрации холестерина, превышающей 30

молZ, размер везикул резко возрастает, при концентрации свыше БО мол% холестерин из "равновесного" бислоя выделяется в отдельную кристаллическую фазу (Barton, 197*6).

Обнаруженная нами тенденция к существованию в желчи более крупных ВЖ при относительно ьысоких концентрациях желчных кислот, которые, так известно.оказывают разрушающее (детерген-тное) воздействие на везикулы и липосомы может свидетельствовать о большей стабильности крупных ВЖ. Стабилизирующим фактором в этом случае может служить большее насыщение крупных ВЖ холестерином, т.к. известно,что холестерин сникает проницаемость биомембран для жирорастворимых ионов и воды,повышая повышая микровлзкость липидного бислоя и способствуя тем самым стабилизации везикул (Лопухин и др. ,1983, Вассерман и др. , 1933, Papahajopoulos et al. ,1977).

В настоящей работе впервые било проведено сравнение ЕЖ больных ХКХ и ХБХ с целью выяснения существуют ли различия в физико-химических свойствах у ВЖ сходных размеров при этих двух заболеваниях. Сравнение ВЖ при различной патологии, существенно различающихся по размерам, показалось нам не корректным, так как само различие в размерах обусловливает различие физико-химических свойств везикул, что убедительно доказано на липосомах. При этом оказалось, что в желчи больных ХКХ и ХБХ, содержащей Ш сходных размеров, не выявлено существенных различий в биохимических показателях, и это может означать, что физико-химические свойства ВЖ в значительной степени определяются их размера».™ независимо от патологии.

Обращает на себя внимание, что индекс литогенности гак при ХКХ, так и при ХБХ превышает 1,более того, имеется тенденция его к росту в группз больных ХБХ. Это может служить еще одним подтверждением того, что индекс литогенности не всегда содержит в себе дифференциально-диагностическое значение в определении холестеринового холелитиаза.

На сегодняшний день остается открытый вопрос об информативности исследования пузырной желчи, полученной при дуоденальном зондировании, хотя данный способ получения желчи является единственно доступным для учреждений клинико-амбулаторного звена. Это послужило основанием для исследования желчи, полученной при дуоденальном зондировании, на предмет обнаружения в ней ВЖ. При исследовании пузырной желчи больных ХКХ и ХБХ,

полученной при дуоденальном зондировании, методом ФКС установлено, что абсолютные размеры Ш "дуоденальной" желчи были меньшими почти в два раза по сравнению с таковыми в операционной желчи и составляли в среднем 57,7+5,85 нм в диаметре (операционная желчь - 133,0+10,5 нм). Столь значительное расхождение в размерах ВЖ "дуоденальной" и операционной желчи моулт быть объяснено присутствием в дуоденальной желчи факторов с возможным разрушающим воздействием на ВЖ (например, ккшечный и панкреатический сок, знтеральные раздражители холекинетики -33% раствор сернокислой магнезии и 20% раствор ксилита, детрит и др.). Настоящее исследование дуоденальной желчи продемонстрировало, что для нее сохраняются практически все тенденции в биохимических показателях, характерных для операционной кэлчи, исключение составляют абсолютные размеры ВЖ, что необходимо учитывать при подобных исследованиях.

Для определения еще одной важной биофизической характеристики ВЯ-седиментационной плотности нами был применен метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности перкола. С целью исследования ВЖ перкол был использован впервые. Он привлек нате внимание своей способностью к быстрому формированию градиента плотности и интактностью к биомембранам, в отличие от других градиентных жидкостей.

При исследовании калькулевной желчи установлено, что ВЖ имеют седиментационную плотность в пределах 1,060-1,048 гр/мл. При анализе фракций,полученных при ультрацентрифугировании в градиенте плотности перкола на уровне плотности 1,048 гр/мл и меньше определялись самые высокие изотопные пики, соответствующие наибольшему содержанию меченного холестерина Н и 1— фосфатидилхолина С,которые мы расценивали как везикулярные пики . фракции, соответствующие этим пикам .были взяты на трансмиссионную микроскопию с использованием методики негативного контрастирования 2% растовором фосфорно-вольфрамового натрия, фи этом определялось 2 вида частиц: сферические моно-дамеллярные липидные структуры везикул желчи с диаметром 50 -75 нм и компактные правильной сферической формы селиконовые частички перкола с диаметром 15 - 20 нм (см. фото 1). Осуществленный нами впервые седиментационный анализ везикулярной фракции калькулезной желчи в присутствии дигитонина позволил выявить феномен "дигитонинового сдвига". Известно, что ди-

(А.

Участи и, и

ПЕРКОЛА

ЖЕЛЧИ ЭД т^^-Ч

оото ^

Ч Ч

¿Л 1-7 -

чвнр ¿.оду ••• * *' г

'" л-"".-' « ( •

ЖЕЛЧИ

К

«9

,Сч ; .»с и

£ а ч

ЮИчм

Трансмиссионная электронна? микроскопия фракции зэлчн.полученной при ультрацзнтрмфагировании в градиенте плотности перкола на дровио плотности 1.063 г/мл.

гитонин, являясь специфическим реагентом на свободный холестерин связывается с частицами, содержащими холестерин, и тем самым изменяет их плавучую плотность, что и приводит к "дигито-ниновому сдвигу". Наличие в.данном случае мощного "дигитонино-зого сдвига" может свидетельствовать о значительной гетерогенности везикулярной фракции транспорта холестерина желчи, и в частности, о различном удельном содержании холестерина в ВЖ больных ХКХ.

Молярное соотношение ХС: ФЛ везикул желчи при ХКХ и ХБХ, определяемое в настоящем исследовании с помощью метода дигито-ниновой преципитации с последующи радиоизотопным анализом основных липидных компонентов, в среднем составило 2: 3. При сравнении молярного соотношения ХС: ФЛ при ХКХ и ХБХ оказалось, что оно равно 5:3 и 1:2, соответственно. Молярное соотношение В преципитате при ХКХ (6:3) может означать, что они в большей степени по сравнению с ВЖ при ХБХ способны к агрегации, т. к. известно, что фосфолипидные везикулы с молярным соотношением ХС:ФЛ>1 агрегируют гораздо легче, в результате чего могут появиться кристаллы холестерина . В таких везикулах образуются обнаженные участки холестерина, лишенные окружения фосфолипи-дов, что может быть достаточным условием для кластеризации с последующим образованием кристаллов холестерина (VI ¡бс!-^, Но-екэгга, 1984; БаШоП е1 а1. ,1990). При этом биохимические показатели в этих группах практически не различались.

Шлученные результаты позволяют рекомендовать метод преципитации дигитонином для диагностики холестеринового холели-тиаза на ранней биофизической стадии. Сходство результатов исследования молекулярного соотношения ХС: ФЛ в дигитониновом преципитате "дуоденальной" и операционной желчи позволяет применять данный метод цри дуоденальном зондировании, что делает его более доступным для лабораторий клинико-амбулаторного звена.

Так как гипербшшрубинемия, часто встречающаяся при ЖКБ и другой гепато-билиарной патологии, является следствием холе-мии, нам показалась логичной задача попытаться обнаружить ютици желчи в крови. В этих целях применялся упомянутый ранее метод преципитации дигитонином в некоторой модификации применительно к сыворотке крови. Параллельно осуществлялась преципитация липопротеидов крови (ЛГОШ,' ЛПОНП, ЛПБП).

Полученные данные свидетельствуют о наличии корреляции между уровнем гипербилирубинемии ( в основном, конъюгирован-ной) и уровнем холестерина, содержащимся в дигитониновом преципитате сыворотки (ЫЭ.61, р<0,02%) (рис. 4); при этом наибольшее количество холестерина в преципитате определялось у больных а синдромом холестаза (прч билиарном циррозе печени -22,7Х и механической желтухе, обусловленной раком головки поджелудочной железы - 15,7%), наименьшее - у больных с синдромом Жильбера (неконъюгированиой билирубинемии) - 1,5% и хроническим гастритам, служивших контролем - 3,27.. Определенной зависимости между уровнем гипербилирубинемии и холестерином, осажденным с липопротеидами крови, не было выявлено.

Учитывая специфическую способность дигитонина связи -ваться с частицами мембраноподобного строения и эффективно преципитировать Ш, можно считать, что преципитат, полученный из сыворотки крови больных о синдромом холестаза также представлен везикулярными образованиями. Тогда наличие корреляции между уровнем гипербилирубинемии (конъюгированной) и количеством холестерина в дигитониновом преципитате плазмы крови при холестазе позволяет предположить, что выделенная нами везикулярная фракция представляет собой либо ВЖ, либо аномальный липопротеид-Х (ЛП-Х), определяемый при холестазе. Известно, что аномальный липопротеид-Х определяется в плазме крови больных при холестазе, ЛХАТ - недостаточности и представляет собой моноламеллярную везикулу с диаметром 30-00 нм, имеющей в своем составе 65% фосфолипидов, 252 холестерина, 102 белка, с плотностью, приближающейся к таковой у ЛПНП и ЛПОНП. Приведенные данные свидетельствуют о сходстве структуры и размеров аномального ЛП-х и ВЖ и позволяют предположить, что они представ' ляют собой одну и ту же транспортную форму холестерина. Таким образом с помощью метода дигитониновой преципитации выделена везикулярная форма транспорта холестерина из крови больных с синдромом холестаза, не исключено, что она представлена везикулами желта, и это требует своего дальнейшего уточнения.

В настоящей работе также исследовалось влияние потенциальных нуклеирующих и антинуклеирующих факторов на агрегацион-ную способность ВЖ, которое определялось по степени изменения средних размеров ВЖ под их непосредственным, воздействием. Для этих целей применялся метод ФКС, который зарекомендовал себя

наиболее эффективным как раз в тех случаях, когда исследователя интересуют не абсолютные значения коэффициента диффузии со всеми вытекающими из него морфологическими характеристиками частиц, а их изменение под действием различных факторов.

Возможность осуществления измерения размеров везикул в нативной желчи при воз,*"*ствии in vitro нуклеирующих и анти-нуклеирующих факторов, позволило нам в некоторой степени моделировать определенные моменты патогенетического процесса при ЖКБ.

Из встречающихся в литературе потенциальных нуклеирующих факторов мы остановили свой выбор на ионах кальция, на перекисях липидов и денатурированной калькаулезной желчи, имитирующей нарушенное соотношение между основными липидами желчи.

Наш выбор обоснован тем, что ионы кальция играют важную роль во многих физиологических и мекмембранных процессах. Кальций влияет на ионную проницаемость плоских липидных бисло-ев и липосом (вызывает латеральное фазовое разделение мембранных компонентов, смещает температуру фазового перехода липида в ламеллярных структурах, индуцирует изотермические структурные изменения в липидных мембранах, способствует агрегации и слиянию липосом, приводит ка увеличению положительного (или уменьшению отрицательного) поверхностного электростатического потенциала мембран).увеличивает плотность упаковки молекул липида в моно- и бислоях, "модифицирует взаимодействие бислойных липидных мембран.

Предпочтение в нашей работе перекисям липидов обусловлено тем, что перекисное окисление представляет собой один из важнейших универсальных процессов повреждения мембран как природных, так и искусственных. Функциональные проявления этого процесса весьма разнообразны. Они затрагивают важнейшие физико-химические свойства мембран (проницаемость, вязкость, фазовое состояние), вызывают нарушения, обусловленные искажением белок-липидных взаимодействий в мембранах, приводят к повреждению продуктами окислительной деградации липидов, мембра-носвязанных и растворимых ферментных систем. Все эти проявления пепекисного окисления липидов играют важную роль в формировании многих патологических процессов, в том числе и при би-лиарной патологии (Владимиров,1937; Леев и др. , 1989).

Денатурированная калькулезная желчь, применяемая нами для

воздействия на ВЖ, в данном случае расценивалась как определенное соотношение детергент/липид. Предварительная денатурация исключала участие в процессе нуклеацин пузырного гли-ко-нротеида - муадна и других потенциальных нуклеирующих факторов белковой природы. На ппимере фосфатид/гл-холшювнх ли-посом, которые служат удобной моделью ВЖ, хорошо известно, что различные соотношения детергент-липид приводят либо к jfpano-Еанию штосом, либо к их разрушь пню че;.ез структурные переходы "липосомы - смешанные липосомы - смешанные мицеллы" (Иванов и др. ,1988; Ацагорцян и др. ,1989).

Результаты, полученные при воздействии ионов кальция на везикулы желчи свидетельствуют о том, что они обладают двух-направленным действием - индуцируют увеличения на 20-30% размеров мелких (<100 нм) ВЖ вследствие их адгезии и слияния и уменьшение на 127. размеров крупных (>120 нм) и средних (100-120 нм) ВЖ вследствие их лизиса. Ото не противоречит результатам, полученных на липосомах и свидетельствующим о том, что присутствие в среде конов кальция является фактором, способствующим как лизису, та!? и слиянию липосом друг с другом. Применительно к ВЖ существенно то, что кальций в значительной степени способен индуцировать конформационные изменения полярных головок лецитина: одна молекула кальция связывается с двумя молекулами лецитина, способствуя тем самым слиянию (Маркин,Козлов 1983; Attenbach, Seeling, 1984).

Воздействие ПЛ на везикулы желчи также носило двухнаправ-ленный характер: они индуцировали увеличение на 19% размеров мелких (<100 нм) ВЖ вследствие их адгезии и слияния и уменьшение на 17-18% средних (100-120 нм) и крупных (>120 нм) ВЖ вследствие их распада. Различный эффект Ш1 на R'fC разных размеров может быть обусловлен различием их физико-химических свойств. Примером последнего может служить доказанное нами различие в насыщении холестерином ВЖ разных размеров. По литературным данным известно о двойственном поведении холестерина в модели окисления., что позволяет предположить наличие у него как анти-, так и прооксидантных свойств в зависимости от условий. Закономерная взаимосвязь обшей интенсивности свободно-радикальных процессов и количество свободного холестерина r ли-пидах показывает, что для регуляции процессов свободно-радикального окисления холестерина аажны количественные ссотноше-

ния концентрации этого субстрата и остальных липидов в мембране.

Воздействие на ВЖ денатурированной калькулезной желчи, применяемой нами как эквивалент нарушенного соотношения основных липидов (желчные кислоты/фосфолипиды), имеющего место при «КБ, приводило'к значительному (на 23-42Х) уменьшению ВЖ всех размеров вследствие их распада. Сходные результаты были получены при исследовании фосфолипидных .липосом, содержащих холестерин, т. к. детергенты в зависимости от концентрации могут не только нарушать упорядоченность структурных мембран, но и приводить к их фрагментации с последующим уменьшением размеров липосом

Таким образом, полученные результаты относительно исследуемых потенциальных нуклеируквдх факторов свидетельствуют об их существенном модифицирующим воздействии на ВЖ и возможном участии в процессе агрегации ВЖ, что не исключает их патогенетической роли в процессе холестеринового холелитиаза.

Интересными оказались результаты сравнения воздействий вышеперечисленных факторов на ВЖ у больных ХКХ и ХБХ. ВЖ при ХБХ в большей степени изменяли свои размеры под воздействием ионов кальция (р<0,01), денатурированной калькулезной желчи ч дигитонина (р<0.01) но сравнению с ВЖ при ХКХ, что может свидетельствовать об их меньшей стабильности, ГШ, в отличие от всех других факторов, оказывали одинаковое воздействие на как при ХКХ, так и при ХБХ, хотя при этом сохранялась тенденция ВЖ при ХБХ к меньшей устойчивости. Наиболее вероятной причиной различия в стабильности ВЖ при ХКХ и ХБХ нам представляется их различная насыщенность холестерином: более насыщены ВЖ при ХКХ, менее - при ХБХ. Известно, что холестерин резко повышает устойчивость фосфолипидных везикул в результате снижения проницаемости мембран для жирорастворимых ионов и воды и повышения микровязкости липидного слоя (Вассерман и др. , 1983;Лопухин и др. ,1983; Меликян, 1984).

На основании полученных данных можно предположить, что относительно меньшая стабильность ВЖ при ХБХ может привести

1) к ускоренной их агрегации под воздействием определенных факторов, что неизбежно приведет к формированию камня, и тогда ХБХ можно рассматривать как начальную стадию холелитиаза;

2) к ускоренному распаду ЕК или переходу их из одного агрегат-

кого состояния в другое (везикулы - смешанные мицеллы), что может способствовать поддержанию коллоидного равновесия желчи, и тогда ХБХ можно рассматривать как самостоятельную патологию, не приводящую к холелитиазу.

В целях изучения воздействия на ВЖ больнчх ХКХ и ХБХ потенциальных антинуклеируюших факторов мы применяли вещества растительного происхождении - продукты переработки древесины (хлорофиллино-каротидная паста (ХКП), хлоррофиллин натрия, пренол, изабиенол). -Эти вещества были любезно предоставлены нам совместным предприятием на базе Лесотехнической Академии г. Ленинграда, латвийской фирмы "Силава" и Рижского медицинского института с целью определения воздействия на желчь и возможности их фармакологичешсого применения в дальнейшем. Дополнительным обоснованием для применения вышеперечисленных веществ в нашем исследовании явилось и то, что, например, ХКП, содержащая каротины и каротиноиды, а также хлорофиллин натрия, представляющий собой природный порфирин, входят в состав растительной грубо-волокнистой диеты, нормализующей липидный состав желчи и служащей для профилактики у.олелитиаза. Кроме того, хлорофиллин натрия обладает выраженной антиоксидантной активностью; пренол, относящийся к терпенам, входит в состав композийных препаратов холеретиков; изабиенол представляет собой природный долихол и является регулятором текучести мембран (из характеристики предоставленных веществ).

Полученные результаты свидетельствуют, что ХКП и хлорофиллин натрия индуцируют незначительное уменьшение средних размеров ВК на 5 и 14%, соответственно, что можно расценить как незначительный дезагрегирующий эффект, который более выражен у хлорофиллина натрия. Наличие прямой корреляции (г-0,9, р<0,01) между выраженностью эффекта на ВЖ перекисей липидов и хлорофиллина натрия можно объяснить общностью субстрата, на который воздействуют эти два вещества, а, именно, на фосфоли-пиды мембран ВЖ в реакции свободно-радикального окисления, где ПЛ являются индуктором ПОЛ, а хлорофиллин натрия - ингибитором. Мощный стабилизирующий эффект наблюдается у пренола и изабиенола, т.к. размеры везикул при их воздействии практически не изменялись, что позволяет расценивать их эффект как стабилизирующий.

Тогда одним из возможных механизмов реализации антинукле-

ируюцего воздействия на желчь можно предположить стабилизацию и дезагрегацию ВЖ, либо предотвращение разрушения и ускоренной агрегации ВЖ, лежащей в основе нуклеации и последующего формирования холестеринового камня. Не исключено, что способ реализации стабилизирующего эф*.ыа исследуемых веществ неодинаков: хлорофиллин натрия и ХКП, являясь антиоксидантами, могут влиять на перекисное окисление липидов; эффект пренола, относящегося к классу терпенов, может быть результатом предотвращения конечной стадии процесса агрегации ВЖ - адгезии и слияния; механизм стабилизирующего эффекта изабиенола может быть результатом изменения текучести мембран В* и подлежит дальнейшему изучению.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что исследуемые вещества растительного происхождения обладают стабилизирующим либо "мягким" дезагрегирующим эффектом. Обнаруженные нами эффекты вышеуказанных вешэств позволяют рекомендовать для дальнейшего изучения с целью перспективного применения для профилактики и лечения ЖКБ ( медикаментозной лито-трипсии).

ВЫВОДЫ

1. Везикулы желчи больных хроническим калькулёзным и хроническим бескаменным холециститами гетерогенны по размерам к физико-химическим свойствам: их размеры колеблются в пределах 94-200 нм в диаметре и в среднем составляют 133,0+10,5 нм в диаметре; имеют седиментационную плотность в пределах 1,048 -1,063 гр/мл; молярное соотношение холестерин: фосфолипиды (ХС: ФЛ) везикул желчи в среднем составляет 2:3.

2. Мэлярное соотношение холестерин: фосфолипиды (ХС: ФЛ) везикул желчи при хроническом калькулезном холецистите в среднем составляет 5:3; при хроническом бескаменном холецистите -1:2, что свидетельствует о большем насыщении везикул желчи холестерином при хроническом калькулезном холецистите.

3. Накопление перекисей липидов в желчи сопровождается увеличением размеров везикул желчи при хроническом калькулезном и хроническом бескаменном холециститах вследствие их адгезии и слияния,что свидетельствует о важнейшей роли продуктов перекисного окисления липидов в процессе агрегации везикул желчи, и, следовательно, нуклеации кристаллов холестерина.

4. Ионы кальция индуцируют увеличение размеров мелких ве-

зикул желчи вследствие их адгезии и слияния и уменьшение размеров средних и крупных везикул вследствие их распада, что не исключает их участия в процессе нуклеации кристаллов холестерина.

5. Везикулы желчи при хроническом бескаменном холецистите по сравнению с везикулами желчи при хроническом калькулёзном холецистите обладают менькей стабильностью (агрегационной устойчивостью) под воздействием на них модифицирующих факторов, что может быть следствием различной степени насыщения их холестерином.

6. Вещества растительного происхождения (хлорофиллино-ка-ротидная паста, хлорофиллин натрия, пренол, изабиенол)обладают стабилизирующим эффектом на везикулы желчи, не исключён также "мягкий" дезагрегирующий эффект, что позволяет рекомендовать их для дальнейшего изучения с целью возможного применения в качестве фармакологических средств для профилактики и лечения холелитиаза (медикаментозной литотроипсии).

7. Количество холестерина, осажденного из сызоротки крови методом преципитации дигитонином,коррелирует (г=0,6; р<0,02) с уровнем гипербилирубинемии (в частности, кон'чогированной) и поэтому может служить маркёром холестаза.

8. При исследовании дуоденальной желчи сохраняются все тенденции биохимических и биофизических показателей, характерные для операционной желчи; исключение составляют абсолютные размеры везикул желчи, что необходимо учитывать при подобных исследованиях; причиной значительного расхоадения в размерах может являться присутствие в дуоденальной желчи веществ с разрушающим воздействием на везикулы желчи (кишечный и панкреатический соки, энтеральные раздражители и др.)

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При исследовании желчи больных с билиарной патологией для дифференциально-диагностической цели должны применяться биофизические и биохимические методы, причём первым принадлежит' ведущая роль.

2. В целях диагностики холелитиаза на ранней (биофизический) стадии может быть использован метод преципитации везикул желчи дигитонином с последующим определением молярного соотношения холестерин: фосфолипиды (ХС:ФЛ) в преципитате; в

силу своей простоты и доступности он шкет быть рекомендован для биохимических лабораторий клинико-поликлинического звена.

3. Для диагностики гипербилирубинемии холестатического генеза может быть рекомендован метод преципитации дигитонином в применении к сыворотке крови.

4. При исследовании воздействия веществ растительного происхождения (хлорофиллино-каротидная паста, хлорофиллин натрия, пренол, изабивнол) установлен стабилизирующий эффект на везикулы желчи, что позволяет рекомендовать их для дальнейшего изучения с целью перспективного применения для профилактики и лечения ККБ (растворения камней).

5. Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать при комплексном лечении хронического калькулёзного и хронического бескаменного холециститов применение препаратов с выраженным антиоксидантным эффектом, а также препаратов, предотвращающих агрегацию везикул желчи.

6. Разработанные методики исследования везикул желчи с применением фотон-корреляционной спектроскопии, ультрацентрифугирования в градиенте плотности перкола и преципитации дигитонином могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения везикул желчи при билиарной патологии.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние гиперлипопероксидхолии на адгезивные свойства везикулярнх частиц желчи при билиарной патологии //IV Всесоюзный съезд гастроэнтерологов: Тез.докл. - М-Л - 1990. -Т.Н. -С. 65-66.

2. Ультрацентрифугирование желчи в градиенте плотности с целью выделения везикул желчи // Восьмой республиканский съезд терапевтов Белорусской ССР: Тез. докл. , декабрь 1990. - Минск. -1990. - С. 143 -145.

3. Характеристика везикулярных форм транспортирования холестерина желчи при использовании корреляционной лазерной спектроскопии // Восьмой республиканский съезд терапевтов Белорусской ССР: Т^з. док-л. .декабрь 1990. - Минск. -1990. - С. 145 - 140.

4. Характеристика везикул желчи человека методом лазерной динамической спектроскопии // X конференция молодых учёных "Квантовая электроники и спектроскопия": Тез. докл. , сентябрь 1990. - Паланга. -1990. -С. 160.

5. Адгезивные свойства везикулярных форм транспорта холестерина желчи при билиарлой патологии: Отчет о НИР /Минский мед. ин-т. N ГР. 018578616; Инв. N 02890027742. - Минск, 1990. -

44 с.

Подписано в печать 26.08.92г. Формат 60x84/16. Печ. л. I. Заказ 136, тираж 100. Бесплатно.

Отпечатано на ротапринте МГМИ. Минск, ул.Ленинградская,6.