Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Свободнорадикальные механизмы влияния асбестовых волокон на организм

РТ6 о» - г ом «36

На правах рукописи

СООДАЕВА Светлана Келдибековна

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ АСБЕСТОВЫХ ВОЛОКОН НА ОРГАНИЗМ.

14.00.07 - Гигиена 03.00.04 - Биохимия.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук.

МОСКВА 1996

Работа выполнена в научно-исследовательском институте пульмонологии МЗ и МП РФ и Российском государственном медицинском университете.

Научные консультанты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор ВЕЛИЧКОВСКИЙ Б.Т.

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор ЧУЧАЛИН А.Г.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ПАЛЬЦЕВ Ю.П. доктор медицинских наук, профессор ТОГУЗОВ Р.Т. доктор биологических наук ЮДИНА Т.В.

Ведущая организация - Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова.

Защита состоится " "_1996 года

в_часов на заседании диссертационного Совета Д.

084.05.01 при Московском ордена Трудового Красного Знамени НИИ гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана ( 141000, Московская обл., г. Мытищи, ул. Семашко, 2.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана.

Автореферат разослан "В-" ЬуХ^Сл^1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор _КОМАРОВА A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Природный волокнистый минерал асбест находит широкое применение в строительстве и ряде производств. Число лиц, контактирующих с асбестом, увеличивается как за счет людей, работающих с минералом в промышленности, так и населения, вдыхающего пыль вблизи асбестодобывающих и асбестопотреб-ляющих предприятий, а также в результате износа асбестсодержа-щих прокладок в автомобилях, асбестоцементных шиферных листов, служащих кровлей зданий и т.д.

Асбест обладает высокой биологической агрессивностью: вызывает воспалительные изменения в легких, развитие интерсти-циального фиброза - асбестоза, возникновение злокачественных новообразований - мезотелиомы плевры, рака легких. (Selikoff I.J.,1990, Измеров Н.Ф. с соавт.,1993, Mossman В.Т.,1993). По классификации Международного агентства по изучению рака, асбест входит в группу достоверно доказанных канцерогенов (Murray R., 1989). Он также усиливает канцерогенное действие 3,4-бензпирена и других ароматических углеводородов (Пылев JI.H. и др.,1990, Kamp D.W. et al.,1992). Заболевания, вызываемые асбестом, являются актуальной проблемой гигиены и профпатоло-гии, решение которой имеет важное медико-социальное значение.

Несмотря на энергичные усилия многих исследователей, механизм воздействия асбеста на организм остается невыясненным, как и причины промотирующего эффекта его по отношению к ароматическим углеводородам.

Исследования последних лет показывают важную роль сво-боднорадикальных процессов (СРП) в развитии профпатологпй. Выявлено усиление свободнорадикального окисления при силикозе, изменение перекисного окисления липидов (ПОЛ) при антракозе, а также под действием пылей сложного состава и других патогенных факторов (Величковский Б.Т.,1988,1995, Муравлева Л.Е.,1988, Архипова О.Г.,1983). Изучена взаимосвязь процессов ПОЛ и уровней тяжелых металлов переменной валентности при оценке функционального состояния организма (Юдина Т.В., 1992). Патологические процессы, обусловленные асбестом в организме, также пытаются связать с развитием свободнорадикальных реакций (Величковский Б.Т. и др., 1986, 1995, Korkina L.G. et al.,1988, Lund L.G. et al., 1991). Показано, что асбест может инициировать генерацию активных форм кислорода (АФК) двумя путями. Во-

первых, химические свойства асбестовых волокон, в особенности, входящие в состав ионы железа, обуславливают каталитическую активность в реакциях с образованием свободных радикалов. Во-вторых, асбест вызывает развитие "дыхательного взрыва" фагоцитирующих клеток с высвобождением активных метаболитов кислорода (Mossman В.Т. et al.,1990, Weiss S.J.,1989). Однако до сих пор не проведены комплексные исследования основных систем генерации активных форм кислорода под влиянием асбеста, неизвестно какие радикальные формы играют ведущую роль и по каким механизмам происходит реализация их повреждающего действия. Невыяснено также как действует асбест на метаболизм канцерогенных углеводородов, осуществляемый микросомальной монооксигеназной системой.

Цель исследования.

Изучение свободнорадикальных механизмов влияния асбеста на организм и разработка на этом основании новых способов гигиенической оценки асбестсодержащеи пыли, а также методов направленного скрининга медикаментозных препаратов для профилактики и патогенетической терапии заболеваний, вызываемых асбестом.

Задачи исследования.

1. Изучение молекулярных механизмов реализации активности асбестовых волокон в модельных бесклеточных средах.

2. Исследование влияния асбеста на активность микросомальной цитохром Р-450 содержащей монооксигеназной системы детоксикацип организма.

3. Характеристика действия асбеста на окислительный метаболизм фагоцитирующих клеток и ферментные системы "дыхательного взрыва".

4. Изучение изменения свободнорадикального статуса организма при экспериментальном асбестозе.

5. Создание комплекса методов для гигиенической оценки ас-бестсодержащей пыли и поиска перспективных препаратов с противоасбестовой активностью.

Научная новизна и теоретическая значимость исследований.

Теоретическое значение проведенных исследований заключается в выяснении свободнорадикальных механизмов патологического воздействия асбестовой пыли, в существенном углублении и расширении понимания причин стимулирующего, промотирующего канцерогенного эффекта, выявлении особенностей молекулярного механизма повреждающей способности минерала. Показана веду-

гцая роль железосодержащих активных центров на поверхности асбеста в катализе свободнорадикальных реакций. Количественно определена способность пылей асбеста генерировать супероксидные, а также различные типы гидроксильных радикалов. Установлено, что интенсивность этих реакций строго коррелирует с содержанием и координационным состоянием железа на минерале. Выявлено различие каталитических эффектов железа в растворе и на поверхности асбеста: в первом случае происходит генерация в основном ■свободных гидроксильных радикалов, а во втором - образование саитспецифичных криптогидроксильных радикалов. Впервые установлено, что повышение скорости генерации супероксида и окисления НАДФН под влиянием асбеста в монооксигеназной системе связано не с ускорением транспорта электронов в микросо-мальной цепи, а с усилением окислительно-восстановительных реакций на активных центрах волокон, конкурирующих за донор редокс-потенциалов. Показано, что под влиянием асбестовых волокон увеличивается продукция гидроксильных радикалов в микросомах, при этом основную часть составляют криптогидро-ксильные радикалы, индуцирующие процессы ПОЛ. Впервые установлено, что асбест способствует усилению гидроксилирования 3,4-бензпирена в микросомах по радикальному механизму. Обнаружено, что хроническое воздействие асбеста способствует снижению оксигеназной активности мпкросомальной системы и инактивации ключевого фермента цитохрома Р-450. Установлено, что под воздействием асбеста происходит непосредственная активация НАДФН-оксидазы фагоцитов, образование преимущественно криптогидроксильных радикалов, изменение редокс-цикла и повышение количества общего железа в системе. Выявлено, что оп-сонизация асбеста не приводит к инактивации минерала. Показано, что мутагенные эффекты асбеста обусловлены как генерацией криптогидроксильных радикалов, так и резким стимулированием ПОЛ бномембран. Выявлены особенности протекания свободнорадикальных процессов (СРП) на различных этапах развития экспериментального асбестоза: на начальных преобладает активация НАДФН-оксидазы и усиление генерации АФК; на стадии фиброзо-образования более характерно повышение ПОЛ в тканях, изменение редокс-цикла железа и антиоксидантной активности.

Практическая значимость.

Разработаны новые методы определения генотоксичности фиброгенной пыли и содержания каталитически активных железосодержащих центров на поверхности минерала, позволяющие дать

быструю и точную гигиеническую оценку асбестсодержащей пыли. Предложен комплекс современных физико-химических методов направленного скрининга медикаментозных препаратов для профилактики и патогенетической терапии заболеваний, вызванных асбестом. Обоснована необходимость использования соединений с антиоксидантными и хелатирующими свойствами в качестве противоасбестных средств.

Результаты исследований вошли в методические рекомендации "Экспериментальное обоснование предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) фиброгенной пыли в воздухе рабочей зоны предприятий топливно-энергетического комплекса", Москва, 1994. Материалы диссертации используются в учебном процессе курса пульмонологии ФУВ РГМУ, научно-исследовательской работе НИИ пульмонологии МЗ и МП РФ, лаборатории патогенеза и экспериментальной терапии пневмокониозов РГМУ, лечебной работе пульмонологического отделения 57 ГКБ г.Москвы.

Апробация работы.

Основные положения и материалы диссертации были доложены и обсуждены на 6 и 7 Всесоюзных семинарах и Международной школе "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине", Рига,1988; Рига,1989; Ленинград, 1991; 3 Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант", Москва,1989; 5 Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта,1989; Всесоюзном симпозиуме "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и патологии", Новосибирск,1990; 1 и 2 Всесоюзных Конгрессах по болезням органов дыхания, Киев,1990; Челябинск,1991; 3, 4, 5 Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания, Санкт-Петербург,1992; Москва,1994; Москва,1995; 1 симпозиуме "Окислительный стресс и повреждение тканей. Роль свободноради-кальных процессов в патологии легких", Москва,1994; Международном семинаре по экологической биофизике, Москва,1995; научных сессиях НИИ пульмонологии МЗ и МП РФ,1992,1993, 1994,1995,1996; научных конференциях кафедр биохимии, биофизики и лаборатории патогенеза и эксперментальной терапии пневмокониозов РГМУ.

Апробация диссертации проведена на совместной научно-практической конференции НИИ пульмонологии МЗ и МП РФ, кафедры госпитальной терапии педриатического факультета РГМУ, сотрудников 57 ГКБ (22.04.1996) и на заседании проблемной

комиссии Ученого Совета Московского НИИ гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана (07.06.1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 печатных работ.

Структура и обьем диссертации. Работа состоит из введения, 7 глав, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 57 рисунками, 4 схемами и 19 таблицами. Список литературы включает отечественных и зарубежных источников.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологические, в том числе канцерогенные, эффекты асбеста обусловлены генерацией гидроксильных и криптогпдро-ксильных радикалов, а также резким повышением пероксидации липидов биомембран. Усиление генерации активных форм кислорода обусловлено активацией НАДФН-оксидазы фагоцитов и каталитическими превращениями суперокспда и пероксида водорода на активных центрах поверхности минерала.

2. Механизм промотирования асбестом канцерогенного действия 3,4-бензпирена обусловлен усилением гидроксилирования углеводорода в микросомах по радикальному механизму. Асбест вызывает нарушение функционирования микросом путем прямого и опосредованного повреждения монооксигеназной системы.

3. При экспериментальном асбестозе реализуется свободнора-дикальный механизм влияния минерала, сопровождающийся изменением редокс-цикла железа и антиоксидантного статуса организма, а также снижением оксигеназной активности микросом.

4. Медикаментозные препараты с хелатнрующими, антирадикальными и антиоксидантными свойствами, а также способностью ингибировать ферментные системы, восстанавливающие молекулярный кислород, обладают противоасбестной активностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работу проводили на белых беспородных крысах обоих полов массой 180-200 г, крысах линии \Vistar, беспородных кроликах, а также на мышах линии С57В1. Всего в исследованиях было использовано 4707 крыс, 11 кроликов и 300 мышей. Объектом исследования служил биологический материал, взятый у экспериментальных животных: легкие, печень, альвеолярные и перитонеальные макрофаги, эритроциты, лейкоциты, нейтрофилы, сыворотка крови. В

работе также исследовались лейкоциты периферической крови 48 здоровых доноров.

Характеристика пылевых образцов.

В работе были использованы следующие образцы фиброгенной пыли: хризотил-асбест (ХА) Баженовского и Тувинского месторождений (Россия), крокидолит (UICC, Канада), эрионит Челябинского месторождения (Россия), эрионит (Болгария), клиноптилолит месторождения "Белый пласт" (Болгария), морденит (Болгария), морденит Шивыртуйского месторождения (Россия), кварц Люберецкого месторождения (Si02), международный стандарт кварца DQ12, стандартный диоксид титана (ТЮ2), стекловолокно и пек.

Хризотил-асбест (ХА) Баженовского месторождения характеризуется следующими параметрами: удельный вес - 2,2 г/см3, удельная поверхность - 53,7 м2/г, длина волокон менее 10 мкм, диаметр волокон менее 5 мкм. Баженовский ХА с 3,4-бензпиреном (БП), адсорбированным на поверхности волокон готовился следующим образом: вначале ХА отмывали избытком ацетона, после этого волокна высушивали и инкубировали с раствором БП в конечной концентрации 0.25 мМ, при премешивании в течение суток, затем суспензию центрифугировали для осаждения пыли, высушивали и использовали в опыте.

Для систематического изучения свободнорадикальной активности асбеста исследования проводили на четырех типах моделей: 1) в бесклеточной среде; 2) в суспензии клеточных мембран и органелл; 3) во взвеси клеточных элементов лабораторных животных и человека; 4) в хронических экспериментах на животных.

Подготовка биологических моделей.

Альвеолярные макрофаги выделяли по методу Bechard D.E. et al., 1988 с небольшими модификациями. Перитонеальные макрофаги получали по методу Berton G. et al.,1982. Сыворотку, эритроциты и клетки лейкомассы крови выделяли по общепринятым методикам (Клаус Д.,1987, Boyum А.,1968). Мембранные препараты НАДФН-оксидазы выделяли по Markert М. et al.,1984. Выделение микросом осуществляли согласно Карузиной И.И. и др.,1977. В работе использовали также образцы свежевыделенной цельной печени, гомогенат печени и легких, перфузированных физиологическим раствором.

Модель пылевого фиброза легких создавали путем интратра-хеального введения беспородным крысам 50 мг хризотил-асбеста в физрастворе. Подготовку пылевых образцов проводили методом

водной сепарации. В экспериментах использовали пыли, содержащие более 95% частиц с диаметром 5 и менее мкм.

Методы исследования свободпорадшсальпой активности асбеста.

Образование супероксндного радикала (02") в клетках оценивали спектрофотометрически (Hansen К. et al.,1987) с модификациями; в микросомах по Soodaeva S.K. et al.,1982 с модификациями; в бесклеточной системе по СОД-чувствительному восстановлению сукцинилированного цитохрома с. Генерацию гидроксильных радикалов (НО-) определяли по разрушению 2-дезокси-0-рпбозы (ДОР) согласно Moorhouse Ch.P. et al.,1985, с модификациями. Определение пероксида водорода (Н202) в бесклеточных и клеточных системах проводили с применением метода Pick Е. et al.,1980 с модификациями; в микросомах с помощью метода Hildebrandt A.G. et al.,1975. Генерацию радикалов кислорода в суспензии клеток определяли по люминол или люцигенин зависимой XJI (Allen R.C. et al.,1976). Активность мембранной НАДФН-оксидазы определяли по методу Markert М. et al.,1984, с модификациями; липоксигеназы - по Laakso S. et al.,1984. Интенсивность ПОЛ в макрофагах и микросомах определяли по образованию малонового диальдегида (МДА) согласно Gabor S. et al.,1980 и Fontecave М. et al.,1987, соответственно.

Методы исследования свободнорадикалыюго статуса организма при экспериментальном асбестозе.

Активность НАДФН-оксидазы фагоцитов определяли по методу Bellavite Р.,1988, с модификациями. Определение динитро-зильных комплексов железа в цельной печени осуществляли методом ЭПР (Тарасова Н.И. и др.,1981). Измерение общего железа сыворотки кровп проводили по Меньшикову В.В.,1987. Церуло-плазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) сыворотки крови, определяли методом ЭПР (Коваленко O.A. и др.,1971), антиоксидантная активность (АОА) оценивалась по методу Stocks J. et al.,1974.

Скорость НАДФН-зависимого N-диметилирования диметила-нилпна и п-гидрокснлированпя анилина в микросомах определяли по количеству образовавшегося формальдегида и п-аминофенола, соответственно (Карузпна И.И. и др.,1977). Инактивацию цитохрома Р-450 в микросомах определяли спектрофотометрически (Бачманова Г.И. и др.,1981).

Модифицирующее действие феназепама и . диазепама на мутагенные эффекты фотрина исследовали методом учета хромосомных повреждений (Малашенко A.M. и др.,1977).

Определение ТБК-активных продуктов в гомогенатах легких и печени проводили по (Michara М. et al.,1980). Общие липиды и ок-сипролин в тканях определяли по Кацнельсону Б.А. и др.,1964, Stegemann Н.,1958, соответственно.

Модельные системы генерации кислородных радикалов.

Генерацию 02" определяли в ксантин-ксантиноксидазной системе (McCord J.M. et al.,1977). Гидроксильные радикалы продуцировали в модифицированном реактиве Фентона (Коркина Л.Г.и др., 1988), синглетный кислород - в системе гипохлорит натрия/ пероксид водорода (Bottu G.,1989).

Аналитические методы.

Определение белка проводили по методу Lowry О.Н. et al.,1951. Содержание цитохрома Р-450 регистрировали по Omura Т., Sato R.,1964. Сукцинилирование цитохрома с проводили по методу Kuthan Н. et al.,1982, с модификациями. Скорость восстановления цитохрома Р-450 в микросомах регистрировали в анаэробных условиях с помощью приставки Aminco-Morroy для метода остановленного потока к спектрофотометру Aminco DW-2. Скорость окисления НАДФН в микросомах в присутствии асбеста оценивали спектрофотометрическн (Fontecave М. et al.,1987). Скорость гидро-ксилпрования бензпирена в микросомах определяли по убыли его флуоресценции (Yang, Kicha,1978).

Содержание ионов Fe2+ измеряли фенантролиновым методом (Козлов А.В. и др.,1990) с модификациями. Общее железо при экспозиции асбеста с макрофагами и в растворе определяли фенантролиновым методом после восстановления его гидразином. Неге-мовое железо в микросомах оценивали по Brumby Р.Е. et al.,1987. Гемолиз эритроцитов пылевыми частицами определяли спектрофотометрическн по выходу гемоглобина (Коркина Л.Г. и др.,1988).

Определение заряда фагоцитов производилась посредством регистрации доннановского потенциала, генерируемого суспензиями клеток, по Ojteg G. et al.,1989 с некоторыми модификациями (Ситарчук И.А. и др.,1992).

Статистические методы обработки результатов.

В работе были использованы стандартные методы статистического анализа. Достоверность различий между экспериментальными группами по изучаемым параметрам оценивалась с помощью параметрического Т- критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона - Уитни - Манна с применением компьютерной программы "Statgraf" и "WinGraf" для IBM PC.

Обьем, направления и уровни исследований приведены на схеме.

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ

Уровпи исследования Показатели и объекты исследования Обьем исследований (количество анализов)

бесклеточные системы 02, Н202,Н0 , ионы железа, антиоксидапты, хелаторы 5400

субклеточные системы (микросомы) 02", НоОзЛЮ, ионы железа, ПОЛ, БП, ан-тиоксиданты, хелаторы 7600

клеточные системы (альвеол., перитонеал. лейк., эритр. крови) 02", Н202,Н0-, ноны железа, ПОЛ, антиоксидапты, хелаторы 8800

хронические эксперименты на животных 02", ионы железа, ПОЛ, АОС, антиоксиданты, хелаторы 8700

хнмич. и фермент, модельные системы генерации АФК 02", ПО-, х02> антиоксидапты, хелаторы 9200

Всего: 39700

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение каталитической активности асбестовых волокон в бесклеточной среде.

Высокоразвитая поверхность и наличие ионов металлов переменной валентности обуславливают заметную каталитическую активность асбеста в окислительно-восстановительных реакциях. С применением ЭПР-спектроскоппи было показано, что пыль асбеста в бесклеточной среде в присутствии пероксида водорода способна катализировать генерацию высокореакционноспособных гпдро-ксильных радикалов (^еШтап Б.А. et а1.,1984, Ои1шшап М. et а1.,1987). Однако до сих пор не удалось внести ясность относительно образования первого интермедиата восстановления молекулярного кислорода - супероксидного анион-радикала, являющегося предшественником остальных радикальных форм.

С применением разработанного нами метода с использованием сукцинилированного цитохрома с, впервые проведено количественное определение образования супероксида в бесклеточной системе при экспозиции асбеста и кремнезема. Скорость генерации в случае с крокидолитом равнялась 3.8 ± 0.27, а с хризотил-асбестом - 5.1 ± 0.18 нмоль 027час, что в 2-3 раза превышает таковую с кремнеземом; реакция более выражена в начальный период инкубации и усиливается в присутствии донора редокс-эквивалентов - НАДФН.

Образование гидроксильных радикалов определяли по деградации 2-дезокси-В-рибозы (ДОР), входящей в состав ДНК. Преимуществом этого метода является высокая чувствительность (НаШ\уе11 В. et а1., 1987), а также возможность детекции как истинных гидроксильных, так и образующихся на поверхности пылинки сайтспецифичных криптогидроксильных радикалов. Пыли, внесенные в систему с физиологическим рН, при инкубации в течение 30 минут по разному влияли на деградацию ДОР (рис.1). Диоксид кремния способствовал незначительной реакции, а волокна асбеста - крокидолита и, особенно, хризотила приводили к существенному увеличению генерации гидроксильных радикалов на 49% и 76% соответственно, по отношению к контрольному уровню. Интенсивность процесса зависела от концентрации асбеста: с увеличением количества минерала, вносимого в инкубационную среду, практически линейно растет уровень гидроксильных радикалов, причем под действием хризотила деградация ДОР при всех концентрациях волокон была выше, чем с крокидолитом. Зависимость же от времени инкубации не носила линейного характера -

Процент от контроля

Рис.1. Дегредация дезоксирибозы при экспозиции с пылью.

1 - контроль; 2, 3, 4 - экспозиция с диоксидом кремния, крокидолитом н хризотил-асбестом, соответственно.

генерация НО- была более выражена в инкубационный период от 80 до 60 минут. Посредством внесения 100 тМ этанола определяли образование свободных гидроксильных и сайтспецифичных крппто-гидроксильных радикалов. Этанол-ингибируемая деградация ДОР отражает генерацию свободных гидроксилов. Выявлено, что в бесклеточных системах при. экспозиции асбеста образуются преимущественно криптогпдроксильные радикалы (75-78 %). Интенсивность этой реакции, как и продукции 02", коррелирует с концентрацией ионов железа на поверхности минерала. Так, при измерении ионов железа после восстановления гидразином, содержание их на хризотиле составляло 12 + 2 нмоль на мг, что превышало таковое на крокпдолите в 1,7 раза, а на кварце Люберецкого месторождения - в 6 раз. Баженовский хризотил-асбест, содержащий больше железа на поверхности, чем крокидолит, вызывает достоверно более высокое образование НО-. В катализе свободноради-кальных реакций асбестом важное значение придается ионам железа, включенным в структуру волокна (Kamp D.W. et al.,1992). По литературным данным амфиболовый асбест - крокидолит содержит примерно до 27%, а серпентиновый хризотил - до 6% железа (Pooley F.D.,1981). Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество железа на поверхности асбеста, имеющее ключевое значение в физико-химических реакциях, не соотносится

с процентным содержанием в волокне. Соответственно, при исследовании каталитических свойств минералов необходимо определять ионы железа на поверхности каждого конкретного образца.

Известно, что образование НО- обусловлено ионами железа вкупе преимущественно с пероксидом водорода. Поэтому было проведено определение последнего в растворах, содержащих асбест. Однако обнаружить пероксид водорода в присутствии волокон не удалось. Это объясняется тем, что образующийся в системе Н202 немедленно вступает в реакцию Фентона с ионами железа на поверхности минерала. Также быстро асбест реагирует с внесенным пероксидом водорода, резко снижая его концентрацию и увеличивая скорость генерации гидроксильных радикалов.

Обнаружено различие в динамике радикалообразования ионами железа в растворе и на асбесте. В растворе с высокой начальной скоростью генерации образуются свободные гидроксилы, а при действии минерала - преимущественно криптогидроксильные радикалы, прирост которых увеличивается с продолжительностью экспозиции. В этом случае происходит связывание ионов железа твердого носителя с молекулами ДОР, которые на месте атакуются образующимися радикалами и разрушаются. Затем свободная ДОР опять взаимодействует с ионами железа каталитических центров волокна, снова происходит ее деградация и т.д. То есть, в присутствии субстрата каталитические центры асбеста способны проявлять продолжительную активность. Суммарный анализ полученного экспериментального материала позволяет отнести эти активные центры к железо-кислородным комплексам открытого типа.

Таким образом, в бесклеточных системах в аэрируемой среде, в результате функционирования каталитически активных железо-кислородных комплексов на поверхности асбеста, происходит генерация супероксидных радикалов, превращение которых приводит к образованию в основном сайтспецифичных криптогидро-ксильных радикалов. Интенсивность этих реакций строго коррелирует с содержанием и координационным состоянием железа на поверхности минерала. Следует отметить, что скорость асбестинду-цированного радикалообразования в бесклеточных системах невелика и замедляется с окислением двухвалентных ионов железа. Активность процессов под воздействием волокон резко возрастает в организме, что связано как с наличием ферментных систем, восстанавливающих молекулярный кислород, так и доноров редокс-потенциалов типа НАДФН, смещающих рановесие в сторону образования Ее2+ и, тем самым, усиливающих функциони-

рование каталитических центров на поверхности минерала. Это удалось убедительно продемонстрировать в дальнейших экспериментах с использованием биологических систем.

Влияние асбеста на активность изолированной микросомальнон монооксигеназной системы.

В процессе микросомального НАДФН-специфичного переноса электронов, происходит активация молекулярного кислорода с образованием супероксидных радикалов (АгсИакоу АЛ. а1.,1990, БоосЗаеуа Э.К. et а1.,1982). В результате их дисмутации образуются пероксид водорода и гидроксильные радикалы. Однако нет данных о их генерации под влиянием асбеста и не выявлена роль в последующих свободнорадикальных реакциях. Поэтому было проведено поэтапное изучение действия асбеста на генерацию АФК в монооксигеназной системе и функционирование электронтранспортной цепи мпкросом.

Скорость образования супероксида в микросомах, экспонированных с асбестами, измеренная с использованием сукцишглпро-ванного цитохрома с, приведена на рис.2. В отсутствии минералов НАДФН - специфичная генерация радикалов составляла 11.2 ± 0.9 нмоль 02" в минуту в расчете на мг белка. Добавление крокндолита или хризотила в концентрации 1 мг/мл приводили в первые 5 минут к повышению продукции супероксида в 1,5 и 2 раза, соответственно. Скорость генерации радикалов в пробах без волокон носила линейный характер на протяжении всего времени течения реакции, а в присутствии асбестов она линейно возрастала в первые 5 минут, затем постепенно уменьшалась и приближалась к таковой в контроле. Как показали дальнейшие исследования, причина замедления реакции связана с образованием гидроксильных радикалов и развитием в системе процессов ПОЛ.

В микросомах под действием асбеста происходит значительное снижение продукции пероксида водорода. В присутствии крокндолита скорость образования пероксида водорода уменьшалась на 50%, а хризотила - на 80%. Это обусловлено быстрым взаимодействием Н202 с ионами двухвалентного железа на поверхности асбеста, то есть с развитием реакции Фентона - основной реакции образования гидроксильных радикалов в биологических системах.

Исследование генерации гидроксильных радикалов в микросомах, инкубированных с асбестами и частицами ТЮ2, показало резкое увеличение общего разрушения ДОР - на 60% с крокидоли-том и на 108% с хризотилом. Диоксид титана практически не приводил к изменению изучаемого показателя. Этанол ингибировал

О 2 4 6 8 10

Время, мин

Рис.2. Изменение генерации супероксидного радикала в ¡микросомах под влиянием асбеста.

1 - контроль; 2 - крокидолит; 3 - хризотил - асбест.

деградацию ДОР, вызванную асбестом на 25-28% (рис.3). То есть, под действием асбеста в микросомах усиливается образование высокореакционноспособных сайтспецифичных криптогидроксиль-ных радикалов. Инициирование этого процесса происходит, во-первых, за счет супероксидов, генерирующихся на начальном этапе воздействия асбеста на монооксигеназную систему; во-вторых, в результате взаимодействия пероксида водорода с каталитическими центрами поверхности волокон. Соответственно, ведущую роль в токсическом действии асбеста играют радикалы, образующиеся при соприкосновении поверхности волокон с мембранами микросом. В этом и заключается отягощающее влияние волокнистой структуры и высокого модуля упругости асбеста на его биологические эффекты, так как именно эти качества обеспечивают непосредственный

присутствии, так и отсутствии волокон, что подтверждает преимущество в индукции пероксидации липидов именно радикалов, образуемых каталитическими центрами поверхности асбеста.

ПОЛ в микросомальной системе зависело от состава инкуба-цпоной среды и концентрации асбеста, с повышением которой практически линейно увеличивалась пероксидацпя липидов как в присутствии, так и отсутствии НАДФН. Из полученных данных следует, что в микросомах, окисляющих НАДФН, при действии асбеста одновременно протекают два процесса ПОЛ - независимый и зависимый от работы фермента.

Индуцированное волокнами неферментативное ПОЛ обусловлено, в основном, содержанием ионов железа, а НАДФН - специфичное, наряду с последним, может быть связано с изменением функционирования электронтранспортной цепи, которое оценивали по скорости окисления НАДФН и восстановления цитохрома Р-450. Константа скорости восстановления гемопротеида под действием крокидолита или хризотил-асбеста не претерпевала значимых изменений, но при этом увеличивалась начальная скорость окисления НАДФН. Под действием крокидолита и хризотила она составляла 10.0 ± 0.2 и 11.7 ± 0.3 нмоль/мин на мг белка соответственно, (контроль - 7.5 ± 0.2).

Итак, асбестом (в большей мере хризотилом) повышается скорость окисления НАДФН и увеличивается продукция супе-рокспдных радикалов в микросомах на начальных стадиях воздействия минералов. Обычно подобное протекание реакций свидетельствует об ускорении переноса электронов в НАДФН-специфичной цепи. Но тот факт, что скорость восстановления цитохрома Р-450 при этом практически не изменяется, свидетельствует о том, что возрастание показателей связано не с ускорением электронного транспорта, а обусловлено усилением окислительно - восстановительных реакций на активных центрах поверхности асбеста, которые успешно конкурируют за НАДФН и вносят вклад в повышение образования не только супероксида, но и гндроксиль-ных радикалов, индуцирующих ПОЛ в системе. В результате усиления свободнорадикальных реакций асбестом нарушается не только функционирование, но и структурная организация микросомальной монооксигеназной системы.

Влияние асбеста па биотрапсформацию 3,4 - бензпирена в

микросомах.

Гидроксилирование БП в микросомах в присутствии хризотил-асбеста оценивалось по убыли флуоресценции субстрата.

Начальная скорость окисления 1 мкМ БП в отсутствии минерала составляла 0.8 нмоль БП в минуту на 1 мг белка. При совместной экспозиции с 0,5 мг волокон этот показатель увеличивался и равнялся 1.12 нмоль БП/мин/мг белка. В дальнейшем происходило плавное снижение скорости реакции в обоих случаях, но в системе с асбестом оставалось превышение примерно на 40%, то есть, асбест способствовал усилению как начальной, так и общей скорости гидроксилирования БП в микросомах в 1,4 раза. Для выявления возможного вклада в этот процесс АФК, образующихся при экспозиции с асбестом, было проведено изучение совместного действия БП и хризотила на генерацию супероксидных и гидро-ксильных радикалов в микросомальной системе. Показано, что в присутствии асбеста происходит суммирование протекающих по радикальному механизму каталитических реакций на поверхности волокна и реакций микросомального окисления БП, приводящее в итоге к усилению метаболизма углеводорода. Практически одинаковое усиление пероксидации липидов мпкросом как с одним хризотил-асбестом, так и пылью совместно с БП при добавлении НАДФН позволяет заключить, что каталитические центры волокон успешно конкурируют за восстановитель не только при свободном окислении НАДФН, но и в гидроксилазных реакциях в присутствии субстрата.

Таким образом, асбест повышает токсичность БП посредством усиления его радикального окисления в микросомах, в результате чего увеличивается образование метаболитов углеводорода с выраженными канцерогенными свойствами.

Влияние асбеста на микросомальную систему in vivo.

Обнаружено, что при воздействии асбеста in vivo также происходят серьезные нарушения в монооксигеназной системе. Для характеристики функционального состояния монооксигеназной системы в препаратах мпкросом определяли скорость инактивации ключевого фермента - цитохрома Р-450 и скорость окисления субстратов двух типов - диметиланилнна (ДМА) и анилина. В микросомах, выделенных через месяц после однократного ин-тратрахеального запыления крыс хризотил-асбестом в дозе 50 мг, оксигеназная активность мембран эндоплазматического ретикулума была снижена как для субстрата I типа- ДМА (4.83 ± 0.21, контроль 6.62 ± 0.30 нмоль/мг белка в мин), так и П-типа - анилина (0.57 ± 0.02, контроль 0.76 ± 0.03 нмоль/мг белка в мин). Скорость инактивации цитохрома Р-450 в этих микросомах достоверно превышала скорость процесса в контроле. С увеличением срока

воздействия асбеста до 9 месяцев наблюдалось еще большее усиление скорости инактивации гемопротеида. Препарат рутин, обладающий антиоксидантньши свойствами улучшал исследованные показатели. Следовательно, при воздействии асбеста in vivo в микросомах также реализуется свободнорадикальный механизм повреждающего действия волокон, приводящий к нарушению функциональной активности основной системы детоксикации, ответственной за биотрансформацпю ксенобиотиков, что повышает чувствительность организма к токсическим веществам.

Действие асбеста па клеточные системы.

Показано, что асбест вызывает развитие "дыхательного взрыва" фагоцитирующих клеток, при котором происходит выработка ими АФК (Weiss S.J.,1989, Mossman В.Т. et al.,1990). Однако механизмы их генерации и реализации повреждающего действия остаются невыясненными. Являясь молекулярной основой повреждения биоструктур, те или иные АФК, могут определять специфику патогенной активности пыли. Исходя из этого, на первом этапе было проведено исследование образования определенных радикальных форм кислорода фагоцитами под влиянием пылевых частиц.

При активации перитонеальных макрофагов 1 мг крокидоли-та, Баженовского хризотил-асбеста или Люберецкого кварца, генерация супероксидного радикала за первые 30 минут была практически одинаковой с вызванной воздействием 1 мг опсонизи-рованного зимозана и примерно втрое выше, индуцированной диоксидом титана (рис.5). При инкубации в течение часа, образование радикала под влиянием опсонизированного зимозана и кварца существенно возрастало. Даже диоксид титана вызывал некоторое повышение процесса. Но крокидолит и хризотил не дали увеличения. Напротив, под влиянием хризотил-асбеста уровень генерации супероксида оказался далее меньше, чем в первые полчаса экспозиции. Это явление обусловлено отмеченной другими авторами (Doli N.J. et al.,1982) высокой цитотоксичностью асбеста, приводящей к разрушению клеток в системе к концу экспозиции.

На образование радикальной формы в фагоцитах могут оказывать влияние эндогенные системы антиоксидантной защиты, в частности, фермент супероксиддисмутаза (СОД), специфически катализирующая реакцию дисмутации супероксидных радикалов. В наших экспериментах пнгпбирование эндогенной СОД макрофагов достигалось прединкубацпей с 0,3 мМ цианида натрия (NaCN), который в указанной концентрации не угнетает клеточное дыхание

Рис.5. Генерация супероксидного аниоп-радикала перитонеальными макрофагами крыс при активации различной пылью и оисонизированным зимозаном.

1 - диоксид титана; 2 - крокидолит; 3 - хризотил-асбест; 4 - кварц; 5 - опсонизированный зимозан; 6 - опсонизнроваппый зимозан + циапид.

и в то же время эффективно пнгибирует СОД-активность. Данная обработка привела к повышению концентрации супероксида при стимуляции фагоцитов опсонизированным зимозаном (рис.5).

Исследование влияния использованных стимуляторов в концентрации 1 мг на образование супероксидного радикала альвеолярными макрофагами показало, что в количественном отношении генерация его несколько ниже, чем клетками перито-неального экссудата. В основном, это связано с более выраженной, по сравнению с другими фагоцитами, СОД-активностью указанных клеток (Rossi F. et al.,1979). В целом кинетика радикалообразова-

ния альвеолярными макрофагами была аналогична таковой пери-тонеальными макрофагами.

Таким образом, при действии исследованных пылевых образцов и опсонизированного зпмозана на фагоциты происходит генерация супероксида. Этот процесс зависит от вида стимулятора, времени экспозиции, а также эндогенной СОД-активности клеток.

С увеличением концентрации вносимого минерала, в альвеолярных макрофагах происходило усиление начальной скорости генерации супероксида при их активации как крокидолитом, так и хризотил-асбестом. Однако, индуцированное последним образование радикала при всех концентрациях была достоверно выше, чем крокидолитом. Подобное действие может быть связано со следующими причинами: во-первых, с более высокой концентрацией каталитических центров на его поверхности, а во-вторых, немаловажную роль могут играть электростатические взаимодействия. Так, при исследовании суммарного поверхностного заряда тканевых фагоцитов методом измерения доннановского потенциала, нами выявлено, что альвеолярные макрофаги заряжены более отрицательно, чем перитонеальные. Известно, что крокидолит имеет отрицательный заряд, а хризотил-асбест - положительный (Hamilton et al.,1981). Поэтому при воздействии последнего, из-за кулоновского притяжения положительно заряженных волокон с более отрицательно заряженными альвеолярными макрофагами, возможно предпочтительное электростатическое взаимодействие и более сильная активация ферментных систем.

В литературе имеются данные о ингибировании супернатантом лаважной жидкости или сывороткой генерации АФК фагоцитами, вызванной различной пылью, в том числе и асбестом. Авторы объясняют это инактивацией поверхности пылевых частиц посредством неспецифической адсорбции белков и предполагают, что АФК, образующиеся альвеолярными макрофагами, не имеют большого значения при действии минералов in vivo, поскольку инактивация вдыхаемых частиц белками сурфактанта представляется неизбежной (Vilim У. et al.,1987). В наших экспериментах опсонизация асбеста действительно приводила к снижению продукции супероксида макрофагами в часовом интервале экспозиции, но при дальнейшей инкубации, по мере освобождения поверхности минерала лизосомальнымп ферментами, наблюдалось восстановление радикалообразования и приближение к уровню, вызываемому нативным волокном. Следовательно, неспецифическая адсорбция

белков лишь отдаляет, но не предотвращает опосредованного активным кислородом токсического действия пыли на клетку.

Показано, что различные минеральные волокна, в том числе и асбест, вызывают высвобождение пероксида водорода из альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов (Катр БЖ. et а1.,1989, Ооос^Нск Ь.А. а1.,1990). При исследовании продукции Н202 альвеолярными макрофагами, активированными Люберецким кварцем, хризотил-асбестом или крокидолитом, нами обнаружено, что в контрольных пробах, содержащих только фагоциты, образуется за 30 минут незначительное количество пероксида водорода, равное 0.65 ± 0.05 нмоль Н202 на 2 х 106 клеток. Однако, в отличие от кварца, приводящего к усилению процесса более, чем в 2 раза, под воздействием асбеста наблюдается образование Н202 на уровне контроля и ниже. Подобный эффект асбеста обусловлен превращением на волокнах продуцируемого Н202 в агрессивные гидроксильные радикалы.

Генерацию гидроксильных радикалов клетками под воздействием пылей определяли по деградации ДОР в присутствии этанола и без него. Этанол-ингибируемая реакция вычленяла уровень свободных гидроксильных радикалов, а неподавляемая спиртом - сайтспецифичных криптогидрокспльных радикалов. Полученные данные приведенные на рис.6 свидетельствуют о том, что только асбест (в большей мере хризотил), способен значительно усиливать генерацию гидроксильных радикалов при взаимодействии с изолированными макрофагами, причем большую часть составляют криптогидрокспльные радикалы.

Одним из важных последствий токсического воздействия кислородных радикалов является пероксидация липидов биологических мембран, приводящая к изменениям в их структурной целостности, ферментативной активности, рецепторной функции, ионном транспорте и т.д. Помимо этого, продукты ПОЛ - МДА и гидроперекиси липидов, обладают мутагенной активностью. Нами исследовано влияние различных пылей (диоксида титана, кварца ДС}12, Люберецкого кварца, крокидолита и Баженовского хризотил-асбеста) на пероксндацию липидов в перитонеальных макрофагах крыс (рис.7). При экспозиции клеток с малофиброгенным диоксидом титана, уровень образования МДА незначительно (примерно на 6%), превышал контрольные значения. Кварц ДС5х2 усиливал ПОЛ мембран клеток на 20%, а Люберецкий кварц - на 53%. Наибольшим стимулирующим эффектом в отношении пероксидации липидов обладал асбест. Так, крокидолит увеличивал количество

Процент от контроля

250 200 150 100 50 0

[□ без этанола П с этанолом I

Рис.6. Образование фагоцитами гидроксильпых радикалов, индуцированное воздействием различной пыли.

1 - коптроль; 2 - диоксид титана; 3 - кварц БС)^ ; 4 - Люберецкий кварц; 5 - крокидолнт; 6 - хризотил-асбест.

Концентрация МДА (нМ)

без этанола □ с этанолом

Рис.7. Действие пыли на пероксидацню липидов в фагоцитах. 1 - коптроль; 2 - диоксид титана; 3 - кварц йС)^; 4 - Люберецкий кварц; 5 - крокидолит; 6 - хризотил-асбест.

образующегося МДА на 300%, а хризотил - на 380% по сравнению с контролем. Этанол, в концентрации 80 мМ, которая в процессе эксперимента не влияла на жизнеспособность клеток, ингибировал ПОЛ, вызванное крокидолитом или хризотилом, только на 30%. Следовательно, в усилении ПОЛ ведущую роль играют сайтспеци-фичные криптогидроксильные радикалы, образующиеся при экспозиции асбеста с фагоцитами.

Следует отметить, что отечественный Баженовский хризотил-асбест обладает более выраженной свободнорадикальной агрессивностью, чем крокидолит, хотя последний признан во всем мире наиболее опасной разновидностью асбеста и для него установлены жесткие гигиенические регламентации.

Предполагается, что механизм, посредством которого пылевые частицы асбеста индуцируют выделение клетками АФК, связан с непосредственной активацией основной ферментной системы "дыхательного взрыва" - НАДФН-оксидазы (Kamp D.W.et al.,1992). Однако до сих пор прямые данные об этом отсутствуют. Поэтому было проведено исследование активности НАДФН-оксидазы в мембранных препаратах, выделенных из перитонеальных макрофагов крыс, а также лейкоцитов крови человека после их стимуляции хризотил-асбестом, кварцем Д(^12 или опсонизированным зимоза-ном. Самая высокая активность в перитонеальных макрофагах была зарегистрирована при стимуляции клеток опсонизированным зимозаном - 2.15 + 0.12 нмоль 02" в мин на мг белка (рис.8). Под действием асбеста и кварца она была несколько ниже и

составляла 1.71 и 1.57 нмоль 02" в мин на мг белка соответственно. Активность НАДФН-оксидазы лейкоцитов крови здорового донора, индуцированная использованными стимуляторами, была выше, чем в перитонеальных макрофагах крыс, что связано с включением вспомогательных систем стимуляции глюкозомонофосфатного шунта гранулоцитов.

Таким образом, под воздействием асбеста действительно происходит непосредственная активация НАДФН-оксидазы как в перитонеальных макрофагах крыс, так и лейкоцитах крови человека. Величина этой реакции сравнима с таковой под воздействием кварца, но ниже вызванной опсонизированным зимозаном.

Известно, что асбест обладает мутагенной активностью -вызывает в культуре клеток хромосомные аберрации, сестринский обмен хроматид и т.д (Wang N.S. et al.,1987, Price-Jones M.J. et al.,1980). При внутрибрюшинном введении хризотил-асбеста с увеличением продолжительности экспозиции происходит повыше-

нмоль О / мг белка.

Время, мнн.

Рис.8. Измепепие активности мембраппой НЛДФН - оксидазы перито-неальных макрофагов при воздействии различпой пыли и опсонизированпого зимозапа.

1 - опсонизироваппый зимозан + рутип (10"3 М); 2 - кварц DQ13 ;

3 - хризотил-асбест; 4 - опсонизироваппый зимозан.

ние уровня клеток с хромосомными аберрациями в перитонеальном экссудате и костном мозге, то есть асбест оказывает как локальный, так и генерализованный мутагенный эффект (Durnev A.D. et al., 1993). Значение механизма мутагенной активности, опосредованной свободнорадикальными процессами, попытались подтвердить на примере известного химического мутагена фотрина. В опытах in vivo нами получены данные, свидетельствующие о том, что в механизме мутагенного действия фотрина наряду с прямым алкилированпем ДНК принимают участие и АФК, так как выявлена способность транквилизаторов с антирадикальными свойствами -диазепама и феназепама, снижать его мутагенные эффекты. Но до спх пор не проведено сравнительных исследований генерации высокореактивных радикалов фагоцитами под действием асбеста и стандартного химического мутагена. Поэтому в следующей серии

экспериментов определяли образование гидроксильных радикалов перитонеальными макрофагами при их экспозиции с фотрином и хризотил-асбестом. Фотрин в концентрации 10 3М усиливал образование гидроксильных радикалов фагоцитами на 26%, а 0.5 мг асбеста - на 59% по сравнению с контролем. Индуцированная совместной экспозицией мутагена и хризотила продукция радикалов превышала контрольные значения на 76%. Представленные данные говорят о том, что мутагенные эффекты фотрина, по всей вероятности, обусловлены в большей мере алкилирующей активностью в-отношении ДНК, чем образованием НО-. В случае же асбеста приоритетное значение имеет генерация им агрессивных гидроксильных и криптогидроксильных радикалов, разрушающих ДНК. Из результатов этих исследований следует также, что в присутствии асбеста могут промотироваться эффекты мутагена.

Важное значение железо-содержащих каталитически активных центров поверхности асбеста в развитии свободнорадикаль-ных реакций диктует необходимость изучения состояния железа при взаимодействии волокон с клетками. Поэтому в пробах определяли общее содержание железа после восстановления его гидразином. Инкубация волокон с макрофагами приводила к повышению исследуемого показателя. Так, при воздействии в течение часа 1 мг хризотил асбеста на 2 х 106 клеток, количество общего железа повышалось с 23 ± 2 до 30 ± 1 нмоль/мл. По-видимому, это связано с выходом железа из внутриклеточных мембран, целостность которых нарушается в результате повреждающего действия асбеста. Для исследования редокс-цикла железа при экспозиции хризотил-асбеста в растворе и с фагоцитами использовали фенантролин, связывающий ионы двухвалентного железа. Полученные результаты приведены на рис.9. При экспозиции асбеста в растворе Хенкса при физиологических рН содержание Ге2+ возрастало к 15 минутам инкубации (кривая А), затем наблюдалось плавное снижение. В системе с клетками выявлена совершенно иная картина (кривая Б): с продолжительностью инкубации происходило уменьшение содержания ионов двухвалентного железа. Обнаруженное различие эффектов в растворе и клеточной системе может быть объяснено редокс-циклом железа. В первом случае увеличение количества ионов двухвалентного железа, по-видимому, связано с восстановлением железа супероксидом, образование которого при инкубации с асбестом зарегистрировано нами в бесклеточной системе. Снижение же содержания ионов Ге2+ в системе с клетками, по всей вероятности, обусловлено превалирующим окислением железа в результа-

Время, мин.

Рис.9. Изменение редокс-цикла железа при экспозиции хризотил-асбеста в растворе (Л) и с фагоцитами (В).

те взаимодействия его с перекисями и образованием гидроксиль-ных и линидных радикалов. В пользу этого говорят полученные данные о значительном повышении асбестом генерации гидрокси-лов и процессов ПОЛ в фагоцитах.

Таким образом, при активации клеток асбестом происходит изменение редокс-цикла железа, обусловленное, по всей видимости, образованием гидроксильных и лппидных радикалов. В системе с макрофагами асбест приводит к повышению общего содержания железа, которое, вероятнее всего, мобилизуется из мембранных структур, нарушенных токсическим воздействием волокон. Высвобождение минералом железа из биомембран способствует усилению интенсивности свободнорадикальных реакций.

Изменение свободнорадикалыюго статуса лабораторных животных под воздействием асбеста.

Рядом авторов показано, что продолжительная экспозиция с асбестом приводит к увеличению генерации фагоцитирующими клетками АФК. Клетки приобретают также способность к более

высокому образованию активного кислорода при действии вторичного стимула (Cantin A. et al.,1988, Goodglick L.A. et al.,1990). Однако данные о состоянии основной ферментной системы "дыхательного взрыва" - НАДФН-оксидазы при влиянии асбеста in vivo отсутствуют. Недостаточно сведений относительно генерации конкретных радикалов кислорода и особенностях развития СРП на разных сроках воздействия минерала.

В экспериментах in vivo было изучено воздействие широко применяемого отечественного хризотил-асбеста Баженовского месторождения имеющего мировое значение, который во всех исследованных нами модельных системах проявлял более выраженную свободнорадикальную активность, чем крокидолит.

Показатели окислительного метаболизма фагоцитов были изучены на ранних сроках после однократного внутрибрюшинного введения крысам 10 мг хризотил-асбеста - через 3 суток. При исследовании спонтанной генерации супероксидного радикала выявлено, что перитонеальные макрофаги животных, экспонированных даже таким малым количеством асбеста, выделяли радикала на 46% больше, чем в контроле. Аналогичная ситуация наблюдалась и при стимуляции клеток стандартным активатором "дыхательного взрыва" - форболмиристатацетатом (ФМА). При этом образование супероксида фагоцитами животных, контактировавших с минералом, превышала на 61% контрольный уровень. Определение НАДФН-оксидазы перитонеальных фагоцитов после стимуляции ФМА показало, что у животных, экспонированных асбестом, происходит усиление активности этой ферментной системы. Так, если в контроле ее активность равнялась 1,7 ± 0,11 нмоль 02~ в мин на 106 клеток , то в опыте она составляла 2,6 ± 0,17 нмоль 02" в мин на-106 клеток, то есть "производительность" системы под воздействием асбеста была повышена в 1,53 раза. Таким образом, при экспозиции асбеста in vivo на ранних сроках происходит активация НАДФН-оксидазы фагоцитов и повышается образование супероксида; интенсивность радикалообразования возрастает при дополнительном стимулировании клеток.

В следующей серии экспериментов изучали показатели в тканях через 4 недели после однократного интратрахеального введения крысам 50 мг хризотила.

Известно, что кислородные радикалы регулируют интенсивность фиброзообразования, принимая участие на разных этапах этого многоступенчатого процесса, в частности, гидроксильный радикал участвует в реакциях прямого окисления пролина в оксп-

тах показатели отношения сигналов ЦП /ТФ, зарегистрированных высокочувствительным методом ЭПР, коррелировали с общей АОА сыворотки крови, определенной традиционным СФ методом. Выявлена также корреляция между изменением уровня ПОЛ в тканях, оксипролина в легких и состоянием общей АОА сыворотки крови, что позволяет рекомендовать измерение последней в качестве более доступного и, в то же время, чувствительного теста для оценки развития экспериментального асбестоза и эффективности проводимой терапии.

На стадии выраженного фиброзообразования (через 6 месяцев) выявлено еще большее усиление ПОЛ, особенно в органе-мишени -легком, которое увеличивалось в 2,8 раза по сравнению с контролем (табл.2). Интенсивность процесса коррелировала с содержанием оксипролина в ткани. Уровень последнего был повышен в 2,7 раза, а липидов - в 1,7 раза, относительно контроля. Следует отметить, что накопление липидов в легких становится значимым лишь к 6 месяцам после запыления. Соответственно, показатель уровня оксипролина точнее характеризует биологическую агрессивность асбеста, чем содержание липидов в легких.

Таким образом, при воздействии асбеста in vivo практически во все исследованные сроки определяется усиление свободноради-кальных процессов, проявляющееся на начальных этапах в активации НАДФН - оксидазы и генерации АФК фагоцитами, а в даль-

Таблица 2. Изменение уровня оксипролина, липидов и показателей ПОЛ при 6-месячпой экспозиции асбеста и терапии рутипом (п=9).

Исследованные параметры единицы измерения группы животных контроль асбест асбест+рутин (с 3 мое) (I) (II) (III)

оксипролин мкг/100 г сухих легк. 270 ±21 733 ± 34 * 448 ± 26 **

липиды % от веса сырых легк. 3.1 ± 0.6 5.12 ± 1.1 * 3.42 + 1.2 "

ПОЛ легких пмоль/па гр. ткани 241 ± 28 6G9 ± 78 * 280 ± 32 **

ПОЛ печени нмоль/на гр. ткани 645 ± 11 957 ± 58 * 370 ± 35 **

* - достоверность различия р < 0.05, отпосительпо контроля; ** -достоверность различия р < 0.05, относительно группы И.

нейшем, при фиброзообразовании - в изменении ПОЛ в тканях (в первую очередь в легких), редокс-цнкла железа и состояния АОС сыворотки крови.

Пути коррекции асбестиндуцированных свободнорадикальных

процессов.

Важное значение свободнорадикальных процессов в повреждающем действии асбеста указывает на целесообразность использования свободнорадикальных ингибиторов и хелатирующих агентов для предотвращения токсических эффектов минерала. В нашей работе проведены исследования влияния таких препаратов в бесклеточных, субклеточных, клеточных системах, а также на уровне целого организма.

Изучение действия соединений, обладающих хелатирующими свойствами - ЭДТА, десферала и рутина в концентрации 1 мМ на связывание ионов железа поверхности хризотил-асбеста показало, что наиболее сильный эффект проявляет десферал, который снижал уровень ионов железа на 80%, тогда как рутин на 60%, а ЭДТА - всего на 30%. Десферал снижал также асбестиндуцирован-ное образование гидроксильных радикалов. Причем наибольший эффект (практически полное ингибирование) достигался при предобработке им минерала с последующим отмыванием. Подобное действие объясняется тем, что десферал очень хорошо связывается с асбестом как in vitro, так и in vivo (Weitzman S.A. et al.,1988), блокируя активные железосодержащие каталитические центры минерала.

С целью исследования влияния соединений, обладающих антирадикальными, антиоксидантными и хелатирующими свойствами, на асбестиндуцированное ПОЛ мнкросом были применены следующие препараты: природный флавоноид рутин, комплекс рутина с железом (Fe2+-pyTiiH), комплекс рутина с медью (Cu-рутин), а -токоферол, водорастворимый аналог а -токоферола -тролокс п хелатор ионов железа - десферал ( Табл.3). Все использованные соединения, за исключением тролокса, приводили к значительному подавлению пероксидации липидов, вызванной воздействием асбеста, как в отсутствии, так и в присутствии НАДФН. Тролокс в обоих случаях ингибировал ПОЛ на 30%, что по-видимому, связано с гидрофильностью препарата, затрудняющей проникновение его в мембрану. Наиболее выраженным эффектом обладал десферал, который приводил к торможению асбестобуслов-ленной ПОЛ на 70% в отсутствии НАДФН и на 75% в системе с восстановителем. Рутин, его комплексы с металлами, как и а-

Таблица 3. Влияние соединений с антиоксидаптпыми и хелатируго-щими свойствами на асбестиндуцированное ПОЛ микросом.

Условия опыта Копц-я соединений 100 мкМ без НАДФН С О.ЗмМ НАДФН

нмоль МДА/мг белка Процент ингибир. нмоль МДА/мг белка Процент ипгибир.

микросомы +ХА 4.65 ± 0.50 9.52 ± 0.43

микр-мы + ХА + Л 1.59 + 0.17 58 3.43 ± 0.28 64

микр-мы +ХЛ+Ге2+К 186 ±0.14 60 362 ± 0.25 62

микр-мы +ХА + СиЛ 1.72 ± 0.12 63 3.80 ± 0.31 60

микр-мы + ХА + а-токоферол 1.63 ± 0.15 65 3.90 ± 0.28 59

микр-мы +ХЛ+ тро-локс 3.26 ± 0.22 30 6.76 ± 0.52 29

микр-мы +ХА + дес-ферал 1.39 ± 0.10 76 2.38 ± 0.21 75

токоферол, практически одинаково снижали пероксидацию липп-дов в микросомах в среднем на 60%.

Исследование влияния рутина на начальную скорость генерации супероксида в микросомальной системе показало, что флаво-ноид в концентрации 50 мкМ снижает ее на 21%. В присутствии 1 мг хризотила ингпбирующий эффект рутина на образование супероксидного радикала оказался более выраженным и составил 40%. Следовательно, противоасбестное действие рутина в микросомах реализуется двумя путями - образованием неактивного хелатного комплекса с ионами железа на волокне и взаимодействием с АФК. Ежедневное внутрпжелудочное введение животным 1 мл 1 мМ рутина в течение месяца после однократного интратрахеального за-пыления Баженовским хризотил-асбестом, приводило к частичному восстановлению функциональной активности микросом и снижению степени инактивации цитохрома Р-450.

Из форм активного кислорода, генерация которых индуцируется воздействием асбеста на клетки, по нашему мнению, ключевое значение имеют гидроксильные радикалы. Значимость их обусловлена высочайшей агрессивностью и преимущественной генерацией при экспозиции именно с асбестом. На рис.10 приведены данные о влиянии различных препаратов на индуцированное хризотил-асбестом образование НО- фагоцитами. Видно, что маннитол, считающийся традиционной "ловушкой" гидроксильных радика-

120 100 80 60 40 20 0

Процент от контроля

± 7"

......£8

" ±4

/-' ■•■■-■А

±2

3

± 6

V/

Рис. 10. Влияние препаратов с антиоксидаптпыми и хелатирующими свойствами па образование гидроксильных радикалов фагоцитами при воздействии асбеста. 1 - хризотил-асбест; 2 - хризотил-асбест + рутип (1 мМ); 3 - хризотил-асбест + десферал; 4 - хризотил-асбест + каталаза 500 ед. акт.; 5 - хризотил-асбест + маппитол (50 мМ).

лов, вызывал 50%-ное ингибирование лишь при высокой концентрации, равной 50 мМ, а каталаза, которая разлагает Н202 до воды, препятствуя тем самым образованию в системе НО- , в количестве 500 ед., практически не оказывала эффекта. В то же время рутин, обладающий как антиоксидантной, так и хелатирующей способностью, в концентрации 1 мМ, оказывал выраженное действие, снижая асбестиндуцированную генерацию гидроксилов клетками на 60%. Влияние десферала на реакцию определяли после обработки им асбеста, так как при непосредственном введении его в инкубационную смесь наблюдалась реакция с ДОР, искажающая результаты. Подобная обработка волокон хелатором приводила к самому существенному, на 89%, ингпбнрованию радикалообразо-вания клетками.

Являясь родоначальниками других АФК, определенную роль в токсическом действии асбеста на фагоциты играют и супероксидные радикалы. Выявлено, что препараты (50 мкМ), обладающие антиоксидантной активностью или сочетающие в себе антиокси-дантные и хелатирующие свойства, эффективно ингибируют вызванную воздействием асбеста генерацию супероксида фагоцитами (рис.11). Кроме того, на примере отечественного бронхорас-

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1

0.5 0

Рис.11. Действие препаратов с антиоксидаптными и хелатирующими свойствами па асбестиндуцированное образование супероксида фагоцитами. 1-хризотил-асбест (1 мг); 2-хризотил-асбест (1 мг) + рутин; 3-хризотил-асбест (1 мг) + Ге2+-рутин; 4-хризотил-асбест (1 мг) + а-токоферол; 5-хризотил-асбест (1 мг) + тролокс.

ширяющего препарата тровентола показано, что соединения, воздействующие непосредственно на механизмы активации фагоцитов, но не проявляющие выраженные антирадикальные свойства также могут обладать противоасбестной активностью.

Особый интерес представляет протективный эффект флавоно-ида рутина, связанный с его способностью образовывать прочные хелатные комплексы с ионами металлов и взаимодействовать с супероксидными, гидроксильными, пероксидными радикалами, обрывая цепные свободнорадикальные реакции (Afanas'ev а1.,1988,1989, Нос1шск et а1.,1988).

В специальной серии экспериментов определяли влияние рутина на активность НАДФН-оксидазы при стимуляции фагоцитов опсонизированным зпмозаном. Из полученных результатов следует, что при воздействии флавоноида активность фермента ингибируется практически одинаково - на 76% в перитонеальных макрофагах крыс (рис.8) и на 74% в лейкоцитах крови человека. Таким образом, рутин способен взаимодействовать и с ключевым ферментом "дыхательного взрыва", восстанавливающего молекулярный кислород, снижая его активность.

нмоль супероксида / 10 клеток

Исходя из вышеприведенных данных, а также принимая во внимание нетоксичность, доступность и дешевизну препарата, в хронических экспериментах на животных был использован рутин.

Через месяц у животных, получавших ежедневно внутриже-лудочно 1 мл 1 мМ рутина с 1 дня после интратрахеального введения асбеста, наблюдалось достоверное снижение уровня оксипроли-на в легких, общего железа, отношения ЦП/ТФ и общей АОА сыворотки крови. В группе животных, получавших один рутин, все показатели соответствовали контрольным значениям, что еще раз подтверждает нетоксичность препарата. Таким образом, нетоксичное природное соединение рутин оказывает выраженное противо-асбестовое действие, тормозит начальные стадии фиброза, способствует предотвращению дисбаланса АОА, вызванного асбестом.

В дальнейших экспериментах изучали лечебное действие рутина. При этом экспериментальные животные были разделены на 3 группы: 1 - контрольные крысы, которым интратрахеально вводили 1 мл 0.9% раствора ЫаС1; 2 - животным однократно интратрахеально вводили 50 мг Баженовского хризотила; 3 -животным вводили интратрахеально 50 мг Баженовского хризотила и начиная с 3-го месяца внутрижелудочно вводили 1 мл 1мМ рутина ежедневно. Через 6 месяцев у крыс всех трех групп определяли оксипролин и липиды в ткани легких, а также ПОЛ в легких и печени (табл.2). Рутин, применяемый на фоне развившегося фиброза, оказывал эффективное лечебное действие, достоверно снижая уровень оксипролина в легких, а содержание липидов, ПОЛ легких и печени, практически до контроля. Обнаруженное лечебно-профилактическое действие рутина подтверждает важную роль СРП в патогенезе заболеваний, вызываемых асбестом. Полученные данные позволяют заключить, что препараты с выраженными антиоксидантными и хелатирующпми свойствами, как и ингибиторы систем, восстанавливающих кислород, могут служить эффективными протекторами от патогенного действия асбеста.

Разработка методов скрининга перспективных препаратов с противоасбестовой активностью и гигиенической оценки фибро-

генной пыли.

Реализация повреждающего действия асбеста связана со способностью индуцировать СРП в организме. Как установлено в нашей работе, усиление этих процессов под влиянием асбеста происходит в результате: 1) активации основной ферментной системы "дыхательного взрыва" фагоцитов - НАДФН-оксидазы; 2) нарушения функционирования микросомальной монооксигеназной

системы; 3) каталитических .превращений АФК на активных центрах минерала.

Из образующихся АФК ключевое значение имеют высокоре-акционноспособные гидроксильные радикалы. Исходя из этого, поиск препаратов с противоасбестовой активностью необходимо проводить среди соединений, обладающих или сочетающих в себе следующие свойства:

1) антирадпкальные ("ловушечные") по отношению к гидро-ксильным радикалам и к суперокспду (родоначальнику всех АФК) ;

2) хелатирующие - препятствующие образованию этих радикальных форм на каталитически активных центрах поверхности асбеста;

3) антиоксидантные - обрывающие цепные реакции свободно-радикального окисления липидов;

4) ингибирующне ферментные системы "дыхательного взрыва", активация которых асбестом приводит к генерации радикальных метаболитов кислорода.

Препараты должны соответствовать следующим основным требованиям: обладать низкой токсичностью и в то же время проявлять высокую эффективность. Помимо этого, во избежание нарушения бактерицидных функций фагоцита, необходимо достижение подавления только избыточного радпкалообразования. Соответственно, важное значение приобретает определение концентрационной зависимости эффекта испытуемых соединений. Поэтому исследование вышеперечисленных параметров на первом этапе следует проводить в модельных системах генерации АФК.

С использованием СФ метода (по СОД-чувствительному восстановлению цитохрома с), а также люцигенин - зависимой ХЛ, в ксантин - ксантиноксидазной системе генерации супероксидного радикала, нами был проведен скрининг более, чем 40 соединений. На рис.12 приведены данные пнгибирующего действия на ХЛ-ответ наиболее эффективных препаратов - рутина, комплекса рутина с железом (Ге2+-рутин), норднгидрогуаретовой кислоты (НДГК), а также аскорбиновой кислоты. Видно, что все эти соединения успешно снижают генерацию радикалов. Рутин и его комплекс с железом также существенно подавляли СОД-чувствительную скорость восстановления цитохрома с, по которой производится наиболее точное количественное определение образования супероксидного радикала. К сожалению, нам не удалось провести СФ исследования с НДГК и аскорбиновой кислотой, поскольку обнаружено, что эти соединения, как и многие другие, способны

Интенсивность ХЛ в процентах.

' концентрации.

Рис.12. Влияние соединений на люцигенинзависимую хемилюминес-ценцию в ксантин-ксантиноксидазной системе.

1 - НДГК; 2 - Ге2+ -рутип; 3 - рутил; 4 - аскорбиновая кислота.

восстанавливать напрямую цитохром с. Поэтому совместно с К.К.Бривибой было проведено исследование влияния препаратов на генерацию АФК в модельных системах с применением ХЛ методов. Взаимодействие соединений с супероксидом в ксантин - ксан-тиоксидазной системе определяли по люцигенин-зависимой ХЛ; с гидроксильными радикалами - в модифицированной системе Фентона (ЭДТА-Н202-Ге2+); с синглетным кислородом (х02) - по люминол-зависимой ХЛ в системе гипохлорит натрия - пероксид водорода. Помимо этого изучали действие препаратов на ХЛ-ответ фагоцитирующих клеток, активированных асбестом, а также на активность лппоксигеназы (ЛОГ) и гемолиз эритроцитов, вызванный волокнами минерала. Во избежание получения ложного ингибирования, связанного с физическим эффектом тушения, исследовали влияние соединений на флуоресценцию люминола. Обнаружено, что рутин, его комплекс с железом и НДГК в концентрациях Ю-5 - Ю-6 М практичсеки не влияют на последную, и в то

же время эффективно взаимодействуют с активным кислородом в различных системах.

При подсчете коэффициентов корреляции использовали процентное значение эффекта действия того или иного соединения для каждой из исследованных систем. Обнаружено, что способность препаратов ингибировать XJI клеток лучше всего коррелирует с инактивацией АФК в модифицированном реактиве Фентона (г=0.86). С другими параметрами корреляция выражена слабее. Однако, тот факт, что супероксидные радикалы являются предшественниками всех радикальных форм кислорода, диктует необходимость учитывать и их ингибирование.

Таким образом, потенциальные ингибиторы клеточной хеми-люминесценции, которая регистрируется при фагоцитозе волокон асбеста, должны взаимодействовать с радикалами, образующимися в модифицированном реактиве Фентона (с гидрокспльными и криптогидроксильными радикалами) и супероксидом, генерируемым в ксантин - ксантиноксидазной системе. При наличии большого количества анализируемых соединений с потенциальной проти-воасбестовой активностью более рационально на первых этапах исследования использовать именно эти бесклеточные химические и ферментативные системы. Данные модельные системы являются простыми, время анализа сокращается, а результаты получают однозначную интерпретацию. Далее отобранные препараты тестируются на способность подавлять XJI-ответ активированных асбестом макрофагов. Кроме того, учитывая тот факт, что канцерогенный и промотирующий эффекты асбеста во многом определяются с его влиянием на монооксигеназную систему детоксикации организма необходимо тестирование препаратов и в микросомах (изучение ПОЛ, реакций гидроксилирования, генерации НО). Перспективные препараты, помимо вышеперечисленных модельных систем, требуют дальнейшего исследования влияния на ингибирование мутагенного эффекта и развитие асбестоза в экспериментах in vivo.

С учетом выявленного в проведенных исследованиях важного значения в свободнорадикальной токсичности асбеста каталитически активных железосодержащих центров на минерале, для гигиенической оценки фиброгенной пыли предложен метод определения общего железа на поверхности пылевых частиц, с помощью фенантролина после восстановления ионов металла гидразином.

Опираясь на выявленные механизмы повреждающего дей-

ствия асбеста на эндогенные макромолекулы разработан новый способ определения степени генотоксичности природных и синтетических асбестов, а также других фиброгенных минералов, содержащих или загрязненных ионами металлов переменной валентности. Метод основан на способности минералов вызывать деградацию неотъемлемого компонента ДНК - 2-дезоксн-О-рибозы (ДОР), гидроксильными и криптогидроксильными радикалами, образующимися под воздействием пыли и позволяет в простой и удобной модельной системе: а) выявить потенциальную генотоксичность как нативных природных и синтетических, так и подвергнутых химическим, физическим, термическим, ядерным и др. воздействиям пылевых образцов; б) количественно определить степень генотоксичности; в) проводить поиск и отбор соединений с протек-тивными свойствами. Преимуществами того и другого метода являются высокая чувствительность, экспрессность, а также то, что выполнение работ не требует дорогостоящего специального оборудования.

Таким образом, разработанные новые методы гигиенической оценки фиброгенной пыли способствуют более точной, быстрой н дешевой их регламентации, а экспресс-методы скрининга позволяют проводить направленный отбор препаратов с противоасбестовой активностью. Новые данные о свободнорадикальных механизмах влияния асбеста на организм являются основой для разработки эффективных способов предупреждения вредного воздействия этой пыли и сохранения здоровья работающего с ней персонала, а также населения, контактирующего с минералом.

ВЫВОДЫ

1. Исследование молекулярного механизма действия асбеста в модельных бесклеточных, микросомальных и клеточных системах, а также в хронических экспериментах на лабораторных животных показало, что его высокая биологическая активность обусловлена способностью вызывать длительное образование в организме повышенных количеств активных форм кислорода, в том числе чрезвычайно реакционноспособного гидроксильного радикала.

2. Интенсивность генерации активных форм кислорода зависит от концентрации и времени экспозиции волокон, а также вида и свойств асбеста: величины заряда и содержания каталитических центров на поверхности минерала.

3. Свободнорадикальная агрессивность асбеста обусловлена активацией фагоцитов в результате электростатического взаимодействия поверхности пылинки с клеточной мембраной, приводя-

щей к непосредственной стимуляции НАДФН-оксидазы и усилению образования супероксидного анион-радикала; каталитической трансформацией супероксида и пероксида водорода в гидроксиль-ный радикал на активных центрах поверхности минерала; нарушением функционирования микросомальной монооксигеназной системы; развитием повышенного уровня ПОЛ биомембран.

4. Мобилизация асбестом железа из мембранных структур микросом и фагоцитирующих клеток является дополнительной причиной усиления образования активных метаболитов кислорода и продуктов ПОЛ.

5. Собственный мутагенный и канцерогенный эффекты асбеста обусловлены в первую очередь генерацией сайтспецифичных крпптогпдроксильных радикалов, вызывающих повреждение компонентов ДНК клетки и повышение образования продуктов ПОЛ, являлющихся эндогенными мутагенами. На этой основе разработан новый метод гигиенической характеристики фиброген-ной пыли - определение генотоксичности минералов.

6. Механизм действия асбеста как промотора опухолей, индуцируемых ароматическими углеводородами заключается в его способности усиливать гидроксилирование 3,4-бензпирена в микросомах по радикальному механизму, в результате чего возрастает образование метаболитов углеводорода с выраженными канцерогенными свойствами.

7. Повреждающее действие асбеста на микросомальную систему обусловлено прямой индукцией ПОЛ мембран эндоплазма-тического ретикулума, а также нарушением механизмов функционирования электронпереносящей цепи. В организме реализуется свободнорадикальный механизм токсического влияния волокон, приводящий к инактивации цптохрома Р-450 и снижению оксиге-назной активности микросом.

8. Важными критериями свободнорадикальной токсичности асбеста являются показатели количества и активности железосодержащих каталитических центров на минерале. На основании этого разработан новый способ гигиенической оценки фиброгенных пылей - определение ионов железа на поверхности минерала.

9. Изменения свободнорадикального статуса организма на начальных этапах развития экспериментального асбестоза характеризуются в основном активацией НАДФН-оксидазы фагоцитов и усилением генерации активных форм кислорода. На стадии фибро-зообразования более показательно повышение ПОЛ в ткани легких, изменение редокс-цикла железа и возрастание антиоксидантной активности в сыворотке крови. Установлено, что уровень ПОЛ в

легких коррелирует с содержанием оксипролина в органе и ан-тиоксидантной активностью сыворотки крови.

10. Показано ослабление патологического воздействия асбестовой пыли соединениями, обладающими антиоксидантными и хелатирующими свойствами, а также ингибиторами ферментных систем фагоцитов, восстанавливающих молекулярный кислород.

11. На основании изучения свободнорадикального механизма повреждающего действия асбеста создан комплекс экспресс-методов для направленного скрининга лекарственных соединений, обладающих противоасбестовой активностью, включающий в себя исследования в модельных химических, субклеточных и клеточных системах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Comparative studies of superoxide generation in microsomes and reconstituted monooxygenase systems. //In:"Cytochrome P-450. Biochemistry, Biophysics and Environmental Implications", 1982, (E.Hietanen et al.,eds.),Elsevier Biomed.Press, Amsterdam-N.Y.Oxford,p.615-618 (with coworkers).

2. Измерение скорости образования супероксидного радикала в микросомальной цепи с помощью сукцинилированного цитохрома с. // Мат-лы Всесоюзн. симп. "Цитохром Р-450:структура и функция", Минск, 1982, с.33.

3. Исследование стехиометрии свободного окисления НАДФН в микросомальной цепи. //Там же, с.24 (в соавт.).

4. Образование суперокисного радикала в реконструированных монооксигеназных системах. //Там же, с.34 (в соавт.).

5. Effects of quinones on the superoxide production by enzymes and peritoneal macrophages. //Proceed, of 5 conf."Superoxide and superoxide dismutase", Jerusalem, Israel, 1989, p.33-34 (with coworkers).

6. Исследование антирадикальных свойств рутина и его комплекса с железом в модельных химических системах и суспензии фагоцитов. //Мат-лы 3 Всесоюзн. конф. "Биоантиоксидант", 1989, М., Т.1, с.46 (в соавт.).

7. Антимутагенные свойства бензодиазепиновых транквилизаторов. //Хим.фарм.журнал, 1989, N 7, с.784-786 (в соавт.).

8. Образование супероксидного радикала и перекисное окисление липидов,индуцированное волокнами асбеста в микросомах печени крыс. //Мат-лы 5 Всесоюзн.конф. "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, с.151-152. (в соавт.)

9. Влияние адриамицина на продукцию супероксидного радикала монооксигеназной системой микросом. //Там же, с.137-138. (в соавт.).

10. Are quinones producers or scavengers of superoxide ion in cells? //Arch.Biochem.Biophys., 1990, vol.281, N 2, p.245-250 (with coworkers).

11. Новые подходы к отбору препаратов для профилактики и лечения асбестоза. //В сб. резюме 1-го Всесоюзного конгресса по болезням органов дыхания, Киев, 1990, публ.748 (в соавт.).

12. The effect of substances with antiradical properties on the activity of NADPH-oxidase and lipoxygenase of peritoneal macrophages of rats. //In:"Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states", Novosibirsk, 1990, p.66-67 (with coworker).

13. Образование активных форм кислорода перитонеальнымп макрофагами крыс под влиянием цитотоксических пылей. //Бюлл. эксп. биол. мед., 1991, том 112, N 9, с.252-254 (в соавт.).

14. Генерация свободных радикалов кислорода фагоцитами под влиянием волокон асбеста. //В сб.резюме 2-го Всесоюзного конгресса по болезням органов дыхания, Челябинск, 1991, с.264.

15. Поиск противофиброзных препаратов среди биофлавонои-дов. //Там же, с.180 (в соавт.).

16. Свободнорадпкальные процессы на отдаленных сроках радиационного воздействия. //Пульмонология, 1993, N 4, с.67-70 (в соавт.).

17. Развитие свободнорадикальных процессов при экспериментальном бронхоспазме. Влияние бронхорасширяющего препарата тровентол. //Бюлл.эксп.биол.мед., 1994, том 117, N 6, с.619-621 (всоавт.).

18. Свободнорадпкальные механизмы развития патологических состояний, вызываемых асбестом. //В сб.резюме 4-го Национального конгресса по болезням органов дыхания, Москва, 1994, публ. 836.

19. Изменение негемового железа и нерекисного окисления липидов микросом под действием асбеста. //Там же, публ.833 (в соавт.).

20. Противофиброзное действие препаратов на основе природных флавоноидов. //Там же, публ. 69 (в соавт.).

21. Исследование молекулярных и клеточных механизмов действия тровентола. // Там же, публ. 765 (в соавт.).

22. Электростатические взаимодействия определяют эффективность действия антихолинэргических препаратов. // Там же, публ. 763 (в соавт.).

23. Changes of oxygen metabolism and level of lipid peroxidation in blood leucocytes of patients with chronic bronchitis induced by troventol. //In abstr. of Internat. conf. on Clinical Chemiluminescence, Berlin, 1994 (with coworkers).

24. Экспериментальное обоснование предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) фиброгенной пыли в воздухе рабочей зоны предприятий топливно-энергетического комплекса. //Метод, рекомендации, Москва, 1994 (в соавт.).

25. Эффективность действия бронходилятаторов определяется электростатическими взаимодействиями. //Бюлл. эксп. биол. мед., 1994, N 11, с.476-478 (в соавт.).

26. Изменение антиокислительной системы сыворотки крови и перекисного окисления липидов при воздействии асбеста. //Бюлл. эксп. биол. мед., 1994, N 8, с. (в соавт.).

27. Новый методический подход к изучению окислительного метаболизма фагоцитирующих клеток. // Пульмонология, 1995, N 1, с.46-49 (в соавт.).

28. Влияние тровентола на свободнорадикальные процессы. //Там же, с.60-63 (в соавт.).

29. Роль свободного железа в процессах, перекисного окисления липидов при воздействии асбеста. //Там же, с.50-52 (в соавт.).

30. Развитие свободнорадикальных реакций в легочных клетках при воздействии асбеста. // Там же, с.75-77.