Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Нейрональные функции при экспериментальных воздействиях, сопряженных с активацией свободнорадикальных реакций

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ

На правах рукописи

ПЕТРАШЕВСКАЯ Наталья Николаевна

НЕЙРОНАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ, СОПРЯЖЕННЫХ С АКТИВАЦИЕЙ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ

14.00.17 — нормальная физиология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1991

Работа выполнена в Белорусском государственной университете н Институте радиобиологии АН Беларуси

Научные руководители: доктор медицинских наук Лобанок Л.М.

кандидат 'биологических наук Шалатонин В.Т.

Официальные оппонента:

Доктор биологических наук, профессор Калшов В.Н. (Институт физиологии АН Беларуси)

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Вислобоков Д.И (Физиологический научно-исследовательский институт ии. A.A. Ухтоиского)

Ведущая организация: Институт нормальной физиологии АМН СССР

Защита диссертации состоится " .{frchtrMf'Zl'&Z г. в " Г часов на заседании Специализированного совета Д.006.II.01' по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии Академии наук Беларуси (22~725, ГСП, Минск, ул. Скорины, 28)

С диссертацией иохао ознакомится в библиотеке Института физиологии Академии наук Беларуси

Автореферат разослан " / " I99Jt_r.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Рубаюва В.М.

Институт физиологии АН БССР, 1991

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Активация перекисного окисления лшидов (ПОЛ) - универсальная реакция к..¿точных систем на разнообразные физиологические ' и патологические воздействия. Возникавдие при активации ПОЛ структурные перестройка липигчой компоненты мембран', изменение физико-химических параметров лшшдного бислоя, нарушение оптимальных Оьлок-липидаых взаимоотношений и проницаемости для основных потенциалобразупцих катионов существенно модифицируют ход метаболических процессов клетки, и, в конечном итоге, деятельность функциональных систем организма /Владимиров,1987; Каган, Орлов, Прилипко.1986; Конев, Волотовский,1983; Лемешко,IS82-I990; Hallivell 1984-1991/. Экспериментальные данные, накопленные к настоядему времени, свидетельствуют, что свободные радикалы кислорода и активируемые ими реакция ПОЛ являются универсальными посредниками в запуске нейрональной дегенерации при гипероксии, ишемии и реоксигенации, радиационных воздействиях, деыекциальных синдромах, нервно-мышечных патологиях /Меерсоя, Долгих,1983; Austin, Arthur,1989: Huller, bloyd,I983/. Это предопределяет интенсивные исследования, направленные на поиск эффективных средств защиты и повышения устойчивости организма к действию окислительных стрессоров, в том числе среди соединений экзогенного и эндогенного происхождения, которые участвуют в контроле за уровнем свободнорадикальных реакций окисления, препятствуют накоплению токсичных продуктов ГОЛ.

Известно, что свободаорадакальные реакции цепного "окисления липидов могут приводить к деструкции функционально важных молекулярных комплексов возбудимых клеток и повреждению структур мозга /Ревин, Максимов, 1985; Carratu, Mlcolo-Chieppa, 1988 /, однако сделать обобщающее заключение о характере зависимости функциональных характеристик нервных клеток от интенсивности протекащих в них свободаорадккальных реакций не представляется возможным из-за отсутствия необходимых экспериментальных исследований. Изучение этих взаимоотношений необходимо для понимания взаимосвязи функций нервной системы с процессами ПОЛ, а также разработки способов повышения устойчивости функциональных систем организма к действию

' 3

повреждащих факторов на основе применения веществ актиоксвдвнтного действия. Представляется перспективным использование для этих целей модельных нейробиологических объектов, позволяющих проводить экспериментальное тестирование свободнорадикального повреждения нервных клеток и поиск эффективных средств управления этик процессом.

__Ц§ли_и_задачи исследования. Целью данной работы являлось

изучение устойчивости нейрональных функций в условиях активации ПОЛ и изыскание способов их антиоксвдантнсй защиты. Исходя из цели исследования были определены следующие задачи:

1. Используя нейр»биологическую модель нервной системы прудовика (lyimaea stagnalis) изучить динамику алектрофизиологаческих параметров нервных клеток в условиях "окислительного стресса", вызываемого действием липопероксвдного аналога гидроперекиси трет-бутила (ГТБ).

2. Дать характеристику свободнорадикального повреждения изолированных шелшшзированных нервных волокон и изучить возможность повышения их функциональной устойчивости антиоксидантами.

3. Выяснить роль процессов перекисного окисления липидов при развитии ранней дегенерации двигательных нервов и определить антиоксидантные воздействия, повышающие в этих условиях устойчивость нервно-мышечной функции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Индукция реакций перекисного окисления липидов вызывает модификацию паттерна импульсной активности клетки, нарушение функции потенциалзависимых натриевых и калиевых каналов и увеличение неспецифической проводимости нейрональной мембраны.

2. .Нарушение функциональных нейрональных характеристик, наступающее в условиях длящегося переживания изолированных нервных волокон и их ранней дегенерации при перерезке iñ vivo сопряжено с активацией перекисного окисления липидов.

3. Соединения, обладающие антиоксидантными свойствами, повышают устойчивость нейрональных функций.

Научная___новизна. В работе установлены эффекты

свободнорадикального воздействия на нервную клетку, выражающиеся в полифазных изменениях ее мембранного потенциала и импульсной

4

вктивности. В ранние фазы воздействия развивается начальная деполяризация, сиенящаяоя гиперполяризацией мембраны с последующими осциллирусврши изменениями характера разряда нейронов. Наступающее затеи подавление фоновой активности и вторичная деполяризация завершаются потерей возбудимости и гибелью. клетки. ' Индукция свободнорадикальных реакций модифицирует состояние потекциалзависимых ионных ..атриевых и калиевых каналов и ведет к росту неспецифической проводимости нейрональной мембраны. Предложена модель свободнорадикального повреждения шелинизированных нервных волокон при переживании in vitro которая использована для экспериментальных исследований способов их антиоксидантной защиты. Установлено, что ранняя дегенерация двигательных нервных волокон связана с активацией ПОЛ. Функциональные изменения нервно-мышечного проведения в этих условиях характеризуются неодинаковой чувствительностью к корригирующим актиоксидантным воздействиям.

Теоретическая___«.„практическая___значимость____результатов.

Результаты исследования расширяют теоретические представления о Взаимосвязи функции нервной клетки с процесаии бвободаорадикального окисления лшшдов. Экспериментально доказана роль свободнорадикальных процессов ПОЛ как реального фактора дегенерационного процесса в нервной системе и применение антиоксидантной защиты для повышения устойчивости нейрональных функций в этих условиях. Выявленная динамика функциональных изменений в условиях активации ПОЛ позволяет использовать электрофизиологические параметры в качестве тестов при скрининге новых внтаоксвдантных соединений.

На основании полученных данных выполнены разработки, которые переданы и используются в Гомельском государственном университете, Институте биохимии АН БССР, Минском государственном медицинском институте.

Апробация . работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на 17 научной конференции молодых ученых МГУ "Проблемы современной биологии" (Москва,1986), 7 сьезде Белорусского физиологического общества иц. И.П. Павлова (Витебск, 1987), 5 и 7 Всесоюзных семинарах "Свободные радикалы в химии, биологии и медицине (Рига, 1987,1989); 2 и 3

5

А

Всесоюзных конференциях "Простые нервные системы. Hz значение для теории и практики" (Казань, 1988; Минск, 1991), 4 Всесоюзном симпозиуме "Теоретические основы, и новые метода диагностики заболеваний нервно-мышечной передачи и переферических нервов" (Боржоми, 1989).

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литераторы, методической главы, 3 экспериментальных глав, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографического указателя, содержащего 317 источников (101 - отечественных- и 216 иностранных). Тест диссертации иллюстрирован 5 таблицами и 23 рисунками.

объекты и метода исследования

Влияние активации свободнорадикальных реакций перекисного окисления липидов на функциональное состояние нервной клетки изучалось на изолированных нервных системах и одиночных нервных клетках пресноводного легочного моллюска Lymnaea Btagnalts

(Gastropoda, Pulroonata). v

В исследованиях свободнорадакального повреждения возбудимости нервных волокон и возможности ингибирования этого процесса с помощью внтиоксидантов в качестве тест-обьекта использовались изолированные седалищные нервы травяной лягушки Fana temporarla.

Развитие ранней дегенерации аксональных тершшалей двигательных нервов изучалось на крысах стадного разведения с массой тела 150-200 г. Под наркозом (тиопентал натрия, 60 кг/кг) в асептических условиях проводили хирургическую перерезку левого седалищного нерва, затеи рану зашивали и животных помещали в обычные условия содержания.

Для микроэлектродных исследованиях использовала электрофизиологическую установку (ExperUnetria, Венгрия). Регистрацию биоэлектрической активности и стимуляцию нейронов осуществляли через один и тот же микроэлектрод (сопротивление 15-40 MOM). Нейронограммы контролировались визуально с помощью осцилотрафа CI-83 и регистрировались на самописце НЗЗЗ-6П. Определяли уровень потенциала покоя (ыВ), амплитуду потенциала

действия (мВ), ■частотные характеристики импульсной активности.

Внутриклеточный диализ изолированных нервных клеток с фиксацией потенциала проводили на У-обр.. ной присасываидей гашетке с диаметром поры для подсоса нейронов 20-40 шш с помощью устройства для фиксации потенциала (Костюк, Крышталь,1981). Поддерживаемый на мембране потенциал составлял -- 50 ыВ. Тестирующий потенциал для выделения максимума входящего тока составлял -10 - +10 мВ, для выделения задержанного выходящего тока - 20 мВ. Вольтамперные характеристики выделенных токов строили стандартным способом. Величину тока утечки определяли при подаче на мембрану гиперполяризующих толчков тока от величины поддерживаемого потенциала.

Для индикацгши изменений возОудкаости изолированных нервных волокон по электрофизиологическим характеристикам определяли времязавимшое повреждение переживающих волокон. Осциллографически точечным хеыотродом, заполненным раствором Рингера для холоднокровных, регистрировали монофазные потенциала действия волокон группы А со скоростью развертки 0,2 мс/см на 5, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 час экспозиции. Стимуляцию волокон осуществляли на несущей частоте 30 Гц прямоугольными импульсами отрицательной полярности длительностью 0,1 мс, пороговое напряжение 6,0-6,8 В. Определяли и анализироввли амплитуду потенциала действия (мВ), максимальную скорость мембранной деполяризации (В/с), скорость проведения импульса (и/с), абсолютный (АРП) и относительный (ОРП) рефрактерные периоды (мс) волокон группы А. Возможный защитный эффект антиоксидантов определяли при инкубации волокон в растворах Рингера, содержащих ионол и 0БХ-2 - новый антиоксидакт, синтезированный в отделе биоэнергетики кафедры физиологии человека и животных Белгосуниверситета. Концентрация тестируемых антиоксидантов составляла Ю-6 г/шь

Электрофизиологическое тестирование нейрональной дегенерации на уровне .аксональных терминалей двигательных нервов осуществляли методом стииуляционной электронейромиографии. Через 24 и 48 час после перерезки нерва проводили попарное сравнение вызванных суммарных потенциалов действия га. во1еш (М-ответов) при раздражении дегенерирующего (Мд) и контрольного (Мк)

7

контралатервлького нервов. Максимумами М-ответов характеризовали размер фонда функционирующих двигательных единиц контрольного и дегенерирующего нервов. Рассчитывали индекс дегенерации (ИД): ИД=1-Мд/Мк*100%, который показывает относительное количество выключаемых в ходе дегенерации двигательных единиц. Нарушение нервно-мышечной передачи определяли по изменению времени восстановления синаптичекой функции после проведения одиночного импульса (Г, мс) и устойчивости синапгического проведения высокочастотных импульсов (V, мВ/с).

При исследовании влияния антиоксидантов на развитие• нейрональной дегенерации витамин Е вводили перорально в дозе 500 иг/кг (135 МЕ) на протяжении 5 дней до перерезки. Рутин и кверцетин вводили внутриОршинно в дозах 25 и 125 мг/кг в виде 5% растворов в диыетилсуяьфоксиде (ДОСО), ОБХ-2 вводили внутриОршинно в дозе 50 мг/кг (10% ) ежедневно в течение 5 дней до операции , а также, в течение 2 суток после операции по 50 ыг/кг через 6 час. Влияние антиоксидантов на дегенерацию оценивали по коэффициенту антиоксидантной защиты КАЗ=йДк/ИДа, где ИДк - индекс дегенерации в контроле, ИДа - при применении антиоксидантов.

В качестве инициатора реакций перекисного окисления липидов использовали гидроперекись трет-бутила (10 и 20 мМ).

Развитие реакций ПОЛ в исследуемых экспериментальных моделях оценивали по накоплению малонового диельдегида (МДА, ныоль/мг бежа) с использованием теста с тиобарбитуровой кислотой . (ОЫаша, 0И1в111,1979).

Активность СОД (усл.ед./иг белка) определяли по способности тормозить восстановление паранитротегразолия хлористого в дифорыазан супероксиданионрадикалом, генерируемым фотохимически в среде, содержащей рибофлавин (Чумаков, Сагальчик,1983).

Активность ГР (нмоль НАДРН Н/шш/чг белка) оценивали по убыли НАДРН * Н (Крутикова, Шту-шан, 1981). Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре СФ-21.

Определение содержания общего белка проводили по методу Лоури (Ьожгу е-1.а1., 1951).

При обработке и анализе результатов применяли вариационно-статистические методы с вычислением степени

достоверности между средними величинами по t-критерию Стьвдента. Математическая обработка результатов экспериментов выполнена на ПЭВМ "Conrnodore-64".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Функциональная устойчивость нейронов в условиях активации реакций перекмсиого окисления липидов

Сравнительное изучение уровней активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы, проведенное у представителей Mollusca показало, что их значения у наземных Helix pomatia и Linax sp. близки с таковыми в печени крыс и достоверно выше чем у Lymnaea stagnalls и Planorbarius corn-ua, обитающих в водной среде. Активности СОД и ГР в гепатопанкреасе и центральной нервной системе (ц.н.с.) L. stagyialls на 24-28% ниже таковых в печени крыс. Определенная близость уровней ферментативной антиокислительной защиты в тканях прудовика и крыс, пойюглогершых кивогнкх с гораздо более высоким уровнем метаболических процессов, определяет перспективность использования ц.н.с. Ь. stagnalls в качестве модельного объекта для тестирования нейронатологических состояний, опосредованных свободными радикалами.

Введение в раствор инкубации изолированных ц.н.с. радакалообразукщего липопероксидного аналога - гидроперекиси трет-бутила (ПГБ) вызывало дозозавиишое увеличение продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, максимум накопления которых зарегистрирован к 10 жн. Наряду с увеличением содержания МДА снижалась активность ферментов антиоксидантной защиты - СОД и TP, причем в одинаковой степени при инкубации с 10 и 20 мМ ГТБ.

Динамика функциональной импульсной активности ряда идентифицированных и неиденгифицированных нейронов в условиях индукции ПОЛ характеризовалась наличием ряда общих закономерностей в наступающих изменениях потенциала покоя, амплитуда потенциала действия и частоты ПД. Значительное качественное сходство в развитии повреждения в разных нейронах, при актжации свободнорадикальных реакций позволило выделить 5 последовательных фаз реализации повреждающего действия. В

латентную фазу, длящуюся 1-3 мин, отдельные нейроны реагировали ¡■чащением импульсной активности. В фазу начальной реактивности .2-4 мин) возникала гиперполяризация клетки (на 1-4 мВ), /меньшалась либо временно исчезала ее фоновая импульсная активность. Латентная фаза и начальная реактивность нейрона,' вероятно, отражают защитную перестройку возбудимой мембраны, направленную на сохранение возбудимости и функционального статуса нейрона. В фазу адаптивной устойчивости (10-20 мин) несмотря на снижение мембранного потенциала и амплитуды ГЩ импульсная активность поддерживалась на уровне, близком к фоновому. Для фазы реализации повреждения характерно резкое изменение импульсной активности, падение амплитуды ГЩ, уменьшение мембранного потенциала, а' затем и полное превращение импульсной активности. В терминальную фазу повреждения (1,5- 2 час) импульсная активность нейронов отсутствовала, но могли сохраняться синаптические потенциалы. Мембранный потенциал снижался до 35-30 мВ, но клетка была способна генерировать ЦД после предварительной гиперполяризации. В конце этой фазы развивалась быстрая деполяризация и гибель нейрона.

Исследования, проведенные в условиях внутриклеточного диализа с фиксацией потенциала позволили выявить, что индукция свободнорвдикальных реакций ПОЛ модифицировала состояние потенциалзависимых натриевых и калиевых каналов. , Динамика подавления потенциалзависимых. проводимостей мембраны носила сложный фазовый характер. Снижение максимальной амплитуды входящего тока происходило в 2 фазы: раннш, в которую после частичного угнетения входящего тока наблюдалось его восстановление и кратковремегаая стабилизация; и позднюю, .когда развивалось полное подавление натриевого тока. При действии ГТБ имело место первоначальное нарастание амплитуды задержанного выходящего калиевого тока • с последующей стабилизацией на новом повьшеннсш уровне. Абсолютное подавление калиевой проводимости запаздывало на 5 - 10 мин по отношению к натриевой. .Анализ вольтаиперных характеристик исследуемых токов не выявил их смещения вдоль оси потенциалов. Деградация исследованных потенциалзависимых проводимостей на фоне аппликации ГТБ указывает на наступающую при этом утрату

10

электрической возбудимости, но не является единственным фактором нарушения ионного гомеостаза и гибели клетки. Увеличение неспецифической проводимости нейрональной мембраны, оцениваемой по току утечки, который определяется физико-химическим состоянием липидного бислоя и характеризует ев'" ":тво мембраны служить барьером проницаемости, развивалось после продолжительного латентного периода до критического размера.

Характеристика свободнорадикального повреядения изолированных нервных волокон и повышение их функциональной устойчивости антиоксидантами Инкубация изолированных седалищных нервов лягушки в сбалансированной безсубстратной среде Рингера при температуре 18-20 С сопровождалась накоплением МДА и снижением активности ферментов антиоксидантноЯ защиты - СОД и ГР. Достоверное повышение содержания МДА на 47% (Р<0,05) наступало через 50 час после выделения нервов. Активации ПОЛ предшествовало снижение активности СОД на 35 % (Р<0,05) регистрируемое через 25 час. Снижение активности ГР запаздывало по сравнению с динамикой СОД и выявлялось через 50 час инкубации нервов. В дальнейшем активность 1'Р не изменялась, тогда как СОД через 80 час вновь снижалась. Введение антиоксиданта ионола (2, 6-дитретбутила -4-ыетилфенола) в среду инкубации снижало на 45 % накопление во времени МДА (Р<0,05), повышало на 26% (Р<0,05) активность СОД, по не влияло на активность ГР.

.Для выяснения возможной причинной связи между активацией свободнорадикальных реакций пероксидации мембранных липидов и нарушением функциональной устойчивости нервных волокон проведено электрофизиологическое тестирование параметров проведения нервного импульса. Проведенные исследования показали, что начальные признаки нарушения специализированной аксональной функции в волокнах изолированного нерва, а именно: снижение амплитуды ЦД, максимальной скорости деполяризации, скорости проведения нервного импульса, увеличение длительности абсолютного и относительного рефрактерных периодов волокон группы А, возникали с большой латентностью (50 час) и соответствовали во времени значительному накоплению продуктов,

реагирующих с тиобарбитуровой кислотой.

Антиоксиданты ионол, значительно снижающий уровень продукта ПОЛ, и ОБХ-2, внесенные в среду инкубации, оказывали сильное стабилизирующее действие на возбудимую мембрану аксонов -существенно замедляли скорость потери возбудимости волокнами группы А, увеличивая период наступления достоверных изменений амплитуды 1Щ до 60 час и снижали степень повреждения возбудимой мембраны. Поддержание возбудимости может быть обусловлено частичным сохранением в процессе переживания максимальной натриевой проводимости, о чем свидетельствовало замедление снижения максимальной скорости развития переднего фронта ПД (V гоах.). За 80 час инкубации с конолсм амплитуда ПД была на 53%, а V шах. на 45% выше (Р<0,01), чей в контрольных препаратах.

Важным следствием антиоксидантной защиты изолированных' нервных волокон при переживании являлось продолжительное сохранение нормальной скорости инактивации натриевых каналов и падения калиевой проводимости при деполяризации мембраны. Об атом свидетельствовали незначительные сдвиги абсолютного и относительн го рефрактерных периодов на фоне антиоксидантов. АРП и ОРП при инкубации с ионолоы увеличились в 1,5 и 2,2 раза, тогда как в контроле соответствующие показатели составили 4,2 и 6,6 (Р<0,001). Следует отметить, что нарушение функциональных свойств нервных стволов в условиях антиоксидантной защиты ОБХ-2 были более значительны, чей при применении ионола. .

Стабилизация механизма возбудимости нервных волокон, достигаемая внтиоксиданташ, свидетельствует о их принципиальной возможности улучшать функционирование молекулярных структур возбудимой ыенбраны, образующих натриевые и калиевые ионные каналы и ионные насосы в условиях активации ПОЛ. Более длительное сохранение специализированной аксональной функции в условиях действия антиоксидантов указывает на возможность их применения для управления' скоростью дегенерации и регенерации поврежденных нервных стволов ln vivo.

Нервно-мышечное проведение в условиях активации перекисного окисления липидов при перерезке седалищного нерва и влияние на него антиоксидантов

Проведенные исследования доказывают роль ПОЛ как реального

12

посредника в запуске дегенерационного процесса в двигательных нервных волокнах после перерезки седалищного нерва у крыс. Об этом свидетельствовал рост содержания ВДА, выявленный в дегенерирующем участке нерва через 24 и 48 час после перерезки. Через 4В час после перерезки обнаружено т",ога снижение активности антиокислительных ферментов, бсЗлее выраженное для ГР, чем для СОД. Витамин Е предупреждал активацию ПОЛ, стабилизируя содержание МДА на уровне ниже фонового как в дегенерирующем, так и в интактнои нервах. Активность СОД при атом поддерживалась в пределах контрольных значения, а активность глутатионредуктазы снижалась практически с той же скоростью, как и в нервах, не подвергавшихся токоферольной защите. В денервированной т. ео1еиз содержание продуктов ПОЛ и активности СОД и ГР не изменялось.

Электронейромиографическое тестирование через 24 и 48 час после перерезки седалищного нерва показало, что характерным признаком дегенерации является нарушение свойств синаптической передачи: замедление времени восстановления синапса после проведения одиночного импульса и возрастание скорости декремента амплитуды биоэлектрического ответа на ритмическую стимуляцию нерва. Развитие дегенерации на уровне аксональных терминалей влекло за собой выключение активности отдельных двигательных единиц и постепенное уменьшение размера их потенциального фонда, что находило выражение в регистрируемом падении максимальной амплитуды вызванных М-ответов. Количественно этот процесс охарактеризован индексом дегенерации (ИД): через 24 час после перерезки нерва ИД составлял 36,7^-7,43, через 48 час ИД увеличивался до 77,5±8,2%. Значения ИД, полученные для различных временных интервалов показали, что дегенеравдонный процесс развивался с небольшим ускорением.

В условиях воздействия токоферола, блокирующего активацию ПОЛ, функциональные признаки дегенерации (замедленное восстановление нервно-мышечного синапса, декренентная реакция на ритмическую стимуляцию, сниженная амплитуда М-ответа) не исчезали, но значительно ослабевали, свидетельствуя о задержке дегенерационного процесса. Значения ИД уменьшались: через 24 час дегенерации - на 12,535 /Р<0,05/, через 48 час дегенерации на

24,3% /Р<0,05/. Возрастала устойчивость аксональных терминалей к дегенерационному процессу, так как' коэффициент антиоксидантной защиты, характеризующий эффективность токоферольной защиты, составил 1,52 и 1,46 соответственно. Витамин Е, осуществляя антирадикальную защиту и структурную стабилизацию аксональных терминалей, вероятно нормализует пороги возникновения кальциевого тока и процессы рециклирования фосфолипидов, нарушающиеся при активации ПОЛ (Ре11шг,1937; 2а1евка, ИНвоп, 1989), и, следовательно повышает устойчивость • синаптигческмх терминалей, где' происходит инициация ранних функциональных нарушений при денервации.

В отличие от витамина Е синтетический антиоксидант 0БХ-2 в исследованных условиях применения не вызывал замедления развития характерных электрофизиологических признаков дегенерации.-Коэффициенты антиоксидантной защиты составили 1,09 и 0,98. Рутин и кверцетин - растительные ' флавоноида, обладающие антиокислительной активностью в модельных биохимических системах ПОЛ (Костюк, Потапович, 1987, Сауа111п1, В1пс1о11, 1978), практически не изменяли нормативные параметры нервно-мышечной функции, однако вызывали сильное падение вызванных М-ответов в ью ыщдуга ухе через 24 час после перерезки нерва. Они ускоряли и усиливали дегенерационные изменения- синаптической передачи. Таким образом, растительные флавоноида, в отличие от .¿-токоферола, в условиях ранней дегенерации не проявляли своих антиокислительных свойств, которые могли бы лежать в основе защитного противодегенерацио^юго действия в нервно-мышечной системе. Обнаруженное явление ускорения ранней дегенерации может служить определенным ограничением для применения флавоноидов при нервно-мышечных патологиях свободнораднкального генеза. Возможно, это связано с их способностью функционировать в качестве прооксидантов - генераторов супероксиданион- и гидроксильного радикалов (Костюк, Потапович, 1988; 1аи§ьгоп, На1И*е11, 1989).

выводы

I. Активация в нейронах Ьутпаеа в1а£па11в свободнорадикальных процессов гидроперекисью трег-Сутила, сопровождающаяся увеличением содержания малонового диальдегида и уменьшением

активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы, оказывает поврендавдее действие на нейрональную функции. Наступающая при этой модификация паттерна импульсной активности включает следующие основные фазы: латентную, начальной реактивности, адаптивной устойчивости, реализации повреждения и терминальную.

2. Входящий и задержанный выходящий токи в условиях активации свободнорадикальных реакций перекисного окисления липидов уменьшаются, а иеспецифическая проводимость нейрональной мембраны, напротив, увеличивается.

3. Возникающие в процессе переживания изолированных нервных волокон нарушения функциональных характеристик аксонального проведения - снижение амплитуды потенциала действия, уменьшение скорости развития деполяризации, удлинение рефрактерных периодов, уменьшение скорости проведения импульса в волокнах группы А сопряжены с активацией перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует наступающее при этом увеличение содержания МДА и уменьшение активности антиокислительных ферментов СОД и ГР.

4. В условиях длящегося переживания изолированных нервов ионол повышает функциональную стабильность аксснальной мембраны и улучшает функциональные характеристики проведения нервного импульса. Содержание МДА в нервных волокнах при атом снижается, активность СОД повышаемся, а ГР - не изменяется. Новый синтетический антиоксидант ОБХ-2 - производное 4-ашшшо-5-иетокси-1,2-бензопшона оказывает сходный, однако менее выраженный эффект.

5. При ранней дегенерации двигательных нервных волокон развивается прогрессирующее во времени нарушение синаптической передачи: снижение амплитуды максимального Н-ответа, замедление восстановления нервно-мышечного синапса, возрастание скорости декремента амплитуды биоэлектрического ответа на ритмическую стимуляцию. В дегенерирующей нерве увеличивается содержание МДА и снижается активность СОД и ТР.

6. Витамин Е замедляет развитие нарушений нервно-мышечной передачи при ранней дегенерации аксоналышх термина лей, о чем свидетельствует стабилизация восстановительных процессов в нервно-мышечном синапсе, повышение устойчивости проведения

высокочастотных сигналов, уменьшение индекса дегенерации. Содержание МДА в нервных волокнах при этой снижается, активность СОД повышается, а ГР - не изменяется.

7. Производное ортобензох^инона г ОБХ-2 не оказывает защитного аффекта на нейрональные функции, а растительные флавоноиды рутин и кверцетин усиливают функциональные нарушения нервно-мышечной передачи при ранней дегенерации двигательных нервов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Петрашевская H.H., Боборико Т.Л. Сравнительное изучение ферментов антиокс^дантной защиты у некоторых видов брюхоногих моллюсков // Пробл. соврем, биол. Тр. 17 науч. конф. иол. ученых биол. фак. МГУ, Москва, 22-25 апр., 1986. Ч.2.- И., 1986., 2-5, ил.4. Библиограф. 8 назв. Рус. (Рукопись деп. в ВИНИТИ 15.09.86, T666I-B ).

2. Петрашевская H.H., Боборико Т.Л. Системы антиоксидантной защиты у некоторых, видов брюхоногих моллюсков // Вопросы эволюционной физиологии. Тезисы сообщений 9 совещания по эволюционной физиологии - Л., Наука - 1986,-С.222.

3. Петрашевская H.H. Электрофизиологические характеристики нервных клеток в условиях инициации свободнорадикальных реакций // МП сьезд Бел. визиол. общества им. И.П.Павлова. Тез.докл.-Витебск.-1987.-178 с. . .

4. Мороз Л.Л., Петрашевская ,Н."., Будько Д.Ю., Шалатонин В.Т. Эле ктрофизиологиче екая характеристика повреждающего действия индукторов свободнорадикальных реакций на возбудимые мембраны // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Сборник научных статей.- Рига.- I9Ö8.-С.184-187.

5. Петрашевская H.H., Мороз Л.Л., Шалатонин В.Т. Использование Ьушаеа BtagnaliB в качестве модельного объекта для тестирования нейропатологий, опосредованных свободными радикалами // Простые нервные системы и их значение для теории и практики . Материалы II Всесоюзной конференции.- Л., Наука.- 1988.- С.226-229.

6. Петрашевская H.H., Мороз Л.Л., Будько Д.Ю., Шалатонин В.Т. Изменение потенциалзависимых ионных проводимостей мембраны \и импульсной активности нейронов Lynsiaea stagpalls при воздействии индукторе» свободнорадикальных реакций // Известия АН БССР. Сер,

биол. наук.-1989.- г.- С.60-64.

7. Шалатонин В.Т., Петрашевская Н.Н., Чернова Т.О. Влияние /-токоферола, рутина и кверцетина на развитие ранней дегенерации

двигательных нервных волокон // Вестник БГУ. Серия 2.-1991,-2.- С.31-35.

8. Шалатонин В.Т., Петрашевская Н.Н.., Чернова j\0. Активация перекисного окисления липидов при ранней дегенерации двигательных нервов и влияние на ёе развитие антиоксидантов // Пат. физиология и эксперим. терапия- 1991.- 5.- С.

9. Shalatonin V.T., FetrashevBkaya N.N. Experimental modelling oi iree radical neuropathology on nervous system ol lymnaea Btagnalls //Simpler Nervous Systems. Regional Meeting ol the International Society lor Invertebrate Neurobiology (ISDJ).-Ulnsk.-1991.-P.84.

Подписало h печати i&.il-Oh- Формат 60x84 I/¡S.

Усл. печ.л. Тираз -feo авз. Бесплатно. Заиаз 2чео.

ППП БелНИИНТИ. 220004, Мнвсн, пр. Иашерова, 23.