Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Стволовые и прогениторные клетки пульпы и их характеристики после ортопедического препарирования твердых тканей зуба (клинико-экспериментальное исследование)

003490073

На правах рукописи

Шамсутдинов Марсель Ильдусович

Стволовые и прогениторные клетки пульпы и их характеристика после ортопедического препарирования твердых тканей зуба (клинпко-экспериментальное исследование)

стоматология -14.00.21 гистология, цитология, клеточная биология - 03.00.25

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань - 2009

003490073

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители: доктор медицинских наук, доцент

Салеева Гульшат Тауфиковна

доктор медицинских наук, профессор Киясов Андрей Павлович

доктор медицинских наук, профессор Вагнер Владимир Давыдович

доктор медицинских наук, профессор Исламов Рустем Робертович

ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «25» декабря 2009 г. в ¿ц °°час. на заседании диссертационного совета Д 208.034.02 при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (420012, г.Казань, ул. Бутлерова, Д.49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке К ганского государственного медицинского университета (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д.49 Б).

Автореферат разослан « 2^» ноября 2009 г.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

И.Д. Ситдикова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема сохранения и восстановления целостности зубов и зубных рядов ставит перед стоматологами сложную задачу обеспечения эффективности лечения и восстановления жевательной функции пациентов. Нарушения целостности зубов и зубных рядов могут привести к изменениям в лицевом скелете, височно-нижнечелюстном суставе, в мягких тканях, что не может не отразиться на качестве жизни человека. Лечение дефектов зубных рядов проводится путем замещения несъемными и съемными конструкциями из различных материалов (Х.А. Каламкаров, 1988), а также путем протезирования с использованием дентальных имплантатов (М.З. Миргазизов, В.Н. Олесова и др., 1985). Лечение дефектов твердых тканей зубов предполагает препарирование и последующее закрытие выбранного участка поврежденного зуба пломбировочным материалом (Л. А. Дмитриева, 2003) или ортопедической конструкцией (X. А. Каламкаров, 1977). Высокая потребность в стоматологическом лечении дефектов твердых тканей зубов и зубных рядов обусловливает актуальность изучения и внедрения альтернативных методов лечения.

Традиционные методы лечения, устраняя дефект в зубе, полностью блокируют его возможность к самовосстановлению или регенерации. Однако зуб, как любой орган в организме млекопитающих, способен к регенерации, одним из примеров которой является образование третичного дентина. Следовательно, изучение клеточных источников и механизмов регенерации зуба позволит разработать новые методы лечения, которые будут основаны на принципах регенеративной медицины. Они также направлены на активацию восстановительных механизмов органов и тканей за счет стимулирования пролиферации стволовых клеток, из которых образуются дифференцированные клетки, способные выполнять определенные функции, в том числе и синтез дентина. Конечная же цель регенеративной медицины, в том числе и стоматологии, - получение методами биоинженерии функционально полноценных органов, которые можно использовать для замещения утраченных в результате болезни или с возрастом зубов (A. Atala, 2005; L.G. Griffith, G. Naughton, 2002; E. Ikedaa, T. Tsuji, 2008; B. Pumell, 2008). Изучение развития зубов позволили установить взаимодействие эпителиальных и мезенхимальных (экгомезенхимальных) клеток (S. Shi, S. Gronthos, 2003), из которых соответственно образуются амелобласты и эктомезенхимальные клетки, дающие начало одонтобластам, цементобластам и фибробластам периодонтальной связки. Именно эти знания позволили японским исследователям получить из 14-ти дневного эмбриона мыши клетки методом тканевой инженерии зачаток зуба, успешно трансплантированный в последующем в челюсть взрослого животного (Ikedaa Е. et al!., 2009). В то же время следует подчеркнуть, что наиболее перспективным является разработка методов восстановления целостности зубов или их

выращивания, основанных на использовании стволовых или прогениторных клеток самого пациента. Именно поэтому в последние два десятилетия одной из актуальных проблем является поиск стволовой клетки зуба или пульпы во взрослом организме (Alliot-Licht В. et all., 2005). Основным подходом для идентификации этих клеток является метод выделения клеток из пульпы с последующим культивированием их in vitro на различных подложках и с добавлением различных ростовых факторов (Gronthos et all., 2000). Попытки описать фенотип свежевыделенных клеток не позволили четко идентифицировать фенсггипические признаки как предшественников, так и стволовых клеток пульпы, а главное - установить их локализацию в пределах пульпы. Именно поэтому до сих пор остается не известной реакция стволовых и прогениторных клеток пульпы на одонгопрепарирование и различные виды временных коронок, изготовление которых является неотъемлемой частью протокола ведения пациентов с несъемными ортопедическими конструкциями. Все вышеизложенное явилось основанием для проведения настоящего исследования.

Объект и предмет исследования

Объектом исследования являлись 102 пациента с дефектами твердых тканей зубов и зубных рядов (с временными коронками). Экспериментальная часть выполнялась на кроликах (14) и собаках (4). Предметом исследования явилась пульпа зуба человека и млекопитающих.

Цель работы: исследовать клеточный состав пульпы зуба с позиции поиска прогениторных (стволовых) клеток и проанализировать клеточные реакции пульпы на ортопедические вмешательства.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести анализ отдаленных результатов состояния пульпы отпрепарированных зубов в зависимости от материала, из которого были изготовлены временные коронки, на основании изучения медицинских карт стоматологических больных и клинических наблюдений.

2. Изучить экспрессию эпителиальных и мезенхимальных маркеров, а также маркеров прогениторных и стволовых клеток, в различных клеточных популяциях пульпы человека и лабораторных животных (кролик, собака).

3. Проанализировать реакцию стволовых и прогениторных клеток пульпы на одонгопрепарирование.

4. Сравнить реакцию и состояние стволового компартмента пульпы зуба на различные материалы прямых временных конструкций после одонтопрепарирования.

Методы исследования

В работе использовались современные методы исследования в области стоматологии и гистологии: электроодонтометрический, рентгенологический, иммуногистохимический, статистический.

Достоверность полученных данных н их научная новизна

Для получения достоверных результатов проведено достаточное количество экспериментов. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью пакетов прикладных программ SPSS 10,0 и Statistica 6,0. При этом определяли среднее арифметическое значение (М), среднее квадратичное отклонение (s), ошибку средней арифметической (ш).

Научная новизна полученных результатов, по мнению автора, заключается в том, что впервые было установлено два типа стволовых клеток в пульпе зуба человека - эктомезенхимальные для одонтобластов и мезенхимальные для клеток соединительной ткани пульпы, которые имеют разную локализацию в пределах пульпы и экспрессируют различные маркеры. Впервые был найден маркер, позволяющий выявлять одонтобласты и их предшественников, которым является эпителиальный мембранный антиген, экспрессирующийся на большинстве эпителиальных клеток млекопитающих.

В эксперименте на основании анализа иммуногистохимических реакций установлено, что при препарировании твердых тканей под литые ортопедические конструкции, а также в результате различных лечебных мероприятий на зубах активизируются клетки как эктомезенхимального, так и мезенхимального стволовых компартментов пульпы зуба.

Экспериментально впервые установлено, что не только воспалительная реакция пульпы, но и активация, а также гибель клеток в ее стволовых компартментах после одонтопрепарирования зависят от материалов, из которых изготовлены временные защитные коронки.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты, основные положения и выводы, представленные в работе, имеют теоретическое значение при дальнейшем изучении проблемы развития патологических процессов в пульпе зуба, а также регенерации и активации прогениторных клеток пульпы. Они позволяют по-новому оценить и понять закономерность развития изменений, происходящих в зубе человека, при различных травмирующих факторах, таких как препарирование зуба под литую ортопедическую конструкцию, изготовление временных коронок из акриловой самотвердеющей пластмассы и специального композитного материала. Обнаруженные изменения в клеточном составе пульпы зуба могут способствовать раскрытию причин таких нарушений, как пульпит и его осложнения, а полученные в ходе экспериментального исследования результаты могут повысить эффективность стоматологического лечения за счет подбора материалов для изготовления ортопедических конструкций, обладающих наименьшей цитотоксичностью.

Особую практическую ценность представляет установление факта экспрессии клетками-предшественницами одонтобластов эпителиального мембранного антигена. Поскольку это трансмембранный гликопротеин, то с его помощью можно выделять чистую популяцию клеток

предшественниц одонтобластов и изучать не только возможности и условия их дифференцировки, но и продолжить исследования по созданию тканевых инженерных конструкций для замещения дефектов дентина.

Полученные в работе результаты целесообразно использовать деятельности ортопедических отделений стоматологических медицинских организаций, лекционном материале по ортопедической стоматологии и гистологии для студентов стоматологических факультетов и факультетов последипломного образования, а также при разработке новых методов регенеративной медицины и тканевой инженерии в области стоматологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В пульпе зуба имеются 2 типа стволовых клеток -экгомезенхимальные для одонтобластов и мезенхимальные - для клеток соединительной ткани пульпы.

2. Активация мезенхимальных клеток в центральных зонах пульпы и развитие воспалительной реакции зависят от химических свойств материала, из которого изготовлена временная ортопедическая конструкция.

Личный вклад соискателя

Автором выбрана тема, составлена программа, поставлены задачи, определены этапы и методы исследования. Автор принимал непосредственное личное участие в клиническом обследовании и лечении больных, организации и проведении различных лабораторных, инструментальных и иммуногистохимических исследований, разработал новые способы извлечения пульпарной ткани из твердых тканей зубов. Статистическая обработка, сопоставление полученных результатов с данными литературы, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций принадлежат лично автору.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (2006, 2007, 2008, 2009гг.), международной научно-практической конференции «Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты)» (Пермь, 2008г.).

Публикации по теме диссертации Основные результаты диссертационного исследования достаточно полно отражены в 10 научных работах, в том числе двух статьях, опубликованных в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций -1,25 у.пл., в том числе авторский вклад - 0,75 у.п.л.

Реализация результатов работы

Результаты работы используются: в учебном процессе на кафедре нормальной анатомии; на практических занятиях со студентами, слушателями курсов повышения квалификации стоматологов-ортопедов, с клиническими ординаторами и интернами на кафедре ортопедической стоматологии Казанского государственного медицинского университета;

кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний и новых технологий Чувашского государственного университета; кафедре пропедевтики и физиотерапии стоматологических заболеваний Башкирского государственного медицинского университета. Алгоритм стоматологического ортопедического лечения больных с временным этапом протезирования используется в лечебной деятельности ортопедического отделения стоматологической поликлиники КГМУ, в ООО «Стоматологическая поликлиника» №5, в ОАО «Стоматологическая поликлиника» №9, ООО «Стоматологическая поликлиника Рокада-мед» г. Казани, стоматологической поликлинике МУЗ №1 и №3 г. Набережные Челны.

Структура диссертации, её объем

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников, содержащего 189 работ, в том числе 107 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 49 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования Для решения поставленной цели и задач нами был использованы

следующие методы (табл. 1 ).

__Таблица 1.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ КОЛИЧЕСТВО

Анализ медицинских карт стоматологического больного Статистический 96 единиц

Пациенты с дефектами твердых тканей зубов и зубных рядов (с временными Статистический 102 пациента

коронками) Рентгенологический 240 исследований

Электроодонтометрический 642 измерения

Пульпа зубов человека Гистологический 85 ед.

Контрольная группа гистологический 40 ед.

Опытная группа Гистологический 45 ед.

Кролик (порода шиншилла вес от 2,5 кг. и выше) Контрольная группа зубов Препарированные зубы Гистологический Гистологический 14 кроликов 11 зубов 43 зуба

Собаки (беспородные) 4 собаки

Ко1ггрольные зубы Гистологический 12 зубов

Препарирование зубов с изготовлением временных коронок («Акрилоксид», «Protemp 3 Garant») Гистологический 43 зуба

Общая характеристика клинического материала

Для выполнения поставленных задач по изучению отдаленных результатов состояния пульпы препарированных зубов с изготовлением временных коронок был проведен анализ на основании записей в медицинских картах стоматологических больных.

За период, в течение которого в клинике материалом для изготовления временных коронок прямым методом использовалась пластмасса химического отверждения «Акрилоксид», проанализировано 96 медицинских карт стоматологических больных, которым на интакгные витальные 182 зуба были изготовлены литые конструкции с этапом формирования прямых временных коронок из пластмассы холодной полимеризации «Акрилоксид» (фирмы «Стома»).

С учетом результатов анализа медицинских карт стоматологических больных и данных собственных экспериментальных исследований была набрана группа пациентов из 102 человек, которым на 216 интактных витальных зуба изготовлены литые конструкции с временными коронками из бис-акрилового материала Protemp Garant (ЗМ ESPE). Наблюдения за динамикой процессов, происходящих в пульпе, проводились в течение 1 года с учетом рентгенологической оценки ортопантомограмм до лечения и после припасовки литых конструкций. В некоторых случаях применялась прицельная радиовизиография.

Морфологические и экспериментальные исследования Исследование на зубах человека

Характеристика объекта - пульпа зуба человека.

Нами проведены морфологические исследования 85 пульп зубов человека.

Контрольная группа состояла из пульпы 40 зубов, удаленных по плану ортодонтического лечения и предоставленных врачами города Казани. Опытная группа: пульпа 45 зубов, в том числе 39 единиц удаленных по клиническим показаниям после препарирования под литые ортопедические конструкции и 6 образцов, полученных из зубов пациентов, у которых в процессе ортопедического вмешательства произошло вскрытие рога пульпы, вследствие чего проводилось эндодонтическое вмешательство.

Исследование на зубах кроликов

Характеристика объекта - пульпа кролика. Экспериментальная часть исследования выполнена на 14 кроликах породы Шиншилла обоего пола, весом от 2,5 до 3,5 кг, имеющих санитарные паспорта Были выделены две группы: первая - контрольная, где препарирование не проводилось (11), и вторая - опытная группа (43), у которых проводили препарирование центральных резцов верхней и нижней челюстей по всем требованиям одонтопрепарирования под литые ортопедические конструкции с использованием воздушно-водяным охлаждения под тиопенталовым наркозом. Животные выводились из эксперимента методом воздушной эмболии на 7,14 и 28 сутки эксперимента.

Исследование на зубах собак Экспериментальная часть исследования выполнена на 4 беспородных собаках обоего пола. Были изучены 55 пульп зубов. Из них контрольную составили 12 пульп здоровых зубов. Опытная группа (43 зуба) после препарирования под тиопенталовым наркозом была разделена на 2 подгруппы.

Подгруппе А (21) после препарирования зубов были изготовлены временные коронки прямым методом из «Акрилоксида».

Подгруппе Б (22) после препарирования зубов были изготовлены временные коронки из Protemp 3 Garant прямым способом.

Режим препарирования во всех группах осуществлялся турбинной установкой под воздушно-водяным охлаждением с использованием боров фирмы «Komet» (Германия). Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии на 7, 14 и 28 сутки после препарирования зубов.

Методика извлечения пульпы из зуба в эксперименте Первоначально удаленный зуб обрабатывался антисептиком - 3% раствором перекиси водорода и 0,05% раствором хлоргексидин-биглюконата. Далее пульпу зуба извлекали следующим способом: исследуемый в эксперименте зуб подвергали равномерной механической нагрузке по всей длине до возникновения трещины с помощью стерильного молоточка и свинцовой пластины. Далее щель осторожно, без избыточного давления расширяли, используя стоматологические инструменты (зажим и шпатель). Используя эндодонтические инструменты неповрежденную мягкую ткань пульпы извлекали из коронковой полости и корневых каналов зуба. Выделенную пульпу помещали в 10 % забуференный раствор формалина на 12 часов, промывали в проточной воде, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм наклеивали влажным способом на тщательно обезжиренные и прокаленные предметные стекла, покрытые тонким слоем яичного белка с глицерином. Затем препараты высушивали в течение 48 часов в термостате при 37°С, депарафинировали, регидратировали.

Методика иммуношстохимического окрашивания*

Для проведения иммуношстохимического исследования парафиновые срезы после депарафинизации обрабатывали кипячением в цитратном буфере (pH 6,0) и окрашивали с антителами против рецептора фактора стволовых клеток C-icit, CD-31, CD-34, a-SMA (a-гладкомышечный актин), ЕМА (эпителиальный мембранный антиген) и

' Автор выражает благодарность кандидату биологических наук, ассистенту кафедры нормальной анатомии Титовой М. А., совместно с которой выполнен данный фрагмент работы

ESA (эпителиальный специфический антиген) для выявления in situ отдельных клеточных популяций стрептавидин-биотиновым методом.

В качестве хромогена для выявления пероксидазной активности использовали аминоэтилкарбазол. Все первичные и вторичные антитела были производства компании Novokastra (Великобритания). Характеристика первичных антител представлена в таблице 2. Результаты иммуногистохимического окрашивания оценивали под световым микроскопом Leica DM 1000 и регистрировали с помощью цифровой видеокамеры Leica DFC 290.

Характеристика первичных антител

Таблица 2.

Антитела Клон Аятигеи Клетки, которые экспрессируют этот антиген

Анти C-kit Т595 c-kit (рецептор к фактору стволовых клеток), CD1) 7 Эпителии, глиальные клетки, тучные клетки, мелзноциты.

Акта CD 31 1А10 CD31 Эндотелиальные клетки, тромбоциты, грзнулоцигты, моноциты, В-лимфоциты

Анти CD 34 QBEnd/10 CD34 Эндотелиальные клетки, кроветворные стволовые клетки

Анти a-SMA 1А4 a-гладкомышечный актин Гладкомьпнечные клетки, миофибробласты

АнтиЕМА GP1.4 Эпителиальный мембранный антиген Эпителий

AirraESA VU-1D9 Эпителиальный специфический антиген Эпителий, за исключением мезотелия

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ медицинских карт стоматологических пациентов с проведением этапа изготовления временных коронок

Обязательным этапом в алгоритме протезирования литыми конструкциями является изготовление временных коронок. В связи с этим проанализировано 96 медицинских карт стоматологического больного и установлено, что было отпрепарировано 182 витальных зуба с этапом изготовления временных коронок прямым способом из «Акрилоксида». В 129 зубах - 70,8% пациентов было отмечено воспаление пульпы и проведено последующее эндодонтическое лечение: в первые 14 дней после препарирования и изготовления временных коронок из «Акрилоксида» - в 97 зубах (53,4%), а в 32 зубах (17,6%) были выявлены осложнения в течение 1 года в различные сроки после фиксации постоянных конструкций (рис 1.).

ю

без пат

Воспаление в течение

Воспаление в течение 14 дней; 53,4%

Рис.1. Состояние пульпы в различные сроки после препарирования и изготовления временных коронок из «Акрилоксида»

На основании анализа медицинских карт стоматологических больных по отдаленным результатам состояния опорных зубов в клинике для диспансерного наблюдения была набрана группа пациентов из 102 человек, которым на 216 витальных интактных зуба после препарирования были изготовлены литые конструкции с временными коронками только из бис-акрилового материала (композита) Protemp 3 Garant (фирма ЗМ).

На этапах клинического обследования и лечения проводились рентгенологические исследования. По диагностической панорамной или прицельной рентгенографии определяли отсутствие или наличие патологических изменений в зоне опорных зубов. По контрольному исследованию на этапах лечения оценивали точность прилегания ортопедической конструкции.

Показатель электроодонтометрии опорных витальных зубов до препарирования составил 6,82±2,21мкА. Наиболее выраженная ответная реакция пульпы на раздражение электротоком проявлялась на 7-10 сутки после препарирования и изготовления временных коронок с тенденцией к повышению порога электровозбудимости до 5,11±1,82 мкА. Исследованию на этом этапе подверглись 210 опорных зубов, так как в 6 (2,8%) клинических случаях на этапах изготовления постоянных конструкций развились необратимые воспалительные изменения в пульпе отпрепарированных зубов, что обусловило проведение соответствующего эндодонтического лечения. При этом показатели электроодонтометрии составляли 53,7±9,3 мкА. Анализ причин воспаления пульпы показал, что осложнения были связаны с аномалиями расположения препарируемых зубов и зубочелюстными деформациями (рис.2).

При исследовании зубов через 1 месяц после препарирования и изготовления временных коронок из бис-акрилового материала (композита) Protemp 3 Garant отмечалась тенденция к снижению показателей электровозбудимости (6,9 мкА).

п

Рис.2 Распределение зубов по воспалению пульпы в различные сроки после препарирования и изготовления временных коронок из «Protemp 3 Garant»

Таким образом, анализ медицинских карт стоматологических больных показал, что в 70,8% случаев выявились осложнения в пульпе отпрепарированных зубов, что, по нашему мнению, было связано с полимеризацией быстротвердеющей пластмассы в полости рта в процессе изготовления временных коронок из «Акрилоксида» прямым методом. В случае использования «Protemp 3 Garant» в качестве материала для временных конструкций выявлено, что процент осложнений составляет лишь 2,8% из общего количества зубов, выбранных в качестве опоры для будущих ортопедических конструкций.

Экспрессия маркеров эпителиальных, мезенхимальных и стволовых клеток в клеточных популяциях пульпы зуба у человека

Зубы и окружающая их кость развиваются в результате взаимодействия эпителиальных и мезенхимальных (эктомезенхимальных) клеток, поэтому в зубе можно выделить две популяции стволовых клеток: эпителиальные, из которых образуются амелобласты, и мезенхимальные, дающие начало одонтобластам, цементобластам, остеобластам и фибробластам периодонтальной связки. Микроокружение (клетки и межклеточный матрикс), в котором находятся стволовые клетки, принято определять термином «ниша» стволовых клеток. Предполагают, что ниша эпителиальных (для амелобластов) стволовых клеток в резцах грызунов - это пришеечная область зуба (Harada H. et al., 2007; Mitsiadis T.A. et al!., 2007), a мезенхимальные стволовые клетки, из которых образуются одонтобласты, находятся в периваекулярных областях пульпы (Shi S. et all., 2003). Несмотря на все имеющиеся предположения и на доказательства того, что мезенхимальные стволовые клетки можно выделить из пульпы зуба, периодонтальной связки (Seo В.М. et all., 2004; 2005) и зубного сосочка (Morsczeck С., Gôtz W. et all, 2005), ниша этих клеток, а также их фенотип in vivo до сих пор не известны. Неоднократно было показано, что в пульпе есть

клетки, из которых образуются предшественники одонтобластов (About I. et all., 2000; About I. et all., 2001; Gronthos S. et all., 2000; Gronthos S. et all., 2002; Tecles O. et all., 2005; Graham A. 2003). В то же время сами клетки предшественники (стволовые клетки) до сих пор не идентифицированы, а следовательно, не известен и их фенотип. В отличие от мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани, одонтобласты не являются истинно мезенхимальными клетками и относятся к клеткам так называемой эктомезенхимы (Kuratate М. et all., 2008), то есть к мезенхимальным клеткам, берущим начало из региона нервного гребня. Кроме свойственных нервной ткани маркеров, в частности нестина (Webb P.P. et all., 1995), дифференцирующиеся одонтобласты экспрессируют цитокератин №19 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (Webb P.P. et all., 1995).

Учитывая вышесказанное, нами была выдвинута гипотеза, что одонтобласты и их предшественники могут экспрессировать не только цитокератин, но и другие маркеры эпителия, с помощью которых можно будет определить самих предшественников (стволовые клетки) одонтобластов и их тканевую нишу.

Проведенный в ходе выполнения работы иммуногистохимический анализ пульпы зуба человека позволил нам получить следующие результаты.

Экспрессия а-гладкомышечного актина

Экспрессия этого маркера в пульпе здоровых зубов и пульпе зубов, удаленных по медицинским показаниям, была различной. В пульпе здорового зуба белок экспрессировали, в основном, гладкомышечные клетки кровеносных сосудов. Совершенно иную картину наблюдали в пульпе после препарирования зубов под ортопедические коронки и при воспалении пульпы. Так, в последнем случае после подготовки зуба под ортопедическую конструкцию количество экспрессирующих а-гладкомышечный актин клеток, которые в основном располагались в субодонтобластическом слое, было значительным, и это уже были не единичные, а многочисленные а-гладкомышечный актин-позитивные клетки. В ряде случаев эти клетки располагались в виде многослойного пласта, лежащего на границе между одоигобластами и центральной частью пульпы. При воспалении пульпы клетки, экспрессирующие а-гладкомышечный актин, были обнаружены во всех зонах пульпы, а не только в субодонтобластическом слое. Более того, часть этих клеток располагалась непосредственно среди одонтобластов.

а-Гладкомышечный актин используют в качестве маркера при изучении популяции малодифференцированных клеток, которые образуются из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (мезенхимальных стволовых клеток) (Cai D. et all., 2001; Yamada M. et all., 2005). При культивировании клеток коронковой пульпы, выделенной из моляров, было показано, что в культуре образуются узлы или центры минерализации, где происходит отложение фосфатов кальция, а клетки этих узлов экспрессируют а-гладкомышечный актин (Alliot-Licht В. et all. 2001). Таким образом, именно этот белок часто используется в качестве маркера клеток-

предшественниц одонтобластов (Lopez-Cazaux S. et all. 2006) при изучении стволовых клеток пульпы in vitro.

Данные, полученные в нашем исследовании, подтверждают предположение, что предшественники одонтобластов могут экспрессировать а-гладкомышечный актин. Причем при отсутствии патологии в пульпе а-гладкомышечный актин присутствует только в цитоплазме гладкомышечных клеток и единичных клетках субодонтобластического слоя. При повреждении же зуба или пульпы количество таких клеток возрастает и расширяется зона их распределения в зависимости от степени выраженности действия повреждающего фактора. Сначала увеличивается количество клеток в субодонтобластическом слое, при более выраженном повреждении появляются клетки в центральных зонах пульпы, а затем и среди одонтобластов. Таким образом, на основании уже известных фактов и наших данных следует заключить, что предшественники одонтобластов могут экспрессировать а-гладкомышечиый актин. Однако необходимо иметь в виду, что в ходе развития зуба на стадии зубного зачатка и эмалевого органа в клетках эктомезенхимы этот протеин отсутствует. Таким образом, а-глацкомышечный актин - не облигатный маркер предшественников одонтобластов и появляется в последних лишь при миграции этих клеток на периферию пульпы, в ходе ответных реакций на повреждение зуба для замещения погибших одонтобластов.

Экспрессия CD 31 и CD 34

Оба антигена были обнаружены в эндотелии кровеносных сосудов пульпы. Отличия в экспрессии этих двух антигенов были лишь в интенсивности окраски клеток эндотелия. При проведении иммуногистохимических исследований во всех случаях наблюдали более интенсивное окрашивание клеток с антителами против CD34. В то же время паттерн распределения эндотелиальных клеток и кровеносных сосудов непосредственно в пульпе был одинаков, то есть отличалась только интенсивность окраски. Во всех здоровых зубах наблюдали несколько крупных сосудов, проходящих из корня в коронку зуба, и капиллярное сплетение в субодонтобластическом слое. В тех случаях, когда мы исследовали пульпу, выделенную из зубов на стадии обострения хронического пульпита, наблюдали выраженное увеличение количества капилляров в субодонтобластическом слое.

Кроме сосудов, имеющих четко выраженный просвет и находящихся ближе к центру пульпы, имелись многочисленные клетки, распологающиеся в непосредственной близости с одонтобластами. Следует отметить, что слой одонтобластов в этих случаях терял свою морфологическую гомогенность, то есть имело место альтерация одонтобластов и появление рядом с ними вновь образующихся капилляров. В работе A. Graziano с соавторами (2008) была продемонстрирована способность CD34+ клеток, выделенных из пульпы зуба человека, дифференцироваться в преостеобласты, которые начинали синтезировать костный матрикс после трансплантации под кожу

иммунодефицитным мышам (Graziano A. et all., 2008). Регистрируемое скопление CD34+ клеток в непосредственной близости от поврежденных одонтобластов, описанное в литературе, может свидетельствовать о том, что дифференцировка этих клеток возможна не только в преостеобласты, но и в преодонтобласты. Подтверждением этого могло быть выселение нами CD34+ клеток в непосредственной близости от поврежденных одонтобластов при пульпите. Однако использование двух маркеров эндотелиальных клеток и идентичность распределения CD31+ и CD34+ клеток позволила нам исключить возможность дифференцировки CD34+ клеток в одонтобласты. Увеличение плотности капиллярной сети и появление эндотелиальных клеток в непосредственной близости с одонтобластами может быть проявлением ангиогенеза (образование новых сосудов за счет ответвления от уже существующих) или васкулогенеза (образование сосудов из предшественников эндотелиальных клеток) как одного из звеньев регенераторного ответа в пульпе. Последний является основным механизмом образования сосудов у эмбриона, но был описан в постоянных зубах человека (Trubiani О. et all., 2003). Кроме того, было показано, что выделенные из пульпы зуба SP-клетки, экспрессирующие CD34+, демонстрируют выраженный васкулогенный потенциал на модели ишемии конечности у мышей (Iohara К. et all., 2008).

Таким образом, используя два маркера эндотелиальных клеток, один из которых является также маркером кроветворных стволовых клеток, мы не нашли подтверждения в пользу одонтогенного потенциала CD34+ клеток, а увеличение их количества и CD31+ клеток при повреждении зуба может быть лишь ответной реакцией, направленной на восстановление метаболизма в пульпе.

Экспрессия c-kit (рецептор к фактору стволовых клеток, CD 117)

При окрашивании с антителами против c-kit нами было обнаружено два типа клеток, которые экспрессировали этот антиген. Первая группа - это округлые клетки, расположенные в субодонтобластическом слое, а вторая группа - веретеновидные и отростчатые клетки, которые локализовались в центральных отделах пульпы. Следует отметить, что количество c-kit+ клеток значительно увеличивалось при воспалении пульпы в центральных зонах и практически все клетки пульпы, прилежащие к слою одонтобластов, начинали экспрессировать рецептор фактора стволовых клеток при пульпите.

C-kit - это рецептор, с которым связывается фактор стволовых клеток (stem cell factor, SCF). Их взаимодействие играет важную роль в пролиферации, дифференцировке и активации прогениторных клеток в различных биологических системах. Оба - и фактор, и его рецептор - были обнаружены в клетках пульпы, причем есть клетки, которые одновременно экспрессируют и лиганд и рецептор (Gagari E.et all. 2006). При помощи проточной цитометрии и сортинга клеток группа итальянских исследователей под руководством G.Papaccio выделила из постоянных и молочных зубов популяцию (c-kit+/CD34+/CD45-) клеток (Papaccio G. et all.

2006). Эти клетки при создании определенных условий in vitro дифференцируются в остеобласты, мышечные трубочки, жировые или эндотелиальные клетки (Laino G. et all., 2005; Laino G.et all. 2006; Laino G. et all., 2006; d'Aquino R. et all., 2007; Carinci F.et all., 2008; Graziano A. et all., 2008). Исследователи обнаружили, что регуляция ряда генов, ответственных за адгезию, строение цитоскелета и дифференцировку отличается в остеобластах из кости от остеобластов из клеток пульпы. Поскольку ни в одной из работ не была обнаружена дифференцировка выделенных клеток в одонгобласты, то, опираясь на данные, полученные в нашем исследовании, можно предположить, что итальянские ученые выделяли c-kit+ клетки, которые локализованы в центральных областях пульпы. Более того, нет никаких противоречий с нашими данными по экспрессии.

Нашими исследованиями не выявлены факты, подтверждающие дифференцировку CD34+ клеток в одонгобласты. В то же время на основании данных по экспрессии а-гладкомышечного актина и c-kit мы предполагаем, что предшественники одонтобластов находятся в субодонтобластическом слое пульпы. Другими словами, в пульпе находится как минимум два типа стволовых клеток - мезенхимальных и эктомезенхимальных, которые отличаются не только по происхождению и локализации внутри пульпы, но и по потенциям дальнейшего развития и дифференцировки.

Экспрессия эпителиальных маркеров

ЕМА (epithelial membrane antigen, эпителиальный мембранный антиген) - гликозилированные трансмембранные белки массой 40-425 kDa. В пульпе зуба ЕМА строго экспрессировали только одонгобласты. В здоровых зубах никакие клеточные элементы пульпы, за исключением одонтобластов, не экспрессировали на своей поверхности этот антиген. У одонтобластов хорошо прокрашивалась клеточная мембрана, но антиген не был обнаружен на мембране отростков клеток. При воспалении пульпы ЕМА выявлялся в клетках субодонтобластического слоя. Причем не все клетки этого слоя экспрессировали ЕМА, а лишь те, которые находились ближе к периферии пульпы, то есть прилежали к слою одонтобластов.

ESA (epithelial specific antigen, специфический для эпителия антиген) -поверхностный гликопротеин (40 kD) экспрессируется на базсшатеральных поверхностях эпителиальных клеток. ESA не был обнаружен ни в одном из исследованных зубов.

Из двух эпителиальных антигенов, которые мы использовали для выявления эпителиальных клеток и дифференциальной диагностики опухолей, только ЕМА был обнаружен в пульпе зуба. Этот антиген присутствовал на мембране одонтобластов и их предшественников. Проанализировав научную литературу, можем сказать, что мы впервые описали экспрессию эпителиального мембранного антигена в одонтобластах человека. Таким образом, наша гипотеза о том, что одонтобласты как эктомезенхимные клетки могут экспрессировать не только цитокератины, но и другие маркеры эпителия, подтвердилась. Более того, это еще одно

подтверждение того, что одонтобласты развиваются из нейроэктодермы, потому что ЕМА был обнаружен в клетках паутинной оболочки, эпендимоцитах и глиальных опухолях.

Следовательно, одонтобласты и их предшественники экспрессируют ЕМА. В пульпе зуба присутствуют как минимум два типа стволовых клеток -мезенхимальные и эктомезенхимальные. Это обстоятельство необходимо учитывать при культивировании смешанной популяции клеток, полученной из пульпы, а эпителиальный мембранный антиген может быть использован в качестве маркера одонтогенной дифференцировки клеток при поиске условий направленной дифференцировки стволовых и прогениторных клеток пульпы в одонтобласты.

Реакция клеточных элементов пульпы зубов кролика на препарирование твердых тканей зуба На гистологических срезах пульпы зубов кроликов как в норме, так и в эксперименте при окрашивании антителами к C-kit, CD-31, CD-34 наблюдали стойкое неспецифическое окрашивание, что не позволило изучить клетки, экспрессирующие эти антигены. Это может быть связано с тем, что антигенные детерминанты аналогичных молекул, как внутриклеточных, так и располагающихся на поверхности клеток, у кролика и у человека отличаются. Однако специфическое окрашивание на ЕМА и а-гладкомышечный актин позволило проследить реакцию на одонтопрепарирование как со стороны эктомезенхимальных (ЕМА), так и мезенхимальных клеток (а-ГМА).

Экспрессия эпителиального мембранного антигена Как и в пульпе человека, одонтобласты кролика экспрессировали ЕМА, но не ESA, что еще раз подтверждает предположение о том, что одонтобласты представляют собой обособленную популяцию мезенхимальных клеток пульпы, которую следует отнести к эктомезенхиме. Отличие при оценке результатов окрашивания антителами к ЕМА одонтобластов кролика и человека состояло в том, что ЕМА более интенсивно экспрессировался на «апикальной » (обращенной к слою дентина) поверхности клеток и в отростках одонтобластов грызунов.

На сроке 7 дней после препарирования зуба было установлено увеличение общего количества клеток и появление многочисленных мелких клеток в одонтобластическом слое пульпы. В целом, гомогенная структура ткани сохранилась. Интенсивность экспрессии ЕМА в одонтобластах увеличилась.

Начиная со второй недели эксперимента на соединительнотканной периферии остова пульпы, т.е. на границе со слоем «старых» одонтобластов, появлялся слой мелких «молодых» клеток, интенсивно окрашивающихся антителами к ЕМА. Появление этих клеток позволяет предположить, что на этом сроке старый поврежденный слой одонтобластов начинает восстанавливаться за счет мелких клеток - предшественников одонтобластов, которые находятся на границе с пульпой.

На 14-й день было отмечено нарушение межклеточных контактов в периферической зоне пульпы и слой одонтобластов уже не был гомогенным,

несмотря на всю осторожность, предпринятую нами при выделении ткани пульпы, в большинстве образцов на этом сроке. В целом, гомогенная структура ткани сохранилась. Интенсивность экспрессии ЕМА в одонтобластах увеличилась.

На 28-е сутки эксперимента слой одонтобластов выглядел рыхло, как и на 14-е сутки, и также практически во всех образцах был отделен от основной массы пульпы. В пограничном слое пульпы, как и на 14-й день, выявлялись ЕМА-позитивные мелкие клетки. Клетки с такой же экспрессией и такой же величины появились и были нами обнаружены в толще соединительнотканной основы пульпы.

Экспрессия а-гладкомышечного актина

Экспрессию а-гладкомышечного актина в нормальных интактных зубах у кролика наблюдали в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов и единичных клетках, располагающихся среди волокон соединительной ткани.

Через 7 дней наблюдали увеличение клеточности в центральных зонах пульпы, а также стаз и расширение мелких кровеносных сосудов. Гладкомьпиечные клетки стенки кровеносных сосудов экспрессировали а-гладкомышечный актин и уже не единичные, а многочисленные мелкие клетки среди соединительнотканных элементов в центральной зоне пульпы.

Таким образом, мы обнаружили, что после препарирования резцов кроликов наблюдается ответная реакция со стороны клеток, прилежащих к слою одонтобластов, т.е. происходит активация стволового компартмента в субодонтобластическом слое по экспрессии ЕМА и в центральных зонах пульпы по экспресс™ а-гладкомышечного актина. Но если в центральных зонах пульпы появление клеток, экспрессирующих а-гладкомышечный актин, наблюдали на 7-14 день, а к концу 4 недели морфология центрального слоя пульпы мало чем отличалась от интактных зубов, то полное восстановление субодонтобластического слоя и слоя одонтобластов не происходило и к 28 дню эксперимента, поскольку не восстанавливалась целостность твердых тканей после препарирования. Но одним из самых интересных результатов данного исследования был факт выявления на 28-й день эксперимента ЕМА-позитивных клеток не только на границе, но и в толще соединительнотканной основы пульпы. Факт, что слой ЕМА-позитивных клеток обнаружился на границе одонтобластов и соединительной ткани, позволил нам предположить, что часть клеток соединительной ткани могут восполнять «страдающую» популяцию и дифференцироваться непосредственно в одонтобласты. Присутствие же ЕМА-позитивных клеток в толще соединительной ткани позволяет нам сделать еще одно предположение: внутри соединительнотканных элементов пульпы находятся клетки, и это, видимо, стволовые клетки, которые, как и их потомки, могут дифференцироваться в одонтобласты. На основании полученных фактов можно выдвинуть рабочую гипотезу, что клетки мезенхимального столового компартмента могут дифференцироваться в предшественников одонтобластов для восстановления популяции клеток, синтезирующих дентин.

Реакция клеточных элементов пульпы зубов собак на препарирование твердых тканей зуба и изготовление различных временных коронок («Акрнлоксид» и «Proterap 3 Garant»)

Третий блок морфологических исследований был проведен нами на собаках. В отличие от кролика и человека, в нормальной пульпе собаки специфическое окрашивание антигенов наблюдали только с антителами против а-гладкомышечного актина. Как и в пульпе человека и кролика, в интактных зубах собаки а-гладкомышечный актин экспрессировапи только гладкомышечные клетки кровеносных сосудов.

На 7 сутки эксперимента при использовании обоих типов коронок наблюдали увеличение клеточности пульпы, однако в случае использования коронки из материала «Акрилоксид», наряду с этим, выявлялись клетки, экспрессирующие а-гладкомышечный актин.

Через 2 недели во всех случаях, когда зуб был покрыт временной коронкой из материала «Акрилоксид», наблюдалась воспалительная реакция разной степени выраженности, а среди воспалённых клеток имелись клетки, экспрессирующие а-гладкомышечный актин. В случае использования временных коронок из материала «Protemp 3 Garant» было отмечено увеличение клеточности пульпы и образование новых мелких кровеносных сосудов и лишь слабая воспалительная реакция.

Через 28 дней в случае использования коронки из специального композита для временных коронок из материала «Protemp 3 Garant» морфология пульпы мало отличалась от морфологии пульпы интактных зубов, а вот в пульпе зубов, где использовалась временная коронка из материала «Акрилоксид», несмотря на то, что явления воспаления уменьшались, все еще сохранялась воспалительная реакция, однако а-гладкомышечный актин выявлялся лишь в а-гладкомышечных клетках кровеносных сосудов. Вероятно, воспалительная реакция и повреждения в пульпе зубов собак связаны с токсическим эффектом и нагревом во время полимеризации. Помимо неприятного запаха, коронки из материала «Акрнлоксид» обладают небольшой прочностью и точностью по сравнению с временными коронками, изготовленными из композитного материала«Рго1ешр 3 Garant».

Выводы

1. Анализ медицинских карт стоматологических больных позволил установить, что использование пластмассы холодной полимеризации «Акрилоксид» и аналогов для изготовления временных коронок после препарирования витальных зубов в 70,8% случаев ведет к осложнениям пульпы. Клиническое наблюдение с изготовлением временных ортопедических конструкций из специального бис-акрилового материала Protemp 3 Garant привело к эндодонтическому лечению в 2,8% случаев, а в 87,2% - к нормализации электровозбудимости пульпы опорных зубов.

2, Одонтобласты, как клетки эктомезенхимы, экспрессируют ЕМА+ (эпителиальный мембранный антиген).

3. В пульпе зуба человека имеются 2 популяции клеток, экспрессирующих рецептор к фактору стволовых клеток (C-kit+) и отличающихся по морфологии:

а) эктомезенхимальные, имеющие округлую и овальную формы, расположенные в субодонтобластическом слое (ЕМА+; C-kit+);

б) мезенхимальные, имеющие отросчатую и веретенообразную формы, расположенные в центральной зоне пульпы (a-sma+; C-kit+).

4. После препарирования зубов кроликов под ортопедические конструкции ответная реакция пульпы характеризуется увеличением количества ЕМА+ клеток в промежуточной зоне пульпы и a-sma+ клеток -в центральной зоне пульпы без признаков воспаления. Нормализация соотношения клеток, экспрессирующих эти антигены, восстанавливается к 28 суткам после препарирования.

5. Изготовление прямых временных ортопедических конструкций на зубах собак из разных материалов вызывает разные ответные реакции со стороны пульпы:

а) использование коронок из пластмассы холодной полимеризации «Акрилоксид» ведет к увеличению в центральных отделах пульпы a-sma+ клеток с признаками воспаления в виде стаза и расширения кровеносных сосудов и с инфильтрацией мононуклеарами в периваскулярных пространствах;

б) использование коронок из специального бис-акрилового композитного материала Protemp 3 Garant активирует мезенхимальные стволовые клетки (a-sma+; C-kit+) в центральной зоне пульпы без воспалительной реакции.

Практические рекомендации

1. При выборе материала для временных коронок и мостовидных протезов прямого метода изготовления рекомендуется использовать различные специальные композиты типа Protemp 3 Garant (фирмы ЗМ).

2. На клинических этапах изготовления прямых временных ортопедических конструкций на витальные зубы необходимо исключить использование пластмассы холодной полимеризации типа «Акрилоксид».

3. Учитывая сроки восстановления стволового компартмента пульпы, рекомендуется проводить постоянную фиксацию ортопедических конструкций не ранее чем через 28 дней после препарирования витальных зубов.

4. При гистологическом изучении и для сохранения целостности пульпы необходимо извлечение пульпы из зуба следующим путем: исследуемый зуб подвергать равномерной механической нагрузке по всей длине, используя при этом как основу свинцовую пластинку и стерильный молоточек для воздействия силы, до возникновения трещины. Далее щель осторожно, без избыточного давления расширять, используя стоматологические инструменты (гладилку, шпатель). Для извлечения неповрежденной мягкой ткани пульпы из коронковой полости и корневых каналов необходимо использовать эндодонтические инструменты.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Шамсутдннов МЛ. Мезенхимальные стволовые клетки зуба /М.И. Шамсутдинов //XI Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине»: Казань, 2006г. - С. 165.

2. Шамсутдинов М.И Дентикли - источник одонтобластов /М.И. Шамсутдинов //XII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине». Казань, 2007г. - С. 203.

3. Шамсутдинов МЛ. Реакция стволовых клеток пульпы зуба на препарирование под ортопедическую конструкцию (экспериментальное иммуногистохимическое исследование) /М.И. Шамсутдинов, Г.Т. Салеева, А.П. Киясов, А.К. Шафигуллина // Российский вестник дентальной имплантологии.- 2007. - №1/4 (II).- С. 126-128.

4. Шамсутдинов М.И. Состояние стволовых клеток пульпы при препарировании зуба под ортопедическую конструкцию / М.И. Шамсутдинов, Г.Т. Салеева, А.П. Киясов // Стоматология: наука и практика. Сборник материалов «Утробинские чтения»: «Правд». - Казань: 2008-97.

5. Шамсутдинов М.И. Методические подходы к изучению клеточных популяций пульпы зуба иммуногистохимическими методами. /М.И. Шамсутдинов, Г.Т. Салеева, М.А. Титова, А.П. Киясов // «Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты)»: Пермь 2008.- С. 201.

6. Шамсутдинов М.И. Изучение процесса регенерации зуба человека с помощью маркеров стволовых клеток / М.И Шамсутдинов //XIII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине»: Казань, 2008,- С. 148.

7. Шамсутдинов М.И. Одонтобласты постоянных зубов экспрессируют эпителиальный мембранный антиген /М.И.Шамсутдинов //XIII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине»: Казань, 2008г.-С.149.

8. Шамсутдинов М.И. Экспрессия эпителиальных (ЕМА, ESA) и мезенхимальных (a-SMA, CD-31) антигенов в клетках пульпы зубов человека /М.И. Шамсутдинов, Г.Т. Салеева, МЛ. Титова, А.П. Киясов //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV,№1, 2009.- С.52-59.

9. Шамсутдинов М.И. Эпителиальные маркеры при исследовании пульпы зуба / М.И. Шамсутдинов // XIV Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине»: Казань, 2009г. - С. 114.

10. Шамсутдинов М.И. Реакция пульпы зуба человека на временные ортопедические конструкции. / М.И. Шамсутдинов // XIV Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине»: Казань, 2009г.-С. 113-114.

Подписано в печать 24.11.09г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л.1,5.

Тираж 100. Заказ №223. Отпечатано с готового оригинал - макета в ООО «Вестфалика» г. Казань, ул. Б. Красная, 67. Тел.: 250-30-42

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Проблема сохранения и восстановления целостности зубов и зубных рядов ставит перед стоматологами сложную задачу обеспечения эффективности лечения и восстановления жевательной функции пациентов. Нарушения целостности зубов и зубных рядов могут привести к изменениям в лицевом скелете, височно-нижнечелюстном суставе, в мягких тканях, что не может не отразиться на качестве жизни человека.

Лечение дефектов зубных рядов проводится путём замещения несъёмными и съёмными конструкциями из различных материалов [44, 43, 47, 48], а также путём протезирования с использованием дентальных имплантатов [5, 8, 23, 29, 30, 56, 66, 73]. Лечение дефектов твёрдых тканей зубов предполагает препарирование и последующее закрытие выбранного участка поврежденного зуба пломбировочным материалом [26, 31, 51, 57, 58, 72, 76, 80, 166, 167, 189] или ортопедической конструкцией [1, 18 19, 47, 48, 55, 71, 77]. Высокая потребность в стоматологическом лечении дефектов твёрдых тканей зубов и зубных рядов обусловливает актуальность изучения и внедрения альтернативных методов лечения.

Традиционные методы лечения, устраняя дефект в зубе, полностью блокируют его возможность к самовосстановлению или регенерации. Однако зуб, как любой орган в организме млекопитающих, способен к регенерации, одним из примеров которой является образование третичного дентина [3, 6, 13, 14, 16,26, 52, 80].

Следовательно, изучение клеточных источников и механизмов регенерации зуба позволит разработать новые методы лечения, которые будут основаны на принципах регенеративной медицины. Они также направлены на активацию восстановительных механизмов органов и тканей за счёт стимулирования пролиферации стволовых клеток, из которых образуются дифференцированные клетки, способные выполнять определенные функции, в том числе и синтез дентина. Конечная же цель регенеративной медицины, в том числе и стоматологии, — получение методами биоинженерии функционально полноценных органов, которые можно использовать для замещения утраченных в результате болезни или с возрастом зубов [165].

Изучение развития зубов позволили установить взаимодействие эпителиальных и мезенхимальных (эктомезенхимальных) клеток [135], из которых соответственно образуются амелобласты и эктомезенхимальные клетки, дающие начало одонтобластам, цементобластам и фибробластам периодонтальной связки.

Именно эти знания позволили японским исследователям получить из 14-тидневного эмбриона мыши клетки методом тканевой инженерии зачаток зуба, успешно трансплантированный в последующем в челюсть взрослого животного [83].

В то же время следует подчеркнуть, что наиболее перспективным является разработка методов восстановления целостности зубов или их выращивания, основанных на использовании стволовых или прогениторных клеток самого пациента[20]. Именно поэтому в последние два десятилетия одной из актуальных проблем является поиск стволовой клетки зуба или пульпы во взрослом организме [88].

Основным подходом для идентификации этих клеток является метод выделения клеток из пульпы с последующим культивированием их in vitro на различных подложках и с добавлением различных ростовых факторов [169]. Попытки описать фенотип свежевыделенных клеток не позволили чётко идентифицировать фенотипические признаки как предшественников, так и стволовых клеток пульпы, а главное - установить их локализацию в пределах пульпы. Именно поэтому до сих пор остаётся неизвестной реакция стволовых и прогениторных клеток пульпы на одонтопрепарирование и различные виды временных коронок, изготовление которых является неотъемлемой частью протокола ведения пациентов с несъёмными ортопедическими конструкциями.

Все вышеизложенное явилось основанием для проведения настоящего исследования.

ОБЪЕКТ И ПРЕДМЕТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлись 102 пациента с дефектами твердых тканей зубов и зубных рядов (с временными коронками). Экспериментальная часть выполнялась на кроликах (14) и собаках (4). Предметом исследования явилась пульпа зуба человека и млекопитающих.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовать клеточный состав пульпы зуба с позиции поиска прогениторных (стволовых) клеток и проанализировать клеточные реакции пульпы на ортопедические вмешательства.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести анализ отдаленных результатов состояния пульпы отпрепарированных зубов в зависимости от материала, из которого были изготовлены временные коронки, на основании изучения медицинских карт стоматологических больных и клинических наблюдений.

2. Изучить экспрессию эпителиальных и мезенхимальных маркеров, а также маркеров прогениторных и стволовых клеток в различных клеточных популяциях пульпы человека и лабораторных животных (кролик, собака).

3. Проанализировать реакцию стволовых и прогениторных клеток пульпы на одонтопрепарирование.

4. Сравнить реакцию и состояние стволового компартмента пульпы зуба на различные материалы прямых временных конструкций после одонтопрепарирования.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ заключается в том, что впервые было установлено два типа стволовых клеток в пульпе зуба человека - эктомезенхимальные для одонтобластов и мезенхимальные для клеток соединительной ткани пульпы, которые имеют разную локализацию в пределах пульпы и экспрессируют различные маркеры. Впервые был найден маркер, позволяющий выявлять одонтобласты и их предшественников, которым является эпителиальный мембранный антиген, экспрессирующийся на большинстве эпителиальных клеток млекопитающих.

В эксперименте на основании анализа иммуногистохимических реакций установлено, что при препарировании твёрдых тканей под литые ортопедические конструкции, а также в результате различных лечебных мероприятий на зубах активизируются клетки как эктомезенхимального, так и мезенхимального стволовых компартментов пульпы зуба.

Экспериментально впервые установлено, что не только воспалительная реакция пульпы, но и активация, а также гибель клеток в её стволовых компартментах после одонтопрепарирования зависят от материалов, из которых изготовлены временные защитные коронки.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Полученные результаты, основные положения и выводы, представленные в работе, имеют теоретическое значение при дальнейшем изучении проблемы развития патологических процессов в пульпе зуба, а также регенерации и активации прогениторных клеток пульпы. Они позволяют по-новому оценить и понять закономерность развития изменений, происходящих в зубе человека при различных травмирующих факторах, таких как препарирование зуба под литую ортопедическую конструкцию, изготовление временных коронок из акриловой самотвердеющей пластмассы и специального композитного материала.

Обнаруженные изменения в клеточном составе пульпы зуба могут способствовать раскрытию причин таких нарушений, как пульпит и его осложнения, а полученные в ходе экспериментального исследования результаты могут повысить эффективность стоматологического лечения за счёт подбора материалов для изготовления ортопедических конструкций, обладающих наименьшей цитотоксичностью.

Особую практическую ценность представляет установление факта экспрессии клетками-предшественницами одонтобластов эпителиального мембранного антигена. Поскольку это трансмембранный гликопротеин, то с его помощью можно выделять чистую популяцию клеток-предшественниц одонтобластов и изучать не только возможности и условия их дифференцировки, но и продолжить исследования по созданию тканевых инженерных конструкций для замещения дефектов дентина.

Полученные в работе результаты целесообразно использовать в деятельности ортопедических отделений стоматологических медицинских организаций, лекционном материале по ортопедической стоматологии и гистологии для студентов стоматологических факультетов и факультетов последипломного образования, а также при разработке новых методов регенеративной медицины и тканевой инженерии в области стоматологии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. В пульпе зуба имеются 2 типа стволовых клеток — эктомезенхимальные для одонтобластов и мезенхимальные - для клеток соединительной ткани пульпы.

2. Активация мезенхимальных клеток в центральных зонах пульпы и развитие воспалительной реакции зависят от химических свойств материала, из которого изготовлена временная ортопедическая конструкция.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ

Автором планировалось настоящее исследование, формировалась база данных. Соискателем составлен план, поставлены задачи, определены этапы исследования. Автор провел подбор и анализ литературы. Автор принимал непосредственное личное участие в клиническом обследовании и лечении больных, в организации и проведении различных лабораторных, инструментальных и иммуногистохимических исследований, лично выполнял экспериментальные исследования на животных и проводил забор экспериментального материала у человека и животных, разработал новые способы извлечения пульпарной ткани из твёрдых тканей зубов. Статистическая обработка, сопоставление полученных результатов с данными литературы, оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций принадлежат автору.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях- молодых учёных Казанского государственного медицинского университета (2006, 2007, 2008, 2009 гг.), международной научно-практической конференции «Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты)» (Пермь, 2008 г.).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Основные результаты диссертационного исследования достаточно полно отражены в 10 научных работах, в том числе двух статьях, опубликованных в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией. Общий объём публикаций - 1,25 у.п.л., в том числе авторский вклад - 0,75 у.п.л.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре нормальной анатомии, на практических занятиях со студентами, слушателями курсов повышения квалификации стоматологов-ортопедов, с клиническими ординаторами и интернами на кафедре ортопедической стоматологии

Казанского государственного медицинского университета, кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний и новых технологий Чувашского государственного университета, кафедре пропедевтики и физиотерапии стоматологических заболеваний Башкирского государственного медицинского университета.

Алгоритм стоматологического ортопедического лечения больных с временным этапом протезирования используется в лечебной деятельности ортопедического отделения стоматологической поликлиники КГМУ, в ООО «Стоматологическая поликлиника» № 5, в ОАО «Стоматологическая поликлиника» № 9, ООО «Стоматологическая поликлиника Рокада-мед» г. Казани, стоматологической поликлинике МУЗ № 1 и № 3 г. Набережные Челны.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ, ЕЁ ОБЪЁМ Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка использованных источников литературы, содержащего 189 работ, в том числе 107 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 49 рисункми.

ВЫВОДЫ

1. Анализ медицинских карт стоматологических больных позволил установить, что использование пластмассы холодной полимеризации «Акрилоксид» для изготовления временных коронок после препарирования витальных зубов в 70,8 % случаев ведёт к осложнениям пульпы. Клиническое наблюдение с изготовлением временных ортопедических конструкций из специального бис-акрилового материала «Protemp 3 Garant» привело к эндодонтическому лечению в 2,8 % случаев, а в 87,2% - к нормализации электровозбудимости пульпы опорных зубов.

2. Одонтобласты как клетки эктомезенхимы экспрессируют ЕМА+ (эпителиальный мембранный антиген).

3. В пульпе зуба человека имеются 2 популяции клеток, экспрессирующих рецептор к фактору стволовых клеток (C-kit+) и отличающихся по морфологии: а) эктомезенхимальные, имеющие округлую и овальную формы, расположенные в субодонтобластическом слое (ЕМА+; C-kit+); б) мезенхимальные, имеющие отросчатую и веретенообразную формы, расположенные в центральной зоне пульпы (a-sma+; C-kit+).

4. После препарирования зубов кроликов под ортопедические конструкции ответная реакция пульпы характеризуется увеличением количества ЕМА+ клеток в промежуточной зоне пульпы и a-sma+ клеток — в центральной зоне пульпы без признаков воспаления. Нормализация соотношения клеток, экспрессирующих эти антигены, восстанавливается к 28 суткам после препарирования.

5. Изготовление прямых временных ортопедических конструкций на зубах собак из разных материалов вызывает разные ответные реакции со стороны пульпы: а) использование коронок из пластмассы холодной полимеризации «Акрилоксид» ведёт к увеличению в центральных отделах пульпы a-sma+ клеток с признаками воспаления в виде стаза и расширения кровеносных сосудов; б) использование коронок из специального бис-акрилового композитного материала «Protemp 3 Garant» (фирмы «ЗМ ESPE») активирует мезенхимальные стволовые клетки (a-sma+) в центральной зоне пульпы без воспалительной реакции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При выборе материала для временных коронок и мостовидных протезов прямого метода изготовления рекомендуется использовать различные специальные композиты типа «Protemp 3 Garant» (фирмы «ЗМ ESPE»).

2. На клинических этапах изготовления прямых временных ортопедических конструкций на витальные зубы необходимо исключить использование пластмассы холодной полимеризации типа «Акрилоксид».

3. Учитывая сроки восстановления стволового компартмента пульпы, рекомендуется проводить постоянную фиксацию ортопедических конструкций не ранее чем через 28 дней после препарирования витальных зубов.

4. При гистологическом изучении и для сохранения целостности пульпы необходимо извлечение пульпы из зуба следующим путём: исследуемый зуб подвергать равномерной механической нагрузке по всей длине, используя при этом как основу свинцовую пластинку и стерильный молоточек для воздействия силы, до возникновения трещины. Далее щель осторожно, без избыточного давления расширять, используя стоматологические инструменты (гладилку, шпатель).

Ill

Для извлечения неповрежденной мягкой ткани пульпы из коронковой полости и корневых каналов необходимо использовать эндодонтические инструменты.