Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Структурно-метаболические параметры моноцитов и лимфоцитов в механизмах реализации иммунного ответа при хроническом воспалении

На правах рукописи

Окладникова Евгения Владимировна

СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МОНОЦИТОВ И ЛИМФОЦИТОВ В МЕХАНИЗМАХ РЕАЛИЗАЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ

14.00.16- Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 ДЕК 2009

Иркутск-2009

003488650

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Булыгип Геннадий Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Бодиенкоеа Галина Михайловна

(Ангарский филиал Учреждения Российской академии медицинских наук

Восточно-Сибирского научного центра экологии человека Сибирского отделения РАМН - Научно-исследовательский ийститут медицины труда и экологии человека)

доктор медицинских наук,

профессор Семинский Игорь Жанович

(ГОУ ВПО Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию)

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН (г. Красноярск)

Защита диссертации состоится «__» _2009г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при «Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан «_»_ 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Шолохов Л. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы:

Среди проблем современной медицины, имеющих важное научно-практическое значение, на одном из первых мест стоит решение вопроса о патогенезе хронизацин воспалительного процесса. Актуальность изучения этой проблемы связана с возрастанием числа хронических инфекционно-воспалительных заболеваний. Следствием хронических воспалительных заболеваний являются экономические потери из-за утраты трудоспособности во время обострения заболевания; они приводят к ранней инвалидизации и снижению социальной адаптации больных (P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, Х.И. Истамов, 1995; А.Н.Трунов, А.В.Ефремов, 2001; M.Macarthur, G.L.Hold, 2004; D. Schottenfeld, J.L.Beebe-Dimmer, 2006; B.Saile, 2007).

Несмотря на различный лато- и морфогенез воспаления при разных нозологических формах, важную роль в развитии и течении хронического воспалительного процесса играют общие изменения в системах организма, и в первую очередь в иммунной системе (Д.Н.Маянский, 1994; В.А.Карпин, 2005; К.А.Лебедев, 2005; P.N.Shek, R.J.Shephard, 1998). Реализация иммунного ответа во многом определяется функциональной активностью ИКК, которая, в свою очередь, зависит от метаболических процессов в клетках и состояния их мембранных структур (Ю.Е.Вельтищев, Э.А.Юрьева, 1987; К.АЛебедев, И.Д.Понякина, 1990; L.Yang, H.Luo, 1996; A.Perl, P.Jr.Gergely, 2002). Уровень и соотношение интенсивности: энергетических и пластических процессов в клетках отражаются показателями активности внутриклеточных ферментов, которые могут использоваться в диагностических и прогностических целях (Г.В.Булыгин, Н.И.Камзалакова, А.В.Андрейчиков, 1999; Л.М.Куртасова, А.А.Савченко, 2006; P.Sarantos, 1994; К.А. Frauwirth, C.B.Thompson, 2004).

Важная роль в реализации иммунных механизмов при воспалении отводится мононуклеарным фагоцитам и лимфоцитам, врожденная или приобретенная ^неполноценность которых может способствовать формированию хронического течения воспалительного процесса

(Д.Н.Маянский, 1991; И.С.Фрейдлин, 1998; А.Н.Казимирский, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмасн, 2003; Е.П.Калинина, Е.М.Иванов, 2007; S.J.Simonte, C.Cunninghain-Rundles, 2003). Проведенные ранее исследования выявили высокую информативность показателей активности дегидрогеназ для оценки метаболизма лимфоцитов при различных заболеваниях (Г.В.Булыгин, Г.Н.Казакова, 1998; Е.П.Тихонова, Г.В.Булыгин, 2003; И.А.Игнатова, 2005; M.Benderdour, G.Charron, 2003; M.Jain, D.A.Brenner, L.Cui, 2003). Исследования активности внутриклеточных ферментов в моноцитах, в том числе и при хронических воспалительных процессах, немногочисленны (В.В.Василькова, И.Ф.Вишневецкая, 2006; О.А.Мурзова, В.И.Григанов, 2008; I.N.de-Halac, S.R.Bacman, 2000; K.Triques, M.Stevenson, 2004). Недостаточно изучен и липидный спектр моноцитов и макрофагов; имеются' немногочисленные сведения об особенностях липидного состава мембран мононуклеарных фагоцитов при их активации и сепсисе (B.Schmid, 2003; S.K.Jackson, J.Parton, 2004), сахарном диабете и ожирении (В.А.Извекова, 1991); изучено содержание эфиров холестерина в моноцитах у больных псориазом (Н .Takeda, 2001).

Хронические воспалительные заболевания придатков матки представляют собой проблему медицины, актуальность которой обусловлена увеличением числа данных заболеваний, высокой частотой их хронизации и значительным влиянием на репродуктивную функцию женщин (С.Н.Занько, 1998; О.М. Валькевич, 2006; N.Mulayim, 2003; C.Banikarim, M.R.Chacko, 2004; U.Lauper, 2005). Исследований, посвященных оценке функциональной активности моноцитов периферической крови при хроническом воспалении придатков матки, немного (С.Н. Занько, А.Н. Косинец, Л.Я. Супрун, 1998).

Активное участие иммунной системы, и ее фагоцитарного звена в частности, в возникновении и течении воспаления придатков матки определяет возможность использования данного заболевания как модели при изучений иммупопатогенеза хронического воспалительного процесса через исследование субклеточных параметров моноцитов и лимфоцитов, определяющих функциональные возможности этих ИКК.

Цель исследования: выявление субклеточных механизмов, лежащих в основе изменений функциональной активности моноцитов и лимфоцитов при хроническом воспалении, на примере ХНВПМ.

Основные задачи исследования:

1. Оценить показатели периферической крови, клеточного, гуморального и фагоцитарного звеньев иммунитета больных ХНВПМ при обострении и ремиссии воспалительного процесса.

2. Установить зависимость изменений в липидном спектре лимфоцитов и моноцитов от фазы воспаления.

3. Определить активность дегидрогеназ (Г6ФДГ, ГЗФДГ, ЛДГ, НАДИЦЦГ, НАДФИЦДГ, НАДМДГ, НАДФМДГ, НАДГДГ, НАДФГДГ) в лимфоцитах и моноцитах при ХНВПМ в разные фазы воспалительного процесса.

4. На основании результатов исследования установить особенности липидного спектра и активности внутриклеточных ферментов иммунокомпетентных клеток, отражающие механизмы формирования иммунодефицитного состояния при хроническом воспалительном процессе.

5. С использованием информативных показателей разработать схему зависимости функционального состояния ИКК от особенностей их структурно-метаболических параметров при хроническом воспалении.

Научная новизна.

Впервые установлено, что изменения спектра липидов моноцитов и лимфоцитов у больных ХНВПМ при обострении и ремиссии воспалительного процесса, отражают развитие как деструктивных изменений за счет активации ПОЛ и липолиза, так и включение механизмов защиты клеточных мембран от указанных деструктивных процессов. Защитные перестройки липидного спектра с увеличением доли ХОЛ при уменьшении ФЛ приводят к ограничению проницаемости мембран для субстратов метаболизма.

Впервые исследована активность ряда внутриклеточных дегидрогеназ (Г6ФДГ, ГЗФДГ, ЛДГ, НАДИЦЦГ, НАДФИЦДГ, НАДМДГ, НАДФМДГ,

НАДГДГ, НАДФГДГ) моноцитов и лимфоцитов; установлена зависимость уровня активности ферментов от фазы воспалительного процесса. Особенности липидного спектра клеток ограничивают субстратную обеспеченность внутриклеточного метаболизма, что в первую очередь проявляется в снижении активности ферментов энергопродуцирующих реакций цикла Кребс'а.

Впервые установлено ключевое значение метаболических механизмов формирования функциональной недостаточности моноцитов при хронизации воспалительного процесса у больйых ХНВПМ.

Практическая значимость.

В результате исследования определены особенности структурно-метаболических параметров моноцитов больных в разные фазы воспаления, позволившие установить ведущую роль метаболических нарушений в формировании функциональной недостаточности фагоцитарного звена иммунной системы, которая создает условия для возникновения хронического течения воспалительного процесса. Полученные результаты позволяют рекомендовать исследование активности внутриклеточных дегидрогеназ в качестве диагностических показателей течения воспаления.

Обоснована целесообразность определения показателей метаболических процессов в ИКК для оценки характера их нарушений при хроническом варианте воспаления. Получено обоснование целесообразности использования метаболических иммунокорректоров в комплексном лечении больных ХНВПМ.

Результаты исследования используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии, кафедре клинической иммунологии, а также кафедре фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармтехнологии и последипломного образования Красноярского государственного медицинского университета им проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого,

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертации и полученные результаты исследований представлены на IV Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные и генетические поражения плода» (Красноярск, 2003), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2007). ГГо теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 - в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 главы собственного исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Полученные результаты проиллюстрированы с помощью 17 таблиц, 9 рисунков и 2 схем. Библиографический справочник содержит 225 источников, из которых - 123 отечественных и 102 зарубежных авторов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Лшщцный спектр и показатели активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов и моноцитов адекватно отражают изменения функционального состояния этих клеток иммунной системы в разные фазы хронического воспаления.

2. Состояние клеточных мембран и внутриклеточный энергодефицит ИКК формируют снижение их функциональных возможностей в реализации иммунного ответа при воспалении и являются важнейшими условиями хронизации воспалительного процесса.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования.

Обследовано 107 женщин в возрасте 19-40 лег, которые были распределены по следующим группам: 1 группа - больные с обострением

ХНВПМ - 36 чел., 2 группа - больные с ХНВПМ в фазу ремиссии - 36 чел., 3группа - практически здоровые женщины - 35человек (группа контроля).

В 1-ю и 2-ю группу не включались женщины, проходившие до тдамента поступления в стационар амбулаторное лечение. Это позволило исключить возможное влияние лекарственных средств на иммунную систему и физиологическое состояние ИКК. В состав контрольной группы включались женщины, не имеющие хронической патологии и заболеваний с иммунопатологическими механизмами патогенеза (аллергические, системные и др.) и не болевшие острыми бактериальными или вирусными заболеваниями в течение 2-х месяцев до момента обследования. Диагноз ХНВПМ подтверждался общепринятым в акушерско-гинекологаческой практике клиническим обследованием, ультразвуковым, микроскопическим и бактериологическим исследованиями. У женщин всех групп проводилось определение показателей лейкограммы, оценка клеточного, гуморального и фагоцитарного звеньев иммунной системы, определение параметров литшдного спектра и активности внутриклеточных ферментов моноцитов и лимфоцитов. .

Определение фенотипа лимфоцитов проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью мышиных мопоклональных антител к молекулам различных CD-рецепторов лимфоцитов. Анализ образцов проводился на люминисцентном микроскопе «Люмам И-1». При постановке реакции использовались рекомендации Р.М.Хаитова, Б.В.Пинегина (1995) с некоторыми модификациями. В работе использовались мышиные моноклональные антитела ЗАО "Сорбент" к CD3 (Т-лимфоЦиты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-цитотоксические/супрессоры) и CD 19 (В-лимфоциты), меченные ФИТЦ.

Для определения поглотительной функции лейкоцитов нами использовался, тест фагоцитоза частиц латекса по Д.Н. Маянскому (1985). Функциональную активность фагоцитов изучали в тесте восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-тест по Б.С.Нагоеву и М.Г.Шубичу (1981).

Количество B-лимфоцитов определялось по экспрессии рецепторов СД-19 в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Функциональная активность В-лимфоцитов определялась по уровню основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови - IgA, IgG и IgM, регистрируемых по методике радиальной иммунодиффузии (Manchini G., 1964).

Выявление ЦИК проводилось методом иммунопреципитации с раствором ПЭГ-6000 с учетом результатов на фотоэлектроколориметре при длине волны 315 нм (Haskova V., Kaslik J„ Richa J., 1978).

Выделение лимфоцитов из периферической крови для исследований производилось по A.Bouym (1968) на градиенте плотности фиколл-верографина. По определению морфологического состава лейкоцитарной взвеси с помощью мазков, окрашенных по Романовскому-Гимза, устанавливалась чистота выхода лимфоцитов, которая составляла 92-95%.

Моноциты из периферической крови выделяли по Михеенко Т.В. (1987) с модификациями, необходимыми для получения клеточной популяции моноцитов с .минимально измененными цитохимическими характеристиками, что позволяет исследовать исходный метаболический статус клеток.

Активность внутриклеточных ферментов в моноцитах и лимфоцитах крови определялась биолюминесцентным методом с бактериальной люциферазой (Савченко A.A., Сунцова JI.H., 1989) и вычислялась по наработке восстановленного или окисленного кофермента в избыточно обогащенной субстратом среде. Определялась активность следующих внутриклеточных ферментов: Г6ФДГ, ГЗФДГ, ЛДГ, НАДИЦДГ, ПАДФИЦДГ, НАДГДГ, НАДФГДГ, НАДМДГ, НАДФМДГ. Показатели активности ферментов рассчитывались в мкЕ/104 клеток.

Изучение лигаадного спектра моноцитов и лимфоцитов проводилось методом тонкослойной хроматографии с экстракцией липидов из клеток по методу Folch et al. (1957). В лимфоцитах определялись следующие фракции липидов: ФЛ, ХОЛ, СЖК, ТАГ, ЭХ; а также фракции отдельных фосфолипидов: ЛФЛ, СФМ, ФХ, ФЭА, ФИ+ФС. Кроме того, высчитывались

следующие показатели: соотношения XOJI/ФЛ, СЖК/ТАГ, СФМ/ФХ. В моноцитах оценивали объем фракций ФЛ, ХОЛ, СЖК, ТАГ, ЭХ и их

соотношения ХОЛ/ФЛ, СЖК/ТАГ. .............

Статистическая обработка результатов производилась с использованием прикладных программ: «SPSS 12.0 for Windows», «SigmaStat 3.0». Для всех данных определялись среднее арифметическое значение величин (М), ошибка среднего арифметического (т). Оценка достоверности различий средних проводилась с использованием параметрических (критерий Стьюдента) и непараметрических (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) критериев. Дополнительно проводился анализ результатов исследований с применением метода однофакторного дисперсионного анализа.

Работа выполнена на кафедре клинической иммунологии Красноярского государственного медицинского университета им проф. В.Ф.Войно-Ясенвцкого. Набор материала для исследования осуществлялся на базе городской гинекологической больницы №4 и в медицинском центре «Медикахэлп» г. Красноярска.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ результатов обследования больных ХНВПМ показал, что Изменения параметров развернутого анализа крови и иммунного статуса в динамике заболевания отражают функционирование достаточно типичных для воспаления механизмов защиты. Обострение воспалительного процесса характеризовалось лейкоцитозом до 8,22±0,39-109/л;; Р<0,001, повышением содержания палочкоядерных нейтрофилов (2,19*0,30%; Р<0,001) и моноцитов (7,22±0,52%; Р<0,001), повышенной СОЭ (10,94±0,94 мм/час; Р<0,001) и снижением процеишого содержания лимфоцитов. Оценка иммунного статуса женщин, страдающих ХНВПМ, показала, что изменения популяционного и субпопуляциошюго состава лимфоцитов при обострении воспаления свидетельствуют о повышении абсолютного (1498,94±62,75 в мют) и относительного (75,94±1,00%) количества СИЗ-клеток (Р<0,01.дия обоих показателей). Изменения взаимоотношения регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов бьши незначительны, величина ИРИ не отличалась от его значений в контрольной группе. У

больных отмечалось снижение процентного и абсолютного содержания МК-клеток (12,44±0,91%; Р<0,05 и 242,83±20,40; Р<0,1 соответственно), способных лизироватъ клетки организма, инфицировашпле возбудителями, ингибировагь размножение микроорганизмов и являются таким образом «существенным компонентом неспецифической защиты организма» (В.С.Смирнова, И.С.Фрейдлин, 2000). Функщмяильные параметры гуморального звена при обострении ХНВПМ не отражают ожидаемой его активации в ответ на усиление антигенного раздражения: концентрация иммуноглобулинов защитных классов А, М и О не изменены по огношению к уровню контроля, а процентное содержание В-лимфоцитов даже уменьшено до 10,67±0,87% (в группе контроля- 13,51±1,09%; Р<0,05).

Состояние фагоцитарного звена иммунной системы в фазу обострения воспаления заболевания можно оценить даже как депрессивное, со снижением поглотительной и переваривающей способности фагоцитов. Показатель НС'Г-теста (14,58±0,83%) не отличался от уровня контрольной группы (14,00±0,56%), что подтверждает, с одной стороны, сохранение кислородопродуцирующей функции нейтрофильных фагоцитов, с другой - свидетельствует об отсутствии ожидаемой активации при обострении воспалительного процесса и усилении антигенной стимуляции.

При исследовании липидного спектра моноцитов (рис.1) и лимфоцитов (табл. 1) больных ХНВПМ в фазу обострения отмечалось снижение доли ФЛ и преобладание относительного объема ХОЛ над ФЛ, а также увеличение

45,00

ФЛ ЭХ ХОЛ/ФЛ (-10) СЖК

□ контроль п обострение ХНВПМ О ремиссия ХНВПМ

Рис. 1 Показатели спектра нейтральных лигщдов моноцитов в разные фазы ХНВПМ

доли СФМ, что в совокупности свидетельствует об уменьшении проницаемости и повышении микровязкости клеточных мембран ИКК. Эта реакция направлена на защиту клетки от разрушающего воздействия перекисных радикалов и других патогенных агентов, количество которых увеличивается за счет активации реакций ПОЛ и липолиза при патологических процессах (Я.Кагава, 1985; Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин, 1998; Г.В.Булыгин, Н.И.Камзалакова, А.В.Андрейчиков, 1999; Е.П.Тихонова, 2003). Однако, данный механизм отрицательно влияет на функциональные свойства ИКК.

Таблица 1

- Лишдный спемр (%) и соотношение фракций липидов лимфоцитов периферической крови женщин, больных ХНВПМ в фазу обострения и ремиссии (М±т)

Фракции Контроль п=35 Обострение XHBIIM п=3б Ремиссия XHBIIM n=36

липидов 1 2 3

30,22±0,81 22,12±0,42 19,58±0,61

ФЛ Pi<0,001 Pi<0,001 P2<0,01

ХОЛ 20,74+0,68 21,15±0,60 21,37±0,69 : , . ■

СЖК 7,38±0,30 9,55±0,31 Р,<0,001 10,07±0,27 Pi<0,001

ТАГ 8,67±0,47 9,28±0,27 9,12±0Д

ЭХ 32,54±1,34 37,90±0,90 Р,<0,01 39,30±0,72 Pi<0,001

ЛФЛ 0,07±0,01 3,07±0,09 Pi<0,001 2,37±0,15 Pi<0,001 P2<0,001

СФМ 5,27±0,3б 11,07±0,50 Р,<0,001 11,11±0,39 Pi<0,001

ФХ 30,60±1,43 25,68±0,89 Pi<0,0l 27,38±0,73

ФИ+ФС 5,75±0,44 8,43±0,29 Pi<0,001 7,38±0Д7 Pi<0,01 P2<0,05

ФЭА 2б,45±1,18 . 24,67±0,51 20,62±0,30 Pi<0,001 P2<0,001

ХОЛ/ФЛ 0,69±0,02 0,96±0,02 Р,<0,001 1,11 ±0,04 Pi<0,001 P2<0,001

СЖК/ТАГ 0,90±0,04 1,03±0,02 Pi<0,01 1,12±0,03 Pi<0,001 P2<0,05 . •

СФМ/ФХ 0,21±0,03 0,44±0,02 Pi<0,001 0,42±0,02 Pi<0,001

Он приводит к нарушению подвижности и экспрессии мембранных рецепторов, в связи со снижением проницаемости мембран уменьшает субстратную обеспеченность внутриклеточных процессов. Все это ограничивает способность клеток к активации при формировании иммунного ответа. Еще одним фактором, нарушающим функционирование клеток при обострении хронического воспалительного процесса, является увеличения в них количества СЖК, способных разобщать процессы окислительного фосфорилирования и дыхания в клетках (Я.Кагава, 1985), что отрицательно влияет на их функциональные возможности через нарушения внутриклеточного обмена.

Изменения метаболических процессов в лимфоцитах при обострении ХНВПМ характеризовались отсутствием повышения в них активности Г6ФДГ (1,09±0,13 мкЕ/104 кл.; контроль - 1,21±0,11 мкЕ104 кл.). Известно, что ПФП особенно активен в быстроделящихся тканях и клетках организма (Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин, 1998). Поэтому при обострении воспалительного процесса мы вправе ожидать повышение интенсивности в лимфоцитах реакций ПФП, проявляющееся через активацию его „ключевого фермента - Г6ФДГ. Это усиливало бы образование в клетках рибозо-5-фосфата, синтез РНК и ДНК и создавало предпосылки для повышения митотической активности клеток и синтеза цитокинов и иммуноглобулинов, необходимых для реализации полноценного иммунного ответа. Отсутствие таких изменений позволяет нам предположить наличие у больных ограничения митотической активности этих клеток, что проявляется лимфопенией и может являться одной из причин ограничения иммунного ответа и хронизации воспалительного процесса. Возможно также, что отсутствие активации Г6ФДГ при обострении, которая соответствовала бы усиленному антигенному раздражению, является проявлением генетически обусловленной ферментопатии, встречающейся у людей, склонных к частым инфекционным воспалениям, тяжелому их течению с последующей генерализацией (Н.И.Камзалакова, 2000).

Первый по эффективности внутриклеточной энергопродукции - цикл Кребса - характеризуется уменьшением -субстратного обеспечения его

начальных этапов, что проявляется снижением активности НАДИЦДГ (0,71±0,04 мкБЮ4 кл.; контроль - 5,58±0,47 мкЕЛО4 кл.; Р<0,001) и НАДФИЦДГ (11,45±0,55 мкМО4 кл.; контроль - 29,08±1,36 мкМО4 кл.; Р<0,001). По-видимому, с целью компенсации метаболического дефицита в ЦТК активируется поступление на него субстратов с аминокислотного обмена через реакцию, катализируемую ферментом НАДФГДГ (0,19±0,01 мкЕЛО4 кл.; в контроле 0,14±0,01 мкЫО4 кл.; Р<0,01). Вероятно, такое «нерациональное» использование аминокислот для поддержания необходимого уровня энергопродукции в свою очередь может приводить к ограничению способности клеток к синтезу белков, в частности цитокинов и иммуноглобулинов. Это предположение подтверждается снижением у больных антителообразования в фазу обострения ХНВПМ. На конечных этапах ЦТК происходило активное перераспределение потока субстратов и повышенное использование их в реакции малат-пируват за счет активации НАДФМДГ, являющейся шунтирующим ферментом ЦТК и имеющей важное значение для реакций липидного анаболизма (В.В.Иванищев, Б.И.Курганов, 1992; Ь.А1уагег, А.ЫашЦ, 1999; С.С.Кио, Ь.С.Тва^ 2000). По-видимому, не происходит компенсации выработки макроэргов в лимфоцитах и за счет гликолиза, что подтверждается снижением активности ЛДГ (0,09±0,005 мкЕ^О4 клеток.; контроль - 0,85±0,07 мкЕ/104 клеток,; Р<0,001), приводящим кроме этого к уменьшению образования в клетке НАДН, необходимого для реакций наработки АТФ.

Метаболизм моноцитов при обострении ХНВПМ претерпевает подобные изменения (табл.2). ■

Снижение в этих клетках активности ГЗФДГ свидетельствует об уменьшении поступления продуктов липидного катаболизма на гликолиз, а также предполагает снижение эффективности работы а-глицерофосфатного шунта, обеспечивающего ЦТК водородом (Р.РгаЬЬакаг, Н.ЬаЬоу, 1998; К.Н\уагщ, 1999). Обеднение потока субстратов по гликолизу может

происходить и за счет повышения их оттока на другие процессы клетки, например, в ПФП - основного конкурентом гликолиза за глюкозо-6-фосфат

(Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин, 1998; S.Tuttle, 2000; M.Jain, D.A.Brenner, 2003). Уменьшение активности ЛДГ приводит к накоплению лактата в моноцитах и, как следствие, снижению интенсивности субстратного потока в гликолизе.

Таблица 2

Активность НАД(Ф)-зависимых ферментов (мкЕ^О4!^.) в моноцитах периферической крови больных ХНВПМ при обострении и ремиссии воспалительного процесса (М±т)

Контроль Обострение XHBIIM Ремиссия ХНВПМ

Ферменты 11=35 п=36 11=36

1 2 3 .

Г6ФДГ 0,92±0,01 1,13±0,07 2Д2±0,09

Р)<0,01 Pi< 0,001

Р3< 0,001

ГЗФДГ 1,20±0,06 0,52±0,05 0,68±0,05

Pi<0,001 Pi<0,001

Р2<0,05

ЛДГ 0,30±0,02 0,14±0,01 0,34±0,02

Pi<0,001 Р2< 0,001

НАДИЦЦГ 20,54±1,25 б,58±0,37 3,99±0,26

Р,<0,001 Р,<0,001

Р2< 0,001

НАДФИЦДГ 29,40±2,35 21,68±1,83 8,23±0,43

Pi<0,01 . Р)<0,001

Р2< 0,001

НАДГДГ 1,21±0,14 0,3010,02 0,80±0,04

Pi<0,001 Pi<0,05

Р2< 0,001

НАДФГДГ 0,18±0,02 0,08±0,01 0,15±0,01

Р,<0,001 Р2< 0,001

надмдг 9,62±0,67 10,04±0,4б 14,81±1,07

Р(<0,001

Р2< 0,001

НАДФМДГ 0,11±0,01 0,24±0,02 0,20±0,01

Pi<0,001 Р!<0,001

Достоверное снижение в моноцитах активности НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ отражает уменьшение субстратного потока начальных этапов UTK. Восполнения объема субстратов в цикле Кребса за счет окислительного дезаминирования глутамата и превращения его в а-кетоглутарат (M.Yoshino, K.Murakami, 1993) не происходит.

Кроме этого, как и в лимфоцитах, наблюдается усиленный отток субстратов с ЦТК по пути малат-пируват за счет повышения активности НАДФМДГ с восстановлением НАДФ+ до НАДФ-Н. Так как последний

выступает в роли кофактора для НАД(Ф)-зависимых ферментов и необходим для синтеза жирных кислот, стероидов (C.T.Zimmerle, G.M.Alter, 1993), такое повышение выработки НАДФ-Н может быть расценено как один из компенсаторных механизмов, направленных на интенсификацию синтетических реакций в этих клетках.

Таким образом, состояние метаболизма исследованных ИКК при обострении хронического воспаления можно характеризовать как энергодефицитное, которое ограничивает активность клеток. Вероятно, в результате этого не происходит полной санации очага воспаления, что способствует его переходу в фазу ремиссии, а не в выздоровление.

Изменения со стороны иммунной системы и метаболизма клеток в разной степени сохраняются и в фазу ремиссии. Казалось, что отсутствие выраженной клинической картины основного заболевания является отражением восстановления активности иммунной системы и адекватной ее работы по предотвращению нового обострения. Действительно, мы отмечали снижение активности неспецифических защитных реакций, о чем свидетельствует приближение к уровню контрольной группы большинства показателей периферической крови. Наблюдается и восстановление показателей клеточного звена иммунитета, относительное количество лимфоцитов приближается к уровню контроля.

В то же время со стороны гуморального иммунитета отмечается повышение суммарного количества иммуноглобулинов (19,03±0,87 г/л; контроль - 16,81±0,69 г/л; Р<0,05) и ЦИК (42,36±2,78 уе; 26,91±1,95 уе -контроль и 52,03±3,73 уе - обострите ХНВПМ), что может свидетельствовать о сохранении антигенной стимуляции иммунной системы из-за неполной элиминации возбудителя из организма. Не исключена возможность депонирования микроорганизмов в рубцовой ткани (А.Н.Трунов, А.П.Шваюк, О.М.Горбенко, 1997; К.Ю.Макаров, 2006; Н.А.Пекарева, Л.А.Трунова, Т.В.Белоксова и др., 2008).

Липидный спектр и лимфоцитов, и моноцитов больных в фазу ремиссии характеризуется практически теми же особенностями, что и при обострении хронического воспалительного процесса - сниженным содержанием ФЛ, относительным повышением ХОЛ, увеличенным содержанием СЖК и ЛФЛ. Все это свидетельствует о сохранении особенностей липидного обмена клеток, свойственного больным ХНВПМ, которые определяют перечисленные выше | физико-химические характеристики мембранных структур ИКК. Таким образом, сохраняющиеся и в фазу ремиссии установленные изменения липидного спектра лимфоцитов и моноцитов, являются фактором, ограничивающим функционирование ИКК, формируя предпосылки для нового обострения.

Восстановление энергетического обмена в лимфоцитах при ремиссии выражается в активации начальных этапов ЦГК — повышены НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ (рис.2). Усилено поступление субстратов с аминокислотного обмена (активнее НАДГДГ); а снижение их оттока из цикла Кребса на конечных его этапах подтверждается уменьшением показателя НАДФМДГ.

а контроль □ обострение ХНВПМ и ремиссия ХНВПМ

Рис.2. Активность НАД(Ф)-зависимых ферментов (мкЕ/10000 клеток) цикла Кребса в лимфоцитах больных ХНВПМ в разные фазы заболевания

Вместе с тем повышение активности ГЗФДГ отражает дополнительное поступление субстратов на гликолиз, как источник энергопродукции в клетке. Вероятно, дефицит в нем субстратов несколько компенсирован и возросшей

активностью ЛДГ. Интенсификация выработки АТФ в ЦТК и гликолизе за счет перераспределения субстратных потоков в ремиссию воспалительного процесса, вероятно, является механизмом, направленным на поддержание внутриклеточного обмена при ограничении субстратов в клетке вследствие повышенной микровязкости мембраны лимфоцитов.

Еще более выраженное в фазу ремиссии воспаления, чем при его обострении, повышение в лимфоцитах активности Г6ФДГ свидетельствует об усиливающемся оттоке субстратов с гликолиза на ПФП. Такое перераспределение субстратных потоков на фоне сохраняющегося ограничения их поступления в клетки создает более благоприятные условия для пластических и синтетических процессов. В нашем исследовании это проявляется повышением количества лимфоцитов и суммарного содержания иммуноглобулинов у больных, обследованных в ремиссию заболевания.

Повышение активности Г6ФДГ и ГЗФДГ в лимфоцитах при наступлении ремиссии зависит, по-видимому, и от изменения состава популяции циркулирующих в крови лимфоцитов с увеличением среди них доли молодых клеток, имеющих, как известно (R.Curi, J.F.Williams, E.A.Newsholme, 1989) высокую метаболическую и пролиферативную активность.

Состояние ЦТК в моноцитах при ремиссии ХНВПМ характеризовалось сохранением низкой интенсивности процессов энергопродукции (для начальных реакций цикла - даже снижением по сравнению с фазой обострения). Такая особенность его функционирования в моноцитах в эту фазу воспалительного процесса, по-видимому, приводит к ограничению энергообеспеченности клеток. Свидетельствами в пользу этого утверждения являются, отсутствие, по сравнению с контрольным уровнем, пополнения субстратного потока ЦТК за счет метаболитов аминокислотного обмена, удаление из него значительной части, субстратов по пути малат - пируват и уменьшение поступления субстратов метаболизма на цикл через АцКоА. Реакции гликолиза в моноцитах в фазу ремиссии воспаления, вероятно,

компенсаторно, активированы, что сочетается с повышением субстратной обеспеченности ПФП.

Таким образом, изменения состояния метаболизма в лимфоцитах и моноцитах при ремиссии хронического воспалительного процесса нельзя расценить как полностью однозначные и однонаправленные. Если ферментные показатели лимфоцитов в ремиссию заболевания отражают восстановление и даже повышение интенсивности в них энергопродукции, то в моноцитах в этой фазе процесса сохраняются многие признаки недостаточной активности процессов энергообеспечения, наблюдавшиеся при обострении заболевания и способствующие ограничению функциональных возможностей клеток.

Перечисленные особенности внутриклеточного обмена, по-видимому, являются причиной сохраняющегося и в фазу ремиссии снижения активности фагоцитов. Это может приводить к замедлению созревания клеток, превращения их в тканевые макрофаги, к нарушению межклеточной кооперации при воспалении. Постоянная антигенная стимуляция, имеющая место как в период ремиссии, так и при обострении хронического воспалительного процесса, по-видимому, истощает резервы системы мононуклеарных фагоцитов, а последующая хронизация воспалительного процесса в значительной степени определяется нарушениями антибактериальной защиты, которая обеспечивается этой системой. Нарушения функциональных возможностей моноцитов и осуществляемой ими антибактериальной защиты, способствующие сохранению персистенций микроорганизмов в очаге хронического воспаления, в значительной степени обусловлены внутриклеточным энергетическим дефицитом.

Анализ результатов изучения параметров периферической крови, иммунного статуса, липидного спектра и активности ферментов лимфоцитов и моноцитов, обследованных нами больных, позволили предложить гипотетические схемы зависимости функционального состояния ШСК от особенностей внутриклеточных процессов в них при хроническом воспалении (схема 1, схема 2).

ОТЕОЛвзавнаргбетй пфлтга(ЩДГ, ■ ¿ГЗФДГ)

СКЕЖЕИЙ1 SKÏEEECCÎH ЗЕЕрГОГрОДуЮр^КЗСЩХ ргжпЕЙ ЩК -ШАДКЦДГ, ЩАДФШ1ДГ, Л1АДГДГ.

галдФму;: л :/■■■

ргаишаЦТК

1НАДИЦДГ. ¿НАДФЖЖ ТНАДГДГ*,1НАДФМДГ

*i3mpna>e : л.' БосгпдшдввЕе : • резЕции. гзшкЬшзз.

ПЛДГ.ТПФДГ*)

Актигацад

ПФП

{ÎSKTJSÉECnî:

Г0ФДП

/игкьввшйзвгргеряетнх грпгсгзк s ssmcs ::

шши акЕЕвосю зяергепнеасЕх. ееошгсе в {кип»1

ОхргнЕчэпн резпвй 1каязфлеах& тздзггы (севшее: . -г - футшаЁ^кжиакгв, ¿ФИ. ¿ФЧ) ; ' : " : :

с уеакпш.ветняфвиояи |зшнш:: (сЕВЯДЙ фуЕКЕЕЙ «ЕМДЯВ, i<HÏ, »ФЧ, ШСТ)

Схема Î. С^уиурно-метабошяеские й фуйщионшавьк'изменения показателей ыонм^итов при оБопрении и » еиаш ХНБПМ Пргсдопаю: "-Поь'пкезшке коотигаяи значений coœpcc&ntâ rpyni^iпрактически зд с.р лых . ■ - '.

; ¿впиТ- апгкеике кпкузегичениепскагателл, ^'Я-фегх^аркьйгадег.с ФЧ-фагоцйтарвое чиохо ; : • : ' V

ВЫВОДЫ:

1. Обострение хронического воспаления сопровождается активацией неспецифических механизмов защиты, о чем свидетельствует лейкоцщте, повышение СОЭ, увеличение числа палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов.

2. Изменения в иммунной системе при обострении хронического воспаления характеризуются повышением общего количества Т-лимфоцитов и Т-хелперов, что свидетельствует об активации клеточного звена. Вместе с тем, состояние фагоцитарного звена можно характеризовать как депрессивное, а изменений в гуморальном звене иммунитета не выявлено, что в совокупности препятствует элиминации возбудителя воспаления.

3. Обострение хронического воспаления характеризуется активацией в лимфоцитах и моноцитах процессов ПОЛ (содержание ЛФЛ в лимфоцитах повышено в 43 раза) и липолиза (содержание СЖК повышено на 29,40% и 21,17% соответственно). Проницаемость мембран этих клеток ограничивается, что отражается увеличением соотношения ХОЛ/ФЛ (в 1,4-1,5 раза). При ремиссии воспаления вышеперечисленные особенности липидного спектра моноцитов и лимфоцитов сохраняются, отражая сниженные функциональные возможности этих клеток, что способствует хронизации воспаления.

4. Обострение хронического воспаления сопровождается снижением в лимфоцитах уровня энергопродукции. Активности ферментов ЦТК снижена, как на его начальном этапе (НАДИЦЦГ ниже контроля в 7,86 раза, а НАДФИЦЦГ - в 2,54 раза), так и на заключительном (НАДМДГ снижена в 1,73 раза). Интенсивность реакции, гликолиза, катализируемой ЛДГ, также снижена - её показатель в 9,45 раза меньше, чем в контроле. При ремиссии активность энергопродуцируюнщх циклов повышается, как и поступление субстратов на ПФП, что отражает восстановление внутриклеточного метаболизма и способностей лимфоцитов к митозу и синтезу.

5. Дня моноцитов при обострении хронического воспаления характерно уменьшение энергопродукции в ЦТК (НАДИЦДГ ниже контроля в 3,12 раза, а НАДФИЦЦГ - в 1,35 раз) без компенсаторного поступления метаболитов с

аминокислотного обмена. Интенсивность реакции гликолиза снижена (ЛДГ в 2,14 раза меньше, чем в контроле). При ремиссии происходит тенденция к «нормализации» работы ЦТК, но активность ферментов не достигает уровня контроля, отражая стабильность энергодефицита. Высокая активность ПФП в моноцитах не зависит от фазы хронического воспаления.

6. Энергетический дефицит внутриклеточного обмена при, хроническом воспалении ограничивает функциональные возможности лимфоцитов и в еще большей степени - моноцитов. Функциональная недостаточность последних за счет длительной антигенной стимуляции, как и функциональная недостаточность фагоцитоза в разные фазы воспаления, не позволяют добиться санации его очага. Это способствует переходу фазы обострения воспалительного процесса не в выздоровление, а в фазу ремиссии и является предпосылкой для развития в дальнейшем нового обострения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ: 1 .При оценке состояния иммунной системы больных с ХНВПМ наряду с другими исследованиями рекомендуется определять активность внутриклеточных дегидрогеназ в иммунокомпетентных клетках с целью установления характера и выраженности в них нарушений метаболизма.

2. Наличие метаболического иммунодефицита является показанием для применения в комплекЬном лечении больных метаболических иммунокорректоров.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Окладникова, Е.В. Иммунологические изменения и метаболический статус лимфоцитов периферической крови при остром воспалении придатков матки / Е.В.Оклад'никова, Д.В. Окладников, Т.А.Куркучекова Н Науки о человеке: сб. ст. по матер. 4 конгр. молодых ученых и специалистов. - Томск, 2003. - С.83.

2. Окладникова, Е.В. Вильпрофен в комплексном лечении женщин, страдающих воспалительными заболеваниями гениталий на фоне смешанной

генитальной инфекции / Е.В.Окладникова, Д.В.Окладников, И.И.Евдоченко и др. // Инфекционные и генетические поражения плода: матер. IV всерос. науч.-практ.'конф. - Красноярск, 2003. -С.71-72.

3. Окладникова, Е.В. Особенности липидного спектра лимфоцитов периферической крови при хроническом воспалении / Е.В.Окладникова, Г.В.Булыгин И Успехи соврем, естествознания. - 2007. - №3. - С.95-96.

4. Окладникова, Е.В. Метаболический статус моноцитов периферической крови при хроническом воспалении 7 Е.В.Окладникова, Г.В.Булыгин // Успехи соврем, естествознания.-2007.-Х°3. - С.96-97.

5. Окладникова,. Е.В. Дегидрогеназы лимфоцитов периферической крови при хроническом воспалении в стадии обострения / Е.В.Окладникова, Н.С. Пронъкина И Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири: тез. докл. науч.-практ. конф. молодых ученых. - Красноярск, 2007. -С.304-306.

6. Окладникова, Е.В. Иммунокоррекция нарушений фагоцитоза при хроническом воспалении / Е.В.Окладникова, Д.В.Оклад!!иков, И.А.Новицкий // Человек и лекарство: тез. докл. XV рос. нац. конгр. - М., 2008. - С.249.

7. Окладникова, Е.В. Сравнительная характеристика активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в моноцитах и лимфоцитах периферической крови практически здоровых женщин / Е.В.Окладникова, Г.В.Булыгин // Творчество длиною в полвека: сб. науч. тр., посвящ. 50-летию педиатр, фак-та. -Красноярск, 2008. - С.83-84.

8. Окладникова, Е.В. Особенности внутриклеточного метаболизма моноцитов периферической крови при хроническом воспалении придатков матки / Е.В.Окладникова, Г.В.Булыгин, В.В.Гребенникова // Сиб. мед. обозрение. -2009. - №2. - С.35-37.

9. Окладникова, Е.В. Спектр нейтральных липидов моноцитов периферической крови в разные фазы хронического воспаления / Е.В.Окладникова, Г.В.Булыгин // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: тез. докл. XII межрегион, науч.-практ. конф. - Красноярск, 2009. - С.265-266.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГЗФДГ - глицерол-3-фосфатдсгидрогеиаза

Г6ФДГ - глюкозо-6-ф'осфатдегидрогеназа

икк - иммунокомпетентные клетки

ИРИ - иммунорсгуляторный индекс (С1),|/С08; ТхУТс)

лдг - лактатдегидрогеназа

ЛФЛ -лизофосфолипиды

нлдгдг - НАД-зависимая глутаматдегндрогеназа

НАДИЦДГ - НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа

НАДМДГ - НАД- зависимая малатдегидрогеназа

НАДФГДГ - НАДФ-зависимая глутаматдегндрогеназа

НАДФИЦДГ - НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа

НАДФМДГ - НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПФП - пентозофосфатный путь

СЖК - свободные жирные кислоты

СФМ - сфингомиелин

ТАГ - триацилглицериды

ФИ - фосфатидилинозитол

ФИ+ФС - суммарная фракция

фосфатидилинозитол+фосфатидилсерин

ФЛ - фосфолипиды

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

хнвпм - хроническое неспецифическое воспаление придатков

матки

хол - холестерин

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

эх - эфиры холестерина

Отпечатано:

Северное шоссе 47 ООО ПКФ «ФЛАТ» Зак.56 Тир. 100