Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетические механизмы взаимодействия липополисахаридов бактерий с моноцитами и лимфоцитами крови человека in vitro

На правах рукописи

КОСЕНКО ЮРИИ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Патогенетические механизмы взаимодействия линопслкслхаридов бактерий с моноцитами и лимфоцитами крови человека in vitro

i4.00 16 - патологическая физиология

Автореферат диссертаций на соискание ученой сгенеии канлидага медипчиских каух

Работа выполнена в Луганском государственном медицинском университете

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Флегонтова Вероника Валентиновна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Кожин Александр Алексеевич Доктор медицинских наук, профессор Васильева Галина Ивановна

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

X с

Защита состоится ¿?с/)/)еА# 2005 г. в /3 часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 208.082.03 при Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, к. мед. н

Тренева Г.О.

¿fSLéf

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Во второй половине XX спгалетя несколько раз происходило изменение видового состава микрофлоры, вызывающей гнойно-воспалительные заболевания (Белобородое В.Б., 2001). В 1940-50-х гг. из гнойных очагов выделяли преимущественно грамположительные кокки и кишечную палочку; с 1980-90-х гг. ведущее значение приобрели условно-патогенные грамогрицательные бактерии и неспоровые анаэробы (Гайдаш И.С. и др., 2000; Martin С., 1997; Sugawara S. et al., 2000). Эта этиологические агенты, выделенные из очагов, как правило, ассоциируют с аэробными и анаэробными спороносными бактериями.

В формировании защитных, компенсаторных и адаптационных реакций организма существенная роль принадлежит системе мононуклеарных фагоцитов (Хаитов Р.М. и Пинегин Б.В., 1995; Мазуров Д.В. и др., 2001). В связи с этим понятен закономерный интерес исследователей к изучению фагоцитарной активности моноцитов периферической крови при различных патологических процессах бактериальной этиологии (Aderem А., 1999). На первых порах иммунные нарушения создают благоприятные условия для адаптации и размножения бактерий, в дальнейшем же способствуют распространению очагов поражения и хроническому течению процесса (Хаитов Р.М и др., 1998; Карпова М.Р., 1999; Белобородова Н.В. и Бачинская Е.Н., 2000). В фагоцитозе участвуют, в основном, 2 группы клеток: гранулоцигы и моноциты (макрофаги). Роль макрофагов состоит в распознавании, фагоцитозе, процес-синге и длительной презентации детерминант этиологических агентов инфекционных заболеваний (Ярилин А.А., 1998). Одновременно с антигенной презентацией происходит синтез цигокинов, в частности, ингерпейкина-1 (ИЛ-1). Цигокины в высоких концентрациях при выходе в кровь обеспечивают сигнальные функции, связанные с формированием генерализованной воспалительной реакции (Cuzzola M. et al., 2000).

Экологические катастрофы последних лет привели к существенному снижению резистентности организма людей, что, естественно, повлекло за собой изменение сформированных микробиоценозов различных полостей организма человека, в том числе и ротовой полоста (Киселева АФ. и др., 1994; Бирюкова C.B., 1999). На фоне этих процессов генетически детерминированные свойства пагогенносги и вирулентности бактерий получили своё феноти-пическое развитие в направлении их усиления. Вирулентные микроорганизмы в ходе своего эволюционного развития выработали специальную систему приспособлений, направленную на угнетение фагоцитарной активности организма. Одним из этих факторов является липопсшисахарид (ЛПС) - структурный компонент клеточной стенки грамопгрицательных бактерий (Борисова Е.В., 1999). ЛПС выполняет две гтптгг .ф-дпядпг ппргпгтщт антигенную

I гас НАЦИОНАЛЬНАЯ i

I библиотека I .

специфичность и является главным фактором пагогенности - это компонент эндотоксина (Васильев Н.В. и др., 1984). Он вызывает иммунные реакции, в том числе поликлональную активацию иммунной системы, способность стимулировать или угнетать ответ на антигены, индуцировать поликлональную иммунную толерантность и т.п. (Платонов А.Е. и др., 1999). JTTTC способствует выделению моноцитами цитостатического фактора белковой природы -фактора некроза опухоли (ФНО). Рецепторы к ЛПС есть на плазматических мембранах макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и эндогелиоцитов. Эффекты ЛПС характеризуются дозозависимостью: небольшие дозы стимулируют интенсивность фагоцитоза по отношению к разным бактериям, большие - снижают фагоцитарную активность и действуют цитотоксически (Анненков А.Е. и др., 1987). ЛПС запускает продукцию ИЛ-1 р, -6, -8, -10, ФНО-а, интерферона, простаглавдинов, лейкотриенов, фактора активации тромбоцитов и др. (Couturier C.et al., 1992; Baqui A.A. et al., 2000). Доказано, что цигокины, как основные провос палительные медиаторы, индуцируются в макроорганизме грамотрицательными и грамположительными бактериями, и предопределяют "большую" воспалительную природу бактериальных инфекций. Несмотря на тождественность структуры, ЛПС различных видов бактерий отличаются по химическому составу и биологическим свойствам. Растворимый ЛПС обли-гатно патогенных бактерий, не угнетающий гиперчувствителыюсть замедленного типа самостоятельно, возможно, может наделять иммуносупрессив-ными свойствами живые бактерии (Борисов В.А. и Фролов А.Ф., 1990).

Антигенная стимуляция иммунокомпетентных клеток, осуществленная при дефиците факторов, обеспечивающих пролиферацию, может привести к запрограммированной гибели активированной иммунокомпетенгной клетки, одним из механизмов которой является апогтгоз (Самохин А.В. и др., 1997; Маянский Н.А., 2001). Апогтгоз - это физиологическая, активная, программированная гибель клеток, информация о которой закодирована в клеточном геноме и поддаётся регуляции. Нарушение процесса программированной клеточной гибели в сторону усиления или ослабления играет существенную роль в патогенезе иммунопатологических процессов у человека, в том числе вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных и онкологических заболеваний, хронических воспалительных процессов, вирусных и других инфекций. В культурах клеток апоптоз способны усиливать или ослаблять микробы и их структурные компоненты (Казимирко Н.К. и др., 2000; Талаев В.Ю. и др., 2001).

В доступной литературе нами не были найдены данные о комплексном изучении дозозависимого и видоспецифического влияния структурного компонента условно-патогенных грамотрицательных бактерий - ЛПС - на секреторную активность его главных мишеней - моноцитов (продукция KJT-ip, -6,

ФНОчх) и Т-хелперов первого типа (продукция ИЛ-2); фагоцитарную активность моноцитов; влиянии ЛПС на апогтгоз моноцитов и лимфоцитов.

Цель исследования: Изучить влияние липополисахарвдов грамсггри-цательньгх бактерий - этиологических агентов хронического пародонгита - на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека.

Доя достижения цели поставлены такие отдельные задачи:

1. Исследовать in vitro продукцию моноцитами крови человека интерлейки-нов-1 ß, -6 и фактора некроза опухоли-а под влиянием липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

2. Изучить секрецию интерлейкина-2 Т-хелперами первого типа под влиянием липополисахарвдов грамотрицательных бактерий.

3. Определить фагоцитарную активность моноцитов крови человека под влиянием липополисахарвдов грамотрицательных бактерий.

4. Изучить влияние липополисахарвдов грамотрицательных бактерий на апоптоз моноцитов и лимфоцитов крови человека.

Научная новизна исследования. Впервые установлено дозозависимое и видоспецифическое влияние липополисахарвдов условно-патогенных грамотрицательных бактерий на цитокинпродуцирующую способность моноцитов и лимфоцитов крови человека, на фагоцитарную активность и апоптоз моноцитов, апоптоз Т- и B-лимфоцитов. Показано, что по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов грамотрицательных бактерий происходит прогрессивное увеличение продукции интерлейкинов-1 ß, -2, -6, фактора некроза опухсши-а; усиление апогтгоза моноцитов, Т- и B-лимфоцитов, угнетение фагоцитоза моноцитов. Более значительно влияли на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека in vitro липополисахариды факультативно анаэробных бактерий - Escherichia fergusonii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, менее значительно - липопсшисахарвды строго анаэробных бактерий - B.fragilis, Р. melaninogenicus, Fusobacterium necroforum.

Практическая значимость. Определены теоретические подходы к трактовке патогенеза хронических пародонтитов, вызванных грамотрица-тельными условно-патогенными бактериями, на основе изучения биологической активности их липополисахарвдов в отношении моноцитов и некоторых субпопуляций лимфоцитов крови человека. Полученные данные используются в лекционном курсе и при проведении практических занятий на кафедрах патологической физиологии и микробиологии Луганского государственного медицинского университета, что подтверждено соответствующими актами внедрения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium in vitro дозозависимо и специфически стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т-хелперов первого типа крови человека, а также фагоцитарную активность моноцитов. Под влиянием липополисахаридов повышается продукция моноцитами интерлейкинов-lß и -6, фактора некроза опухоли-а и продукция ингерлейкина-2 Т-хелперами первого типа.

2. Липополисахариды in vitro стимулируют апоптоз моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, что проявляется экспрессией на данных клетках маркера апоптоза CD95. Апоптозстимулирующая способность липополисахаридов возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концешрации липополисахаридов и является видоспецифическим признаком.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на заседаниях Луганских областных обществ патофизиологов и микробиологов в 2003-2004 гг.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 4 научных работах.

Объем и структура диссертации. Работа написана на 98 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 1 рисунком. Список литературы включает 143 источника отечественных и иностранных авторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Материалы и методы исследования. Объектом исследования были 120 культур моноцитов и 110 культур лимфоцитов периферической крови практически здоровых доноров-мужчин в возрасте от 20 до 24 лет. Забор крови в объеме 20 мл проводили из локтевой вены в утреннее время (7.00-8.00) до еды. Кровь вносили в стерильные стеклянные пробирки, содержавшие 0,2 мл гепарина, перемешивали и для получения плазмы отстаивали в течение 2 часов в термостате при 37°С. Полученную плазму крови в дальнейшем использовали для выделения моноцитов и лимфоцитов.

ЛПС получали из культур условно-патогенных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, выделенных от 120 больных хроническими пародонтитами, которые обращались за стоматологической помощью в частную стоматологическую клинику «Улыбка» (г. Луганск) с 2003 г. по 2004 г. Установление родовой принадлежности культур и видовую идентификацию бактерий проводили согласно приказу МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. и "Определителя

бактерий Берджи". Идентификацию бактерий проводили с использованием диагностических наборов «Энтеротесг 24 (стриппированный)», «Нефершесг 16 (стриппированный)», «Колитест» и «Анаэрстгесг 23» производства АО «Лахема»®, Чехия. Препараты ЛПС выделяли из клеточной стенки бактерий водно-феноловой экстракцией при 65°С. Использовали следующие рабочие концентрации ЛПС (мкг/мл): 10,0; 50,0; 100,0.

Популяции моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека получали с помощью центрифугирования на градиенте платности фиколл-верографин. Определение фагоцитарной активности моноцитов периферической крови проводили чашечным методом. Подсчитывали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ).

Определение ИЛ-1 ß, ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНО-а проводили в супернатангах моноцитов и лимфоцитов с помощью коммерческих наборов ELISA (Medgenix Diagnostics, Бельгия).

Изучение потенциальной апоптогенной активности ЛПС условно-патогенных бактерий в отношении лимфоцитов и моноцитов проводили морфологическим методом. Для морфологической оценки апоптоза взвесь клеток (моноцитов, Т- и B-лимфоцитов, Т-хелперов) наносили на предметное стекло, подсушивали и окрашивали акридин-оранжевым следующим образом. Раствор акридин-оранжевого в дистиллированной воде (0,1 % разводили перед использованием в 10 % фосфатным буфером до рН=6,0-6,5 добавлением 0,1 М раствора NaH2P04). Предметное стекло покрывали красящим раствором на 15 минут, далее удаляли его фильтровальной бумагой и промывали свежей порцией закисленного фосфатного буфера Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа с синим светофильтром. Экспрессию молекул CD95 на поверхности моноцитов, Т-лимфоцигов, Т-хелперов и В-лимфоцитов изучали методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител производства научно-производственного центра «Медбиоспектр» (Москва, Российская Федерация).

Полученные цифровые результаты обрабатывали статистически на персональном компьютере методами вариационной статистики. Достаточной считалась вероятная ошибка менее 5 % (р<0,05). Дальнейшую обработку цифровых показателей осуществляли с помощью параметрического корреляционного анализа и анализа таблиц долей и пропорций. Для исследования взаимосвязей между исследуемыми переменными нами был использован метод параметрической корреляции (корреляция Пирсона).

Влияние ЛПС условно-патогенных грамотрицательных бактерий на секреторную активность моноцитов. Установлено, что ЛПС влияли на секреторную активность моноцитов, что проявлялось усилением продукции данными клетками ИЛ-1 ß, -6 и ФНО-а. Указанное влияние было дозозависи-

мым и видоспецифическим. Моноциты крови человека в условиях in vitro при отсутствии в среде культивирования бактериальных ЛПС продуцировали ИЛ-1р, -6 и ФНО-а в средних концентрациях (пг/мл) 37,0±2,2, 53,0±3,1 и 40,0+2,4 соответственно. Указанное содержание монокинов было принято нами в качестве референтной нормы.

Внесение в культуру моноцитов ЛПС Е. fergusonii в дозе 10 мкг/мл сопровождалось увеличением продукции ИЛ-ip по сравнению с референтной нормой в 4,6 раза, ИЛ-6 - в 3,8 раза, ФНО-а - в 4,1 раза (р<0,05). При увеличении концентрации ЛПС Е. fergusonii до 50 мкг/мл продукция ИЛ-ip, -6 и ФНО-а возросла в 18,0, 12,0 и 11,4 раза соответственно. Наибольшая стимуляция секреторной способности моноцитов крови человека зарегистрирована при использовании ЛПС Е. fergusonii в концентрации 100 мкг/мл. При этом синтез моноцитами ШТ-ip возрос против референтной нормы в 54 раза, ИЛ-6 и ФНО-а - соответственно в 31,2 и 37,6 раза.

Аналогичные изменения секреторной активности моноцитов крови человека наблюдали при использовании в эксперименте ЛПС P. vulgaris, входящего, как и £ fergusonii, в семейство энтеробактерий. Как оказалось, ЛПС P. vulgaris в дозе 10 мкг/мл вызывали увеличение продукции ИЛ-1 р моноцитами по сравнению с референтной нормой в 4,4 раза, ИЛ-6 и Ф1 Ю-а - 3,3 и 3,8 раза соответственно. Использование ЛПС P. vulgaris в дозе 50 мкг/мл вызывало прогрессивное усиление секреторной активности моноцитов крови человека. Так, при указанной концентрации ЛПС P. vulgaris синтез ИЛ-ip увеличился против референтной нормы в 14,8 раза, ИЛ-6 - в 10,5 раза, ФНО-а - в 11,2 раза. Наибольшая продукция ИЛ и ФНО-а моноцитами крови человека регистрировалась при внесении в среду культивирования моноцитов ЛПС Р. vulgaris в действующей концентрации 100 мкг/мл. Под влиянием указанной дозы ЛПС P. vulgaris продукция ИЛ-ip увеличивалась в 45,0 раз по сравнению с референтной нормой, ИЛ-6 и ФНО-а - в 27,3 и 34,7 раза соответственно. Сопоставление полученных результатов с аналогичными для ЛПС Е. fergusonii статистически достоверного различия не выявило (р>0,05), что позволило считать потенциалы ЛПС Е. fergusonii и ЛПС P. vulgaris во всех использованных концентрациях идентичными.

Существенно влияли на секреторную активность моноцитов крови человека ЛПС P. aeruginosa. При использовании минимальной концентрации ЛПС продукция ИЛ-ip увеличивалась по сравнению с референтной нормой в 3,5 раза, ИЛ-6 - в 3,0 раза, ФНО-а - в 3,2 раза (р<0,05). Повышение действующей дозы ЛПС P. aeruginosa до 50 мкг/мл вело к еще большей активации секреторной функции моноцитов. При использовании ЛПС P. aeruginosa в дозе 100 мкг/мл стимуляция секреции монокинов была наибольшей, что проявлялось увеличением концентрации ИЛ-ip в исследуемом супернатанге в 39,2

раза, ИЛ-6 - в 20,9 раза, ФНО-а - в 29,8 раза. Вместе с тем, установлено, что монокин-сгимулирующая активность ЛПС P. aeruginosa была достоверно ниже таковой для Е. fergusonii.

Существенно влияли на функциональную активность моноцитов крови человека ЛПС Н. influenzae., однако монокин-стимулирующий потенциал ЛПС указанного микроорганизма был менее выраженным по сравнению с ЛПС энтеробактерий и P. aeruginosa.

Существенный интерес представляло изучение влияния на секреторную активность моноцитов крови человека ЛПС строго анаэробных условно-патогенных грамотрицательных бактерий, которые так же, как и вышеуказанные факультативно анаэробные бактерии, являлись этиологическими агентами хронических пародонтигов. С этой целью нами были изучены ЛПС бактероидов, превотслл и фузобакгерий.

Установлено, что ЛПС строгих анаэробов стимулировали продукцию моноцитами ИЛ-lp, ИЛ-6 и ФНО-а, однако в целом монокин-стимулирующий потенциал ЛПС представителей родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacteriiim был ниже такового для факультативно анаэробных патогенов. Наименее активными из всех исследуемых ЛПС оказались ЛПС F. necroforum.

Таким образом, влияние ЛПС на секрецию моноцитами ИЛ-ip, ИЛ-6 и ФНО-а носило дозозависимый и ввдоспецифический характер. Минимальные действующие концентрации ЛПС вызывали наименьшую стимуляцию синтеза монокинов, тогда как высокие дозы ЛПС - наибольшую. Наиболее активную продукцию монокинов вызывали ЛПС Е. fergusonii, наименее активно - ЛПС F. necroforum. В целом, под влиянием ЛПС грамотрицательных бактерий имело место преобладание продукции ИЛ-lp над другими монокинами, которые секретируются моноцитами крови человека.

Влияние ЛПС условно-патогенных грамотрицательных бактерий на секреторную активность Т-хелперов первого типа. О секреторной функции лимфоцитов и о влиянии на неё ЛПС судили по изменению продукции ИЛ-2 - лимфокина, который продуцируется Т-хелперами первого типа. Спонтанная продукция Т-хелперами первого тала ИЛ-2 составила 1,6+0,15 мкг/мл, что и было принято в качестве референтной нормы.

В зависимости от видовой принадлежности ЛПС наиболее активными в плане стимуляции образования ИЛ-2 оказались ЛПС Е. fergusonii, наименее активными - ЛПС F. necroforum. При использовании ЛПС Е. fergusonii в действующей дозе 10 мкг/мл кратность увеличения продукции ИЛ-2 составила 1,8 раза, тогда как при 50 мкг/мл - 5,3 раза. Внесение в среду культивирования лимфоцитов ЛПС данного патогена в действующей концентрации 100 мкг/мл

вызывало наибольшее образование ИЛ-2 (увеличение против референтной нормы в 13,8 раза).

Подобную с ЛПС Е. fergusonii активность проявляли ЛПС P. vulgaris. При концентрации ЛПС данного патогена 10 мкг/мл продукция ИЛ-2 Т-хелперами первого типа превышала референтный показатель в 1,7 раза, при 50 и 100 мкг/мл - в 5,5 и 12,8 раза соответственно.

Менее активными оказались ЛПС, принадлежащие P. aeruginosa и Н. influenzae. При использовании ЛПС данных видов бактерий в действующей дозе 10 мкг/мл степень увеличения продукции ИЛ-2 составляла от 1,6 раза (Р. aeruginosa) до 1,75 раза (Я influenzae), при дозе ЛПС 50 и 100 мкг/мл - соответственно 4,6, 5,1 и 11,6,12,2 раза.

Заметно влияли на секреторную активность лимфоцитов ЛПС строго анаэробных бактерий. При этом наибольшим стимулирующим потенциалом обладали ЛПС В. fragilis. Внесение в среду культивирования лимфоцитов ЛПС P. melaninogenicus в действующей концентрации 10 мкг/мл вело к увеличению синтеза ИЛ-2 против референтной нормы в 1,6 раза, при концентрациях 50 и 100 мкг/мл - в 4,6 и 8,4 раза соответственно. Для ЛПС F. necroforum степень увеличения синтеза ИЛ-2 при 10 мкг/мл составила 1,4 раза, при 50 мкг/мл - 3,4 раза, при 100 мкг/мл - 7,4 раза.

Таким образом, ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий способны индуцировать продукцию ИЛ-2 Т-хелперами первого типа. Степень отмеченного влияния зависела как от стимулирующей конце(прации ЛПС, так и от его видовой принадлежности. Наиболее активно продукцию ИЛ-2 индуцировали высокие дозы ЛПС (100 мкг/мл), выделенные из культуры Е fergusonii. Наименее активными скатались малые действующие дозы ЛПС (10 мкг/мл) F. necroforum.

Влияние липополисахаридов условно-патогенных бактерий на фагоцитарную активность моноцитов (ФАМ). Учитывая то, что от ФАМ зависит полноценная реализация как защитной, так и антигенпредставляющей функции моноцитов, представляло существенный интерес изучение дозозави-симого и видоспецифического влияния ЛПС на фагоцитарную активность данных клеток. При отсутствии в среде культивирования ЛПС ФИ и ФЧ моноцитов составили, соответственно, 36+2,0 % и 3,5±0,2 у.е. Данные показатели были приняты нами в качестве референтной нормы.

При внесении в среду культивирования моноцитов крови человека ЛПС Е. fergusonii оказалось, что их действующая концентрация 10 мкг/мл способствовала повышению ФАМ. Это проявлялось увеличением показателя ФИ по сравнению с референтной нормой в 1,3 раза, а ФЧ - в 1,4 раза (р<0,05). Напротив, контакт моноцитов с ЛПС Е. fergmonii в действующей дозе 50 мкг/мл угнетал фагоцитоз. При данном условии эксперимента ФИ моноцитов

снизился против референтной нормы в 1,8 раз, ФЧ - в 1,66 раз (р<0,05). Наибольшее угнетение ФАМ крови человека зарегистрировано при внесении в среду культивирования ЛПС £ fergusonii в концентрации 100 мкг/мл. При этом показатели ФИ и ФЧ моноцитов были ниже референтной нормы в 3,8 и 3,9 раза соответственно (р<0,05). Таким образом, полученные нами данные свидетельствовали о том, что малые концентрации ЛПС К fergusonii стимулировали ФАМ, тогда как высокие дозы ЛПС её существенно угнетали.

Аналогичное влияние на ФАМ наблюдали также при использовании ЛПС других этиологических агентов хронических пародонтитов.

На фагоцитоз моноцитов крови человека in vitro значительно влияли ЛПС строго анаэробных грамопгрицательных условно-патогенных бактерий родов Bacteroides, Prevotella, Fusobakterium. В целом, влияние ЛПС данной группы патогенов на фагоцитоз было аналогичным таковому для факультативно анаэробных бактерий. Так, внесение в среду культивирования моноцитов ЛПС В. fragilis в действующей концентрации 10 мкг/мл вызывало увеличение ФИ и ФЧ моноцитов в 1,3 раза против референтной нормы, что было аналогично изменениям, возникавшим при использовании ЛПС £ fergusonii в такой же концентрации. При влиянии на моноциты крови человека ЛПС В. fragilis в действующей дозе 50 и 100 мкг/мл ФИ оказался сниженным в 1,4 и 2,6 раза, а ФЧ - в 1Д и 2,2 раза соответственно (р<0,05).

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что направленность влияния ЛПС на ФАМ крови человека, в основном, определяется действующей на моноциты концентрацией ЛПС, и в меньшей степени зависит от их видовой принадлежности. Малые действующие дозы ЛПС разных видов грамотрицатсльных условно-патогенных бактерий стимулировали ФАМ, что проявлялось увеличением показателей ФИ и ФЧ. Напротив, высокие дозы ЛПС угнетали ФАМ тем более значимо, чем выше была действующая концентрация ЛПС. Угнетение фагоцитарной способности моноцитов крови человека сопровождалось существенным уменьшением показателей ФИ и ФЧ. По сравнению с ЛПС факультативно анаэробных условно-патогенных бактерий, ЛПС строго анаэробных патогенов обладали меньшим угнетающим фагоцитоз потенциалом.

Экспрессия молекул CD95 на поверхности моноцитов и лимфоцитов под влиянием липополисахарцдов условно-патогенных бактерий. Оценку апогтгоза моноцитов и лимфоцитов проводили морфологическим методом - окраской мазков акридин-оранжевым. ДНК в ядрах клеток, не вступивших на путь апогтгоза, окрашивалось в зелёный цвет, а РНК в ядрышках и цитоплазме - в красный. При апогтгозе зелёное окрашивание проникало в цитоплазму, а фрагментирующееся ядро имело вид зелёных глыбок. Большинство погибших клеток имели морфологические изменения, характерные для

апоптоза. В данном разделе приведены данные изучения потенциальной апоптогенной активности ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий на основании исследования экспрессии молекул CD95 на поверхности моноцитов и лимфоцитов.

Проведенные нами исследования показали, что ЛПС Е. fergusonii, Р. vulgaris, P. aeruginosa, Я influenzae, В fragilis, P. melaninogenicus и F. necrofo-гит незначительно влияли на апогггоз моноцитов. Это влияние выражалось в статистически достоверном увеличении количества моноцитов, которые не- 4

ели на поверхности своей цитоплазматической мембраны специфический маркер апогтгоза CD95, только при стимуляции высокими действующими концентрациями ЛПС, преимущественно 100 мкг/мл. Небольшие дозы ЛПС (10-50 мкг/мл) апоптозиндуцирующего действия на моноциты крови человека, как правило, не оказывали. Количество моноцитов крови человека, экс-прессировавших in vitro на своей поверхности молекулы CD95 при отсутствии влияния ЛПС составило 5,5+0,3 %, что и было принято нами за референтную норму. Установлено, что независимо егг видовой принадлежности ЛПС в действующих концентрациях 10-50 мкг/мл не вызывали статистически достоверного увеличения экспрессии молекул CD95 на поверхности моноцитов in vitro. Исключение составили ЛПС Я influenzae, которые в дозе 50 мкг/мл вызывали повышение экспрессии CD95 на поврехности моноцитов до уровня 6,7±0,4 %, что было в 1,2 раза выше аналогичного показателя референтной нормы (р<0,05). Внесение в среду культивирования моноцитов крови человека ЛПС в действующей концентрации 100 мкг/мл сопровождалось умеренным увеличением уровня клеток, несущих на своей поверхности CD95. Кратность увеличения моноцитов с усиленной экспрессией молекул CD95 на своей поверхности колебалась от 1,15 раза (P. melaninogenicus) до 1,55 раза (Я influenzae). Согласно полученным данным, наиболее активно индуцировали экспрессию молекул CD95 на поверхности моноцитов ЛПС Я influenzae, наименее активными оказались ЛПС строго анаэробных условно-патогенных бактерий.

Таким образом, способность ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий к усилению экспрессии молекул CD95 на поверхностях (

клеток проявлялась при высоких действующих на моноциты человека концентрациях ЛПС (100 мкг/мл), что вело к увеличению количества CD95+-клегок. При указанной дозе проявлялись видоспецифические особенности •

бактериальных ЛПС, которые выражались в большем или меньшем апогтго-зицдуцирукиДем потенциале.

Установлено, что ЛПС Е. fergusonii, P. vulgaris, P. aeruginosa, Я influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum усиливали экспрессию молекул CD95 на поверхности Т- и B-лимфоцитов. При этом уровень клеток, экс-

премировавших данные молекулы, повышался по мере увеличения действующей концентрации ЛПС. Количество Т- и B-лимфоцитов, экспрессирую-щих на своей поверхности молекулы CD95, при отсутствии в среде культивирования данных клеток ЛПС, было принято нами в качестве референтной нормы, которая для общего количества Т-, B-лимфоцитов и субпопуляции Т-хелперов составила 6,4+0,4 %, 4,5±0,3 % и 3,7±0,2 % соответственно. Внесение в среду культивирования лимфоцитов ЛПС способствовало увеличению количества клеток, которые экспресс провали кластер дифференцирования CD95, что свидетельствовало о готовности лимфоцитов к апоттгозу. Уровень лимфоцитов, экспрессировавших на своей поверхности молекулы CD95, существенно повышался по мере увеличения концентрации ЛПС и был наибольшим при дозе ЛПС в среде культивирования, равной 100 мкг/мл.

Так, в отношении общего пула Т-лимфоцигов количество клеток с кластером дифференцирования CD95, при действующей концентрации ЛПС 10 мкг/мл превышало показатель референтной нормы в зависимости от видовой принадлежности ЛПС, в среднем, в 1,2 раза (в 1,1-1,45 раза), при дозе ЛПС 50 и 100 мкг/мл - соответственно в 1,48 раза (колебание -1,2-1,8 раза). Апоптоз Т-лимфоцитов определенным образом зависел от видовой принадлежности ЛПС. Наибольшую апоптогенную активность проявляли ЛПС Я influenzae. Менее значительным апоптогенным потенциалом по сравнению с ЛПС Я influenzae обладали ЛПС Р. aeruginosa, хотя выявленные отличия не были статистически достоверными. При внесении в среду культивирования Т-лимфоцигов ЛПС Р. aeruginosa в действующих дозах 10, 50 и 100 мкг/мл кратность увеличения количества Т-клеттж с экспрессией молекул CD95 на своей поверхности по сравнению с референтной нормой составила, соответственно, 1,4,1,78 и 2,28 раза

На третьем месте по способности индуцировать апоптоз Т-лимфоцигов среди изучаемых грамотрицательных условно-патогенных бактерий находились ЛПС Е. fergusonii. Менее активными по сравнению с ЛПС Е. fergusonii оказались ЛПС P. vulgaris. При минимальной действующей концентрации ЛПС P. vulgaris (10 мкг/мл) степень увеличения Т-лимфоцишв с маркерами CD95 составила 1,09 раза, что было недостоверно при сопоставлении с показателем референтной нормы. При увеличении дозы ЛПС P. vulgaris до 50 и 100 мкг/мл количество Т-клегок с маркерами апогтгоза CD95 увеличивалось против нормы, соответственно, в 1,5 и 2,15 раза (р<0,05).

Наименьшее влияние на экспрессию на поверхности Т-лимфоцигов молекул CD95 имели ЛПС строго анаэробных условно-патогенных бактерий, относящихся к родам Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium.

В связи с тем, что Т-хелперы/инпукторы (СЕ)4+-лимфоцигы) составляют подавляющее большинство Т-лимфоцитов и являются одной из субпопу-

ляций иммунорегулирующих клеток, представляло интерес установление влияния ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий на экспрессию молекул CD95 на поверхности этих клеток. С этой целью нами было проведено изучение влияния ЛПС Е. fergusonii, P. vulgaris, P. aeruginosa, Н. influenzae, B.fragilis, P. melcminogenicus и F. necroforum на Т-хелперы. При отсутствии в среде культивирования Т-хелперов/ивдукторов ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий количество лимфоцитов, экспрессиро-вавших на своей поверхности молекулы CD95, составляло 3,7+0,2 %, то при внесении в среду ЛПС в дозе 10 мкг/мл уровень Т-хелперов с маркером CD95 увеличивался, в среднем, в 1,39 раза (диапазон увеличения составил 1,19-1,65 раза в зависимости от видовой принадлежности ЛПС). При использовании ЛПС в действующей концентрации 50 и 100 мкг/мл кратность повышения Т-хелперов/ивдукгоров с маркерами CD95 составила 1,8 и 2,3 раза соответственно. Колебания степени увеличения в первом случае составили сгг 1,35 до 2,35 раза, во втором случае - от 1,73 до 3,08 раза.

На уровень экспрессии на своей поверхности молекул CD95 Т-хелперами/индукторами влияла видовая принадлежность ЛПС. Как оказалось, наибольшим индуцирующим экспрессию маркеров апоптоза действием на данную субпопуляцию Т-клеток обладали ЛПС Я influenzae. Примерно равный потенциал с ЛПС Я influenzae имели ЛПС Р. aeruginosa. Внесение ЛПС данного патогена в среду культивирования Т-хелперов/индукторов способствовало повышению уровня клеток с маркером апоптоза CD95 по сравнению с референтной нормой в 1,65 раза при действующей дозе ЛПС 10 мкг/мл, в 2,27 раза при дозе 50 мкг/мл, и в 2,95 раза при дозе 100 мкг/мл.

Для ЛПС Е. fergusonii и Р. vulgaris кратность увеличения уровня СЕ)95+-Т-хелперов/индукгоров против референтной нормы при 10, 50 и 100 мкг/мл ЛПС составила, соответственно, 1,5 и 1,4 раза, 1,95 и 1,84 раза, и 2,4 и 2,3 раза (р<0,05). Как видно из полученных данных, потенциал ЛПС Р. vulgaris в отношении усиления экспрессии на поверхности Т-хелперов/ицпукторов молекул CD95 был наименьшим среди ЛПС факультативно анаэробных условно-патогенных грамотрицательных бактерий, которые были нами протестированы. Вместе с этим, он существенно превышал таковой для ЛПС строго анаэробных грамотрицательных бактерий родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium.

ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий в условиях in vitro усиливали экспрессию маркеров апоптоза CD95 на поверхности В-лимфоцитов периферической крови человека. При этом наибольший уровень B-клеток, которые имели маркер апоптоза CD95, имел место при действии на В-лимфоцигы высоких действующих концентраций ЛПС. Анализ влияния ЛПС грамотрицательных бактерии на экспрессию молекул CD95 В-

лимфоцитами в зависимости от видовой принадлежности ЛПС показал, что наибольшим потенциалом обладали ЛПС Р. aeruginosa. Подобный ЛПС Р. aeruginosa потенциал проявляли ЛПС Н. influenzae. При действующей дозе ЛПС указанной видовой принадлежности 10 мкг/мл кратность увеличения В-лимфоцитов с маркером апогтгоза CD95 составила 1,8 раза, при дозе 50 мкг/мл - 2,73 раза, при дозе 100 мкг/мл - 3,49 раза. Вместе с этим, статистически достоверных отличий между потенциалами ЛПС Р. aeruginosa и ЛПС Я » influenzae в усилении экспрессии молекул CD95 В-лимфоцигами выявлено не

было(р>0,1).

Выраженное, но менее значительное по сравнению с ЛПС Р. aeruginosa и Н. influenzae усиление экспрессии маркеров апогтгоза B-клетками зарегистрировано при тестировании ЛПС E.fergusonii и Р. vulgaris. Наименьшую способность усиливать экспрессию маркеров апоптоза на поверхности В-лимфоцитов проявляли ЛПС строго анаэробных грамотрицательных условно-патогенных бактерий. Так, кратность повышения количества B-лимфоцитов с маркером апоптоза CD95 под влиянием 10 мкг/мл ЛПС данных видов бактерий, в среднем, составила 1,51 раза по отношению к референтной норме, при 50 и 100 мкг/мл - 1,99 и 2,52 раза соответственно. Существенных различий между потенциалами ЛПС В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum не выявлено.

Таким образом, ЛПС Е fergusonii, P. vulgaris, P. aeruginosa, Я influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum в условиях in vitro стимулировали апогтгоз Т- и B-лимфоцитов крови человека, что выражалось усилением в экспрессии на цитоплазматических мембранах указанных клеток маркера апоптоза CD95. Количество Т- и B-лимфоцитов с данными маркерами увеличивалось по мере возрастания действующей на них концентрации ЛПС, а также отличалось в зависимости от видовой принадлежности ЛПС. Наибольшие уровни Т- и B-лимфоцитов, экспрессировавших на своей поверхности молекулы CD95, зарегистрированы при действующей дозе ЛПС Я influenzae и P. aeruginosa 100 мкг/мл. Отмечено, что наиболее чувствительными к апоп-тогенному действию ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий были B-лимфоциты, а не Т-лимфоцигы, тогда как среди последних готовность ' к апогтгозу демонстрировали преимущественно Т-хелперы/ицдукгоры.

Корреляционный анализ и анализ таблиц сопряженности. Для исследования взаимосвязей между исследуемыми переменными нами был использован метод параметрической корреляции (корреляция Пирсона). Определяли корреляционные связи между следующими переменными: ИЛ-lß моноцитов (пг/мл), ИЛ-6 моноцитов (пг/мл), ФНО-а моноцитов (пг/мл), ИЛ-2 лимфоцитов (пг/мл), ФИ моноцитов, %, ФЧ моноцитов (у.е.), количество СЕ)95-моноцитов (%), количество С1)95-Т-лимфоцитов (%), количество

СЕ)95-Т-хелперов первого типа (%), количество СШ5-В-лимфоцитов (%). При концентрации ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий -этиологических агентов хронических пародонгигов 10 мкг/мл нами наблюдалась очень сильная положительная корреляционная связь между уровнями продукции ИЛ-1р, ИЛ-6 и ФНО-а моноцитами (между ними существует физическая взаимосвязь). С другой стороны, наблюдали не столь очевидные статистические связи между продукцией ФНО-а моноцитами и секрецией ИЛ-2 лимфоцитами, как показатель корреляционной связи между секреторной активностью моноцитов и лимфоцитов, а также между ФНО-а и количеством СГ)95-Т-хелперов первого типа, что можно трактовать как взаимосвязь между функциональной активностью моноцитов (ФНО-а) и показателями их готовности к реализации апоптозной программы. Кроме того, мы наблюдали связь между количеством СЕ)95-Т-лимфоцигов, СЕ)95-Т-хелперов первого типа, СЕ)95-В-лимфоцитов - эти показатели, характеризующие процесс подготовки лимфоцитов к апоптозу, имели между собой тесную физическую связь. При концентрации ЛПС в тест-среде 50 мкг/мл прослеживались те же сильные положительные корреляционные связи: между секрецией ИЛ-1 р, ИЛ-6 и ФНО-а моноцитами, секрецией лимфоцитами ИЛ-2, то есть показателями секреторной активности моноцитов и лимфоцитов; между количеством С095-моноцигов, СГ)95-Т-лимфоцитов, СЕ)95-Т-хелперов первого типа и СЕ)95-В-лимфоцигов - показателями экспрессии молекул СЭ95 на поверхности моноцитов и лимфоцитов. Эти закономерности были очевидны и имели реальную физическую природу. Но при этой концентрации ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий прослеживались и новые интересные взаимосвязи: так, отмечалась обратная корреляционная связь между ИЛ-1р, ИЛ-6, ФНОчх моноцитов - показателями, которые характеризуют секреторную активность моноцитов с одной стороны и ФЧ моноцитов - показателем фагоцитарной активности моноцитов - с другой.

Эту интересную закономерность, возможно, следует трактовать следующим образом: при меньших дозах ЛПС условно-патогенных бактерий снижается иммунная нагрузка и активируется, в основном, система гуморального иммунитета. Сильная положительная корреляция между ФИ моноцитов и ФЧ моноцитов полностью объяснима - это различные показатели одного процесса - фагоцитарной активности моноцитов. И еще ряд интересных обратных корреляций между ФИ моноцитов, ФЧ моноцитов с одной стороны и уровнем СШ5-Т-лимфоцигов, СЕ>95-Т-хелперов первого типа - с другой. Согласно этим данным, активация фагоцитоза моноцитами тормозит экспрессию на поверхности Т-лимфоцитов молекул СЕ>95.

При концентрации ЛПС 100 мкг/мл сохранялись и усиливались все обнаруженные предыдущие закономерности. Чётко прослеживались положи-

тельные внутрнгрупповые корреляции переменных иммунных клеток, которые характеризуют секреторную активность: продукция моноцитами ИЛ-lß, ИЛ-6, ФНО-а, секреция лимфоцитами ИЛ-2 и обратные корреляционные связи с другим блоком переменных: ФИ и ФЧ моноцитов - показателей фагоцитарной активности моноцитов. Таким образом, существует обратная корреляционная взаимосвязь между системой клеточного и гуморального иммунитета.

Нами был применён метод анализа таблиц сопряжённости для установления связи между концентрацией ЛПС с одной стороны и фагоцитарной активностью моноцитов и готовностью моноцитов и лимфоцитов к реализации апоптозной программы - с другой. Анализ таблиц сопряжённости фагоцитарной активности моноцитов показал, что существует статистически достоверная взаимосвязь между концентрацией ЛПС и силой фагоцитарной реакции. Анализ таблиц сопряжённости показателей экспрессии на поверхности клеток молекул CD95 давал более неоднозначную картину. Анализ этих четырёх таблиц позволил подтвердил, полученный нами в эксперименте результат - готовность моноцитов и лимфоцитов к реализации апоптозной программы активировалась с повышением действующей концентрации ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий - этиологических агентов хронических пародонтитов для Т-лимфоцитов и B-лимфоцитов, а для моноцитов и Т-хелперов степень готовности к реализации апоптозной программы была дозонезависимым параметром (глава 5 настоящего исследования).

Подводя итог, можно констатировать, что полученные нами результаты свидетельствуют о существенном значении биологических свойств липопо-лисахаридов условно-патогенных бактерий -этиологических агентов хронических пародонтитов благодаря их способности изменять секреторную функцию и готовность к реализации апоптозной программы моноцитов и лимфоцитов, а также поглотительную способность моноцитов.

ВЫВОДЫ

1. Липополисахариды грамотрицательных условно-патогенных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium являются биологически активными веществами, которые влияют на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека в условиях in vitro.

2. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium в условиях in vitro стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т-хелперов первого типа крови человека. Под влиянием липополисахаридов повышается продукция моноцитами интерлейкинов-lß и -6, фактора некроза опухоли-а и продукция ингерлейкина-2 Т-хелперами первого типа.

Цнгокинсшмулирующая активность липополисахаридов является дозо-зависимой и видоспецифической. Продукция указанных цитокинов прогрессивно возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов. Наибольшей цитокин-стимулирующей активностью обладают липополисахариды Е. fergusonii, P. aeruginosa, Я influenzae, наименьшей - липополисахариды B.fragilis, Р. melaninogenicus, F. necroforwn.

3. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium влияют на фагоцитарную активность моноцитов в условиях iri vitro. Небольшие дозы липополисахаридов (10 мкг/мл) стимулируют фагоцитоз моноцитов, большие дозы (50-100 мкг/мл) - угнетают его тем сильнее, чем выше действующая доза липополисахаридов. Наибольшим иммуно-супрессивным потенциалом обладают липополисахариды Е. fergusonii, Р. aeruginosa, Я influenzae, наименьшим - липополисахариды В. fragilis, Р. melaninogenicus, F. necroforwn.

4. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium в условиях in vitro стимулируют апоптоз моноцитов, T- и В-лимфоцигов, что проявляется экспрессией на данных клетках маркера апоптоза CD95. Способность липополисахаридов грамотрицательных бактерий усиливать экспрессию молекул CD95 на поверхности иммунокомпетенгных клеток возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов, и более выражена у представителей родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, чем у представителей родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Косенко Ю.В., Русалов В Л. Нормальная микрофлора полости рта // Украинский медицинский альманах. - 2003. - № 6. - С. 218-220.

2. Косенко Ю.В. Влияние цитокинов на размножение бактерий - этиологических агентов хронического пародонгига // Украинский медицинский альманах. - 2004. - № 4. - С. 206-209.

3. Косенко Ю.В. Влияние липополисахаридов этиологических агентов хронического пародонгига на фагоцитоз моноцитов // Украинский медицинский альманах.-2004.-№5.-С. 115-117.

4. Косенко Ю.В. Влияние липополисахаридов бактерий на апоптоз моноцитов // Украинский медицинский альманах. - 2004. - № 6. - С. 66-68.

Подписано в печап,г Формат 60.9СУ16 Бумагаисчая. Условн. печ. лист O.g. Тцмж 120 за Заказ№29. ЧП ГайдашНС, Укреие,91007, Луганск, уп Прию«и,47а

í-5582

РНБ Русский фонд

2006^4 4266

Актуальность темы. Во второй половине XX столетия несколько раз происходило изменение видового состава условно-патогенной микрофлоры, вызывающей гнойно-воспалительные заболевания [4]. Так, если в 1940-50-х гг. из гнойных очагов выделяли преимущественно стрептококки и кишечную палочку, то в последующие годы установлено преобладание стафилококков, удельный вес которых в этиологической структуре гнойно-воспалительных заболеваний возрос до 60-90 % [118]. С 1980-90-х гг. ведущее значение приобрели грамотрицательные бактерии [111, 114]. Существенно увеличился удельный вес гнойно-воспалительных инфекций, обусловленных неспоровыми анаэробными условно-патогенными микроорганизмами: пептококками, пептострептококками, фузобактериями, бактероидами, превотеллами, дихе-лобактерами и др. [25, 121, 128]. Эти этиологические агенты, выделенные из очагов, как правило, ассоциируют с аэробными - синегнойной и кишечной палочками, протеем и другими, а также со спороносными бактериями - кло-стридиями и т.п.

В формировании защитно-приспособительных, компенсаторных и адаптационных реакций организма существенную роль играет система моно-нуклеарных фагоцитов благодаря неспецифическому фагоцитозу, способности разрушать некоторые белки, обезвреживать чужеродные молекулы и клетки, образовывать макромолекулы, которые специфически реагируют с чужеродными веществами [62, 84]. В связи с этим понятен закономерный интерес ряда исследователей к изучению фагоцитоза макрофагов крови при различных патологических процессах, вызванных условно-патогенной микрофлорой [85, 92]. Результаты данных исследований свидетельствуют, что наблюдается снижение показателей завершённости фагоцитоза, снижение бактерицидности сыворотки крови и тканевой жидкости, снижение резистентности организма на всех этапах развития гнойно-воспалительных заболеваний. На первых порах иммунные нарушения создают благоприятные условия для адаптации и размножения возбудителей, в дальнейшем же способствуют распространению очагов поражения и хроническому течению процесса [5, 47, 84].

В фагоцитозе участвуют, в основном, 2 группы клеток: гранулоциты и моноциты (макрофаги) [80, 91]. Роль макрофагов состоит в распознавании, фагоцитозе, процессинге и длительной презентации детерминант этиологических агентов инфекционных заболеваний [90]. Одновременно с антигенной презентацией происходит синтез цитокинов, в частности, интерлейкина-1 (ИЛ-1). Цитокины в высоких концентрациях при выходе в кровь обеспечивают сигнальные функции, связанные с формированием генерализованной воспалительной реакции [103].

Экологические катастрофы последних лет привели к существенному снижению резистентности организма людей, что, естественно, повлекло за собой изменение сформированных микроценозов различных полостей организма человека [49, 71, 72, 85]. На фоне этих процессов генетически детерминированные свойства патогенности и вирулентности условно-патогенной микрофлоры получили своё фенотипическое развитие в направлении их уси- -ления. В частности, вирулентные микроорганизмы в ходе своего эволюционного развития выработали специальную систему приспособлений, направленную на модулирование фагоцитарной активности организма [106]. Одним из этих факторов является липополисахарид (ЛПС), входящий в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий [7].

ЛПС (компонент эндотоксина) грамотрицательных условно-патогенных и строго патогенных бактерий выполняет две важные функции: определяет антигенную специфичность и является главным фактором патогенности [19, 29]. Открытие ЛПС и дальнейшее изучение его структурных и биологических свойств показало, что он вызывает иммунные реакции, в том числе поликлональную активацию иммунной системы, способен стимулировать или угнетать ответ на конкретные антигены, индуцировать поликлональную иммунную толерантность и т.п. [73]. В отношении иммунорегуля-торных В-лимфоцитов выявлена способность ЛПС вызывать in vivo и in vitro образование В-супрессоров, активность которых можно изучать в модельных опытах in vitro [102]. ЛПС способствует выделению моноцитами цитостати-ческого фактора белковой природы - фактора некроза опухоли (ФНО), который стимулирует секрецию ИЛ-1, -6, -8, лейкотриенов, тромбоксана, активность макрофагов; имеет слабое влияние на Т-лимфоциты; способствует усилению фагоцитарной активности нейтрофилов, активизирует общий коагуля-ционный потенциал крови, усиливает микроциркуляторные нарушения, обладает противоопухолевой активностью [20, 131]. Рецепторы к ЛПС есть на плазматических мембранах макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и эндоте-лиоцитов. В эксперименте in vitro было показано, что в ответ на введение ЛПС на поверхности моноцитов через 30 минут появляется связанный с мембраной ФНО-а, через 90 минут - ИЛ-ip, позднее - ИЛ-6 и другие цитокины; позднее эти цитокины покидают поверхность фагоцитов и появляются в крови [110]. ЛПС стимулирует гуморальный ответ мышей на тимусзависимый и тимуснезависимый антигены и модулирует клеточный иммунитет, снижая интенсивность гиперчувствителыюсти замедленного типа к эритроцитам барана, влияет на функциональную активность макрофагов [23]. При этом эффекты ЛПС характеризуются дозозависимостыо: небольшие дозы стимулируют интенсивность фагоцитоза по отношению к разным бактериям, большие - снижают фагоцитарную активность и действуют цитотоксически. ЛПС, появляясь в организме, может влиять на чувствительные клетки-мишени (Т-, В-лимфоциты, макрофаги), включая мембраномолекулярные механизмы активации [1].

На сегодняшний день выделяют ряд структурных компонентов бактериальной клетки, способных непосредственно вызывать образование провос-палительных цитокинов (интерлейкинов, фактора некроза опухоли) [45, 127]. Прежде всего, это ЛПС, запускающий продукцию ИЛ-ф, -6, -8, -10, ФНО-а, интерферона, простагландинов, лейкотриенов, фактора активации тромбоцитов и др. [10, 27, 94, 102, 124]. Доказано, что продукция цитокинов, как основных провоспалительных медиаторов, индуцируется в макроорганизме грамотрицательными и грамположительными бактериями, и предопределяет -большую" воспалительную природу бактериальных инфекций. У всех гра-мотрицательных бактерий отмечается значительный разброс по способности индуцировать образование цитокинов (в частности, ФИО): от 0,01 нг/мл у некоторых микроорганизмов до более 100 нг/мл - у других [30].

Несмотря на сходство структуры, ЛПС различных видов бактерий отличаются по определённым признакам. Вирулентность условно-патогенных анаэробных бактерий Bacteroides fragilis и Prevotella melaninogenicus зависит от ЛПС, который, в отличие от ЛПС аэробных грамотрицательных бактерий, не содержит гептозы и 2-кето-З-дезоксиктаната, но может содержать атипичный липид А [16]. Кроме отличий в химическом составе ЛПС бактероидов и других грамотрицательных бактерий, есть отличия и в их биологических свойствах [9]. Введенный кролику 1 мг ЛПС В. fragilis не приводит к развитию феномена Шварцмана (псевдоаллергии), тогда как 3 мг ЛПС некоторых видов сальмонелл могут вызывать данный феномен [16]. Есть данные о том, что растворимый ЛПС, не угнетающий гиперчувствительность замедленного типа самостоятельно, вероятно, может наделять иммуносупрессивными свойствами живые бактерии [9]. По-видимому, инвазивность этиологического агента и иммуносупрессивное действие ЛПС связано с генами плазмиды инвазивности. Выявление этого гена у шигелл позволило сделать предположение о наличии такой активности у многих грамотрицательных микроорганизмов [97].

Антигенная стимуляция иммунокомпетентных клеток, осуществлённая при дефиците факторов, обеспечивающих пролиферацию, может привести к запрограммированной гибели активированной иммунокомпетентной клетки, одним из механизмов которой является апоптоз [63, 64, 68, 75, 96, 138]. Апоптоз - это физиологическая, активная, программированная гибель клеток, информация о которой закодирована в клеточном геноме и поддаётся регуляции. Нарушение процесса программированной клеточной гибели в сторону усиления или ослабления играет существенную роль в патогенезе иммунопатологических процессов у человека, в том числе вторичных иммуно-дефицитов, аутоиммунных и онкологических заболеваний, хронических воспалительных процессов, вирусных и других инфекций [53]. Доказано, что в патогенезе иммунопатологических реакций, обусловленных суперантигенами, существенное значение имеет гибель лимфоцитов и фагоцитов в результате апоптоза. Иммуноциты (Т-лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы) экс-прессируют рецепторы Fas (Fas R/ Аро CD95), содержащие «домен смерти», транслирующий апоптозный сигнал на внутриклеточный аппарат апоптоза. Такие клетки могут подавать «сигналы опасности» другим клеткам. В клеточных культурах на апоптоз влияют (усиливают или ослабляют) вирусы, бактерии (и их структурные компоненты), грибы, простейшие [22, 25, 46, 67, 79, 143]. С этими данными связаны новые взгляды в представлениях о молекулярных механизмах инфекционной патологии.

В доступной литературе нами не были найдены данные о комплексном изучении дозозависимого и видоспецифического влияния структурного компонента условно-патогенных грамотрицательных бактерий - ЛПС - на секреторную активность его главных мишеней - моноцитов (продукция ИЛ-1(3, -6, ФНО-а) и Т-хелперов первого типа (продукция ИЛ-2); фагоцитарную активность моноцитов, влиянии ЛПС на апоптоз моноцитов и лимфоцитов.

Снизь работы с научными программами, темами. Диссертация является фрагментом плановой научной работы кафедры патологической физиологии Луганского государственного медицинского университета «Воспаление как результат действия бактерий» (номер государственной регистрации 0198U005713). Автор является исполнителем комплексной темы.

Цель исследовании: Изучить влияние липополисахаридов грамотрицательных бактерий - этиологических агентов хронического пародонтита на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека.

Для достижения цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать in vitro продукцию моноцитами крови человека интерлейки-нов-ip, -6 и фактора некроза опухоли-а под влиянием липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

2. Изучить секрецию интерлейкина-2 Т-хелперами первого типа под влиянием липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

3. Определить фагоцитарную активность моноцитов крови человека под влиянием липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

4. Изучить влияние липополисахаридов грамотрицательных бактерий на апоптоз моноцитов и лимфоцитов крови человека.

Научная новизна полученных результатов. Впервые установлено дозозависимое и видоспецифическое влияние липополисахаридов грамотрицательных бактерий на цитокинпродуцирующую способность моноцитов и лимфоцитов крови человека, на фагоцитарную активность и апоптоз моноцитов, апоптоз Т- и В-лимфоцитов. Показано, что по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов грамотрицательных бактерий происходит прогрессивное увеличение продукции интерлейкинов-1[3, -2, -6, фактора некроза опухоли-а; усиление апоптоза моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, угнетение фагоцитоза моноцитов. Более значительно влияли на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека in vitro липополисахариды факультативно анаэробных бактерий - Escherichia fergusonii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, менее значительно - липополисахариды строго анаэробных бактерий - B.fragilis, P. melaninogenicus, Fusobacterium necroforum.

Практическое значение полученных результатов. Определены теоретические подходы к трактовке патогенеза хронических пародонтитов, вызванных грамотрицательными условно-патогенными бактериями, на основе изучения биологической активности их липополисахаридов в отношении моноцитов и некоторых субпопуляций лимфоцитов крови человека. Полученные данные используются в лекционном курсе и при проведении практических занятий на кафедрах патологической физиологии и микробиологии Луганского государственного медицинского университета, что подтверждено соответствующими актами внедрения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Липополисахариды грамотрицательных условно-патогенных бактерий родов Escherichia, Proteus, Psendomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium in vitro дозозависимо и видоспецифически стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т-хелперов первого типа крови человека, а также фагоцитарную активность моноцитов. Под влиянием липо-полисахаридов повышается продукция моноцитами интерлейкинов-ф и -б, фактора некроза опухоли-а и продукция интерлейкина-2 Т-хелперами первого типа.

2. Липополисахариды грамотрицательных условно-патогенных бактерий in vitro стимулируют апоптоз моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, что проявляется экспрессией на данных клетках маркера готовности клеток к реализации апоптозной программы CD95. Апоптозстимулирующая способность липополисахаридов возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов и является ви-доспецифическим признаком.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях Луганских областных обществ патофизиологов и микробиологов в 2003-2004 гг.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 4 научных работах.

выводы

1. Липополисахариды грамотрицательных условно-патогенных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium являются биологически активными веществами, которые влияют на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека в условиях in vitro.

2. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium в условиях in vitro стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т-хелперов первого типа крови человека. Под влиянием липополисахаридов повышается продукция моноцитами интерлейкинов-ip и -6, фактора некроза опухоли-ос и продукция интерлейкина-2 Т-хелперами первого типа. Цитокинстимулирующая активность липополисахаридов является дозоза-висимой и видоспецифической. Продукция указанных цитокинов прогрессивно возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов. Наибольшей цитокинстиму-лирующей активностью обладают липополисахариды Е. fergusonii, Р. aeruginosa, Н. influenzae, наименьшей - липополисахариды В. fragilis, Р. melaninogenicus, F. necroforum.

3. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium влияют на фагоцитарную активность моноцитов в условиях in vitro. Небольшие дозы липополисахаридов (10 мкг/мл) стимулируют фагоцитоз моноцитов, большие дозы (50-100 мкг/мл) - угнетают его тем сильнее, чем выше действующая доза липополисахаридов. Наибольшим иммуно-супрессивным потенциалом обладают липополисахариды Е. fergusonii, Р. aeruginosa, Н. influenzae, наименьшим - липополисахариды В. fragilis, Р. melaninogenicus, F. necroforum.

4. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium в условиях in vitro стимулируют апоптоз моноцитов, T- и В-лимфоцитов, - что проявляется экспрессией на данных клетках маркера апоптоза CD95. Способность липополисахаридов грамотрицательных бактерий усиливать экспрессию молекул CD95 на поверхности иммунокомпетентных клеток возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов, и более выражена у представителей родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, чем у представителей родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследовательская работа, результаты которой обобщены в данной диссертации, ставила целью изучение влияния липополисахаридов грамотрицательных условно-патогенных бактерий видов Е. fergusonii, P. vulgaris, Р. aeruginosa, Н. influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum -этиологических агентов хронического пародонтита на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека, а также на экспрессию на I их поверхности молекул CD95.

Объектом исследования были 120 культур моноцитов и 110 культур лимфоцитов периферической крови практически здоровых доноров. Популяции моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека получали с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин.

ЛПС грамотрицательных бактерий получали из культур микроорганизмов родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, выделенных от 120 больных хроническими пароI донтитами.

ЛПС грамотрицательных бактерий является их главным фактором па-тогенности - это структурный компонент эндотоксина [57]. Открытие ЛПС и дальнейшее изучение его структурных и биологических свойств показало, что он вызывает ряд иммунных реакций [83]: образование in vivo и in vitro В-сунрессоров, выделение из моноцитов цитостатического фактора белковой природы, обладающего противоопухолевой активностью [127]. Рецепторы для ЛПС есть на мембранах макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и эндоте-лиоцитов.

ЛПС запускает продукцию ИЛ-1, -6, -8, -10, ФНО-а, гамма-интерферона, простагландинов, лейкотриенов, фактора активации тромбоцитов и др. [60, 105, 110, 116]. Доказано, что цитокины, как основные медиаторы, индуцируются грамотрицательными бактериями, и предопределяют большую" воспалительную природу бактериальных инфекций. У всех грамотрицательных бактерий отмечается значительный разброс по способности индуцировать образование цитокинов (в частности, ФНО): от 0,01 нг/мл у некоторых микроорганизмов до больше чем 100 нг/мл - у других.

Определение ИЛ-ip, -2, -6 и ФНО-а проводили в супернатантах моноцитов и лимфоцитов в концентрации 10б/мл с помощью коммерческих наборов. Проведенное нами исследование показало, что ЛПС грамотрицательных бактерий являются биологически активными веществами, способными стимулировать продукцию ИЛ-ip, -6 и ФНО-а моноцитами и ИЛ-2 - Т-хелперами первого типа крови человека. Продукция цитокинов под влиянием ЛПС грамотрицательных бактерий прогрессивно возрастает по мере увеличения действующей дозы бактериальных ЛПС (10, 50 и 100 мкг/мл). Наиболее активными стимуляторами синтеза цитокинов являются ЛПС Е. fergusonii, наименее активными - ЛПС грамотрицательных бактерий (в частности, F. necroforum).

Проведенные нами исследования позволили установить, что ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий видов Е. fergusonii, Р. vulgaris, P. aeruginosa, Н. influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum заметно влияли на фагоцитарную активность моноцитов, при этом выявленное влияние зависело как от действующей концентрации ЛПС, так и от его видовой принадлежности. Низкие дозы ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий усиливали фагоцитарную активность моноцитов, напротив, высокие дозы ЛПС угнетали её. Наиболее глубокие изменения фагоцитоза наблюдали при действии на иммуноциты ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий в действующей концентрации 100 мкг/мл. В видовом отношении наиболее активными из изученных оказались ЛПС Е. fergusonii. Контакт моноцитов с данным ЛПС в дозе 100 мкг/мл вызывал наибольшее угнетение фагоцитарной активности. Наименее активно на фагоцитоз влияли in vitro ЛПС представителей родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium.

Антигенная стимуляция иммунокомпетентных клеток, осуществленная при дефиците факторов, обеспечивающих пролиферацию, может привести к запрограммированной гибели активированной иммунокомпетентной клетки, то есть к феномену, который получил название апоптоз [56, 64, 120]. Имму-ноциты, которые подпали под отрицательную активацию, экспрессируют рецептор Fas и его лиганд Fas, и преждевременно гибнут. Процесс апоптоза реализуется после соединения Fas-антигена с его лигандом Fas. Такие клетки могут подавать «сигналы опасности» другим клеткам. В клеточных культурах апоптоз могут усиливать или ослаблять вирусы, бактерии (в том числе их структурные компоненты и продукты жизнедеятельности), грибы, простейшие. С этим связаны новые взгляды в представлениях о молекулярных механизмах инфекционной патологии [25, 46, 63, 112].

Изучение потенциальной апоптогенной активности ЛПС условно-патогенных бактерий в отношении лимфоцитов и моноцитов проводили морфологическим методом. Экспрессию молекул CD95 на поверхности моноцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов и В-лимфоцитов изучали методом непрямой иммунной флюоресценции. В результате проведенных нами исследований установлено, что ЛПС Е. fergusonii, P. vulgaris, P. aeruginosa, Н. influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum, которые являются наиболее частыми этиологическими агентами хронических пародонтитов у человека, обладали способностью стимулировать экспрессию молекул CD95 на поверхности моноцитов, Т- и В-лимфоцитов периферической крови в условиях in vitro. Количество моноцитов и лимфоцитов с маркерами CD95 увеличивалось по мере возрастания действующей концентрации ЛПС и было наибольшим у факультативно анаэробных условно-патогенных бактерий по сравнению с облигатно анаэробными, относящимися к родам Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium. Среди лимфоцитов наиболее чувствительными к влиянию ЛПС бактерий оказались В-лимфоциты, а среди Т-клеток - Т-хелперы первого типа.

Проведенный нами анализ таблиц сопряжённости позволил подтвердить полученный экспериментальный результат — экспрессия молекул CD95 на поверхности моноцитов и лимфоцитов активировалась с повышением действующей концентрации ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий - этиологических агентов хронических пародонтитов для Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, а для моноцитов и Т-хелперов выраженность экспрессии была дозонезависимым параметром.