Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Структурная реорганизация миокарда при эндогенной и экзогенной гиперхолестеринемии и атеросклеротическом процессе

На правах рукописи

Непомнящих Роман Давидович

СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ МИОКАРДА ПРИ ЭНДОГЕННОЙ И ЭКЗОГЕННОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ

14.03.02 - патологическая анатомия

А В Т О Р Е Ф Е PAT диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт региональной патологии и па-томорфологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Бакарев Максим Александрович

Кливер Евгений Эдуардович

ведущий научный сотрудник лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии ФГБУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения имени академика ЕЛ [.Мешалкина» МЗ РФ

Семенов Дмитрий Евгеньевич

ведущий научный сотрудник лаборатории ультраструктуриых основ патологии ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН

Ведущая организация:

ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «_»_2013 г. в_час.

па заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, тел. 334-84-38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «_» _ 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций Молодых Ольга Павловна Д 001.037.01 доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема атеросклероза, несмотря на многочисленные клинические и экспериментальные исследования (Аничков H.H., Цинзерлинг В.Д., 1953; Вихерт А.М, 1974; Нагорнев В.А., 1996; Жданов B.C. и др., 2002; Карпов P.C., 2003; Климов А.Н.,2003; Аронов Д.М., Лупанов В.П., 2009; Липовецкий Б.М., 2012; Ross R., Glomset J.A., 1976; Thompson G., 1994; Stoll G., Bendszus M., 2006; Couzin J., 2008; Sadeghi M.M. et al.; Frostegard J., 2013), в настоящее время остается еще нерешенной в отношении как этиологии, так и патогенеза. В морфогенезе ишемической болезни сердца и хронической сердечно-сосудистой недостаточности ведущее место придают стенозирующему атеросклерозу коронарных артерий и обусловленным этим процессом нарушениям органной гемодинамики (Мясников А.Л., 1965; Автандилов Г.Г., 1970; Вихерт A.M., 1975; Саркисов Д.С., 1977; ГанджаИ.М., Фуркало Н.К., 1978; Анестиади В.Х., Нагорнев В.А., 1982; Сусеков A.B. и др., 2009; Черпаченко Н.М. и др., 2011 ). Однако непосредственная причина недостаточности миокарда - изменение структуры и метаболизма кардиомиоцитов (Семенова Л.А., Целлариус Ю.Г., 1978; Авцын А.П., Шахламов В.А., 1979; Пауков B.C., Фролов В.А., 1982; Кухарчук В.В., Тарарак Э.М., 2010; Егорова И.Ф. и др., 2012; Цыплакова В.Г., 2012; Osipov R.M. el al., 2009; Pereira T.M., et al., 2010; Goldberg I.J. et al., 2012; Drevinge C. et al., 2013).

При изучении пато- и морфогенеза атеросклероза основное внимание уделяется исследованию стенки крупных сосудов. Влияние атеросклероти-ческого процесса на сократительный миокард, его соединительнотканную строму и микроциркуляторное русло недостаточно изучено. В возникновении патологических изменений в миокарде играют роль не только циркуляторные изменения, связанные с развитием атеросклеротических бляшек в коронарных артериях, но и метаболические повреждения мышечных клеток сердца и их внутриклеточных структур. Однако исследования, проведенные на ультраструктурном уровне, единичны (Мартынюк RA. и др., 1976; Давид X. и др., 1977; Мишина C.B., 1984; Гудкова А.Я., 2012; Madamanchi N.R., Runge M.S., 2007; Xu Y. et al., 2013).

Современные морфологические наблюдения служат доказательством прямого повреждения миокарда животных, содержащихся на высокой холестериновой диете (Нагорнев В.А., Бобрышев Ю.В., 1984; Карпов PC., Дудко В.А.,1998; Чазов Е.И. и др., 2007; Рагипо Ю.И. и др., 2011; Липовецкий Б.М.. 2012; Fisher V.W., 1979; Clandinin М.Т., Yamashiro S., 1982; Farnworth E.R. et al., 1983), однако специальные морфологические исследования миокарда при экспериментальном атеросклерозе единичны (Мартынюк РА. и др., 1976; Мишина C.B., 1984) или посвящены отдельным структурам мышцы сердца (Osipov R.M. et al., 2009; Drevinge С. et al., 2013).

Эндогенная гиперхолестеринемия - один из важных факторов риска развития атеросклероза. К возникновению эндогенной гиперхолестери-

нем ии и липидозу аорты может приводить полное голодание, которое как сильный раздражитель нарушает липидный и углеводный обмен путем мобилизации липидов из депо, что сопровождется повышением уровня холестерина в крови (Соколова Р.И., Метелица В.И., 1971 ; Хомуло П.С., 1974; Мишина C.B., 1984; Kanamori H. et al., 2009).

Большая роль липидов в метаболизме сердца (Покровский А. А., 1974; Dontas L.А., 2011) привлекает внимание к сущности и значению жировой дистрофии миокарда (Чернышева Г.В. и др., 1969; Данилова К.М., 1972; Goldberg l.J. et al., 2012). Не ясен вопрос, влияет ли гиперхолестеринемия сама по себе на структурные элементы миокарда и каковы морфологические проявления этого воздействия.

Экспериментальный атеросклероз, воспроизведенный введением животным кристаллического холестерина, - широко используемая в морфологических исследованиях модель (Тарарак Э.М., Ариэль В.М.. 1973; Зубжицкий Ю.Н. и др., 1974; Боцман Н.Е. и др., 1975; Климов А.Н., 1977; Нагорнев В.А., Бобрышев Ю.В., 1984; Толмачева Н.В., Сусликов B.J1., 2007; Rodriguez-Porcel M. et al., 2000; Ferdinandy P., 2003; Scarabelli T.M., Gotllieb R.A., 2004; McCommis K.S. et al., 2011). Однако в таких работах на первом плане стоит описание изменений в сосудистой стенке; сравнительное морфологическое изучение атеросклеротических изменений в сосудах и сердечной мышце кроликов методами морфометрии, световой и электронной микроскопии не проведено.

При кормлении кроликов одним холестерином не удается добиться изменений в миокарде, близких к изменениям, встречающимся у человека (Мясников A.JI. и др., 1963; Климов А.Н., 1977; Мишина C.B., 1984; Couzin J., 2008). Поэтому оправдана разработка новых экспериментальных моделей атеросклероза, при которых развитие атеросклеротических изменений было бы связано не только с экзогенными (введение холестерина), но и с эндогенными липидами. При этом возникала необходимость проведения сравнительного анализа изменений кардиомиоцитов, капилляров, стромы миокарда, коронарных артерий и аорты в динамике экспериментального атеросклероза.

В своих исследованиях мы уделили особое внимание ультраструюур-ному состоянию кардиомицитов и капилляров, учитывая возможность использования экспериментального материала для выяснения патогенеза атеросклероза. Мы провели системный анализ изменений аорты, артериального русла и миокарда при экспериментальном атеросклерозе по данным вскрытий, биохимического исследования сывротки крови, световой и электронной микроскопии.

Проследить ранние изменения миокарда в динамике этого заболевания в клинике сложно. Только в эксперименте на клеточном и ультраструктурном уровнях можно вскрыть тончайшие нарушения механизмов мышечной деятельности сердца.

Изложенное свидетельствует об актуальности изучения морфогенеза атеросклеротического процесса с помощью современных методов струк-

тарного анализа, позволяющих выявлять ранние повреждения кардиоми-оцитов и паренхиматозно-стромальные взаимоотношения.

В качестве основных экспериментальных животных использованы взрослые кролики, так как у них и у человека есть общие факторы видовой предрасположенности к развитию атеросклероза, по сравнению с собаками и крысами, устойчивыми к атеросклеротическому процессу.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить с помощью современного морфофункционального анализа общие закономерности структурных реакций кардиомиоцитов и капилляров при эндогенно и экзогенно вызванной гиперхолестеринемии у крыс и развитии атероскле-ротического процесса в аорте и коронарных артериях у кроликов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологические изменения в аорте, коронарных артериях и миокарде крыс при моделировании эндогенной гиперхолестеринемии.

2. Изучить морфологические изменения в аорте, коронарных артериях и миокарде кроликов в условиях эндогенной гиперхолестеринемии.

3. Изучить характер структурных изменений аорты, коронарных артерий и миокарда у кроликов в динамике экспериментального атеросклероза при введении экзогенного холестерина.

4. Изучить морфологические изменения в аорте, коронарных артериях и миокарде кроликов при моделировании атеросклеротического процесса путем сочетанной экзо- и эндогенной гиперхолестеринемии.

Научная новизна. Впервые с помощью комплексного патоморфологи-ческого анализа (световая, электронная микроскопия, морфометрия и стере-ология) изучен миокард кроликов при моделировании атеросклеротического процесса и миокард крыс при моделировании гиперхолестеринемии для выяснения общих закономерностей внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов и ремоделирования миокарда. Установлено, что к общим закономерностям структурной реорганизации миокарда при разных способах моделирования гиперхолестеринемии у животных разных видов относятся усиление гетерогенности кардиомиоцитов, нарастание в них литических и деструктивных процессов, сопровождающихся усилением аутофагоцитоза и апоптоза кардиомиоцитов, не связанных непосредственно с атеросклеро-тическими повреждениями аорты и коронарных артерий. Эти изменения обусловливают развитие диффузного мелкоочагового кардиосклероза еще до возникновения препятствий кровотоку в коронарных артериях.

Впервые показано, что эндогенная гиперхолестеринемия у крыс и кроликов, вызванная путем полного голодания, не сопровождается развитием атерогенных изменений аорты и коронарных артерий, но обусловливает развитие жировой дистрофии кардиомиоцитов и умеренного диффузного кардиосклероза. Впервые выделены два основных варианта внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов атерогенного генеза: накопление большого количества липидных включений и литические и деструктор! гые изменения органелл с усилением аутофагических процессов.

Впервые при моделировании атеросклероза аорты и коронарных артерий у кроликов при введении экзогенного холестерина и сочетании эндогенной и экзогенной гиперхолестеринемии показано, что литические и деструктивные изменения кардиомиоцитов начинают манифестировать до появления выраженных атеросклеротических изменений в аорте и коронарных артериях. Установлено, что усиление атеросклеротических поражений коронарных артерий способствует развитию диффузного мелкоочагового кардиосклероза.

Впервые описана динамика ультраструюурных изменений кардиомиоцитов и капилляров у крыс и кроликов при моделировании гиперхолестеринемии и атеросклероза, а также соотношение процессов повреждения и регенерации миокарда. Показано, что повреждения кардиомиоцитов обусловлены нарушением в них белково-синтетических процессов, что приводит к ингибированию процессов внутриклеточной регенерации, атрофии и апоптозу кардиомиоцитов с развитием диффузного мелкоочагового кардиосклероза.

Практическая значимость. Полученные в работе новые данные об общих закономерностях изменений кардиомиоцитов и капилляров при моделировании атеросклероза у кроликов и при моделировании гиперхолестеринемии у крыс путем эндо - и экзогенной гиперхолестеринемии имеет большое значение для понимания морфогенеза хронической сердечной недостаточности атерогенного генеза. Полученные данные о соотношениях паренхимы и стромы миокарда и особенностях репарации сердечных миоцитов при экспериментальном атеросклерозе и гиперхолестеринемии способствуют разработке новых подходов к профилактике и лечению атеросклероза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Моделирование эндогенной гиперхолестеринемии у крыс и кроликов путем полного голодания не вызывает атерогенных изменений аорты и коронарных артерий, но обусловливает развитие жировой дистрофии кардиомиоцитов и умеренного диффузного кардиосклероза. Выделены два основных варианта внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов в таких условиях: накопление большого количества липидных включений и литические и деструктивные изменения органелл с усилением аутофа-гических процессов.

2. При моделировании атеросклероза аорты и коронарных артерий у кроликов литические и деструктивные изменения кардиомиоцитов начинают манифестировать до появления выраженных атеросклеротических изменений в аорте и коронарных артериях. Усиление атеросклеротических поражений коронарных артерий способствует развитию диффузного мелкоочагового кардиосклероза.

3. При развитии гиперхолестеринемии и в динамике атеросклеротиче-ского процесса наряду со значительными патологическими изменениями в кардиомиоцитах сохраняются процессы внутриклеточной регенерации,

что способствует не только восстановлению нормальной ультраструктуры кардиомиоцитов, но и обеспечивает их гипертрофический рост.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 1-й Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), научно-образовательном форуме «Кардиология - 2012» (Москва,

2012), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск2012); 6-й Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск,

2013), IV конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология. Инновационные подходы в физиологии и медицине» (Москва, 2013), межлабораторной научной конференции в ФГБУ Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2013)»

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 - в рецензируемых журналах по списку ВАК и в системе цитирования (библиографической базе) Web of Science

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы (234 источника, из них 104 отечественных и 130 иностранных авторов). Диссертация изложена на 140 страницах текста компьютерного набора, содержит 32 рисунка.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основной принцип данной работы - комплексное морфофункциональ-ное исследование миокарда в условиях моделирования гиперхолестери-немии и атеросклеротического процесса. Методы исследования включали гистологические окраски и гистохимические реакции, электронную микроскопию, морфометрию на тканевом уровне в сочетании с биохимическим исследованием сыворотки крови. Эксперименты выполнены с соблюдением всех правил и рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах.

Для решения поставленных задач мы обратились к классической модели атеросклероза, предложенной H.H. Аничковым, с некоторыми модификациями. Создание у кроликов экзогенной гиперхолестеринемии приводит к структурным изменениям артерий, близким к атеросклерозу у человека. В других экспериментах за основу была взята модель атеросклеротического процесса, когда в результате сочетания эндогенной и экзогенной гиперхолестеринемии развивались изменения в сосудах, подобные атсросклеротическим у человека.

Моделирование эндогенной гиперхолестеринемии у кроликов.

Эндогенная гиперхолестеринемия - один из важных факторов риска развития атеросклероза. К возникновению эндогенной гиперхолестери-немии и липидозу аорты может приводить полное голодание, которое как сильный раздражитель нарушает липидный и углеводный обмен путем мобилизации липидов из депо, что сопровождается повышением уровня холестерина в крови (Соколова Р.И., Метелица В.И., 1971).

Опыты поставлены на 30 кроликах с исходной массой от 2,5 до 3,5 кг, которых переводили на полное голодание без ограничения воды. После 10-суточного голодания 1 5 животных были декапитированы, а 15 других переведены на обычное полноценное питание в течение 10 сут, после чего декапитированы. Контролем служили 8 кроликов, содержавшихся на обычном рационе.

Моделирование эндогенной гиперхолсстеринемии у крыс. Опыты проведены на 28 крысах-самках линии Вистар, массой 250 - 300 г. Животные были разделены на 4 группы: 1-я и 2-я группы (по 5 крыс в каждой) были полностью лишены пищи в течение 5 сут; 3-я и 4-я группы (5 и 9 животных, соответственно) - в течение 10 сут. Спустя указанные сроки крыс 1-й и 3-й групп взвешивали и декапитировали, а животных 2-й и 4-й групп переводили на полноценную диету, регулярно взвешивали и при достижении исходной массы декапитировали. Воду животные всех групп получали без ограничения. Контролем служили 4 крысы, которые получали полноценную и достаточную по количеству пищу.

Моделирование атеросклероза у кроликов введением экзогенного холестерина. Атеросклероз у кроликов вызывали кормлением кристаллическим холестерином, который животные получали с овощами утром натощак наряду со стандартным кормом. В эксперименте было 42 самца массой 2 - 2,5 кг. В зависимости от получаемой дозы препарата все животные были разбиты на три группы: 1-я - 29 кроликов, получавших холестерин из расчета 0,25 г/кг массы в течение 4 мес; 2-я - 8 животных, получавших холестерин в дозе 1 г/кг массы (5 кроликов были в опыте 17 сут, 3 кролика - 36 сут); 3-я - 5 животных, получавших холестерин в дозе 2 г/кг массы (2 кроликов наблюдали 3 мес, 3 - в течение 4,5 мес). Контролем служили 20 кроликов, которые находились в одинаковых с опытными животными условиях вивария на стандартном корме без содержания в нем экзогенного холестерина. В конце срока наблюдения животных выводили из опыта декапитацией.

Моделирование атеросклероза аорты и коронарных артерий у кроликов сочетанием эндогенной и экзогенной гиперхолсстеринемии. При кормлении кроликов одним холестерином не удается добиться изменений в миокарде, близких к изменениям, встречающимся у человека. Использован метод, разработанный П.С.Хомуло (1973), который заключается в четырехкратном чередовании полного голодания с водой в течение 10 сут с полноценной диетой, даваемой до восстановления исходного веса

животных. В отличие от этой схемы кроликам в период полноценного питания каждый раз последние 10 дней в пищу добавляли кристаллический холестерин из расчета 0,2 г/кг массы.

Опыты поставлены на 74 беспородных кроликах обоего пола с исходной массой от 2,5 до 4 кг. Перед началом эксперимента животных выдерживали в стандартных условиях вивария в течение 2 нед. В опыт отбирали только здоровых животных.

Исследование проводили в динамике эксперимента от 10 до 120 сут. Из опыта животных выводили декапитацией через 10 сут (полное голодание с водой) - 8 животных; через 20 сут (10-суточный обычный рацион после 10-суточного полного голодания с водой) - 7 животных; через 30 сут (10-суточное полное голодание с водой, 10-суточный обычный рацион и 10-суточное кормление холестерином с овощами) - 11 животных; через 60 сут (2 цикла 10-суточного полного голодания с водой, 10-суточного обычного рациона и 10-суточного кормления холестерином с овощами) - 9 животных; через 90 сут (3 цикла 10-суточного полного голодания с водой, 10-суточного обычного рациона и 10-суточного кормления холестерином с овощами) - 9 животных; через 120 сут (4 цикла 10-суточного полного голодания с водой, 10-суточного обычного рациона и 10-суточного кормления холестерином с овощами) - 18 животных. Контролем служили 37 интактных здоровых кроликов (того же возраста и массы), которых декапитировали в те же сроки.

В течение всего эксперимента животных неоднократно взвешивали. Вначале определяли исходную массу перед опытом, затем взвешивание проходило регулярно каждые 10 дней. Соответственно массе меняли дозу холестерина. Последнее взвешивание производили в конце эксперимента.

Методы патоморфологического исследования сердца. У декапи-тированного животного вскрывали брюшную и грудную полости, осматривали внутренние органы, измеряли количество жидкости в полостях. Затем извлекали еще сокращающееся сердце и для быстрой остановки (во избежание фибрилляции) помещали в мелко растолченный лед. Сердце после полной остановки быстро осматривали, определяли локализацию и размеры измененных участков, взвешивали, вскрывали полости, отсекали переднюю папиллярную мышцу левого желудочка для электронно-микроскопического исследования. Затем вырезали по 2 - 3 фрагмента из стенок левого и правого желудочка и межжелудочковой перегородки для парафиновой проводки.

Аорту отделяли от сердца (до его извлечения) как молено ближе к основанию, осторожно отпрепаровывали и отсекали у места деления ее на общие подвздошные артерии. Извлеченную аорту вскрывали, осматривали, вырезали кусочки для электронно-микроскопического исследования. Затем проводили планиметрическую оценку атеросклеротических поражений и вырезали 5-6 образцов для парафиновой проводки.

Образцы миокарда фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином с постановкой реакции Перлса, по методу ван Гизона. Исследование проводили в универсальном микроскопе «Leica DM 4000В». Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры «Leica DFC 320» и компьютерной программы «Leica QWin»

Для ультраструкгурного анализа образцы фиксировали в 4% пара-формальдегиде, постфиксировали в 1% четырехокси осмия, после дегидратации заливали смесь эпона и аралдита. Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультратомах LKB III и Leica ULTRACUT EM UC7 (Leica, Германия). Полутонкие срезы окрашивали азуром II, ультратонкие - контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Ультратонкие срезы анализировали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Veleta и программного обеспечения ¡ТЕМ (Olympus, Япония, Германия).

Оценку морфофункционального состояния миокарда производили с помощью метода поляризационной микроскопии (Целлариус Ю.Г. и др., 1979) с использованием встроенного поляризатора. При поляризационной микроскопии исследовали окрашенные и неокрашенные срезы.

Морфометрический и стереологический анализ миокарда и сосудов. Морфометрическое исследование миокарда и интрамуральных коронарных артерий проводили с использованием методов (Струков А.И., Кактурский JI.B., 1979; Автандилов Г.Г., 1980; Непомнящих JT.M. и др., 1984). Диаметры кардиомиоцитов определяли с помощью компьютерной программы «Leica QWin», для каждой группы животных проанализированы не менее 100 мышечных клеток сердца при увеличении в 1000 раз.

С помощью стереологического анализа оценивали объемные плотности кардиомиоцитов, капилляров, соединительной ткани (суммарно клеток, волокон и основного вещества). На полутонких срезах при увеличении в 400 раз измеряли площадь сечения анализируемых объектов и относили се к общей площади среза. Объем выборки для каждого животного составил по 20 неперекрывающихся полей зрения. На основании первичных стереологических параметров (объемных плотностей основных струкгур) рассчитывали вторичные стереологические параметры (объемные и поверхностно-объемные отношения струкгур).

Для проведения ультраструктурного стереологического анализа проводили фотосъемку репрезентативных фрагментов кардиомиоцитов при первичном увеличении в 5 000 раз, затем с помощью программы ÍTEM при конечном увеличении в 20 000 раз оценивали объемную плотность митохондрий, миофибрилл, агранулярной саркоплазматическон сети (АСС), Т-системы, саркоплазматического матрикса. Поверхностную плотность определяли для митохондрий, миофибрилл, Т-системы, АСС. На основании первичных стереологических параметров рассчитывали

вторичные - объемные и поверхностно-объемные отношения основных ультраструктур. Объем выборки в каждой экспериментальной группе составлял не менее 30 электронограмм.

Методы биохимического исследования сыворотки крови. В сыворотке крови, полученной из шейной вены сразу после декапитации, определяли показатели липидного спектра плазмы крови - ЛПВП, ЛПНП и триглицериды энзиматическим способом с использованием наборов «Вюсоп» (Германия) на биохимическом анализаторе «ЬаЬзуягет» (Финляндия). Общий холестерин (ОХ) определяли сложением ЛПВП и ЛПНП; индекс атерогенности рассчитывали как отношение ЛПВП/ЛГШП.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программы ЗГа^юа 6; для оценки значимости различий при нормальном распределении использовали 1:-критерий Стьюдента. Различив считали статистически достоверными, если достигнутый уровень значимости (р) не превышал принятого критического уровня значимости, равного 0,05 (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Патоморфологическое исследование миокарда кроликов при моделировании эндогенной гиперхолестсринемии. По данным биохимического анализа, после 10-суточного полного голодания в крови животных происходило повышение содержания общего холестерина (6,63±0,80 мМ/л; в контроле - 3,15±0,27 мМ/л) и липопротеидов (413,2±79,8 мг/дл; в контроле-207,0±7,8 мг/дл).

При вскрытии животных, перенесших полное 10-суточное голодание без ограничения воды, отмечено некоторое истончение жировой ткани в перикарде, большом сальнике и в жировой капсуле почек. Микроскопически в миокарде этих животных обнаружены признаки нарушения кровообращения различной степени выраженности: капиллярная гиперемия, очаговое плазматическое пропитывание стенок интрамуральных артерий, точечные кровоизлияния. Общее строение миокарда не было нарушено, однако в поляризованном свете в кардиомиоцитах отмечено усиление анизотропии дисков А с укорочением изотропных дисков. На полутонких срезах в кардиомиоцитах выявлялись осмифильные включения.

Клеточные элементы стромы обнаруживали диффузную пролифера-тивную реакцию за счет элементов фибробластического и макрофагаль-ного ряда с наибольшей выраженностью в субэпикардиальных слоях миокарда и по ходу расширенных сосудов капиллярного типа. У кроликов, перенесших 10-дневное голодание, в миокарде наблюдалось умеренное диффузное фиброзирование.

При электронно-микроскопическом исследовании миокарда прежде всего следует отметить присутствие большого количества липидных капель, располагавшихся в большинстве мышечных клеток по всей ци-

топлазме - между миофибриллами, под сарколеммой, в околоядерном пространстве; жировые капли нередко обнаруживались в многочисленных узких и глубоких инвагинациях, образованных ядерной мембраной. Ли-пидные капли были полиморфными и содержали различное количество осмиофильного вещества. Наряду с кардиомиоцитами, содержавшими большое количество липидных капель, изредка обнаруживались клетки с единичными каплями жира.

Накопление большого количества липидных капель в кардиомиоцитах голодавших животных в большинстве случаев не сопровождалось значительными изменениями строения основных ультраструктурных компонентов. В большинстве кардиомиоцитов органеллы располагались компактно, в отдельных кардиомиоцах - в основном около ядра и под сарколеммой наблюдались лизис саркоплазмы и деструкция ультраструктур. В таких зонах иногда были видны немногочисленные мелкие рибосомальные гранулы и связанные с ними вновь образованные миофиламенты.

Среди митохондрий, сохранивших нормальное строение, изредка встречались органеллы с просветленным матриксом, с частично фраг-ментированными и лизированнымикристами. Миофибриллярные пучки в большинстве кардиомиоцитов имели нормальное строение; в отдельных клетках отмечалось их истончение и очаговый лизис миофиламентов. Агранулярная саркоплазматическая сеть и Т-система были умеренно расширенными. В некоторых кардиомиоцитах отмечалось усиление аутофагических процессов с образованием больших аутофагосом и конденсацией саркоплазмы.

Таким образом, моделирование эндогенной гиперхолестеринемии у кроликов путем 10-суточного голодания не вызывало морфологических изменений аоргы и коронарных сосудов, но отмечались различной степени выраженности нарушения кровообращения. В то же время развивалась жировая дистрофия миокарда, сопровождавшаяся умеренным диффузным фиброзированием стромы. По характеру ультраструктурных изменений в миокарде можно было выделить кардиомиоциты с преимущественно нормальным строением и различным количеством варьирующих по размерам липидных капель (преобладающая популяция клеток) и кардиомиоциты со значительными деструктивными и логическими изменениями околоядерных и подсарколеммальных пространств и выраженными в разной степени литическими изменениями миофибриллярных пучков, в которых отмечалось накопление большого количества вторичных лизосом и гигантских аутофагосом (с формированием миелиноподобных структур).

Патоморфологическое исследование миокарда крыс при моделировании эндогенной гиперхолестеринемии. Поданным биохимического анализа, через 5 сут полного голодания уровень общего холестерина в сыворотке крови крыс возрастал умеренно до 2,58±0,08 мМ/л (в контроле - 2,02±0Л4 мМ/л), через 10 сут полного голодания этот показатель увеличился до 2,96±0,20, р<0,05).

Таблица 1. Масса сердца и диаметр кардиомиоцитов крыс, подвергшихся полному голоданию (М±ш)

Показатель Контроль Длительность голодания, сут

5 5 (+ 6 сут восстановления массы тела) 10 10 (+ 14 сут восстановления массы тела)

Абсолютная масса сердца, мг 617,8±22,9 599,0±24,1 1234,0±137,7* 453,5±9,4" 1213,3*153,6*

Относительная масса сердца, мг/г 2,63±0,20 3,18±0,15 4,00±0,48* 3,28±0,05* 3,87±0,08'

Диаметр кардиомиоцитов, мкм 14,14±0,31 10,74±0,20* 13,55±0,49 10,45±0,43* 15,64±0,33

Примечание. * - р < 0,05, ** - р < 0,01 при сравнении с контролем.

Потеря массы тела в процессе голодания составила в 1 и 2-й группах - 17,3%, в 3 и 4-й - 32,5%. В условиях неограниченного доступа к корму после голодания скорость прироста массы тела была не всегда пропорциональна размерам потери массы при голодании. Крысы 2-й группы набрали исходную массу тела за 6 сут, в крысы 4-й группы - за 14 сут.

Абсолютная масса сердца через 5 сут голодания снизилась незначительно, через 10 сут - на 27% (р<0,01) (табл. 1). У крыс с восстановлением массы тела до исходной абсолютная масса сердца, наоборот, заметно возрастала - на 100 и 96% соответственно через 5 и 10 сут голодания. Относительная масса сердца была увеличена у крыс всех экспериментальных групп. Диаметр кардиомиоцитов был уменьшен только в группах без дальнейшего восстановления массы тела (соответственно на 24 и 26% через 5 и 10 сут эксперимента, р<0,05).

При моделировании эндогенной гиперхолестеринемии у всех подопытных животных (голодавших по 5 и 10 сут) макроскопических изменений в аорте не обнаружено. При микроскопическом исследовании строение аорты у крыс с гиперхолестеринемией также не отличалось от нормы: внутренняя поверхность была выстлана плоскими эндотелиальными клетками, эластические мембраны среднего слоя аорты имели равномерную толщину, были извитыми и непрерывными, расположение, размеры и тинкториальные свойства гладкомышечных волокон были такими же, как у контрольных животных. Липидиые включения в аорте подопытных и интакггных крыс не выявлялись. Коронарные сосуды сердца существенно не изменялись, отмечался умеренный спазм и вторичный парез большинства интрамуральных артерий.

В кардиомиоцитах крыс, подвергавшихся голоданию в течение 5 сут, обнаружены выраженные ультраструктурные изменения. Наряду с не-

измененными митохондриями появлялись митохондрии неправильной формы, с просветленным и электронно-плотным матриксом, дезорганизованными кристами. Наблюдались очаги лизиса миофибрилл; трубочки Т-системы и везикулы аграпулярной саркоплазматической сети часто были расширены. В таких кардиомиоцитах возрастало количество вторичных лизосом, которые накапливались не только в околоядерной зоне, но и в миофибриллярной вокруг митохондрий, наблюдалось формирование миелиноподобных структур.

С увеличением срока голодания до 10 сут в субэпикардиальном и су-бэндокардиальном слоях левого желудочка и межжелудочковой перегородке появлялись кардиомиоциты с «опустошенными» околоядерными зонами и разреженным саркоплазматическим матриксом. При поляризационной микроскопии миофибриллы в таких клетках выявлялись в виде узких пучков под сарколеммой и отсутствовали в расширенной околоядерной зоне. Диаметр кардиомиоцитов уменьшался по сравнению с контролем на 26% (см. табл. 1), что свидетельствовало об абсолютном уменьшении количества миофибриллярных пучков в клетках с «опустошенным» околоядерным пространством.

По данным элекгронно-микроскопического исследования, околоядерная зона в литически измененных кардиомиоцитах была лишена митохондрий и заполнена мелкозернистым саркоплазматическим матриксом, миофибриллы в таких клетках часто были представлены 1-3 рядами, прилежащими к сарколемме. Миофибриллярные пучки при этом были умеренно лизированы, их размеры значительно варьировали. Гранулярная сеть п виде коротких трубочек встречалась изредка в непосредственной близости к миофибриллам или между ними. Агранулярная саркоплазматическая сеть была представлена небольшими везикулами и заметно редуцирована.

В кардиомиоцитах, сохранявших преимущественно нормальное строение, в околоядерной зоне располагались многочисленные, как правило, мелкие митохондрии. Миофибриллярные пучки имели преимущественно нормальное строение, изредка отмечался их очаговый лизис, в основном, вблизи вставочных дисков. Между миофибриллярными пучками располагались митохондрии (с умеренными литическими изменениями матрикса) и липидные капли, количество которых варьировало от клетки к клетке. Во многих кардиомиоцитах в околоядерных зонах присутствовали вторичные лизосомы с осмиофильными включениями, а вблизи вставочных дисков -аутофагосомы. Усиление процессов аутофагоцитоза - характерная черта внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов в условиях полного длительного голодания.

В кардиомиоцитах крыс, переведенных на полноценную диету после голодания, количество липидных капель и гранул гликогена возвращалось к норме. В остальном ультраструкгурная организация кардиомиоцитов у этих животных отличалась от нормальной, в них возрастало количество митохондрий с литическими изменениями матрикса и деструкцией крист;

Таблица 2. Ультраструктурный стереологический анализ кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс, подвергшихся полному голоданию (М±ш)

Показатель Контроль Длительность голодания, сут

5 5 (н 6 сут восстановления массы тела) 10 10 (1 14 сут восстановления массы тела)

Объемная плотность, %:

миофибрилл 49,79±0,83 57,22^2,56 64,54±0,33** 62,32*0,85" 63,08*0,86"

митохондрий 31,79±0,47 23,62±1,41* 23,44±1,07* 24,17*0,29" 23,27*0,22"

Т-системы 2,18±0, ! 7 2,11 ±,071 1,46±0,12" 2,04±0,02 1,08*0,03*

АСС 1,15±0,13 0,98±0,09 1,09±0.06 1,10±0,09 0,83±0,19

саркоплаз- матического матрикса 15,09±0,53 16,07±1,60 9,47±0,85* 10,37±],00* 11,74*0,67*

Поверхностная плотность, м2/см3:

миофибрилл 1,304±0,099 1,670±0,259 0,605±0,035* 0,772*0,040* 0,614±0,112*

митохондрий 1,557±0,006 1,408*0,116 0,887*0,008" 0,862*0,065" 1,015*0.059"

Т-системы 0,398±0,013 0,443±0,032 0,220±0,018* 0,387±0,021 0,189*0,014"

АСС 0,250±0,013 0,292±0,018 0,277±0,021 0,273±0,043 0,234*0,014

Объемное отношение, число:

митохондрий к миофи-бриллам 0,638±0,020 0,413*0,040 0,363*0,021' 0,383*0,016" 0,370*0,006"

Т-системы к миофи-бриллам 0,044±0,004 0,0374-0,004 0,023±0,002" 0,033±0,001 0,017*0,001"

АСС к мио-фибриллам 0.023±0,007 0,017±0,002 0,017±0,003 0,018±0,002 0,013*0,003*

Примечание. АСС - агранулярная саркоплазматическая сеть. * - р < 0,05, - р < 0,01 при сравнении с контролем.

чаще, чем в контроле, встречались цистерны пластинчатого комплекса Гольджи и вторичные лизосомы. В субсарколеммальной зоне, перикапил-лярном пространстве и в просвете капилляров появлялись миелинопо-добные структуры и вакуоли, заполненные хлопьевидным содержимым.

По данным стереологического анализа, полное голодание крыс вызывало значительную внутриклеточную реорганизацию кардиомиоцитов (табл. 2). Прежде всего, следует отметить более выраженное уменьшение объемной плотности митохондрий (на 27 и 24% соответственно через 5 и 10 сут голодания), что было обусловлено в основном деструкцией этих органелл в околоядерпой зоне. После восстановления массы тела этот показатель оставался заметно уменьшенным (на 27%), что свидетельствовало

о значительном нарушении биосинтетических процессов в кардиомио-цитах и отсутствии их полноценной регенерации в восстановительный период. Поверхностная плотность митохондрий была уменьшена у крыс 3-х групп: через 5 сут голодания и последующего восстановления массы тела, через 10 сут голодания и через 10 сут голодания и восстановления массы тела (соответственно на 43, 45 и 35%, р<0,01), что косвенно свидетельствовало об увеличении размеров этих органелл.

Для внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов в результате голодания было характерно увеличение объемной плотности миофибрил-лярных пучков (на 15 - 25%), в большей степени это проявлялось у крыс в восстановительный период (на 27 - 30%). Подобный дисбаланс в динамике изменений двух основных внутриклеточных компартментов кардиомиоцитов приводил к уменьшению объемного отношения митохондрий к миофибриллам (на 35 - 43%). Разнонаправленные изменения объемных плотностей миофибрилл, Т-системы и агранулярной саркоплазматической сети также обусловили уменьшение их объемных отношений (см. табл. 2), особенно это снижение было выражено у крыс с восстановлением массы тела после голодания.

Полученные количественные данные о внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов в период полного голодания и последующего восстановления массы тела свидетельствуют о глубоких структурных изменениях мышечных клеток сердца в результате метаболических нарушений, которые не нормализуются в период полноценного питания. Дисбаланс в количественных соотношениях основных ультраструктур кардиомиоцитов, возникающий при голодании и не устраняемый при возобновлении полноценного питания может служить структурной основой для развития в дальнейшем сердечной недостаточности, особенно при повышении функциональной нагрузки.

Таким образом, моделирование эндогенной гиперхолестеринемии у крыс путем 5- и 10-суточного полного голодания не вызывало морфологических изменений аорты и коронарных сосудов, но обусловливало развитие литических и деструктивных изменений кардиомиоцитов, для которых характерным было «опустошение» околоядерной зоны, очаговое истончение миофибриллярных пучков, усиление аутофагоцитоза. Увеличение сроков полного голодания способствовало усилению литических процессов в кардиомиоцитах. Литические и деструктивные изменения кардиомиоцитов сопровождались значительной внутриклеточной реорганизацией клеток, для которой характерно было разнонаправленное изменение объемных плотностей основных органелл: увеличение объемной плотности миофибрилл и уменьшение этого показателя для митохондрий, Т-системы и агранулярной саркоплазматической сети.

Патоморфологическое исследование миокарда кроликов при моделировании атеросклероза введением экзогенного холестерина. Через 4 мес после скармливания животным с овощами экзогенного

холестерина (1-я группа) развивался умеренный атеросклероз аорты, в меньшей степени - атеросклероз коронарных артерий, отмечено утолщение их стенок и изменение площади поперечного сечения. В стенке левого желудочка наблюдались очаговые изменения кардиомиоцитов дистрофического и некробиотического характера с развитием диффузного кардиосклероза.

При электронно-микроскопическом исследовании кардиомиоцитов выявлены литические изменения саркоплазмы и отсутствие значимых изменений структуры митохондрий. Миофибриллы часто были контрактурно изменены и частично лизированы. Везикулы агранулярной саркоплазма-тической сети были расширены. Липидные капли располагались между миофибриллами, под сарколеммой, в околоядерной зоне, часто в тесном контакте с митохондриями. В околоядерной зоне, под сарколеммой и вблизи вставочных дисков наблюдались скопления миелиноподобных структур, а также вторичные лизосомы с включениями липофусцина. Большое количество включений липофусцина выявлено между миофибриллами. При стереологическом анализе выявлено незначительное уменьшение объемной плотности миофибрилл (49,13±0,11 %; в контроле -51,17±0,09%) и увеличение объемной плотности митохондрий (38,66±0,13%; в контроле - 35,74±0,11%).

В макрофагах выявлялось повышенное содержание липидных включений. Изменения в капиллярах заключались в сужении или расширении их просвета, некотором увеличении в эндотелии числа пиноцитозных пузырьков.

У кроликов 2-й группы после 17 сут кормления холестерином в дозе 1 г/кг массы на светооптическом уровне не наблюдалось резких отличий в строении мышечных волокон опытных и контрольных животных, за исключением повышенного содержания в них липидов. Мелкие липидные капли и более крупные включения интенсивно инфильтрировали мышечные волокна. Липидные включения наблюдались также в просветах вен и капилляров. В субэндокардиальном слое миокарда желудочков отмечалась капиллярная гиперемия, которая сопровождалась повышенной активностью эндотелия (увеличением размеров клеток и особенно их ядер). Вокруг капилляров, интрамуральных артерий среднего и мелкого калибра обнаруживались скопления лимфоцитов, макрофагов с липидными включениями и фибробластов. Отмечался разной степени выраженности отек интерстициальной ткапи.

При электронно-микроскопическом исследовании изменения строения большинства кардиомиоцитов не выявлены. Во многих клетках присутствовали липидные включения, которые располагались в основном под сарколеммой, около ядер и между миофибриллами. Липидпые капли тесно контактировали с митохондриями. В то же время в отдельных клетках появлялись небольшие очаги деструкции органелл и лизиса саркоплаз-матического матрикса. В цитоплазме эндотелиоцитов обнаруживались

многочисленные микропиноцитозные везикулы, что свидетельствовало об активации процессов трансэндотелиального переноса.

Через 36 сут холестериновой диеты в миокарде кроликов 2-й группы появлялись отдельные кардиомиоциты с разреженной, литически измененной, саркоплазмой и «опустошенными» околоядерными зонами. В таких клетках на ультраструктурном уровне отмечалось уменьшение количества митохондрий в околоядерной зоне, которые были представлены в основном мелкими формами. Наблюдалось заметное истончение мио-фибриллярных пучков и резкое их разобщение. Количество митохондрий между миофибриллами также было уменьшено.

Эндотелий капилляров сохранял признаки повышенного пиноцитоза. Во многих интрамуральных артериях эндотелий был слущен в просвет и содержал большое количество липидных включений. Вокруг сосудов располагались скопления лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток.

У кроликов 3-й группы через 3-4 мес эксперимента по мере нарастания атеросклеротических изменений в коронарных артериях развивались значительные изменения миокарда. Во всех случаях наблюдались инфаркты миокарда различной степени давности, которые чаще локализовались в передней стенке левого желудочка или в его папиллярных мышцах. В миокарде всех отделов сердца среди неизмененных мышечных волокон обнаруживались многочисленные мелкие очаги, образованные литически и контрактурно измененными кардиомиоцитами. Ультраструктурные особенности литически измененных клеток заключались в лизисе сар-коплазматического матрикса, деструкции и уменьшении количества митохондрий в околоядерных зонах, истончении и уменьшении количества миофибриллярных пучков (что фиксировалось также и при исследовании в поляризованном свете).

При электронно-микроскопическом исследовании отмечалось утолщение базальных мембран капилляров, появление в перикапиллярных пространствах утолщенных пучков коллагеновых волокон. Цитоплазма эндотелиальных клеток капилляров была электронно-плотной, количество пиноцитозных везикул было заметно уменьшено. Люминальная поверхность эндотелиоцитов образовывала многочисленные выросты.

Таким образом, литические изменения саркоплазмы и «опустошение» околоядерных зон начинали манифестировать в кардиомиоцитах до появления выраженных атеросклеротических изменений в аорте и коронарных артериях. Усиление атеросклеротических поражений коронарных артерий и нарушений кровообращения способствовали появлению очагов некробиоза и некроза кардиомиоцитов, что приводило к развитию в сердечной мышце диффузного мелкоочагового кардиосклероза. При этом мелкие его фокусы сочетались с более крупными, создавая пеструю картину поражения. Выраженная мозаичность кардиосклероза была обусловлена как разной локализацией изменений миокарда, так и различной степенью выраженности патологических процессов.

Патоморфологическое исследование миокарда кроликов при моделировании атеросклероза аорты и коронарных артерий сочетанием эндогенной и экзогенной гиперхолестеринемии. Из 74 опытных кроликов в разные сроки погибло 8 животных. В ранние сроки погибли 2 кролика (через 10 и 18 сут). Один кролик погиб через 40 сут от начала эксперимента, 5 кроликов погибли от сердечной недостаточности в поздние сроки эксперимента (через 70, 75, 80, 95 и 110 сут); при гистологическом исследовании миокарда этих животных во всех случаях обнаружены инфаркты левого желудочка и папиллярных мышц.

По данным биохимического анализа, содержание общего холестерина в сыворотке крови у интактных кроликов составило 3,15±0,27 мМ/л. Через 10 сут после полного голодания без ограничения воды содержание общего холестерина в сыворотке крови составило 5,86±0,80 мМ/л (р<0,01). В группе животных, содержавшихся после голодания 10 сут на обычном рационе, наблюдалось достоверное уменьшение содержания общего холестерина в сыворотке крови относительно голодавших животных до 2,34±0,23 мМ/л), что было меньше, чем у интактных кроликов.

У кроликов после 10-дневного кормления холестерином среднее содержание общего холестерина в сыворотке крови (10,46±1,99 мМ/л) было достоверно выше такового у контрольных кроликов и животных, декапи-тированных через 20 сут. Содержание общего холестерина в сыворотке крови кроликов через 60 сут кормления холестерином (8,20±0,87 мМ/л) было достоверно выше по сравнению с контрольными животными и животными, декапитированными через 20 сут; при сравнении с кроликами с Ю- и 30-дневным кормлением достоверных различий не обнаружено. Через 90 и 120 сут эксперимента наблюдалось значительное достоверное повышение уровня содержания общего холестерина в сыворотке крови в 5,5 и 6,3 раза (соответственно до 18,08±1,36 и 19,87±2,41 мМ/л) по сравнению с контролем и предыдущими сроками эксперимента.

При вскрытии кроликов в различные сроки опыта в аорте выявлены различные по выраженности атеросклеротические изменения: в сроки до 60 сут от начала опытов отмечена I стадия атеросклероза - липоидоз интимы, через 90 - 120 сут отмечена I! стадия - сочетание липоидоза и фиброзных бляшек. У некоторых кроликов через 120 сут, кроме липоидоза и фиброзных бляшек, на внутренней оболочке аорты обнаружены единичные атеромы (III стадия). Атеросклеротические поражения через 60 сут от начала опытов нами оценены как умеренно выраженные, через 90 сут - как выраженные и через 120 сут - как значительно выраженные.

В миокарде кроликов, перенесших 10-суточнос голодание после 10-суточной полноценной диеты, выявлены три основные субпопуляции кардиомиоцитов: 1 -я субпопуляция - кардиомиоциты с преимущественно нормальным строением, в которых липидные капли обнаруживались редко; 2-я субпопуляция -кардиомиоциты с выраженными литичсскими изменениями саркоплазмы и очагами парциального некроза в околоядер-

ной и субсарколеммальных зонах; 3-я субпопуляция - кардиомиоциты с большим количеством лизосом и гигантских аутофагосом, заполненные плотно упакованными мембранными структурами.

При патогистологическом исследовании миокарда кроликов через 30 сут эксперимента в стенках интрамуральных артерий отмечалась пролиферация эндотелия и отек адвентиции. Наблюдалось полнокровие мелких интрамуральных сосудов и капилляров. В поляризованном свете мышечные волокна сохраняли поперечную исчерченность, однако в некоторых из них выявлялся миоцитолизис. Также наблюдались единичные мышечные клетки с контрактурой миофибрилл.

Через 60 сут в мышце сердца наблюдались полнокровие капилляров и сосудов, единичные очаговые кровоизлияния, отек межмышечной и периваскулярной ткани. Эти сосудистые расстройства обнаружены во всех отделах сердца. Отмечались плазматическое пропитывание стенок мелких артерий и артериол, плазморрагии в межпучковую соединительную ткань. Крупные сосуды часто были полнокровными и находились в состоянии пареза. Для сосудов мелкого и среднего калибра характерны два состояния - спазма и пареза. Капиллярная гиперемия сопровождалась пролиферацией эндотелиоцитов, резким набуханием эндотелиальных клеток, слущиванием их в просвет капилляра. Иногда пролиферирован-ный эндотелий в капиллярах создавал впечатление обильной клеточной инфильтрации.

В миокарде присутствовали многочисленные кардиомиоциты с разреженной, литически измененной, саркоплазмой и «опустошенными» околоядерными зонами. Встречались также контрактурно измененные (эозинофильные) кардиомиоциты, вокруг которых появлялись моно-нуклеарные клетки. Подобные клетки обнаруживались и вокруг мелких сосудов. Клеточные скопления имели форму инфильтратов или небольших гранулем.

В результате возникали мелкие очаги кардиосклероза. При рубцевании гранулем капилляры облитерировались, и этот процесс продолжался вне пределов гранулемы как в сторону артериального, так и венозного отделов. По ходу запустевших капилляров наблюдалась активизация соединительнотканных клеток.

Через 90 сут эксперимента стенки коронарных артерий и их интра-муральные ветви были утолщены. Просвет крупных интрамуральных сосудов неравномерно сужен за счет сегментарного повреждения стенки. В миокарде кроликов отмечалась мозаичность окрашивания кардиомиоци-тов кислыми красителями; преобладали кардиомиоциты, расположенные группами, клетки со слабо окрашивающейся (разреженной) саркоплазмой и «опустошенным» околоядерным пространством. При поляризациоино-микроскопическом исследовании в таких кардиомиоцитах выявлялось уменьшение числа миофибриллярных пучков и более рыхлое их расположение по сравнению с контролем.

Через 120 сут эксперимента в артериях крупного калибра появлялись пучки продольно ориентированных гладкомышечных клеток, в результате чего образовывались их очаговые утолщения, выступавшие в просвет сосудов. В интиме таких измененных участков появлялись «пенистые» клетки - макрофаги с многочисленными липидными включениями. Подобные изменения стенок интрамуральпых сосудов миокарда у большинства животных носили распространенный характер и могли отражать развитие компенсаторно-приспособительных реакций, обусловленных возможным развитие артериальной гипертензии. В отдельных случаях обнаруживались очаги деструкции, гомогенизации и утолщения мышечного слоя интраму-ральных ветвей коронарных артерий за счет неравномерной гипертрофии и гиперплазии гладкомышечных клеток.

В этот срок эксперимента происходило усиление гетерогенности кардиоммоцитов: увеличивалось количество клеток с разреженной саркоплазмой, появлялись атрофирующиеся мышечные клетки. Патологические изменения, обнаруживаемые в миокарде при экспериментальном атеросклерозе, распределялись в основном диффузно и равномерно в различных участках левого желудочка. В то же время у 33% кроликов через 120 сут эксперимента выявлены инфаркты миокарда на стадии рубцевания, у одного кролика - обширный инфаркт в среднем и внутреннем слоях передней стенки левого желудочка с выраженной лейкоцитарной инфильтрацией краевых зон и свежими очагами кровоизлияний в субэндокардиальной зоне миокарда. Ремоделирование миокарда у всех животных было обусловлено мелкоочаговым диффузным кардиосклерозом.

По данным стереологического анализа, через 120 сут в миокарде достоверно уменьшалась объемная плотность кардиомиоцитов на 4% (табл. 3), при этом объемная плотность интерстициальной соединительной ткани возрастала на 28% (р<0,05). Отмечена тенденция к увеличению площади поверхности кардиомиоцитов (см. табл. 3), что косвенно свидетельствует об уменьшении их размеров.

Развитие кардиосклероза сопровождалось уменьшением объемной плотности капилляров (на 21%) при увеличении их поверхностной плотности (на 35%).

Изменения первичных стереологических параметров обусловили и изменения вторичных показателей. Прежде всего это касается объемного отношения кардиомиоцитов к соединительной ткани, которое уменьшилось па 29% (р<0,05) из-за заметного увеличения объемной плотности интерстициальной соединительной ткани (см. табл. 3). Объемное отношение кардиомиоцитов к капиллярам, наоборот, увеличилось на 24%, что было обусловлено более выраженным уменьшением объемной плотности микроциркуляторного русла.

Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов различались в зависимости от срока эксперимента. На самых ранних сроках наблюдений (на 30-е сутки) большинство кардиомиоцитов сохраняло нормальное

Таблица 3. Стсреологичсский анализ миокарда кроликов через 120 сут моделирования атеросклероза аор гы и коронарных артерий сочетанием эндогенной и экзогенной гиперхолестеринемии (М±т)

Показатель Контроль Гиперхолестеринемия

Объемная плотность, %:

кардиомиоцитов 76,49±0,83 73,27±0,79*

капилляров 7,02±1,33 5,57±0,79

соединительной ткани 16,49±0,91 21,16±1,43*

Поверхностная плотность, см2/см3:

кардиомиоцитов 385,83±28,28 456,61±30,78

капилляров 61,83±2,44 68,48±4,88

Поверхностно-объемное отношение, cm2/cms:

кардиомиоцитов 5,05±0,40 6,24±0,42

капилляров 10,15±1,90 13,73±1,71

Объемное отношение (число):

капилляров к кардиомиоцитам 0,092±0,010 0,076±0,008

соединительной ткани к кардиомиоцитам 0,216±0,018 0,289±0,013*

Примечание. * - р < 0,05 при сравнении с контролем.

строение, лишь в некоторых клетках отмечались деструктивные изменения отдельных митохондрий. В эндотелиоцитах капилляров наблюдалось повышенное содержание микропиноцитозных везикул.

Через 60 сут эксперимента ультраструктурные изменения кардиоми-оцитов проявлялись в усилении лизиса саркоплазматического матрикса и миофибриллярных пучков. Во многих клетках наблюдалась деструкция митохондрий в околоядерной зоне. Усиление литических и деструктивных процессов сопровождалось усилением процессов аутофагоцитоза. Значительно изменялись ультраструктура эндотелиальных клеток и строение базальных мембран капилляров. На люминальной поверхности эндоте-лиоцитов заметно возрастало по сравнению с контролем количество разнообразных по величине и форме цитоплазматических отростков.

В последующие сроки наблюдения (90 -120 сут) изменения кардиоми-оцитов становились более выраженными. Нарастали литические и деструктивные изменения, возрастало количество клеток с такими изменениями. В эти же сроки отмечалось прогрессирующее поражение эндотелия капилляров: цитоплазма эндотелиальных клеток становилась более плотной, люминальная поверхность клеток образовывала множественные тонкие выросты. Значительно расширенные пространства между капиллярами и кардиомиоцитами были заполнены аморфным хлопьевидным веществом, в котором обнаруживались различные вакуолеообразные структуры и мелкие гранулы. В межклеточных пространствах повсеместно наблюдалось увеличение количества и размеров пучков коллагеновых волокон. Базальные мембраны капилляров и мышечных клеток были утолщенными.

Таким образом, моделирование атеросклеротического процесса у кроликов путем сочетанной эндо- и экзогенной гиперхолестеринемии показало, что поражение микроциркуляторного русла и кардиомиоцитов происходит раньше, чем формируются атеросклеротические бляшки в коронарных артериях. Повреждение кардиомиоцитов связано с нарушением в них белково-синтетических процессов, что приводит к ингибированию регенераторной реакции и появлению литически измененных клеток. Степень поражения кардиомиоцитов и капилляров в разных участках миокарда различна. Наиболее значительные повреждения отмечены в стенке левого желудочка, где они располагаются по мере ослабления процесса в следующем порядке: субэндокардиальная зона, папиллярные мышцы, субэпикардиальный и средний слои. Эта закономерность подтверждается морфометрическими данными: наибольшая потеря паренхиматозных элементов и развитие стромы отмечены в субэндокардиальном слое левого желудочка и папиллярных мышцах.

Комплексный морфологический анализ миокарда в динамике атеро-склеротического процесса показал, что наряду со значительными патологическими изменениями в кардиомиоцитах развиваются компенсаторные реакции. В ранние сроки это связано с повышенной регенерацией миофи-бриллярного аппарата, усиленной продукцией рибосом и сборкой новых протофибрилл на полирибосомных цепочках. Длительная гиперхолесте-ринемия постепенно приводит к истощению синтеза и воспроизводства миофибрилл и деструктивным изменениям митохондрий. На поздних этапах компенсация функции утраченных кардиомиоцитов происходит за счет появления гипертрофированных сердечных кардиомиоцитов.

Анализ результатов, полученных при моделировании атеросклероти-ческого процесса, позволяет считать, что нарушения биосинтетических процессов в кардиомиоцитах, обусловливающие значительное снижение процессов внутриклеточной регенерации, прогрессирующую атрофию и преимущественно апопготическую гибель мышечных клеток сердца, определяют развитие регенераторно-пластической недостаточности ате-росклеротического сердца.

ВЫВОДЫ

1. Моделирование эндогенной гиперхолестеринемии у кроликов путем 10-суточного голодания не вызывает атерогенных изменений аорты и коронарных артерий, но обусловливает развитие жировой дистрофии кардиомиоцитов и умеренного диффузного кардиосклероза. Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов в таких условиях проявляется преимущественно в накоплении большого количества липидных включений. Одновременно появляется популяция кардиомиоцитов со значительными деструктивными и литическими изменениями околоядерных и подсар колем мал ьных пространств, литическими изменениями

миофибриллярных пучков и усилением аутофагических процессов.

2. Моделирование эндогенной гиперхолестеринемии у крыс путем 10-суточного полного голодания не вызывает морфологических изменений аорты и коронарных сосудов, но обусловливает развитие литических изменений кардиомиоцитов, для которых характерно «опустошение» околоядерной зоны и истончение миофибриллярных пучков. Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов в условиях гиперхолестеринемии определяется разнонаправленными изменениями объемных плотностей основных ультраструктур, отражающими нарушения процессов биосинтеза белков. Изменения архитектоники кардиомиоцитов, возникшие в результате голодания, не устраняются при возобновлении питания и служат структурной основой для развития сердечной недостаточности.

3. При моделировании атеросклероза аорты и коронарных артерий у кроликов введением экзогенного холестерина литические изменения саркоплазмы и «опустошение» околоядерных зон начинают манифестировать в кардиомиоцитах до появления выраженных атеросклеротических изменений в аорге и коронарных артериях. Усиление атеросклеротических поражений коронарных артерий и нарушений кровообращения способствует появлению очагов некробиоза и некроза кардиомиоцитов, что приводило к развитию в сердечной мышце диффузного мелкоочагового кардиосклероза. При этом мелкие очаги кардиосклероза сочетаются с более крупными, создавая пеструю картину поражения.

4. Сочетание эндо- и экзогенной гиперхолестеринемии вызывает наиболее значительное увеличение уровня общего холестерина в сыворотке крови (в 6 раз) и наиболее выраженные атеросклеротические изменения в аорте и коронарных артериях кроликов. Атеросклеротические поражения через 60 сут эксперимента соответствуют I стадии атеросклероза (липоидоз интимы), через 90 - 120 сут - II стадии (сочетание липоидоза и фиброзных бляшек), через 120 сут - III стадии (сочетание липоидоза, фиброзных бляшек и атером).

5. Сочетанная эндогенная и экзогенная гиперхолестеринемия вызывает наиболее значительное ремоделирование коронарных сосудов и миокарда с развитием диффузного мелкоочагового кардиосклероза (объемная плотность соединительной ткани возрастает на 28%). При этом поражения микроциркуляторного русла и кардиомиоцитов развиваются раньше, чем формируются атеросклеротические бляшки в аорте и коронарных артериях. Повреждения кардиомиоцитов обусловлены нарушением в них белково-синтетических процессов, что приводит к ингибированию процессов внутриклеточной регенерации, атрофии и апоптозу кардиомиоцитов.

6. По данным ультраструктурного анализа, при развитии гиперхолестеринемии и в динамике атеросклеротического процесса наряду со значительными патологическими изменениями в кардиомиоцитах сохраняются процессы внутриклеточной регенерации. В ранние сроки это проявляется в усиленной продукции рибосом и сборке новых миофибрилл,

что способствует не только восстановлению нормальной ультраструкгуры кардиомиоцитов, но и обеспечивает их гипертрофический рост. Длительная гиперхолестеринемия постепенно приводит к истощению процессов внутриклеточной регенерации, усилению литических и деструктивных изменений миофибрилл и митохондрий и, как следствие, к атрофии и апоптозу кардиомиоцитов.

7. Патоморфологический анализ изменений аорты, коронарных сосудов и миокарда при моделировании гиперхолестеринемии (у крыс и кроликов) и атеросклеротического процесса (у кроликов) позволяет выделить общие закономерности структурной реорганизации кардиомиоцитов - усиление гетерогенности кардиомиоцитов, нарастание в них литических и деструктивных процессов, сопровождающихся усилением аутофагоцитоза и апоп-тоза кардиомиоцитов, не связанных непосредственно с повреждениями аорты и коронарных артерий. Эти изменения обусловливают развитие диффузного мелкоочагового кардиосклероза еще до возникновения препятствий кровотоку в коронарных артериях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Непомнящих Р.Д. Структурная реорганизация аорты, коронарных артерий и кардиомиоцитов атеросклеротического сердца // 1 -я Всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». - Москва, 2012. - С. 169-170.

2. Лушникова Е.Л., Молодых О.П., Непомнящих Р.Д. Моделирование атерогенных повреждений миокарда // Научно-образовательный форум «Кардиология 2012». - Москва. - С. 96.

3. Клинникова М.Г., Южик Е.И., Непомнящих Р.Д. Влияние экспериментальной гиперхолестеринемии на структурную реорганизацию миокарда // IV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2012. - С. 115-116.

4. Непомнящих JI.M., Лушникова Е.Л., Карпова А.А, Непомнящих Р.Д., Южик Е.И. Закономерности структурной реорганизации аорты, коронарных артерий и кардиомиоцитов атсросклсрогического сердца // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2013. - С. 202 - 204.

5. Молодых О.П., Непомнящих Р.Д, Пичигин В.И. Моделирование атеросклеротического процесса и повреждений миокарда // 6-я Всероссийская конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2013. - С. 107 - 108.

6. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Южик Е.И., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Пролиферативная

активность кардиомиоцитов при хронической гиперхолистеринемии // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2013. - № 4. - С. 231-237.

7. Непомпящих Л.М., Лушникова Е.Л., Поляков Л.М., Молодых О.П., Клинникова М.Г., Русских Г.С., Потеряева О.Н., Непомнящих Р.Д., Пичи-гин В.И. Структурные реакции миокарда и липидный спектр сыворотки крови при моделировании гиперхолестеринемии и гипотиреоза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 155, № 5. - С. 647 - 652.

8. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Пичигин В.И., Клинникова М.Г., Непомнящих Р.Д., Сергеевичев Д.С. Экспрессия мРНК аполипоротеина Е, аполипопротеина A-IV и матриксно-клеточных белков в миокарде и выраженность фибропластических процессов при экспериментальной гиперхолестеринемии гипотиреоза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 155, № 8. - С. 240 - 244.

9. Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И., Клинникова М.Г. Иммуноцито-химический анализ пролиферативной активности кардиомиоцитов при хронической гиперхолестеринемии // Тезисы IV конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология. Инновационные подходы в физиологии и медицине». - Москва, 2013. - С. 56.

10. Пичигин В.И., Непомнящих Р.Д., Лушникова Е.Л. Экспрессия матриксно-клегочных белков и усиление фибропластических процессов в миокарде при моделировании хронической гиперхолестеринемии // Тезисы IV конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология. Инновационные подходы в физиологии и медицине». - Москва, 2013. - С. 84.

11. Nepomnyashchikh L.M., Lushnikova E.L., Polyakov L.P., Molodykh O.P., Klinnikova M.G., Russkikh G.S., Poteryaeva O.N., Nepomnyashchikh R.D., Pichigin V.I. Structural changes in the myocardium and serum lipid spectrum in experimental hypercholesterolemia and hypothyroidism // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2013. -Vol. 155, № 5, September.

- P. 692 - 696.

Соискатель

Р.Д.Непомнящих

Подписано в печать 25.10.2013. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 78.

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Повосибирск-58. ул. Русская, 39. т. 306-67-39

2012500686

2012500686