Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Структурно-молекулярные механизмы ремоделирования миокарда и пролиферативная активность кардиомиоцитов при хронической дислипидемии

На правах рукописи

Пичигин Вячеслав Игоревич

СТРУКТУРНО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ МИОКАРДА И ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ДИСЛИПИДЕМИИ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕ PAT диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2014

Работа выполнена в ФГБУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Непомнящих Лев Моисеевич

доктор медицинских наук, доцент Чава Светлана Валерьевна

Официальные оппоненты:

Майбородин Игорь Валентинович, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Авдалян Ашот Меружанович, доктор медицинских наук, заведующий лаборатории молекулярной диагностики Алтайского филиала ФГБУ Российского онкологического научного центра имени H.H. Бло-хина РАМН.

Ведущая организация:

ФГБУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН.

Защита состоится: «_» _ 2014 г. в_ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru/

Автореферат разослан «_»

Ученый секретарь Диссертационного совета

_2014 г.

Молодых Ольга Павловна

РОССИЙСКАЯ

' ^иьшотека^ЬЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2014

Актуальность темы. Нарушения липидного обмена (дислипидемии), характеризующиеся, в первую очередь, повышенньгм содержанием в крови холестерина, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов, являются важнейшими факторами риска развития атеросклероза и связанных с ним заболеваний сердечно-сосудистой системы (Непомнящих JIM., Розенберг В.Д., 2006; Velagaleti R.S. et al., 2009; Elshourbagy N.A. et al., 2013). В большинстве исследований, посвященных проблеме атеросклероза, особенно в последнее время, основное внимание уделяется оценке изменений и выяснению молекулярных механизмов повреждения внутреннего слоя сосудов, формированию атеросклеротических бляшек, их прогрессу, возможной стабилизации или разрыву. По современным представлениям, формирование атеросклеротической бляшки зависит от совокупности эндогенных и экзогенных атерогенных факторов, которые способствуют накоплению и модификации апоВ-липопротеина на сосудистой стенке, активации эндотелиальных клеток, миграции и активации воспалительных клеток, особенно макрофагов, пролиферации гладко-мышечных клеток, изменению биосинтеза коллагена и его деградации и активации факторов коагуляции и тромбоцитов (Kablak-Ziembicka A. et al., 2011; Weber С., Noels Н., 2011).

Гиперхолестеринемию рассматривают обычно в качестве патогенного фактора, вызывающего атерогенное ремоделирование сосудов (формирование атеросклеротических бляшек) и дисфункцию двух их основных клеточных популяций - эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток. Повреждение внутреннего слоя сосудов в результате действия совокупности эндогенных и экзогенных атерогенных факторов сопровождается накоплением и модификацией липидов в сосудистой стенке, активацией и пролиферацией эндотелиальных клеток, миграцией и активацией воспалительных клеток, особенно макрофагов, а также пролиферацией гладкомышечных клеток (Tabas I., 2010). Эти молекулярно-клеточные модификации приводят к формированию атеросклеротических бляшек, прогрессирующее развитие которых в коронарных артериях может приводить к их частичной или полной окклюзии и тромбоэмболиям.

Значительное внимание к структурно-функциональным изменениям сосудистой стенки при атеросклерозе и гиперхолестеринемии способствовало тому, что в литературе утвердилась точка зрения, согласно которой ведущим событием в патогенезе сердечной недостаточности при атеросклерозе являются циркуляторные нарушения, обусловленные стенозом коронарных артерий, т.е. изменения миокарда, вызванные ишемией и возможной реперфузией (Вихерт A.M., 1971, 1974; Митин К.С., 1974; Нагорнев В.А., 1977; Непомнящих Л.М., 1981, 1998; Автандилов Г.Г. и др., 1984; Kubler W., Katz A.M., 1977; Schuster E.H., Bulkley B.H., 1980). Структурно-функциональным изменениям сердца и миокарда, развиваю-

щимся в условиях гиперхолестеринемии до момента атерогенной окклюзии коронарных сосудов, и их коррекции уделяется относительно мало внимания (Непомнящих Л.М., Розенберг В.Д., 2006), что отражается на невысокой эффективности постишемической терапии, развитии тяжелой сердечной недостаточности и частых летальных исходах.

В исследованиях последних лет показано, что дислипидемии, сопровождающиеся усиленным поглощением липидов различными клетками, вызывают изменения и нарушения основных функций клеток, включая клеточный сигналинг, метаболизм липидов, энергопродукцию, синтез структурных макромолекул и т.п., что в конечном итоге может приводить к гибели клеток. Липид-индуцированные изменения клеточного гомео-стаза, которые принято обозначать как липотоксические (Wende A.R. et al., 2012), обусловливают модификацию межклеточных взаимодействий и инициируют каскад молекулярно- клеточных превращений, реорганизацию межклеточного матрикса, которые определяют как ремоделирование органов и тканей.

Ремоделирование сердца и репаративная регенерация миокарда при развитии патологических состояний сопровождаются реорганизацией волокнистого каркаса и основного вещества миокарда в результате первоначальной активации матриксных металлопротеиназ и последующей активации экспрессии большинства матриксно-клеточных и матриксных белков (Frangogiannis N.G., 2012), приводящих к формированию нового микроокружения. Матриксно-клеточные и матриксные белки играют большую роль в регуляции межклеточных взаимодействий, интеграции молекулярных сигнальных каскадов, что имеет критическое значение для выживания клеток и изменения их функциональной активности. Матриксно-клеточные белки взаимодействуют как с рецепторами на поверхности клеток, факторами роста, протеазами и другими биоактивными эффекторами, так и со структурными матриксными белками, выступая в роли динамичных интеграторов клеточного микроокружения, которое определяет поведение клеток в ответ на внешние стимулы. Это определяет значимость оценки уровня экспрессии матриксно-клеточных белков для анализа структурно-функционального состояния миокарда и выраженности его ремоделирования.

Высокий уровень инвалидизации и смертности от ишемической болезни сердца и других осложнений атеросклероза обусловливает необходимость своевременной диагностики дислипидемических повреждений миокарда и, соответственно, разработки адекватных моделей развития этой патологии. Перспективным направлением моделирования дислипидемий у мелких грызунов, ускорения развития патологического процесса и усиления его проявлений является использование наряду с атерогенной диетой антитиреоидных средств (в частности, мерказолила), использование которого приводит к уменьшению в крови уровня тироксина - одного из важнейших гормонов щитовидной железы, снижающего

уровень холестерина в крови и избыточную жировую массу (Mikhail G.S. et al, 2008).

Цель исследования - изучить характер ремоделирования миокарда крыс с оценкой пролиферативной активности кардиомиоцитов при хронической дислипидемии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить структурные основы ремоделирования миокарда крыс при разных атерогенных диетах в сочетании с гипотиреозом.

2. Изучить характер ультраструктурных изменений кардиомиоцитов крыс при разных атерогенных диетах в сочетании с гипотиреозом.

3. С помощью иммуногистохимического анализа и метода количественной оценки популяции кардиомиоцитов в сердце изучить пролифе-ративную активность кардиомиоцитов при хронической дислипидемии.

4. Изучить характер изменений экспрессии мРНК матриксно-клеточ-ных белков (остеопонтина и люмикана) и аполипопротейнов Е и A-IV при ремоделировании миокарда в условиях хронической дислипидемии.

Научная новизна. Впервые с помощью комплексного морфологического, биохимического и молекулярно-биологического анализа проведено изучение характера и возможных механизмов ремоделирования миокарда при развитии дислипидемии. Впервые показано, что разные атерогенные диеты с использованием экзогенного холестерина и мерказолила обусловливают развитие дислипидемии, которые вызывают сходные общетоксические и кардиотоксические эффекты, проявляющиеся в снижении массы тела и сердца, рембделировании миокарда.

Впервые установлено, что дислипидемии вызывают ремоделирование миокарда, характеризующееся увеличением объемного отношения соединительной ткани к кардиомиоцитам (в результате развития диффузного и мелкоочагового кардиосклероза) и увеличением объемного отношения капилляров к кардиомиоцитам (в результате полнокровия и дилатации кровеносных сосудов). Показано, что усиление фибропластических процессов в миокарде обусловлено липид-индуцированными повреждениями кардиомиоцитов (диффузными и очаговыми логическими процессами), их атрофией и последующей безнекротической гибелью. Установлено, что повышенный уровень холестерина в крови, особенно на фоне угнетения функции щитовидной железы, может обусловливать непосредственные значительные повреждения кардиомиоцитов, интрамуральных сосудов (эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток) и эритроцитов в отсутствие формирования атеросклеротических бляшек.

Впервые показано, что ремоделирование миокарда при дислипидемии реализуется на фоне повышенной экспрессии в миокарде мРНК остеопонтина и мРНК люмикана, которые вовлечены в процессы фиброзирования, а также мРНК аполипопротеинов Е, A-IV и микросомального триглице-рид-переносящего протеина, которые вовлечены в транспорт и обмен липопротеинов. Между объемной плотностью соединительной ткани в

миокарде и уровнем экспрессии мРНК остеопонтина и мРНК люмикана установлена умеренная положительная корреляционная связь.

Впервые показано, что при хронической дислипидемии, индуцированной разными атерогенными диетами, по-разному меняется проли-феративная активность кардиомиоцитов: при употреблении экзогенного холестерина происходит снижение пролиферативной активности кардиомиоцитов (по данным иммуногистохимического выявления К>67), при включении в рацион мерказолила вне зависимости от присутствия в нем экзогенного холестерина происходит увеличение пролиферативной активности кардиомиоцитов. Увеличение пролиферативной активности кардиомиоцитов способствует сохранению или менее выраженному снижению массы сердца при дислипидемии.

Иммуногистохимическое выявление Кд-67 преимущественно в ядрах «малых» одноядерных кардиомиоцитов позволяет рассматривать эти клетки в качестве основной субпопуляции, обеспечивающей пролиферацию кардиомиоцитов и появление двуядерных и многоядерных клеток. Пролиферация гтредсуществующих нетерминально дифференцированных кардиомиоцитов («малых» одноядерных кардиомиоцитов) способствует поддержанию общей численности кардиомиоцитов в сердце при цитопа-тических воздействиях дислипидемий.

Выявленный комплекс ультраструктурных изменений кардиомиоцитов (умеренная липидная инфильтрация кардиомиоцитов, развитие литических и деструктивных изменений органелл, расширения везикул и трубочек Т-системы, усиление аутофагоцитоза) и эндотелиоцитов свидетельствует о цитотоксических свойствах циркулирующего в крови холестерина. К особенностям внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов крыс при дислипидемии относится усиление их пиноцитозной активности (появление в субсарколеммальных зонах большого количества пиноцитозных везикул и окаймленных везикул), что свидетельствует об усилении обменных процессов между кардиомиоцитами и внеклеточным матриксом.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные о характере ремоделирования миокарда, повреждения и регенераторных реакциях кардиомиоцитов при развитии хронической дислипидемии. Представлены некоторые молекулярно-биологические механизмы ремоделирования миокарда при хронических нарушениях липидного обмена.

Установление липид-индуцированных повреждений кардиомиоцитов и ремоделирования миокарда при хронических дислипидемиях будет способствовать разработке новых подходов к коррекции нарушений сердечной деятельности в данных условиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дислипидемии оказывают общетоксическое и кардиопатическое действие, которое проявляется в уменьшении массы тела и сердца крыс, ремоделировании миокарда (развитии диффузного и мелкоочагового кардиосклероза), литических повреждениях кардиомиоцитов.

2. Ремоделирование миокарда, характеризующееся увеличением объемных отношений соединительной ткани к кардиомиоцитам и капилляров к кардиомиоцитам, реализуется на фоне повышенной экспрессии в миокарде мРНК матриксно-клеточных белков остеопонтина и люмикана.

3. При дислипидемии, индуцированной употреблением экзогенного холестерина, происходит снижение пролиферативной активности кар-диомиоцитов (по данным иммуногистохимического выявления Ki-67), при включении в рацион мерказолила вне зависимости от присутствия в нем экзогенного холестерина происходит увеличение пролиферативной активности кардиомиоцитов. «Малые» одноядерные кардиомиоциты являются основной субпопуляцией, обеспечивающей пролиферацию кардиомиоцитов.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на 1-й Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), Научно-образовательном форуме «Кардиология 2012» (Москва, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии» (Томск, 2013), 6-й Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013), IV Конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2013), межлабораторной научной конференции в ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН (Новосибирск, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 - в журналах по списку ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 172 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 71 рисунком (микрофотографиями, электронограммами, графиками), 4 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы. Список литературы включает 292 источника.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика экспериментальных моделей днслипнде-

мни. Дислипидемию воспроизводили путем содержания крыс Вистар на атерогенной диете; использовали 4 модификации атерогенной диеты с включением в нее экзогенного холестерина и мерказолила при свободном доступе к воде. I группа (п=6) - добавление в пищу экзогенного холестерина (Рапгеас Química SA, Испания) в дозе 25 мг/100 г массы тела; II группа (п=6) - добавление в пищу экзогенного холестерина в той же дозе и антитиреоидного препарат мерказолила («Акрихин», Россия) в дозе 1 мг/100 г массы тела; III группа (п=11) - добавление в пищу экзогенного

холестерина в дозе 100 мг/100 г массы тела, мерказолила в дозе 1 мг/100 г массы тела, 0,5% холата натрия, 15% сливочного масла; IV группа (n=l 1) -добавление в пищу мерказолила в дозе 1 мг/100 г массы тела, 0,5% холата натрия, 15% сливочного масла. Длительность содержания на атерогенной диете составила 64 сут. Животных (п=13) в контрольных группах (А и Б) содержали на стандартном лабораторном рационе и выводили из опыта в те же сроки, что и опытных. Всех животных еженедельно взвешивали для контроля динамики массы тела.

Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 г.

После выведения из опыта путем декапитации вскрывали грудную клетку, сердце отделяли от окружающих тканей и помещали в холодную камеру до полной остановки, затем его взвешивали, рассчитывали относительную массу органа.

Методы патоморфологического анализа. Образцы миокарда фиксировали в 10% нейтральном формалине для получения парафиновых срезов Проводку образцов ткани осуществляли в гистологическом комплексе STP 120 (Microm, Германия). Срезы толщиной 2-3 мкм получали на санном микротоме НМ430 (Microm, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону (Bio-Optica Milano SPA, Италия). Исследование срезов проводили в универсальном исследовательском микроскопе Leica DM 4000В, фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Leica DFC320 и компьютерной программы Leica QWinV3.

Для электронно-микроскопического исследования образцы миокарда размерами не более 1 ммЗ первоначально фиксировали в 4% парафор-мальдегиде (pH 7,2), постфиксировали в 1% четырехокиси осмия. После обезвоживания образцы миокарда заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультратомах LKB1П и Leica ULTRACUT EM UC7 (Leica, Германия). Полутонкие срезы окрашивали 1 % раствором азура II. Полутонкие срезы использовали для морфологического описания, морфометрического и стереологического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали в насыщенном спиртовом растворе уранилацета-та и цитрате свинца; исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Veleta и программного обеспечения ÍTEM (Olympus, Япония, Германия).

Иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности клеточных популяций миокарда проводили с использованием маркера пролиферации Ki-67. Применяли непрямой двухшаговый метод с использованием коммерческого набора фирмы Spring (США) (первичные антитела и система визуализации).

После стандартной процедуры депарафинации в ксилолах и спиртах нисходящей концентрации (по 5 мин) на парафиновых срезах (2-3 мкм), проводили блокировку эндогенной пероксидазы, для чего на каждый срез капельно наносили 3% раствор перекиси водорода (Hydrogen peroxide block) и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, затем промывали в TBS (2 раза по 5 мин). Демаскировку проводили кипячением стекол в микроволновой печи LG 1744U при мощности 420W в течение 20 мин в цитратном буфере (pH 6.0). Капельно наносили казеинсодержащий раствор (Protein Block) для блокировки неспецифических сайтов связывания с антителами и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, затем промывали в TBS (2 раза по 5 мин).

Инкубацию с первичными антителами (в разведении 1:100) проводили во влажной камере при температуре 250°С в течение 45 мин, после инкубации промывали в TBS (2 раза по 5 мин). Далее капельным способом наносили Complement для усиления сигнала на 10 мин при комнатной температуре, после чего срезы осушали и наносили вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (HRP Conugate), которые оставляли при комнатной температуре на 15 мин, затем препараты промывали в TBS (4 раза по 5 мин). Хромоген 3,3'-диаминобензидин (DAB) наносили на срезы на 5 мин при комнатной температуре (разведение 1 мкл DAB plus Chromogen к 50 мкл DAB plus Substrat), после чего срезы промывали дистиллированной водой, деактивируя DAB в емкости с раствором перманганата калия. После промывки в дистиллированной воде в течение 2 мин срезы докрашивали гематоксилином (в течение 1 мин) и для завершения реакции помещали в проточную воду на 10 мин с дальнейшей дегидратацией в спиртах возрастающей концентрации, просветлением и заключением в полистирол.

При определении индекса меченных Ki-67 ядер анализировали не менее 500 клеток. Индекс меченых ядер выражали в процентах.

Методы количественного анализа миокарда. Диаметр кардиоми-оцитов определяли с помощью компьютерной программы Leica QWin V3. Измерения проводили при увеличении в 1000 раз с обязательной калибровкой микроскопа (1 пиксель = 0,054 мкм). Для каждого животного оценивали не менее 200 срезов кардиомиоцитов, содержавших ядро.

Количественную оценку общей популяции кардиомиоцитов в сердце проводили с помощью метода щелочной диссоциации фиксированной ткани (Бродский В.Я. и др., 1983; Семенова JI.A. и др., 1985). Подсчет числа клеток производили в камере Фукса-Розенталя (заполняли по 5 камер, в каждой из которых находилось два стабильных по объему отдела). Концентрацию кардиомиоцитов рассчитывали по формуле: с = А • V • 103/т ■ 3,2, где с - число клеток в 1 мг ткани, А - среднее число клеток в отделе камеры, 3,2 ■ 103 - объем отдела (мм3), m - масса образца (мг), V - конечный объем суспензии (мл). Концентрацию клеток определяли в десяти повторах. Абсолютное число кардиомиоцитов в сердце рассчитывали по

формуле: N = с • М, где с - концентрация кардиомиоцитов, М - масса сердца. Кроме общей численности кардиомиоцитов в сердце, определяли количественное соотношение одно-, дву- и многоядерных (3 и более ядер) клеток. Оценку проводили также в камере Фукса-Розенталя, в десяти повторах, просчитывали не менее 500 клеток для каждого животного.

Тканевый стереологический анализ проводили на полутонких срезах в универсальном исследовательском микроскопе «Leica DM 4000В» с использованием компьютерной программы «Leica QWin». Оценивали объемную плотность кардиомиоцитов, кровеносных капилляров, ин-терстициальной соединительной ткани (суммарно клеток, волокон и основного вещества), рассчитывали объемные отношения соединительной ткани и кардиомиоцитов, капилляров и кардиомиоцитов. Объем выборки при оценке стереологических параметров составлял не менее 30 полей зрения при увеличении в 1000 раз для каждого наблюдения (тестируемая площадь - 281866,2 мкм2).

Биохимический анализ крови. В сыворотке крови, полученной из шейной вены сразу после декапитации, определяли показатели липидного спектра плазмы крови - ЛПВП, ЛПНП и триглицериды энзиматическим способом с использованием наборов «Biocon» (Германия) на биохимическом анализаторе «Labsystem» (Финляндия). Общий холестерин (ОХ) определяли сложением ЛПВП и ЛПНП; индекс атерогенности рассчитывали как отношение ЛПНП/ЛПВП. Определяли тиреоидный статус - проводили измерение концентрации тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3) в сыворотке крови с использованием наборов фирмы «Immunotech» (Чехия) иммунохемилюминесцентным методом на люминометре LM-01А (Bekman Coulter Company).

Оценка экспрессии генов методом ПЦР. Образцы сердца непосредственно после забора замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. РНК выделяли с помощью miRNeasy FFPE kit (Qiagen, Германия), элюи-ровали в 25 мкл воды, концентрацию определяли спектрофотометрически с помощью NanoVue plus (GE, Швеция). Для обратной транскрипции использовали 1±0,1 мкг РНК и набор реагентов iScript Select cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, США).

Для синтеза праймеров люмикана (ЛЮМ) и остеопонтина (ОПН), а также некоторых белков, участвующих в транспорте липидов, - Ano A-IV, Ano Е, МТПП, использовали данные (Hwang J.J. et al., 2002; Ameen С. et al., 2005; Shen L. et al., 2008; Sabaretnam Т. et al., 2010) с собственными дополнениями: ЛЮМ (forward: 5 -CTTCAATCAGATAGC-CAGACTGC-3'; reverse: 5'-AGCCAGTTCGTTGTGAGATAAC;3), ОПН (forward: 5'-GCCGAGGTGATAGTGTGGTT-3"; reverse: 5'-TGAGGTGATGTCCTCGTCTG-3'); Ano A-IV (forward: 5 -AAG-CTGAAAGGCAACACGGA-3'; reverse: 5 -TGCCTGAACTTCTCC-ATCTGC-3 ), AnoE (forward: 5'-TGTGAGTGCTATCCGTGACG-3'; reverse: 5'-TATCTG-CTGGGTCTGCTCCT-3'), МТПП (for-

ward: 5'-CGACGGTGAACGATGATCAACT-3' reverse: 5-GAC-CCGCATTTTCGACATT-3). Уровни экспрессии мРНК мишенных генов нормализовали относительно экспрессии мРНК двух генов «домашнего хозяйства»: RNA pol 2 (forward: 5 -CTTCACGGTGCTGGGATT-3"; reverse: 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3') и GAPD (forward: 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'; reverse: 5'-GGCATGGAC-TGTGGTCATGAG-3').

ПЦР проводили в финальном объеме 20 мкл, в 96-луночных планшетах (Axygen, США). В реакционной смеси содержалось по 450 пМ каждого праймера, 10 мкл 2-кратного ПЦР-буфера SsoFastEvaGreen mix (Bio-Rad, США), 5 мкл деионизованной воды MilliQ Academic (Millipore, США) и 2 мкл кДНК. Программа амплификации состояла из 45 циклов, каждый цикл включал 10 сек плавления при 95°С, 10 сек отжига 60°С, 15 сек элонгации при 72°С, с предварительным прогревом планшеты 2 мин при 95°С и финальной элонгацией 2 мин при 72°С. Съем флуоресцентного сигнала производился после этапа отжига. Уровень экспрессии оценивали автоматически с помощью встроенного сервиса Gene Expression программного обеспечения CFX96 (Bio-Rad, США) и нормировали по уровню экспрессии мРНК гена РНК-полимеразы 2. Для каждого образца реакцию проводили в триплетах. Комбинации праймеров и зондов были проверены на специфичность с помощью сервиса BLASTn (blast.ncbi.nlm. nih.govY), и ни в одной из них не было показано значимой гомологии с другими последовательностями. Оптимальные концентрации праймеров были определены бпытным путем из диапазона 300 - 600 пМ.

Статистическая обработка количественных данных включала нахождение среднего значения, ошибки среднего значения и определение значимости различий с помощью t-критерия Стьюдента, вычисление коэффициента корреляции (г). Различия считали значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Массометрические показатели и биохимические маркеры липнд-ного обмена при моделировании дислипидемии. Во всех экспериментальных группах к концу эксперимента (через 64 - 68 сут) происходило снижение массы тела и сердца: у крыс 1 группы эти показатели снижались соответственно на 27 и 25%, у крыс II группы - на 16 и 12%, у крыс III группы - на 14 и 23%, у крыс IV группы - на 10 и 16% (табл. 1). Относительная масса сердца у крыс I и II групп существенно не изменились, благодаря более пропорциональному уменьшению масс тела и сердца, в то время как у крыс III и IV групп произошло снижение относительной массы сердца соответственно на 11 и 7%.

При нахождении на атерогенной диете у животных всех групп происходили изменения липидного спектра сыворотки крови, характерные для дислипидемий (Крыжановский С.П. и др., 2011; Austin М.А. et al.,

Таблица 1. Масса тела, абсолютная и относительная массы сердца крыс Вистар при моделировании дислипидемии (М±ш)

Группы животных Масса тела, г Масса сердца, г Относительная масса сердца, мг/г

Контроль А 539,0±18,6 1,43±0,07 2,65±0,09

I группа 394,0±13,0*" 1,07*0,02" 2,72±0,06

II группа 455,7±7,9" 1,26±0,10 2,76±0,21

Контроль Б 366,8±22,5 1,24±0,07 3,40±0,10

III группа 315,8±18,7 0,96±0,05" 3,04±0,05*

IV группа 328,8±7,9 1,04±0,02" 3,17±0,08

Примечание. * - р<0,05; " - р<0,01; *** - р<0,001 при сравнении с контролем.

1990; Мивигшги К., 2010; Ма1уипа1Ь С.Ы. е1 а1., 2013). У особей I группы в сыворотке крови возрастало содержание общего холестерина (на 9%), ЛПНП (на 10%), ЛПВП (на 9%) и триглицеридов (на 16%), индекс атеро-генности при этом не изменялся (табл. 2). У крыс II группы дислипидемия характеризовалась более значительным повышением содержания общего холестерина (на 38%, р<0,05), ЛПНП (на 47%, р<0,05), в то время как уровень триглицеридов понижался по сравнению с контролем (на 15%), а уровень ЛПВП был увеличен (на 32%, р<0,05); индекс атерогенности был также увеличен (на 10%, р<0,05). У крыс Ш группы возрастало содержание общего холестерина (на 6%), при этом снижалось содержание триглицеридов (на 30%), ЛПВП (на 23%) и ЛПНП (на 48%, р<0,05), соответственно снижался индекс атерогенности. У крыс IV группы выявлены сходные изменения липидного спектра: повышение содержания общего холестерина (на 13%) и снижение содержания триглицеридов (на 17%), ЛПВП (на 7%) и ЛПНП (на 49%).

Увеличение уровня ЛПВП у крыс I и II групп свидетельствует о повышении ферментной активности печени, однако при повышенном поступлении экзогенного холестерина происходило увеличение в сыворотке крови ЛПНП и триглицеридов.

Значительные изменения выявлены для экспрессии мРНК АпоЕ и АпоА-1У, которые вовлечены в транспорт и обмен липопротеинов. У крыс I и II групп экспрессия мРНК АпоЕ в миокарде была увеличена в одинаковой степени (соответственно на 114 и 106%) по сравнению с контролем. В то время как экспрессия мРНК АпоА-ГУ была в большей степени увеличена у крыс II группы (в 3,47 раза), чем у крыс I группы (в 2 раза) при сравнении с контролем.

АпоЕ является одним из компонентов липопротеинов и лигандом для многих рецепторов липопротеинов. Хотя АпоЕ синтезируется преимущественно в печени для рецептор-опосредованного захвата липопротеинов, он также обнаруживается и в других тканях и типах клеток,

Таблица 2. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс Вистар при моделировании гиперхолестеринемии (М±ш)

Группы животных ХС, мМ/л ТГ, мМ/л ЛПВП, мг/дл ЛПНП, мг/дл

Контроль А 2,42±0,15 1,16±0,09 49,54±3,48 43,73±2,32

I группа 2,64±0,09 1,34±0,10 54,18±2,71 47,99±1,55

II группа 3,35±0,19* . 0,99±0,07 65,40±3,87* 64,24±3,87*

Контроль Б 2,28±0,13 0,99±0,19 81,70±7,30 12,48±2,16

III группа 2,41±0,16 0,69±0,20 62,72± 10,66 6,52±1,66*

IV группа 2,58±0,19 0,82±0ДЗ 75,63±7,44 6,40±2,17

Примечание. ХС - холестерин, ТГ - триглицериды, ЛПВП - липопротеиды высокой плотности, ЛПНП - липопротеиды низкой плотности. * - р<0,05 при сравнении с контролем.

включая макрофаги (Огеепо\у К. е1 а1., 2005). АпоА-ГУ является основным циркулирующим аполипопротеином, однако его роль в метаболизме ли-пидов и транспорте липопротеинов до сих пор детально не установлена. АпоА-ГУ принимает участие в поглощении пищевых жиров, транспорте триглицеридов и обратном транспорте холестерина. Кроме того, апоА-1У модулирует активность лецитин-холестерин-ацилтрансферазы, белка-переносчика эфиров холестерина и липопротеинлипазы ((Мое М.А. е1 а1., 2001). Показано, что повышенная экспрессия апоА-ГУ у трансгенных мышей существенно снижает развитие атеросклеротических повреждений за счет уменьшения выраженности окислительных процессов ((Мое М.А. (йа1., 2001).

Повышение экспрессии мРНК АпоЕ и АпоА-1У в миокарде крыс при развитии дислипидемии связано, вероятно, с синтетической активностью интерстициальных макрофагов, которые постоянно выявляются вблизи кровеносных сосудов и доминируют по численности среди соединительнотканных клеток. Отличительной особенностью макрофагов в использованных нами экспериментальных моделях дислипидемии является накопление в них большого количества липидных включений, что делает их сходными с «пенистыми» клетками в атеросклеротических бляшках. Между увеличением экспрессии мРНК АпоЕ и АпоА-ГУ и объемной плотностью кардиомиоцитов выявлена слабая отрицательная корреляционная связь (соответственно 1=-0,285 и г=-0,187), а между экспрессией этих белков и объемной плотностью соединительной ткани - слабая положительная корреляционная связь (соответственно г=0,3075 и г=0,189), что косвенно свидетельствует об увеличении популяции макрофагов и их вкладе в ремоделирование миокарда. Увеличение экспрессии мРНК АпоЕ и АпоА-1У в миокарде при экзогенной холестериновой нагрузке можно рассматривать в качестве адаптивно-компенсаторной реакции, направленной на нормализацию холестеринового (липопротеинового) обмена.

Увеличение экспрессии мРНК другого важного для ассамблеи и транспорта липопротеинов белка - микросомального триглицерид-перенося-щего протеина (МТПТ1) - в миокарде крыс I и II групп были выражены в разной степени: у крыс I группы - на 16,5% (1,34±0,16 против 1,15±0,49 отн. ед. в контроле), у крыс П группы - на 331% (4,96±1,36 отн. ед.). Экспрессия этого белка в миокарде положительно коррелировала с объемной плотностью соединительной ткани (г=0,596) и отрицательно - с объемной плотностью кардиомиоцитов (г=-0,499), что может отражать ведущую роль соединительнотканных клеток (прежде всего макрофагов) в синтезе M l 1111.

Патоморфологические изменения миокарда при моделировании дислипидемии. Изменения миокарда у крыс I группы характеризовались выраженными деструктивными изменениями кардиомиоцитов и реактивными изменениями стромы и сосудов. В кардиомиоцитах наблюдались умеренные либо значительные (до 50% саркоплазмы) литические повреждения саркоплазмы с явлениями перинуклеарного «опустошения». Отмечались также контраюурные повреждения кардиомиоцитов, их парциальный некроз. Практически во всех кардиомиоцитах присутствовали небольшие липидные включения, которые были рассеяны по саркоплазме или образовывали компактные скопления.

Регистрировались значительные нарушения гемодинамики: полнокровие сосудов всех калибров и капилляров, дилатация венул, лимфостаз; умеренный интерстициальный отек. В просвете кровеносных сосудов и капилляров наблюдалось образование эритроцитарных агрегатов по типу монетных столбиков, сладж-синдром, появление значительного числа эхи-ноцитов, тромбоцитарные пластинки. Изменения эритроцитов при алиментарной дислипидемии могли быть обусловлены дефицитом фосфолипидов (фосфатидилинозитола и фосфатидилхолина), формирующих наружный слой липидного каркаса мембраны, с последующей модификацией цито-плазматической мембраны (Караман Ю.К. и др., 2010). У всех животных в просвете вен регистрировалось появление липидных капель (иногда очень крупных размеров), в некоторых венах формировались тромбы.

Во всех слоях миокарда выявлялась мелкоочаговая, но чаще умеренная диффузная мононуклеарная инфильтрация, в том числе периваскулярная. Периваскулярно регистрировалось множество тучных клеток с выраженной метахромазией гранул, иногда дегранулированных. Активация тучных клеток является особенностью реактивной реакции стромальных клеток при атеросклеротическом поражении, вызывает миграцию моно-нуклеарных лейкоцитов и превращение макрофагов в пенистые клетки в очаге агеросклеротических повреждений (Жданов B.C. и др., 2006; Krishnaswamy G. et al., 2001). Пенистые клетки, содержавшие множество мелких липидных капель, в изобилии встречались периваскулярно. В миокарде регистрировались как небольшие очаги кардиосклероза, так и диффузный (межволоконный и периваскулярный) умеренный фиброз.

У крыс П группы наблюдались более выраженные изменения миокарда, чем у употреблявших только холестерин: преобладали литически и некробиотически измененные кардиомиоциты; регистрировались кон-трактурные повреждения. В саркоплазме кардиомиоцитов с литическими изменениями формировались вакуолеобразные расширения и перинукле-арная «опустошенность». Увеличение количества литически измененных кардиомиоцитов могло быть обусловлено усилением окислительного стресса в результате применения мерказолила, снижением каталазной активности (Сапо-Еигора Е. е1 а1., 2010). В кардиомиоцитах наблюдались варьирующие по величине липидные включения.

Сосудистые нарушения были также более выраженными: наблюдалась значительная дилатация вен и капилляров, полнокровие, сладж эритроцитов, их умеренный эхиноцитоз; формирование I игантских пластинок тромбоцитов; лимфостаз. В сосудах наблюдались скопления аморфных мелкозернистых либо кристаллоподобных липидных масс, вплоть до обтурации просвета. Отмечалась гипертрофия гладкомышечных клеток в интрамуральных артериях, которая сопровождалась умеренным гиперэла-стозом. В результате отека интерстициального пространства происходило разволокнение миокарда. В интерстициальном пространстве и периваску-лярно выявлялась значительная мононуклеарная инфильтрация; тучные клетки характеризовались различной функциональной активностью и контактировали с многочисленными моноцитами и пенистыми клетками, отмечалась их дегр^нуляция. При активации тучных клеток описывают как усиление деградации миокардиального коллагена, так и развитие фиброза (ЬеукЖ Б.Р. е1 а1., 2011). У многих особей II группы наряду с интерстици-альным отеком регистрировался выраженный диффузный, мелкочаговый и периваскулярный кардиосклероз.

У крыс III группы отмечался выраженный отек миокарда, его разволокнение; преобладали кардиомиоциты с литическими повреждениями, саркоплазма которых выглядела разреженной, в некоторых случаях наблюдались явления миоцитолизиса. В то же время регистрировались контрактурные повреждения кардиомиоцитов. Контрактуры мышечных сегментов вблизи кровеносных сосудов приводили к очаговому сжатию эндотелиальной выстилки. Во многих кардиомиоцитах регистрировались небольшие осмиофильные липидные включения, чаще в околоядерной зоне. «Малые» кардиомиоциты располагались небольшими кластерами.

Гемодинамические нарушения проявлялись в основном в виде полнокровия венозных сосудов и капилляров, небольших свежих кровоизлияниях. Интрамуральные артерии находились преимущественно в состоянии вторичного пареза, стенки их были утолщены в результате гиперплазии и гипертрофии гладкомышечных клеток. В некоторых артериях наблюдалось формирование в адвентиции продольно ориентированных тяжей гладкомышечных клеток. Особо следует также отметить характерную для данной экспериментальной модели гипертрофию эндотелиальных клеток,

данный феномен регистрировался как в капиллярах, так и в более крупных сосудах. Периваскулярно располагались тучные клетки и макрофаги, в которых различались липидные включения. Миокард был умеренно диф-фузно фиброзирован; встречались также небольшие очаги кардиосклероза, представленные атрофирующимися и некробиотически измененными кардиомиоцитами, окруженные мононуклеарами. Практически у всех животных в интерстициальных пространствах наблюдались скопления небольших липидных капель и отложения хлопьевидной субстанции.

В миокарде крыс IV группы регистрировался межпучковый и межволоконный отек разной степени выраженности, что приводило в некоторых зонах к значительному разволокнению. Наблюдалась мозаичность окрашивания кардиомиоцитов кислыми красителями, что было обусловлено присутствием клеток как с литическими, так и с контрактурными повреждениями. Литические повреждения были менее выраженными, чем у крыс III группы, носили преимущественно диффузный характер (наблюдалась разреженность саркоплазмы). Кроме диффузного и мелкоочагового лизиса саркоплазмы, регистрировались также околоядерные «опустошения». «Малые» кардиомиоциты (в основном двуядерные) встречались повсеместно, образовывали небольшие кластеры, расположенные преимущественно между зрелыми кардиомиоцитами с типичным фенотипом. Во многих кардиомиоцитах в околоядерной и миофибриллярной зонах присутствовали небольшие осмиофильные включения.

У крыс этой группы наблюдалось выраженное полнокровие кровеносных сосудов (венозных синусов и капилляров), небольшие свежие кровоизлияния. Отмечался полиморфизм эритроцитов, которые часто образовывали монетные столбики (сладас-синдром). Итрамуральные артерии находились в состоянии спазма или вторичного пареза, их стенки были утолщены в результате гиперплазии и гипертрофии гладкомышечных клеток. Эндотелиальные клетки были гипертрофированными с гиперхром-ными ядрами, выступающими в просвет сосудов. В некоторых артериях регистрировались гиперэластоз и неравномерная спирализация эластических мембран. Адвентиция артерий была, как правило, фиброзирована, иногда отечна; наблюдалось распространение фиброза на окружающую интерстициальную ткань. Вокруг мелких кровеносных сосудов располагались тучные клетки. Строма миокарда была фиброзирована, в ней присутствовали немногочисленные мононуклеары (преимущественно макрофаги с липидными включениями). Вокруг венозных и лимфатических сосудов наблюдались отложения хлопьевидной субстанции.

Ультраструктура миокарда при моделировании дислипидемии. Ультраструктурные изменения миокарда при моделировании дислипидемии с помощью разных диет носили преимущественно стереотипный характер, но различались по степени выраженности. У крыс I группы в ряде кардиомиоцитов отмечался диффузный и очаговый лизис миофи-бриллярных пучков разной степени выраженности - от умеренного до

значительного (в основном в области вставочных дисков). Выраженные изменения митохондрий (очаговый лизис матрикса, неравномерное расширение, деструкция и уменьшение числа крист, очаговая миелинопо-добная трансформация) регистрировались в отдельных кардиомиоцитах, в то время как расширения везикул агранулярной саркоплазматической сети встречались в большинстве клеток. В субсарколеммальных зонах отмечалось образование миелиноподобных струюур и вакуолей, внутри которых находились скопления гранул гликогена. Подобные образования регистрировались также между миофибриллярными пучками и вблизи вставочных дисков, через которые они выводились в межклеточные пространства и затем накапливались в межклеточных пространствах.

Значительным изменениям подвергалась околоядерная зона кардиоми-оцитов, в которой наблюдались деструкция митохондрий, формирование крупных вакуолеобразных структур, скопления вторичных лизосом с включениями липофусцина и единичные липидные капли. Небольшие липидные капли, как правило, были рассеяны в миофибриллярной зоне кардиомиоцитов, часто отмечалась их осмиофильная трансформация (появление осмиофильного ободка, его неравномерное утолщение и заполнение липидных капель осмиофильной субстанцией).

Изменения микроциркуляторного русла сердца проявлялись в значительном уплощении эндотелия при сохранении его пиноцитозной активности, образовании люминальных цитоплазматических выростов, уплотнении и утолщении базальной мембраны. В цитоплазме эндотелиоцитов, кроме хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сети, небольших митохондрий (с очаговой деструкцией крист), постоянно встречались осмиофильные липидные включения, сходные с таковыми в кардиомиоцитах. В то же время некоторые клетки были в состоянии некробиоза (их цитоплазматический матрикс был значительно отечен, лизирован, количество пиноцитозных микровезикул было уменьшено, сами клетки приобретали сферическую форму). Просветы капилляров и межклеточные пространства, как правило, были заполнены хлопьевидной субстанцией и содержали многочисленные гетерогенные вакуолеобразные и миели-ноподобные структуры. В вакуолеобразных структурах присутствовали гранулы гликогена, которые подвергались литическим изменениям.

В межклеточных пространствах вблизи капилляров располагались соединительнотканные клетки - в основном это были макрофаги и фи-бробласты, а также тучные клетки. В цитоплазме макрофагов присутствовали многочисленные липидные капли с осмиофильными включениями. Фибробласты были представлены удлиненными формами с крупными вытянутыми ядрами; в их цитоплазме присутствовали митохондрии и значительно расширенные цистерны гранулярной цитоплазматической сети с хлопьевидным содержимым и небольшими везикулярными структурами.

Вблизи кровеносных капилляров, кардиомиоцитов, соединительнотканных клеток встречались разные по величине пучки коллагеновых

волокон, которые соединялись с базальными мембранами капилляров и кардиомиоцитов. В некоторых случаях наблюдались массивные отложения коллагеновых волокон.

У крыс II группы (при сочетанном употреблении экзогенного холестерина и мерказолила) ультраструктурные изменения кардиомиоцитов были более выраженными. В них чаще регистрировались очаговые и диффузные литические повреждения миофибрилл. Отмечался также выраженный полиморфизм митохондрий, их очаговая деструкция. Везикулы агранулярной саркоплазматической сети были неравномерно расширены. Между митохондриями наблюдались небольшие липидные капли, которые также подвергались осмиофильной трансформации. Вблизи вставочных дисков отмечались скопления миелиноподобных структур, которые также регистрировались в межклеточных пространствах. В околоядерных зонах кардиомиоцитов отмечались значительные литические изменения саркоплазматического матрикса, деструкция митохондрий и образование вакуолеобразных структур, заполненных гранулярным содержимым.

Следует отметить, что в кардиомиоцитах с литическими повреждениями миофибрилл в зонах лизиса присутствовали скопления полисом и новообразованные миофиламенты, что отражало сохранение регенераторного потенциала кардиомиоцитов.

Кровеносные капилляры были образованы в основном уплощенными эндотелиоцитами с умеренно электронно-плотной цитоплазмой (зрелые формы), в которой различались немногочисленные митохондрии, профили гранулярной цитоплазматической сети, небольшие липидные капли. Одновременно встречались капилляры, выстланные эндотелиоцитами с электронно-прозрачной цитоплазмой; количество органелл в таких клетках было уменьшено, в них встречались гетерогенные вакуолеобразные структуры, люминальная поверхность была ровной, без выростов (отечные формы). Просветы капилляров были заполнены хлопьевидной субстанцией, часто встречались эритроциты, тромбоциты и вакуолеобразные структуры.

В интерстиции вокруг капилляров всегда присутствовали миелинопо-добные и вакуолеобразные структуры, хлопьевидная субстанция, пучки коллагеновых волокон. Среди клеточных элементов наиболее многочисленными были макрофаги, тучные клетки, фибробласты встречались реже.

Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов крыс III группы были сходными с таковыми у крыс I и II групп. Наблюдался преимущественно умеренный диффузный, иногда мелкоочаговый, лизис миофибрилляр-ных пучков. Митохондрии были полиморфными с электронно-плотным матриксом, неравномерными расширениями крист; в некоторых случаях отмечалось кольцевидное расположение крист (в виде отпечатков пальцев). Между митохондриями встречались редкие липидные капли, как правило, небольших размеров, содержимое которых подвергалось мембранозной трансформации или частичной утилизации. В этих же участках появля-

лись аутофагические вакуоли с гетерогенными включениями. Везикулы агранулярной саркоплазматической сети и трубочки Т-системы были умеренно расширены.

Во многих кардиомиоцитах в околоядерной зоне и в субсарколеммаль-ных зонах отмечался значительный лизис саркоплазматического матрикса. В таких зонах наблюдалась, как правило, менее компактная упаковка органелл, встречались многочисленные полисомы, небольшие профили гранулярной саркоплазматической сети. Многочисленные скопления полисом и профилей гранулярной саркоплазматической сети в разных струюурно-функциональных зонах кардиомиоцитов (околоядерной, ми-офибриллярной, субсарколеммальной) свидетельствовали об активации процессов внутриклеточной регенерации.

В кардиомиоцитах крыс III группы отмечалось усиление аутофагиче-ских процессов, о чем свидетельствовали многочисленные гетерогенные и полиморфные аутофагические вакуоли, которые регистрировались в разных зонах кардиомиоцитов, но чаще всего в области вставочных дисков. Аутофагические вакуоли (остаточные тельца) часто содержали мелковезикулярные гетерогенные структуры, а также секвестры гликогена и хлопьевидную субстанцию.

К особенностям внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов у крыс III группы следует отнести усиление их пиноцитозной активности - появление в субсарколеммальных зонах большого количества пиноцитоз-ных везикул и окаймленных везикул, что свидетельствовало об усилении обменных процессов между кардиомиоцитами и внеклеточным матриксом и могло отражать либо усиленное поглощение липидных комплексов, либо интенсивное выведение секретируемых белковых структур.

Кровеносные капилляры были образованы в основном эндотелиоци-тами с умеренно электронно-прозрачной цитоплазмой, в которой хорошо различались многочисленные скопления полисом, профили гранулярной цитоплазматической сети, митохондрии, единичные липидные капли. Кроме свободных и прикрепленных пиноцитозных везикул в цитоплазме эндо-телиоцитов присутствовали также окаймленные везикулы. Люминальная поверхность эндотелиальных клеток часто образовывала многочисленные небольшие выросты. В некоторых кровеносных капиллярах наблюдался апоптоз эндотелиоцитов, что приводило к нарушению межклеточных контактов, обособлению погибших клеток и нарушению целостности эндотелиального пласта. Просветы кровеносных капилляров всегда были заполнены хлопьевидной субстанцией.

В кардиомиоцитах крыс IV группы наблюдались сходные с другими группами ультраструктурные изменения. При этом следует отметить, что ультраструктура многих кардиомиоцитов была изменена в меньшей степени. В то же время в ряде кардиомиоцитов наблюдался диффузный или мелкоочаговый лизис миофибриллярных пучков. Нарушения ультраструктуры митохондрий встречались редко и заключались в литических

изменениях матрикса и разрежении крист. Между митохондриями располагались небольшие единичные липидные капли, которые часто подвергались миелиноподобной трансформации. Везикулы агранулярной саркоплазматической сети и трубочки Т-системы были умеренно расширены. Литические изменения саркоплазматического матрикса бьши наиболее выраженными в субсарколеммальных зонах, которые часто выглядели слабо структурированными. В околоядерных зонах литические и деструктивные изменения встречались реже, в то же время в этих зонах почти во всех клетках регистрировались аутофагические вакуоли (остаточные тельца), содержавшие мелковезикулярные структуры и хлопьевидную субстанцию. Подобные аутофагические вакуоли наблюдались также в других зонах кардиомиоцитов - в межмиофибриллярной и в области вставочных дисков, через которые они выводились в межклеточное пространство и затем в кровеносные капилляры.

Во многих кардиомиоцитах регистрировалось усиление пиноцитозной активности. В межмиофибриллярных и субсарколеммальных зонах часто присутствовали скопления полисом и новобразованные миофиламенты, что отражало процессы внутриклеточной регенерации.

Ультраструктура эндотелиоцитов существенно не изменялась. В просветах капилляров присутствовали единичные эритроциты и хлопьевидная субстанция. В перваскулярных зонах и в межклеточных пространствах отмечались небольшие неравномерные скопления хлопьевидной субстанции, наблюдались единичные волокна (в том числе коллагеновые), которые иногда образовывали небольшие пучки.

Выявленный комплекс ультраструктурных изменений кардиомиоцитов и эндотелиоцитов свидетельствует о цитопатических свойствах циркулирующих в крови холестерина и липопротеинов (литические и деструктивные изменения органелл, усиление аутофагоцитоза в кардиомиоцитах, некробиоз и апоптоз эндотелиоцитов). В то же время в кардиомиоцитах отмечались ультраструктурные признаки индукции процессов внутриклеточной регенерации (скопления полисом в межмиофибриллярной и субсарколеммальной зонах, появление новообразованных миофиламентов) и усиление пиноцитозной активности. Выявленные особенности изменений липидных включений (их осмиофильная трансформация) в кардиомиоцитах могут быть вызваны поступлением в клетки эндогенного холестерина и его дальнейшими метаболическими модификациями, что позволяет рассматривать их в качестве структурных маркеров атерогенных воздействий. Во всех случаях усиление аутофагоцитоза в кардиомиоцитах сопровождалось накоплением в межклеточных пространствах и просветах капилляров миелиноподобных и вакуолео-бразных структур, а также появлением в миокарде активированных форм макрофагов и фибробластов.

Таким образом, у животных всех опытных групп наблюдались значительные (преимущественно литические) изменения кардиомиоцитов и со-

судистого русла миокарда, более выраженные при сочетанием употреблении холестерина и мерказолила. Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышенный уровень холестерина в крови, особенно на фоне угнетения функции щитовидной железы, может обусловливать непосредственные значительные повреждения кардиомиоцитов, интрамуральных сосудов (эндотелиоцитов) и эритроцитов в отсутствии формирования атеросклеротических бляшек и без развития ишемии миокарда.

Литические изменения кардиомиоцитов (просветление саркоплазмы, разрежение миофибриллярных пучков, нарушение их целостности) при развитии хронической дислипидемии могли быть обусловлены как усилением протеолитических процессов, так и нарушением процессов внутриклеточной регенерации (пластического обеспечения) (Непомнящих JIM. и др., 2003). Подобные изменения кардиомиоцитов регистрируются при разных цитопатических воздействиях, которые вызывают угнетение внутриклеточных регенераторных реакций.

Стереологический анализ миокарда при развитии дислипидемии. Развитие дислипидемии во всех группах сопровождалось снижением объемной плотности кардиомиоцитов: у крыс I группы - на 12% (р<0,05), у крыс II группы - на 15% (р<0,01), у крыс III группы - на 7% (р<0,05), у крыс IV группы это уменьшение было незначительным (табл. 3). Объемная плотность капилляров возрастала у крыс I (на 49%, р<0,01) и II (на 27%, р<0,05) групп, что было обусловлено в основном значительным полнокровием сосудов. У крыс III и IV групп этот показатель был снижен (соответственно на 11 и 25%, р<0,05). Во всех группах выявлено увеличение объемной плотности соединительной ткани: у крыс I группы - на 53% (р<0,01), у крыс II группы - на 77% (р<0,01), у крыс III группы - на 51 % (р<0,01), у крыс IV группы - на 31 %.

Разнонаправленные изменения объемной плотности кардиомиоцитов, с одной стороны, и капилляров и соединительной ткани, с другой, обусловливали изменения их объемных отношений. В наибольшей степени эти изменения касались объемных отношений соединительной ткани к кардиомиоцитам, которые заметно возрастали: у крыс I группы - на 73% (р<0,01), у крыс II группы ,- на 109% (р<0,001), у крыс III группы - на 62% (р<0,01), у крыс IV группы - на 36%. У крыс I и II групп возрастали также объемные отношения капилляров к кардиомиоцитам, но в меньшей степени (соответственно на 69 и 48%). У крыс III группы это отношение практически не изменялось, в то«ремя как у крыс IV группы оно было уменьшено (на 23%).

Экспрессия матриксно-клеточных белков при дислипидемии. Увеличение объемного отношения соединительной ткани к кардиомиоцитам при развитии хронической гиперхолестеринемии отражает ремоделирование миокарда, которое сопровождалось значительным повышением экспрессии мРНК остеопонтина и люмикана (рис. 1). У контрольных (интактных) крыс Вистар в миокарде мРНК остеопонтина не

Таблица 3. Стереологический анализ миокарда крыс при развитии дисли-пидемии (М±т)

Группы животных Объемная плотность, % Объемное отношение

КМЦ капилляров соединительной ткани капилляров к КМЦ соединительной ткани к КМЦ

Контроль А 81,01±1,46 5,01±0,38 13,97±1,11 0,062±0,006 0,173±0,017

I группа 71,20±0,79* 7,47±0,16" 21,33±0,75** 0,105±0,003*"* 0,300±0,014**

11 группа 68,83±0,8Г* 6,33±0,25* 24,79±0,90" 0,092±0,004" 0,361±0,017*"

Контроль Б 80,35±0,70 7,50±0,27 12,14±0,97 0,093±0,003 0,151±0,013

III группа 74,99±0,68* 6,70±0,77 18,31±0,10** 0,090±0,011 0,244±0,001**

IV группа 78,45±2,08 5,61±0,16* 15,94±1,96 0,072±0,004 0,206±0,032

Примечание. КМЦ - кардиомиоцигы; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 при сравнении с контролем.

выявлялась, в то время как у крыс I группы экспрессия мРНК этого белка составляла 2,03±0,35 отн. ед., у крыс II группы данный показатель был в 7,7 раз выше (15,72±6,96 отн. ед.) (см. рис. 1, а). Экспрессия мРНК люми-кана в миокарде контрольных крыс и животных I группы существенно не различалась (соответственно 3,49±0,56 и 3,71±0,60 отн. ед.), у крыс II группы этот показатель был увеличен на 42% (4,95±0,48 отн. ед.) по сравнению с контролем (см. рис. 1, б). Выявлена умеренная положительная корреляционная связь между повышением объемной плотности соединительной ткани и уровнем экспрессии мРНК остеопонтина (г=0,408) и люмикана (г=0,470). Изменения объемной плотности капилляров слабо коррелировали с изменениями экспрессии мРНК остеопонтина (г=-0,141) и люмикана (г=0,078).

В миокарде взрослых млекопитающих большинство матриксно-кле-точных белков в норме экспрессируются в минимальной степени, но их экспрессия значительно возрастает при повреждениях сердечной мышцы разного генеза (Dobaczewski М. et al., 2010). Изменения экспрессии матриксно-клеточных белков сопровождается, как правило, усилением фиброзирования миокарда, изменениями фенотипа кардиомиоцитов, дилатацией желудочков, что позволяет рассматривать их в качестве биомаркеров развивающейся сердечной недостаточности.

Таким образом, развитие хронической дислипидемии сопровождается активацией фибропластических процессов в миокарде (увеличением объемной плотности интерстициальной соединительной ткани) и увеличением экспрессии мРНК остеопонтина и мРНК люмикана - матриксно-клеточных белков, принимающих участие в регуляции фиброгенеза. Ремоделирование миокарда при дислипидемии реализуется на фоне повышенной экспрессии мРНК АпоЕ, Ano А-IV и МТТП, которые вовлечены в транспорт и обмен липопротеинов во многих тканях и играют, по-видимому, значительную

контроль I группа II группа

контроль I группа II группа

Рис. 1. Экспрессия мРНК остеопонтина (а) и мРНК люмикана (б) в миокарде крыс при моделировании дислипидемии.

роль в регуляции транспорта и метаболизма липопротеинов в миокарде. Результаты исследования позволяют предполагать, что повышение экспрессии аполипопротеинов Е и А-IV, а также MTTII имеет адаптивно-компенсаторное значение, связано с усилением утилизации липопротеинов макрофагами и направлено на снижение неблагоприятных последствий повышенного уровня липопротеинов.

Иммуногистохимический анализ пролиферативной активности кардиомиоцитов при дислипидемии. По данным иммуноцитохимиче-ского анализа, Ki-67-позитивные кардиомиоциты в миокарде контрольных животных локализовались преимущественно вблизи основания сердца и в субэпикардиальном слое. В среднем слое миокарда пролиферативная активность кардиомиоцитов регистрировалась реже, в субэндокардиальном - не выявлялась. В миокарде контрольных животных Ki-67-позитивные кардиомиоциты составляли 1,67±0,33 и 1,19±0,02%о (соответственно контроль А и контроль Б) (рис. 2). Кардиомиоциты, экспрессирующие Ki-67, были представлены двумя фенотипами: «малые» кардиомиоциты (диаметром 7-9 мкм, длиной 36-42 мкм), в основном одноядерные, иногда - двуядерные (находились в поздней телофазе) и одноядерные (реже двуядерные) кардиомиоциты обычных размеров (диаметром 14-15 мкк, длиной 70 - 80 мкм).

В миокарде крыс, содержавшихся на атерогенной диете, Ki-67-позитивные кардиомиоциты также регистрировались преимущественно вблизи основания сердца в субэпикардиальном и среднем слоях. Как правило, это были небольшие одноядерные кардиомиоциты, реже - двуядерные, в которых оба ядра были Ki-67-позитивными. У крыс I группы дислипидемия приводила к снижению процентного содержания Ki-67-позитивных кардиомиоцитов на 16% (до 1,40±0,24%о) (см. рис. 2). У крыс II группы, наоборот, выявлено увеличение процентного содержания Ki-

3,5 3 2,5

контроль А I группа II группа контроль Б III группа IV группа

Рис. 2. Изменение содержания Ki-67-позитивных кардиомиоцитов (в %о) в миокарде крыс при хронической дислипидемии.

67-позитивных кардиомиоцитов на 40% (до 2,33±0,88%о) (см. рис. 2). У крыс III группы количество Ki-67-позитивных кардиомиоцитов возрастало на 46% (до 1,74±0,57%о), а у крыс IV группы - на 30% (до 1,55±0,50%о).

Изменение пролиферативной активности кардиомиоцитов при дислипидемии по-разному отражалось на изменениях общей численности кардиомиоцитов в сердце. У крыс I группы выявлено уменьшение общей численности кардиомиоцитов в сердце на 21% (табл. 4), что коррелировало со снижением количества Ki-67-позитивных кардиомиоцитов. У крыс II группы общая численность кардиомиоцитов существенно не отличалась от контрольных значений, что можно объяснить увеличением пролиферативной активности кардиомиоцитов у этих животных. У крыс III и IV групп общая численность кардиомиоцитов в сердце была снижена соответственно на 12 и 10%, несмотря на увеличение пролиферативной активности кардиомиоцитов.

При анализе соотношений одно-, дву- и многоядерных кардиомиоцитов установлено увеличение доли одноядерных клеток у крыс I, II и III групп (соответственно на 13, 24 и 31 %), у крыс IV группы доля одноядерных кардиомиоцитов существенно не отличалась от контроля. Увеличение доли одноядерных кардиомиоцитов параллельно с повышением их пролиферативной активности (по данным иммуногистохимического выявления Ki-67) может свидетельствовать о том, что в репликативный пул входят преимущественно предсуществующие так называемые нетерминально дифференцированные (незрелые) кардиомиоциты («малые» кардиомиоциты). «Малые» одноядерные кардиомиоциты чаще, чем большие двуядерные кардиомиоциты, включают BrdU (3,1% против 0,8%), не экспрессируют белок «старения» pi 6INK4a, обнаруживают более высокую активность теломеразы и Т-тип кальциевого потока, который свойственен кардиомиоцитам в эмбриональный и неонатальный периоды развития (Chen X. et al., 2007).

Таблица 4. Количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце крыс Внстар при моделировании дислнпидемни (М±ш)

Группы животных Общая численность КМЦ, х ю6 Концентрация КМЦ, 103 кл./мг Доля одноядерных КМЦ, % Доля двуядерных КМЦ, % Доля многоядерных КМЦ, %

Контроль А 22,37±1,10 15,60±0,51 9,56±0,87 88,83*1,01 1,61±0,15

I группа 17,71 ±0,40* 16,12±0,62 10,82±0,72* 87,78±0,49 1,40±0,16*

II группа 23,60±2,10 18,23±1,11 11,83±0,77 86,54±0,53 1,63±0,32

Контроль Б 22,61 ±0,17 18,54±0,55 9,53±1,05 88,93±1,05 1,53±0,03

111 группа 19,83±1,40 21,73±0,87** 12,47±0,67* 86,47±0,52 1,07±0,19*

IV группа 20,36±0,77 21,02±0,91* 9,73±1,42 88,83±1Д5 1,43±0,26

Примечание. КМЦ - кардиомиоциты; * - р < 0,05; " - р<0,01 при сравнении с контролем.

Полученные нами данные согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что в процессе старения, в постинфарктный период и при действии цитостатика (паклитакселя) физиологическая и репаративная регенерация миокарда происходят преимущественно за счет предсуществующих кардиомиоцитов, способных к делению, а не прогениторных клеток, мигрирующих в сердце (МаШагаэ К. а1., 2013; 8епуо 8.Е. е1 а1., 2013). Данное заключение подтверждается расположением Кь67-позитивных кардиомиоцитов в мышечных волокнах - на их концах с формированием своеобразных точек роста, а также в середине, что обеспечивает интермедиантный рост. В то же время репликативная активность кардиомиоцитов и функциональная активность воспалительных клеток в очагах поражения миокарда (особенно в периинфарктной зоне) могут интенсифицировать миграцию прогениторных клеток в эти зоны и, таким образом, стимулировать пролиферацию кардиомиоцитов и регенерацию миокарда (МаШагаз К. et а!., 2013).

Иммуногистохимическое выявление К>67 преимущественно в ядрах «малых» одноядерных кардиомиоцитов позволяет рассматривать эти клетки в качестве основной популяции, обеспечивающей пролиферацию кардиомиоцитов и появление двуядерных и многоядерных клеток. Выделение популяции одноядерных «малых» кардиомиоцитов как основной популяции клеток, образующих репликативный пул, ставит вопрос об исключении возможных артефактов при их определении. Поскольку длина кардиомиоцитов зависит от степени сокращения/расслабления миофи-брилл, важно исключить отнесение контрактурно поврежденных клеток к этому пулу кардиомиоцитов. Детальное изучение тинкториальных и структурных особенностей (в том числе, и с помощью Поляризационной микроскопии) «малых» КМЦ позволяет отнести их к незрелым клеточным формам (повышенная ацидофилия, уменьшенное число саркомеров,

увеличенное время сокращения и перераспределения Са2+), численность которых меняется в процессе онтогенеза и под действием цитопатических агентов (Непомнящих JI.M. и др., 2011; Chen X. et al., 2007). Увеличение процентного содержания одноядерных укороченных (с уменьшенным числом саркомеров) кардиомиоцитов (с 11,6 до 18%) после моделирования хронической объемной нагрузки было показано и другими исследователями (Du Y. et al., 2010).

При анализе диаметров кардиомиоцитов нами установлено отсутствие заметных изменений этого показателя у крыс I и II групп (соответственно 16,02±0,51 и 15,97±0,23 мкм) при сравнении с контролем (15,3 8±0,41 мкм). У крыс Ш группы отмечено небольшое увеличение диаметра кардиомиоцитов на 8% (до 12,45±0,13 мкм, р<0,01) при сравнении с контролем (11,56±0,10 мкм), в то время как у крыс IV группы этот показатель существенно не изменялся (11,53±0,08 мкм). Эти данные свидетельствуют об отсутствии значимых изменений в размерах кардиомиоцитов во всех опытных группах.

Полученные результаты позволяют заключить, что хроническая дислипидемия обусловливает ремоделирование миокарда, основными характеристиками которого являются увеличение объемного отношения соединительной ткани к кардиомиоцитам и увеличение объемного отношения капилляров к кардиомиоцитам. Эти изменения развиваются на фоне повышенной экспрессии в миокарде мРНК остеопонтина и мРНК люмикана, что отражает вовлечение этих белков в процессы ремоделирова-ния внеклеточного матрикса. Кардиотоксические эффекты дислипидемии проявляются в увеличении количества кардиомиоцитов с литическими повреждениями миофибриллярных пучков, деструктивными изменениями митохондрий, расширенными профилями агранулярной саркоплазмати-ческой сети и Т-системы, выраженным аутофагоцитозом. Усиление не-кробиотических процессов обусловливает гибель части кардиомиоцитов и уменьшение их численности в сердце. Увеличение пролиферативной активности кардиомиоцитов, которое наблюдается в группах с использованием мерказолила, способствует сохранению общей численности кардиомиоцитов в сердце и отражает развитие регенераторных реакций в миокарде в условиях дислипидемии.

ВЫВОДЫ

1. Атерогенные диеты с содержанием экзогенного холестерина и мерказолила вызывают у крыс развитие дислипидемии, характеризующейся гиперхолестеринемией и гипертриглицеридемией. Общетоксические и кардиопатические эффекты дислипидемии проявляются в снижении массы тела и сердца: у крыс I группы соответственно на 27 и 25%, у крыс II группы - на 16 и 12%, у крыс III группы - на 14 и 23%, у крыс IV группы -на 10 и 16%.

2. Дислипидемия, особенно на фоне угнетения функции щитовидной железы, обусловливает непосредственные значительные повреждения кардиомиоцитов (диффузные и очаговые литические повреждения ми-офибрилл), их атрофию и последующую безнекротическую гибель в отсутствие формирования атеросклеротических бляшек; в кровеносных сосудах - гипертрофию эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Липид-индуцированные нарушения кровообращения в миокарде проявляются в выраженном полнокровии кровеносных сосудов, дилатации вен, сладж-синдроме эритроцитов, накоплении тромбоцитарных пластинок.

3. Основными характеристиками ремоделирования миокарда крыс при дислипидемии являются увеличение объемного отношения соединительной ткани к кардиомиоцитам на 40 - 110% (в результате развития диффузного и мелкоочагового кардиосклероза) и увеличение объемного отношения капилляров к кардиомиоцитам на 20 - 70% (в результате полнокровия и дилатации кровеносных сосудов). Ремоделирование миокарда крыс при дислипидемии реализуется на фоне повышенной экспрессии в миокарде мРНК остеопонтина и мРНК люмикана. Между объемной плотностью соединительной ткани в миокарде и уровнем экспрессии мРНК остеопонтина и мРНК люмикана существует умеренная положительная корреляционная связь (соответственно г=0,408 и г=0,470).

4. Моделирование хронической дислипидемии с помощью различных атерогенных диет по-разному модифицирует пролиферативную активность кардиомиоцитов: при употреблении экзогенного холестерина происходит снижение пролиферативной активности кардиомиоцитов (по данным иммуногистохимического выявления Кл-67), при включении в рацион мерказолила вне зависимости от присутствия в нем экзогенного холестерина происходит увеличение пролиферативной активности кардиомиоцитов. Увеличение пролиферативной активности кардиомиоцитов способствует сохранению или менее выраженному снижению массы сердца при дислипидемии.

5. Иммуноцитохимическое выявление К>67 преимущественно в ядрах «малых» одноядерных кардиомиоцитов позволяет рассматривать эти клетки в качестве основной популяции, обеспечивающей пролиферацию кардиомиоцитов и появление двуядерных и многоядерных клеток. Пролиферация предсуществующих нетерминально дифференцированных кардиомиоцитов («малых» одноядерных кардиомиоцитов) способствует поддержанию общей численности кардиомиоцитов в сердце при цитопа-тических воздействиях дислипидемии.

6. Дислипидемия обусловливает умеренную липидную инфильтрацию кардиомиоцитов, развитие литических и деструктивных изменений орга-нелл, расширения везикул и трубочек Т-системы и усиление аутофагоци-тоза с выделение аутофагических вакуолей в межклеточные пространства. К особенностям внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов крыс при дислипидемии относится усиление их пиноцитозной активности (по-

явление в субсарколеммальных зонах большого количества пиноцитозных везикул и окаймленных везикул), что свидетельствует об усилении обменных процессов между кардиомиоцитами и внеклеточным матриксом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пичигин В.И. Ультраструктурная реорганизация кардиомиоцитов и эндотелиоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии // ] -я Всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». - Москва, 2012. - С. 243 - 244.

2. Молодых О.П., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Моделирование атеросклеротического процесса и повреждений миокарда // 6-я Всероссийская конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2013. - С. 107 - 108.

3. Пичигин В.И. Холестерин-индуцированная реорганизация кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных сосудов сердца // Всероссийская конференция молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии». - Томск, 2013. - С. 89 - 90.

4. Непомнящих J1.M., Лушникова Е.Л., Поляков Л.М., Молодых О.П., Клинникова М.Г., Русских Г.С., Потеряева О.Н., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Структурные реакции миокарда и липидный спектр сыворотки крови при моделировании гиперхолестеринемии и гипотиреоза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 155, № 5.-С. 647-652.

5. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Пичигин В.И., Клинникова М.Г., Непомнящих Р.Д., Сергеевичев Д.С. Экспрессия мРНК аполипопротеина Е, аполипопротеина A-IV и матриксно-клеточных белков в миокарде и выраженность фибропластических процессов при экспериментальной гиперхолестеринемии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 8. - С. 240 - 244.

6. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Южик Е.И., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Пролиферативная активность кардиомиоцитов при хронической гиперхолестеринемии // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2013. - № 4. - С. 231 - 237.

7. Nepomnyashchikh L.M., Lushnikova E.L., Polyakov L.P., Molodykh O.P., Klinnikova M.G., Russkikh G.S., Poteryaeva O.N., Nepomnyashchikh R.D., Pichigin V.I. Structural changes in the myocardium and serum lipid spectrum in experimental hypercholesterolemia and hypothyroidism // Bull. Exper. Biol. Med. - 2013. - Vol. 155, № 5. - P. 692 - 696.

8. Непомнящих P.Д., Пичигин В.И., Клинникова М.Г. Иммуноцито-химический анализ пролиферативной активности кардиомиоцитов при

хронической гиперхолестеринемии // Сборник трудов IV Конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология». - Москва, 2013. - С. 23 - 25.

9. Пичигин В.И., Непомнящих Р.Д., Лушникова Е.Л. Экспрессия матриксно-клеточных белков и усиление фибропластических процессов в миокарде при моделировании хронической гиперхолестеринемии // Сборник трудов IV Конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология». - Москва, 2013. - С. 30 - 31.

10. Lushnikova E.L., Nepomnyashchikh L.M., Pichigin V.l., Klinnikova M.G., Nepomnyashchikh R.D., Sergeevichev D.S. Expression of mRNA of apolipoprotein E, apolipoprotein A-IV, and matricellular proteins in the myocardium and intensity of fibroplastic processes during experimental hypercholesterolemia // Bull. Exper. Biol. Med. - 2013. - Vol. 156, № 2. - P. 271 - 275.

11. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Поляков Л.М., Молодых О.П., Клинникова М.Г., Русских Г.С., Потеряева О.Н., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Патоморфологический анализ миокарда и липидный спектр сыворотки крови при моделировании гиперхолестеринемии и гипотиреоза // Сибирский научный вестник. - 2013. - Т. 17. - С. 3 - 7.

12. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Южик Е.И., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Пролиферативная активность кардиол*иоцитов и их общая численность в сердце при хронической гиперхолестеринемии // Сибирский научный вестник. -2013. - Т. 17.-С.7-11.

13. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Пичигин В.И., Клинникова М.Г., Непомнящих Р.Д., Сергеевичев Д.С. Экспрессия мРНК аполипопро-теина Е, аполипопротеина A-IV и матриксно-клеточных белков в миокарде и выраженность фибропластических процессов при моделировании хронической гиперхолестеринемии // Сибирский научный вестник. - 2013.

-Т. 17.-С. 11 - 15.

Соискатель

В.И.Пичигин

Подписано в печать 12.03.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 08. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

i Ч

--6I52

2014067026