Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Стресс-регуляция эритропоэза при острых лейкозах

На правах рукописи

Макешова Айнура Бекболотовна

СТРЕСС-РЕГУЛЯЦИЯ ЭРИТРОПОЭЗА ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ

14.01.21 Гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

21 НОЯ 2013

Москва — 2013

005538744

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант академик РАМН доктор медицинских наук профессор

Савченко Валерий Григорьевич ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации, генеральный директор Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Луговская Светлана Алексеевна

ГБОУДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики доктор медицинских наук профессор Румянцев Сергей Александрович

ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заместитель директора по научной и учебной работе

доктор медицинских наук профессор Стуклов Николай Игоревич

Российский университет дружбы народов, профессор кафедры госпитальной терапии с курсом клинической лабораторной диагностики

Ведущая организация: ГБУЗ «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Защита состоится «_»_2013 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, по адресу: 117997 г. Москва, ул. Саморы Машела, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, по адресу: 117997 г. Москва, ул. Саморы Машела, д.1.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В.М. Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Острые лейкозы относятся к наиболее злокачественной форме опухолевых заболеваний системы крови. Их доля в структуре распространённости злокачественных новообразований в России в 2009 г. составила 3%, заболеваемость (в зависимости от возрастных групп) — 3-17 новых случаев на 100 тыс. населения [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2011, с. 46]. Распространённость лейкозов (все формы, все возрастные группы) в популяции женщин составляет 1%, в популяции мужчин — 1,5% [Juliusson G. et al., 2012, р. 3891].

Значительные успехи последних десятилетий в диагностике и лечении острых лейкозов позволили достигать выздоровления 75-80 % детей. Однако частота резистентных форм и рецидивов лейкозов у взрослых остаются по-прежнему, высокими. Так, при острых миелоидных лейкозах общая 10-летняя выживаемость больных в возрасте моложе 60 лет составляет 28%, безрецидивная — 32%. Наиболее успешными являются результаты лечения острого промиелоцитарного лейкоза, при которых 5-летняя общая выживаемость составляет 75%, безрецидивная — 85% [Савченко В.Г. и др., 2010 с. 3].

Совершенствование химиотерапевтических и трансплантационных технологий, позволяет увеличивать эффективность программ лечения, однако необходимо признать, что дальнейшее увеличение доз цитостатических препаратов и интенсивности их применения не позволяют добиться быстрейшей эрадикации опухолевых клеток. На определённом этапе наступает предел биологической переносимости лечения. Эти факты заставляют искать альтернативные пути воздействия на пролиферативную активность лейкозных клеток и пересматривать принципы лечения [Савченко В.Г. и др., 2005, с. 121].

Медико-социальная значимость болезни также состоит ещё и в том, что стоимость лечения растёт более быстрыми темпами, нежели его эффективность. Болезнь без лечения — абсолютно детальна [Савченко В.Г., 2005, с. 121]. Терапия острых лейкозов продолжается от полугода до двух с половиной лет. Показатели

качества жизни пациентов снижены даже в период ремиссии болезни [Выборных Д. Э., 2012, с. 3].

Патогенез острых лейкозов ассоциируется с воздействием на организм различных стресс-факторов: биологических (экспансия опухолевого клона и инфекционных агентов); химических (воздействие цитостатических, противомикробных препаратов и др.); гипоксии (анемической и тканевой); психоэмоциональных [Грицай JI.H. и др., 2010, с. 27; Юмачиков А.Н., 2004, с. 3]. При острых лейкозах развиваются анемия, гипоксия, метаболический стресс, посттрансфузионная перегрузка железом [Vagace J.M., Gervasini G., 2011, p. 391; [Gatterman N., Porter J.B., 2005, p. 19]. В таких условиях изменяется активность факторов межклеточного взаимодействия (HIF-la, интерлейкинов, ß-эндорфина, шаперонов), поверхностных и растворимых рецепторов (к фолиевой кислоте, трансферрину и др). [Горшкова К.Г. и .др., 2006, с. 46; Ciocca D., Calderwood S., 2005, p. 87; Kupsa T., Horacek J.M., 2012, p. 1]. Одним из главных факторов межклеточного взаимодействия является фактор индуцируемый гипоксией - HIF-la [Серебровская Т.В., 2005, с. 77]. Экспериментальные исследования продемонстрировали, что HIF играет основную роль в системном ответе на гипоксию, и его активность можно проследить в каждой реакции, в результате которой высвобождается кислород. Повышенный уровень HIF-la благоприятно действует на рост и развитие опухолей и в связи с этим ухудшает течение и прогноз болезни [Semenza G., 2008, p. 3836]. По данным литературы известно, что HIF при острых лейкозах, оказывает как антиапоптозный, так и проапоптозный эффекты [Sheffer M., Simon A.J., 2011, p. 1192]. Длительная анемия, и связанная с ней гипоксия тканей, инициирует выработку и других адаптивных белков. С повышенной экспрессией HIF-la связан синтез эритропоэтина (ЭПО) и гепцидина [Weinstein D.A. et al., 2002, p. 3777]. A высокая экспрессия шаперонов (hsp 70) и рецепторов к фолиевой кислоте (FR-a и FR-ß), увеличивают шансы к выживанию опухолевых клеток [Leamon С., Jackman А., 2008, р. 204; Wallin R., Lundqvist A. et al 2002; Sherman M., Multhoff G., 2007]. Эндогенные опиоидные пептиды, в частности ß-эндорфин стимулирует фагоцитарную активность клеток естественного иммунитета и оказывает модулирующее действие на цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и нейтрофилов [К.Г. Горшкова, C.B.

4

Гейн, С.П.Тендрякова 2007, с. 176; Sacerdote Р., 2006, р. 9]. Изменения концентрации p-эндорфина у больных острыми лейкозами на этапах терапии и в ремиссии заболевания, а также взаимосвязь с другими показателями, в частности с цитокинами, не исследованы.

Таким образом, разнообразие стресс-факторов и противоречивые изменения факторов межклеточного взаимодействия (HIF-la, рецепторы к фолиевой кислоте, белки теплового шока (hsp 70) и 3 -эндорфин) по данным литературы, доказывают необходимость проведения научной работы по динамическому исследованию данных показателей у больных острыми лейкозами для понимания патогенеза патологического процесса.

Цель: разработать теоретическую основу особенностей регуляции эритропоэза у больных острыми лейкозами и научно обосновать систему диагностики гипоксии с помощью регуляторных белков. Задачи:

1. Разработать новые подходы оценки регуляции эритропоэза в условиях воздействия стресс-факторов при острых лейкозах.

2. Изучить физиологические изменения белков, участвующих в эритропоэзе в условиях естественного развития гипоксии у практически здоровых лиц.

3. Определить концентрации белков-регуляторов эритропоэза и метаболизма железа у больных острыми лейкозами в динамике заболевания (до лечения, в процессе химиотерапии, ремиссии, в рецидиве заболевания и в зависимости от массы опухоли).

4. Определить концентрацию p-эндорфина. уровень экспрессии белков теплового шока hsp70 и рецепторов к фолиевой кислоте на опухолевых клетках и лимфоцитах при острых лейкозах.

5. Установить факторы, ассоциированные с развитием перегрузки железом, у больных острыми лейкозами при многократных трансфузиях эритроцитной массы.

6. Разработать на основе сравнительного анализа изученных показателей рекомендации по коррекции анемии и профилактике развития посттрансфузионной перегрузки железом у больных гемобластозами.

Научная новизна

Впервые изучены взаимодействия белков межклеточного взаимодействия и оценено их участие в эритропоэзе при острых лейкозах, на этапах лечения и в условиях воздействия стресс-факторов (большая опухолевая масса, воздействие цитостатических препаратов, гипоксия и др.). Выявлены различия содержания белков-регуляторов эритропоэза у больных с инициальным лейкоцитозом до лечения. Получены новые данные об изменении фактора индуцируемого гипоксией (НПМа) при острых лейкозах: повышение его концентрации в властных клетках при воздействии цитостатиками, и взаимосвязь с эритропоэтином и гемоглобином в динамике у исследуемых больных. Впервые выявлено изменение содержание гепцидина у больных острыми лейкозами на этапах лечения и в зависимости от уровня гемоглобина. Концентрация Р-эндорфина у больных острыми лейкозами повышена в 2-3 раза уже в дебюте заболевания, и его динамика в бластных клетках имеет корреляционную зависимость с ЮТ-1а и 1Ь-6.

Впервые установлено, что в период ремиссии болезни происходит снижение содержания гепцидина и нарастание — 1Ь-2 по сравнению с дебютом болезни. Впервые также установлено, что при рецидиве заболевания достоверно повышаются концентрации трансферринового рецептора, гепцидина и фактора индуцируемого гипоксией (ЮТ-1а), по сравнению с показателями до лечения.

Получены новые данные о факторах, определяющих развитие перегрузки железом при лечении больных острыми лейкозами и апластической анемией. Выявлено, что значения ННМа и гепцидина могут использоваться в качестве показателей адекватности выполненной трансфузии донорских эритроцитов. Для мониторирования уровня железа в организме и профилактики перегрузки организма железом, можно рассматривать также и значения ферритина сыворотки крови через 4-6 дней после транфузии донорских эритроцитов.

Впервые обнаружено, что фактором, усугубляющим перегрузку железа при длительных трансфузиях у больных с заболеваниями крови, являются редкие сочетания антигенов эритроцитов и трансфузионные химеры, возникшие в результате неадекватно подобранной эритроцитной массы. Впервые даны научно обоснованные рекомендации по обследованию на совместимость по антигенам ЛЬ-

6

системы реципиентов с планируемой многократной трансфузией эритроцитной массы.

Впервые определены значения факторов межклеточного взаимодействия, регулирующих эритропоэз, у практически здоровых лиц в условиях гипоксии и в зависимости от сроков пребывания на высокогорье (высота 3200 м). Установлено, что под влиянием гипоксии происходят компенсаторные изменения механизмов адаптации, проявляющиеся резким повышением ЮТ-1а в первые сутки пребывания в условиях высокогорья, а повышение содержания эритропоэтина происходит позже (максимальная концентрация зафиксирована на 20-е сутки). В исследовании впервые установлено, что к этому же времени значительно снижается содержание гепцидина. Существенное повышение концентрации эндорфина (в 10-12 раз по сравнению с показателями до подъёма на высокогорье) даёт основание утверждать, что гипоксическая гипоксия является основным триггером для продукции р-эндорфина.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость

Проведенные исследования дали возможность более глубокого понимания значения регуляторных белков и цитокинов в патогенезе острых лейкозов. Изменения основных цитокинов и белков регулирующих эритропоэз показывают, что регуляция эритропоэза и цитокиновой сети существенно нарушена. Даже в период ремиссии не наблюдается нормализации исследуемых показателей

Результаты анализа содержания гепцидина и ферритина в сыворотке и в бластных клетках позволяют с большой вероятностью полагать, что при острых лейкозах их приоритетной функцией является противодействие воспалительному и пролиферативному процессам, а не гипоксии на фоне глубокой анемии. В условиях воздействия гипоксической гипоксии приоритетным является поддержание адекватной оксигенации тканей путём повышения концентрации гемоглобина.

Изменения значений ЮТ-1а, фолатных рецепторов, Р-эндорфина, Нэр-70 в различные периоды заболевания, обосновывают применение в будущем препаратов, ингибирующих данные белки на определенных этапах терапии и препаратов конъюгированных с фолиевой кислотой направленного действия.

Проведенные исследования установили последовательность компенсаторно-адаптивных реакций со стороны белков регулирующих эритропоэз при воздействии гипоксической гипоксии в зависимости от сроков пребывания в условиях высокогорья.

Практическая значимость

Сывороточные показатели метаболизма железа, гепцидина, HIF-la, IL-2 и ILIO могут использоваться для контроля за эффективностью лечения больных острыми лейкозами и коррекции современных схем биологического воздействия (сроки введения рекомбинантного IL-2)

Результаты исследования гепцидина и HIF-la у больных острыми лейкозами позволяют использовать данные показатели для оценки адекватности трансфузионной терапии.

Проведенные исследования обмена железа у больных с заболеваниями системы крови выявили факторы, определяющие развитие перегрузки железом. Рекомендовано лицам с предполагаемой длительной трансфузионной терапией проводить более тщательный подбор эритроцитной массы, с учетом редкого фенотипа антигенов эритроцитов.

Для мониторинга накопления железа рекомендуется ориентироваться на значения сывороточного ферритина не ранее, чем через 4-6 дней после трансфузии эритроцитной массы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В условиях естественного развития гипоксии происходят адаптивные изменения показателей регуляторных белков, активизирующих эритропоэз (повышение концентраций гемоглобина, эритропоэтина, HIF-la и ß-эндорфина и снижение — гепцидина и ферритина). Эти изменения направлены на поддержание гомеостаза кислорода.

2. Содержание регуляторных белков эритропоэза при острых лейкозах зависит от фазы процесса: в дебюте болезни у больных с инициальным лейкоцитозом обнаружено снижение содержания ферритина, гепцидина и HIF-la; концентрация HIF-la увеличивается под воздействием цитостатических препаратов и в период миелотоксического агранулоцитоза. При острых

8

лейкозах приоритетом является противодействие воспалительному и пролиферативному процессам, а не гипоксии на фоне глубокой анемии.

3. Разбалансировка цитокиновой сети при острых лейкозах сохраняется как в период индукционного курса химиотерапии, так и в ремиссии и рецидиве заболевания. В ремиссии заболевания нормальные значения гепцидина сочетаются с высокими значениями интерлейкина-2 (1Ь-2). В рецидиве заболевания зафиксированы высокие значения гепцидина и ЮТ-1а (фактора индуцируемого гипоксией). Высокая пролиферативная активность лейкозного клона согласуется с концентрацией трансферринового рецептора, а неадекватность компенсаторной реакции противовоспалительных цитокинов — с концентрацией интерлейкинов (1Ь-2 и 1Ь-10).

4. Между Р-эндорфином и фактором, индуцируемым гипоксией (НПМа) в бластных клетках установлена прямая корреляционная зависимость (г=0,98), и обратная между Р-эндорфином и интерлеЙкином-6 (г=-0,94).

5. Погрешности подбора эритроцитной массы для больных с редким сочетанием антигенов эритроцитов и с искусственными химерами - значимый фактор развития перегрузки железом.

Реализация результатов исследования

Научные положения диссертации и практические рекомендации внедрены в деятельность отделения высокодозной химиотерапии и трансплантации костного мозга Гематологического научного центра МЗ России.

Апробация работы

Основные положения, материалы и результаты работы доложены и обсуждены на ежегодной Международной школе гематологов «Лейкозы и лимфомы» (Москва, 2011); Всероссийском гематологическом декаднике (Москва, 2009, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения опухолевых заболеваний крови и лимфатической ткани» (Санкт-Петербург, 2010); международном конгрессе гематологов «Актуальные вопросы гематологии» (Бишкек, 2010); I Российской научно-

практической конференции «Клинические и лабораторные аспекты современной гематологии» (Москва, 2013).

Апробация диссертационной работы состоялась на заседании проблемной комиссии Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Минздрава России (протокол № 3/12 от 2 июня 2012 г.).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 252 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материала и методов исследования (глава 2), изложения результаты собственных исследований (главы 3-6), заключения, выводов, практических рекомендаций. В диссертации - 20 рисунков и 38 таблиц. Список литературы включает 312 источников, из которых отечественных — 80 и зарубежных — 232. По результатам диссертации в отечественных и зарубежных изданиях опубликовано 20 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В главе 1 «ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ» изложена современная основа знаний о белках-регуляторах эритропоэза, их изменениях в условиях стресса. Описана роль факторов межклеточного взаимодействия в развитии солидных опухолей и изложены результаты экспериментальных работ по влиянию факторов гипоксии на бластные клетки при острых лейкозах. Подробно описаны виды гипоксий и их влияние на организм здоровых и больных людей.

Теоретической базой диссертации стали публикации о современной концепции адаптации организма человека к изменяющимся условиям обитания, достижения отечественных научных школ, возглавляемых H.A. Агаджаняном, В.П. Казначеевым, Ф.З. Меерсоном, В.И. Медведевым и др.

Согласно данным проф. О.С. Глазачева (2006), гипоксия является важным стресс-факгором при многих физиологических и патологических состояниях. Как известно, провести чёткую границу между гипоксией физиологической,

инициирующей компенсаторные реакции, и гипоксией, запускающей каскад патологических реакций, довольно трудно.

В последние годы уделяется много внимания изучению белков межклеточного взаимодействия, которые являются адаптационными факторами в стрессовых ситуациях. Одним из главных факторов межклеточного взаимодействия является фактор индуцируемый гипоксией — HIF-la [Серебровская Т.В., 2006]. Первоначально этот фактор был открыт как транскрипционный активатор зритропоэза. Однако вскоре стало ясно, что его функции значительно шире, и он прямо или косвенно регулирует функции нескольких сотен генов. В этом направлении интересны труды G. Semenza (2008) и G. Melillo (2009), опубликовавших ряд работ о роли HIF-la при раке и обосновавших актуальность разработки анти-Н1Р-1-таргетной терапии.

В работах Chen Guo Qiang, Hua Yan, Zhen-Gang Peng показано, что гипоксия вызывает дифференциацию лейкемических клеток при остром миелобластном лейкозе. Периодически подвергая гипоксии мышей с острым промиелоцитарным лейкозом, было достигнуто увеличение их продолжительности жизни. Таким образом по данных литературы, гипоксия вызывает как проапоптозный, так и антиапоптозный эффекты, зависящие от типа клеток и их окружения. Однако механизмы этих явлений не исследованы.

Q. Xing (2002) установил, что мембраноассоциированные фолатные рецепторы экспрессируются в опухолевой ткани. При лейкемии резко повышается экспрессия и FR-a и FR-b. В диссертации C.B. Гейна показано, что Р-эндорфин стимулирует фагоцитарную активность клеток естественного иммунитета и оказывает модулирующее действие на цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и нейтрофилов.

Установлено, что анемия и, как её следствие, тканевая гипоксия сказываются на эффективности лечения рака [Teicher В.A. et al., 1990, p. 3340; Beverly A. et al., 1994, p. 269]. Гипоксия способна изменять биологию опухоли — клетка, находящаяся в состоянии кислородного голодания, включает механизмы адаптации к гипоксии. В частности, это происходит через активацию факторов, индуцируемых гипоксией (hypoxia inductor factors — HIF) [Huang L.E. et al., 1998, p. 7887], запускающих серию молекулярных изменений, одним из которых

является продукция сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОР), Этот фактор отвечает за образование новых сосудов в опухоли, стимулируя её рост и метастазирование. Глубокая гипоксия приводит к нарушению репликации хромосом с возникновением спонтанных мутаций.

В литературе нет данных о динамическом исследовании белков участвующих в эритропоэзе, цитокинов и факторов межклеточного взаимодействия при острых лейкозах. Не изучены фолатные рецепторы бластных клеток и р-эндорфины.

Информационные ресурсы — базы данных Центральной научной медицинской библиотеки Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова «Российская медицина» (http://www.scsml.rssi.ru), Научной электронной библиотеки (www.elibrary.ru), Национальной медицинской библиотеки США «РиЬМес!» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), фонды научных библиотек Гематологического научного центра Минздрава России и Кыргызского научного центра гематологии.

В главе 2 «МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ» изложена организация научной работы, охарактеризованы исследовательский материал, методы исследования и обработки данных. Научная работа выполнена в период с ноября 2006 г. по ноябрь 2011 г. Исследовательская часть проведена в 3 этапа. Для каждого этапа работы разработаны формализованные карты учёта. Сводка исследовательского материала и методов исследования приведены в таблице 1.

Первый этап — пилотное изучение физиологии регуляторных белков эритропоэза в условиях естественного развития гипоксической гипоксии. Дизайн исследования — проспективное когортное исследование.

К исследованию на базе Кыргызского научного центра гематологии привлечено 22 практически здоровых лиц женского пола в возрасте от 22 до 34 лет. Исследование проводили в горно-климатическом санатории (3200 м над уровнем моря, перевал Туя-Ашу, Кыргызская Республика). Исследование показателей периферической крови и регуляторных белков проводили в 4-х временных точках: 1-е исследование (исходное) — до подъёма на высоту; 2-е исследование — на 1-3 сутки пребывания в горах; 3-е исследование — на 20-е сутки; 4-е исследование — на 40-е сутки. Образцы сывороток, гемолизированных эритроцитов и выделенные

мононуклеарные фракции были заморожены при минус 40 °С и транспортированы в ФГБУ ГНЦ МЗ для проведения лабораторных исследований.

Второй этап — изучение изменений белков-регуляторов эритропоэза, цитокинов сыворотки крови и бластных клеток, экспрессии белков теплового шока при острых лейкозах. Дизайн научной работы — поперечное исследование.

Работа проведена в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (научный руководитель отделения доктор медицинских наук E.H. Паровичникова) Гематологического научного центра Минздрава России. В исследование включено 94 больных острыми лейкозами. Отдельно анализировались по 25 больных в ремиссии и в рецидиве заболевания.

Диагнозы были верифицированы на основании клинической картины, данных морфологического, цитохимического, иммунофенотипического и кариологического исследований клеток периферической крови и костного мозга.

Критерии включения: больные острыми лейкозами de novo. Критерии исключения", больные, получавшие цитостатическое лечение до поступления в стационар.

Таблица 1 — Направления научной работы, методы сбора, анализа и обработки данных, объём материала.

Направление исследования Методы сбора, анализа и обработки данных Объём материала

Систематический обзор литературы Поисковый метод сбора (выкопировка данных), аналитический, логический, контент-анализ Всего документов — 322. В том числе журнальные статьи — 156, монографии — 22, руководства — 19, статьи из сборников — 15, авторефераты диссертации и диссертации — 7, электронные ресурсы — 16, тезисы — 4.

Изучение физиологии регуляторных белков эритропоэза в условиях естествен- Проспективное когорт-ное исследование. Наблюдение, измерение, статистический анализ Добровольцы — 22

Направление исследования Методы сбора, анализа и обработки данных Объём материала

ного развития гипок-сической гипоксии

Клинико-лаборатор-ные сопоставления Определение ферри-тина, гепцидина, ци-токинов, фактора индуцируемого гипоксией, рецептора к фолиевой кислоте и Р-эндорфина Критерии включения, клинический метод, методы статистического анализа, иммунофер-ментный, иммунорадио-метрический методы, метод радиальной диффузии в агаре, метод проточной цитофлю-ориметрии Участников — 149. Всего выполнено 2400 определений.

Исследование нарушений обмена железа при многократных гемотрансфузиях Ретроспективный анализ Участников — 104. Всего выполнено 2017 исследований.

Возраст больных ОМЛ от 17 до 73 лет (медиана — 34,5 лет), больных ОЛЛ — от 17 до 66 лет (медиана — 25 лет). Клинические проявления в виде анемического, геморрагического синдромов наблюдали у 89 из 94 больных острыми лейкозами (94,7%).

Гепатоспленомегалия, лимфоаденопатия и гиперплазия дёсен выявлены у 28 из 37 (75,7%) больных ОЛЛ, симптомы нейролейкемии — у 20 из 94 (21,3%) больных острыми лейкозами (вне зависимости от варианта болезни).

Анализ проводили как в общей группе, так и при делении больных на подгруппы в зависимости от исходного содержания гемоглобина: 1-я группа (я=36) — с уровнем гемоглобина более 90 г/л, 2-я группа (л=38) — 70-90 г/л, 3-я группа (и=20) — менее 70 г/л.

Рисунок 1 — Распределение выборки по FAB классификации острых лейкозов.

OMJ1 — острый миелоидный лейкоз; МО — острый недифференцированный миелобластный лейкоз; Ml — острый миелобластный лейкоз без созревания; М2 — острый миелобластный лейкоз с созреванием; МЗ — острый промиелоцитарный лейкоз; М4 — острый миеломонобластный лейкоз; М5 — острый монобластный лейкоз; Мб — острый эритробластный лейкоз; ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз; Т — Т-клеточный вариант ОЛЛ; В — В-клеточный вариант ОЛЛ.

Все больные получили программную химиотерапию в соответствии с принятыми на данный момент протоколами лечения.

Третий этап — мониторирование факторов, определяющих развитие перегрузки железом. В исследование включено 104 пациента, в том числе 64 больных острыми лейкозами de novo, 31 — с апластической анемией, 9 — с миелодиспластическими синдромами. Исследование гена HFE на наличие мутаций проводили в лаборатории молекулярной гематологии (руководитель доктор медицинских наук А.Б. Судариков). Перед заместительной гемотрансфузионной терапией у всех больных определяли групповую принадлежность и фенотип

15

эритроцитов по антигенам системы Rh-резус — исследование проводили в лаборатории иммуногематологии (руководитель доктор медицинских наук JI.JI. Головкина).

Всем участникам третьего этапа исследования проводили мониторинг объёма трансфузий эритроцитной массы. Для контроля степени выраженности перегрузки железом у каждого больного выполнено от 4 до 16 исследований показателей обмена железом.

Методы исследования

Клинический метод включал изучение жалоб больного, анамнеза жизни и болезни, объективного статуса, результатов дополнительного обследования для подтверждения диагноза, установления варианта острого лейкоза и подбора протокола лечения. Для классификации использовали рекомендации франко-американо-британской группы экспертов (FAB, 1982), основанной на морфологических и цитохимических характеристиках бластных клеток. Наряду с формой острого лейкоза определяли прогностические группы риска.

Иммунорадиометрический метод использовали для определения ферритина в сыворотке, опухолевых клетках и эритроцитах. Использовали набор фирмы «Immunotech» (Чехия).

Метод радиальной диффузии в агаре использовали для определения трансферрина (Tf) [Левина A.A. и др., 2002].

Иммуноферментный метод применяли для определения эритропоэтина, цитокинов (IL-2, IL-6 и TNF-a) с помощью наборов фирмы РгоСоп (Россия); для определения трансферринового рецептора (TrfRec), гепцидина, HIF-la, рецепторов к фолиевой кислоте (ФР), интерлейкинов (IL-8, IL-10), ß-эндорфина (B-END) — планшеты фирмы «Sarstedt» (США). Использованы моноспецифические антисыворотки и моноклональные антитела фирм «Abcam» (Великобритания) и «AbNovo Ltd» (Канада). В качестве вторых антител использовали моноклональные антитела против соответствующего антигена, предварительно соединённые с пероксидазой хрена (конъюгат по методу Nakane). Иммуноферментный метод применяли и для определения сывороточного железа (СЖ) и общей железосвязывающей способности сыворотки (ОЖСС). Использовали наборы

фирмы «La Chema» (Чехия). НТЖ (насыщение транферрина железом)- расчётная величина, определяемая по соотношению СЖ и ОЖСС.

Метод проточной цитофлюориметрии применяли для определения Heat shock proteins (Hsp-70). Исследование проводили в лаборатории физической биохимии системы крови: под руководством зав. лаб. проф. Ф.И. Атауллаханова. Выделяли мононуклеарную фракцию из периферической крови с помощью раствора Ficoll-Paque. Образцы для хранения замороживали в жидком азоте. После размораживания красили клетки методом прямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител анти Hsp-70 (Stressgen bioreagents, Канада) и проводили анализ окрашенных образцов на проточном цитофлюориметре.

Метод определения рецепторов к фолиевой кислоте. В основе метода лежит способность рецепторов клеток к связыванию конъюгата фолиевой кислоты. Реакцию проводили следующим образом: в первый ряд пробирок помещали взвесь лейкоцитов (0,2 мл) и раствор конъюгата в предварительно подобранной концентрации (0,2 мл), во второй ряд пробирок помещали такое же количество лейкоцитов, конъюгата и стандартное количество фолиевой кислоты, которая должна связать то или иное количество конъюгата. Реакционную смесь термостатировали в течение 1 часа при 37°С. Взвесь лейкоцитов промывали фосфатно-солевым буфером три раза. Затем добавляли в реакционную смесь субстрат для определения количества пероксидазы хрена, связавшейся с лейкоцитами, прогревали снова в течение 30-45 мин., снова промывали таким же образом, переносили 0,1 мл на планшет и визуализировали добавлением 0,1 мл перекиси водорода, а затем промеряли на спектрофотометре при 450 нм. О количестве фолатных рецепторов в клеках судили по разнице связавшейся фолиевой кислоты в первой и во второй пробирках. Количество связавшейся фолиевой кислоты умножали на коэффициент 953,3 и определяли концентрацию фолатных рецепторов [Левина A.A., Мелик-Нубаров Н.С. и др., 2009].

Статистические методы анализа данных

Описательную статистику использовали для обработки эмпирических данных, их систематизации, наглядного представления в форме графиков и таблиц, а также для количественного описания посредством основных статистических показателей (среднее, медиана, дисперсия, доверительный интервал).

Применяли статистические методы точечной и интервачьной оценки данных.

Доверительный интервал (ДИ) — диапазон значений данных, который включает действительное («истинное») значение. Окружая оценку полученного значения, этот диапазон позволяет получить доказательство, насколько точна эта оценка. Чем шире доверительный интервал, тем ниже точность оценки; более узкие интервалы указывают на более высокую точность [Ланг Т.А., Сесик М., 2011, с. 57]. Рассчитывали 95% ДИ.

Дисперсионный анализ — метод, направленный на поиск зависимостей в данных путём исследования значимости различий в средних значениях [Шеффе Г., 1963].

Корреляция по Пирсону — расчёт значения линейной пропорциональности двух переменных по отношению друг к другу. Степень связи (корреляции) между признаками оценивали по шкале Чеддока: слабая — 0,1 < г < 0,3; умеренная — 0,3 < г < 0,5; заметная — 0,5 < г < 0,7; высокая — 0,7 < г < 0,9; весьма высокая — 0,9 < г < 1. Уровень значимости для двустороннего критерия коэффициента корреляции Пирсона (г) определяли по таблице значений [Fisher, R.A.et al., 1963, p. 63].

Коэффициент детерминации (R-квадрат; R2) определяли для оценки доли дисперсии зависимой переменной.

Анализ данных и расчёты статистических показателей проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, STATISTICA 6 (Statsoft), InStat+.

Этический аспект научной работы

Научную работу проводили в соответствии с правилами клинических исследований. От каждого участника получено информированное согласие на участие в исследовании. В ходе исследования осуществлялся внутренний и внешний контроль.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В главе 3 «РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ ЭРИТРОПОЭЗА В УСЛОВИЯХ ЕСТЕСТВЕННОГО РАЗВИТИЯ ГИПОКСИИ» изложены результаты пилотного исследования изменения белков-регуляторов эритропоэза у здоровых людей, находящихся в условиях высокогорья. Установлено, что при острых лейкозах вследствие нарушения окислительного фосфорилирования в митохондриях развивается гипоксия. Об этом свидетельствует достоверное увеличение у больных показателей HIF [Smith T.G. et al., 2008, с. 325]. Некоторые исследователи предполагают, что при острых лейкозах возникают явления, сходные с гипоксической гипоксией, развивающейся при пребывании в условиях высокогорья. Гипоксия при острых лейкозах — стресс-фактор, влияющий на функционирование эритрона. В связи с этим, перед исследованием белков, участвующих в эритропоэзе, у больных острыми лейкозами, нами проанализированы изменения этих белков и цитокинов у здоровых людей при подъеме в условия высокогорья - 3200 м над уровнем моря (таблицы 2-3).

В результате 40-дневного динамического наблюдения здоровых лиц нами установлена последовательность компенсаторных реакций в ответ на гипоксию во внешней среде. За счёт выброса эритроцитов из органов-депо на третьи сутки пребывания в условиях высокогорья происходило существенное повышение содержания гемоглобина в крови добровольцев. Среднее значение составило до подъема -131 г/л (95% ДИ от 128,8 до 133,2) на 3-й сутки пребывания -155 г/л (95% ДИ от 149,0 до 161,0). На 40-й день концентрация гемоглобина соответствовала 138,2 г/л (95% ДИ от 134,3 до 141,7). Снижение концентрации запасного железосодержащего белка ферритина в сыворотке крови происходило от исследования к исследованию. Так, если исходное среднее значение -120 мкг/л (95% ДИ от 111,7 до 128,3), то через 40 дней пребывания на высокогорье -78,9 мкг/л (95% ДИ от 70,7 до 87,1).

Концентрация гепцидина снижалась, достигнув минимума на 20-е сутки исследования — 50 пг/мл (95% ДИ от 43,9 до 56,1), по сравнению с исходным -108,9 пг/мл (95% ДИ от 99,5 до 118,3). Снижение концентрации гепцидина способствовало всасыванию железа в кишечнике и выходу его из макрофагов.

Это явление нами зафиксировано впервые — изменения гепцидина в условиях гипоксической гипоксии ранее в литературе не описаны.

Таблица 2 — Показатели НЬ, ферритина и регуляторных белков в сыворотке

крови у здоровых лиц в условиях высокогорья (п=22)

Этап НЬ, г/л ФС, мкг/л Гепцидин, пг/мл Н1Р-1а, пг/мл ЭПО, ти/мл

1-е иссле- 131,0 120,0 108,9 4,8 15,5

дование (128,8-133,2) (111,7-128,3) (99,5-118,3) (4,3-5,3) (13,5-17,5)

2-е иссле- 155,0 98,8 69,9 24,7 17,9

дование (149,0*161,0) (93,6-104,0) (64,2-75,6) (21,1-28,3) (15,3-20,5)

3-е иссле- 144,1 91,6 50,0 13,4 39,6

дование (138,7-149,3) (84,0-99,2) (43,9-56,1) (11,8-15,0) (34,4-44,8)

4-е иссле- 138,2 78,9 65 8,3 24,3

дование (134,3-141,7) - (70,7-87,1) (56,8-73,2) (7,3-9,3) (22,1-26,5)

Значения у 120-160 80-200 60-80 3-5 5-20

доноров

Таблица 3 — Показатели цитокинов и р-эндорфина в сыворотке крови у здоровых лиц в условиях высокогорья (п=22)

Этап 1Ь-2, пг/мл 1Ь-6, пг/мл Т№-а, пг/мл Р-эндорфин, пг/мл

1-е иссле- 410,2 22,3 25,3 16,6

дование (379,6-440,8) (21,0-23,6) (23,7-26,9) (14,9-18,3)

2-е иссле- 408,5 28,0 23,5 195,7

дование (384,5-432,5) (26,5-29,5) (22,0-25,0) (173,9-217,5)

3-е иссле- 415,3 12,8 17,1 145,3

дование (382,6-448,0) (11,8-13,8) (16,6-17,6) (132,2-158,4)

4-е иссле- 465,3 18,3 20,3 63,4

дование (430,4-500,2) (17,1-19,5) (19,1-21,5) (57,9+68,9)

Значения у 450-700 До 17 15-19 5-15

доноров

Примечания. Результаты представлены в виде М (95% ДИ), где М — среднее; 95% ДИ — 95%-й доверительный интервал; НЬ — гемоглобин, ФС — ферритин сыворотки, Н1Р-1а — фактор, индуцируемый гипоксией, ЭПО — эритропоэтин, 11,-2,11,-6, Т№-а — цитокины.

Средняя концентрация ЮТ-1а в адаптационный период (2-е исследование) повысилось в 6 раз —24,7 пг/мл (95% ДИ от 21,1 до 28,3), и постепенно снизилась к 40-му дню (4-е исследование).

Максимальное значение эритропоэтина в сыворотке здоровых лиц отмечено на 20-е сутки —39,6 ти/мл (95% ДИ от 34,4 до 47,8).

По результатам анализа изменчивости факторов регуляции эритропоэза установлено, что, прежде всего, значительно повышалась концентрация НИМ а, и только затем происходило увеличение уровня эритропоэтина — основного регулятора эритропоэза.

При изучении цитокинов выяснилось, что их концентрации в сравнении с исходными значениями существенно не изменились. Выраженные изменения и существенные в сравнении с исходным показателем были у Р-эндорфина, которые сохранялись весь период наблюдения.

При изучении корреляции по Пирсону выявлена тесная прямая связь изменчивости показателей Р-эндорфина и ЮТ-1сс (г=0,95). Однако 95% ДИ, рассчитанный для коэффициента корреляции, составил от -0,09 до 0,99. Следовательно, гетерогенность этого интервала не позволяет сделать однозначный вывод о достоверности в явной взаимозависимости.

Таким образом, в результате исследования практически здоровых лиц в условиях воздействия гипоксической гипоксии выявлены адаптивные изменения регуляторных белков, направленные на повышение содержания гемоглобина и поддержание адекватной оксигенации тканей.

В главе 4 «ФАКТОРЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭРИТРОПОЭЗА ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ» изложены результаты второго этапа научной работы. Нами исследованы следующие показатели: эритропоэтин, гепцидин, ферритин сыворотки крови и эритроцитов, фактор индуцируемый гипоксией - ЯШ-1а (таблицы 4-5). По результатам дисперсионного анализа показателей этих регуляторных белков эритропоэза установлено, что их статистическое значимое влияние на результативный фактор составляет 93% (Р=49,68; р<0,001). Ниже приведены результаты исследования и их обсуждение.

21

Среднее значение гемоглобина в исследовательской выборке при поступлении больных в клинику соответствовало 91,1 г/л (95% ДИ от 87,3 до 94,9).

Во время химиотерапии и в период миелотоксического агранулоцитоза отмечалось значительное снижение содержания гемоглобина (см. таблицу 4).

В зависимости от исходного содержания гемоглобина всех участников исследования разделили на группы: 1-я группа (л=36) — с уровнем гемоглобина более 90 г/л, 2-я группа («=38) — 70-90 г/л, 3-я группа («=20) — менее 70 г/л.

При анализе результатов исследования в зависимости от содержания гемоглобина отмечено, что у больных со значениями гемоглобина менее 70 г/л показатель ферритина сыворотки был значительно выше, чем при значениях гемоглобина более 90 г/л (рисунок 2). Так, в 1-й группе среднее значение ферритина сыворотки составило 876 мкг/л (95% ДИ от 682,3 до 1095,7), а в 3-й группе — 1625 мкг/л (95% ДИ от 1217,3 до 1849,7). Следует отметить, что нарушений функции печени у участников исследования не выявлено. Поскольку ферритин является маркёром макрофагальной системы, то существенное увеличение ферритина в 3-й группе свидетельствует об увеличении активности этой системы.

Эритропоэтин

При поступлении в клинику (до лечения) выявлены изменения содержания эритропоэтина у 90 из 94 участников исследования (95,7%; 95% ДИ от 91,7% до 99,8%). Эритропоэтин у участников исследования был повышен в среднем в 20-25 раз по сравнению с референсными значения. Наибольшая его концентрация зафиксирована в период миелотоксического агранулоцитоза — 486 ти/ш1 (95% ДИ от 465,1 до 506,9). Средние значения содержания эритропоэтина крови в зависимости от группировки по гемоглобину представлены на рисунке 3.

Таблица 4 — Основные показатели гемограммы, ферритина сыворотки и

эритропоэтина в разные периоды болезни («=94)

Этапы исследования Лейкоциты, х109/л НЬ, г/л ЭПО, ти/т1 ФС, мкг/л

До лечения 34,3 (30,24-37,9) 91,1 (87,34-94,9) 212,0 (192,64-231,4) 1075,4 (982,54-1168,3)

Во время химиотерапии 12,6 (11,34-13,9) 86,7 (85,3^-88,1) 300,4 (270,34-330,5) 1469,0 (1360,64-1577,4)

Период миелоток-сического аграну-лоцитоза 0,7 (0,63-Ю,77) 74,4 (73,24-75,6) 486,1 (442,84-529,2) 1741,1 (1608,74-1873,3)

После восстановления показателей гемограммы 4,05 (3,5т4,6) 85,9 (83,94-87,9) 218,2 (193,64-242,8) 1997,0 (1838,44-2155,6)

Значения у доноров 4-9 х109/л 120-160 г/л 5-20 80-200

Таблица 5 — Основные показатели белков участвующих в эритропоэзе в разные

периоды болезни (п=94)

Этапы исследования ФЭ, мкг/г НЬ иге-га, пг/мл Гепцидин, пг/мл ТгИес, мг/мл

До лечения 60,3 (52,74-67,9) 13,95 (13,34-14,6) 355,9 (325,84-385,4) 4,6 (4,344,9)

Во время химиотерапии 35,4 (30,3440,5) 13,6 (12,74-14,5) 146,1 (130,04-162,2) 3,8 (3,544,1)

Период миелотоксического агранулоцитоза 42,2 (37,1447,3) 23,7 (22,94-24,5) 197,0 (180,54-213,5) 3,45 (3,04-3,9)

После восстановления показателей гемограммы 52,6 (47,84-57,4) 9,6 (9,34-9,9) 286,0 (258,14-313,9) 3,8 (3,644,0)

Значения у доноров 5-10 3-5 60-80 1,5-3,0

Примечания. Результаты представлены в виде М (95% ДИ), где М — среднее; 95% ДИ — 95%-й доверительный интервал; НЬ — гемоглобин; ФС — ферритин сыворотки; ЮТ-1а — фактор, индуцируемый гипоксией; ЭПО — эритропоэтин; 1Ь-2, 1Ь-б, ТИР-а — цитокины; ТгЯес — трансферриновый рецептор.

2200

Е О.

а

ф

е-

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

■ 1

1-я группа 3-я группа

2-я группа

■ Меал ~Г ±БО

Рисунок 2 — Средние значения содержания ферритина сыворотки крови в зависимости от группировки по гемоглобину. Описание групп в тексте, рьз ^ 0,001; /?2-з 5 0,05.

600

500

5 400

§ I

|

300

200

100

1-я группа 3-я группа

2-я группа

Рисунок 3 — Средние значения содержания эритропоэтина крови в зависимости от концентрации гемоглобина. Описание групп в тексте. р\.г< 0,05; р\л < 0,001.

24

Гепцидин

Содержание гепцидина у исследуемых больных было значительно выше условной нормы до лечения (355,96 пг/мл (95% ДИ от 341,6 до 370,4) и 60-80 пг/мл, соответственно). Средние значения концентраций гепцидина в сыворотке крови в зависимости от гемоглобина представлены на рисунке 4.

Во время химиотерапии и после неё происходит снижение средней концентрации гепцидина по отношению к исходному. Вероятно, что это связано со снижением гемоглобина и необходимостью реутилизации сывороточного железа. Об этом можно судить, ориентируясь на показатель корреляции гемоглобина и гепцидина (г=0,76; р<0,05).

1-я группа 3-я группа

2-я группа

■ Меап □ ±ЭЕ 1Ц±ЗС

Рисунок 4 — Средние значения содержания гепцидина в сыворотке крови в зависимости от уровня гемоглобина. Описание групп в тексте. />|.3 < 0,05.

При исследовании корреляции установлено, что до лечения взаимосвязь гепцидина и ферритина была положительной и сильной (г=0,84; р<0,001), а гепцидина и 1Ь-6 — заметной (г=0,68; р=0,044). Во время химиотерапии и после неё корреляции этих показателей существенно не изменились.

Концентрация гепцидина у больных с инициальным лейкоцитозом, (количество лейкоцитов более 30><109/л, п=28) до лечения была существенно ниже, чем у больных из группы сравнения (количество лейкоцитов менее 30* Ю9/л, п=48) — 158,10 пг/мл (95% ДИ от 119,8 до 192,4) и 285,58 пг/мл (95% ДИ от 196,6 до 378,6), соответственно. В последующем содержание гепцидина в первой группе во время проведения химиотерапии значительно снизилось 69,3 пг/мл (95% ДИ от 60,1 до 78,5), вероятно, из-за мощного цитостатического воздействия на печень, в которой этот белок синтезируется, а во время миелотоксического агранулоцитоза среднее содержание гепцидина соответствовало 323,0 пг/мл (95% ДИ от 290,9 до 355,1). Настораживает то, что после выхода из миелотоксического агранулоцитоза концентрация гепцидина сохранялась высокой, что может быть отражением активности воспалительного процесса.

Ферритин

Значения ферритина сыворотки у больных с инициальным лейкоцитозом (количество лейкоцитов более 30><109/л, «=28) до лечения были почти в 2 раза ниже, чем у больных из группы сравнения (количество лейкоцитов менее 30*109/л, „=48) _ 626,10 мкг/л (95% ДИ от 488,01 до 764,24) и 1067,98 мкг/л (95% ДИ от 843,6 до 1292,4) соответственно.

Отмечалось постепенное значительное повышение средних значений этого показателя в период химиотерапии и миелотоксического агранулоцитоза. Так, наибольших значений усреднённый показатель достигал во время миелотоксического агранулоцитоза: в первой группе (и=28) — 3187,3 мкг/л (95% ДИ от 2891,6 до 3482,4), во второй группе (п=48) — 1386,2 мкг/л (95% ДИ от 1266,2 до 1506,2). Это можно связать с выходом ферритина из разрушающихся клеток под влиянием цитостатической терапии и инфекционными осложнениями в период миелотоксического агранулоцитоза.

В период цитостатической терапии концентрация ферритина эритроцитов, как показателя неэффективности эритропоэза снижалась, в связи с уменьшением массы опухоли и снижением подавляющего действия на эритропоэз.

Исследование сывороточного железа и общей железосвязывающей

способности сыворотки. Изменения этих показателей зависели от периода

26

заболевания. Так, до лечения среднее значение сывороточного железа составило 22,01 мкмоль/л (95% ДИ от 20,3 до 23,7), а после выхода из состояния миелотоксического агранулоцитоза — 29,5 мкмоль/л (95% ДИ от 27,2 до 31,8).

Показатель общей железосвязывающей способности сыворотки до лечения составил 56,1 мкмоль/л (95% ДИ от 53,2 до 59,0), во время химиотерапии — до 44,5 мкмоль/л (95% ДИ от 43,8 до 45,2), после выхода из миелотоксического агранулоцитоза — 57,2 мкмоль/л (95% ДИ от 56,2 до 58,2).

Расчётная величина насыщения трансферрина железом (НТЖ) при поступлении в стационар (до лечения) составила 48,7% (95% ДИ от 47,7 до 49,7). В период миелотоксического агранулоцитоза зафиксировано увеличение до 54,7% (95% ДИ от 54,0 до 55,4). Данное значение получено из-за относительно низких показателей общей железосвязывающей способности сыворотки у исследуемых больных.

Трансферриновый рецептор (ТЖес).

При анализе показателей содержания ТгЯес в сыворотке крови больных острыми лейкозами в динамике, установлено что концентрация TrR.ec до лечения соответствовало — 4,6 мг/мл (95% ДИ от 4,3 до 4,9). Отмечено резко снижение его концентрации во время химиотерапии — 3,8 мг/мл (95% ДИ от 3,6 до 4,0), и далее в период миелотоксического агранулоцитоза — 3,45 мг/мл (95% ДИ от 3, до 3,9) по всей вероятности из-за токсического воздействия цитостатических препаратов (рисунок 5).

В проведённом исследовании также установлено, что наибольшая концентрация ТгИес в крови у больных острыми лейкозами определена в группе с низкими значениями гемоглобина (описание групп приведено выше). Значения ТгИес в этих группах: в 1-й группе — 3,7; во 2-й группе — 4,2; в 3-й группе — 7,0 мг/мл.

До лечения Во время В период После выхода из

проведения миелотоксического миелотоксического химиотерапии агранулоцитоза агранулоцитоза

я®® НЬ (г/л) Трансферриновый рецептор (мг/мл)

Рисунок 5 — Сопоставление показателей содержания гемоглобина (НЬ) и

трансферринового рецептора (TrRec) в крови.

Фактор индуцируемый гипоксией

Исследование концентрации HIF-la у больных острыми лейкозами выявило значительные изменения в различные периоды заболевания. Так, если до лечения этот показатель в среднем составлял 13,95 пг/мл (95% ДИ от 13,3 до 14,6), то во время миелотоксического агранулоцитоза — 23,7 пг/мл (95% ДИ от 22,9 до 24,5). После восстановления показателей гемограммы среднее значение HIF-la значительно снизилось по сравнению с исходным — 9,6 пг/мл (95% ДИ от 9,3 до 9,9), но не достигало референсных значений. Средние значения HIF-la были повышены во всех точках исследования — свидетельство того, что гипоксия сохранялась на всём протяжении болезни.

Анализ результатов исследования уровня HIF-la показал, что у пациентов с острыми лейкозами на всех стадиях болезни наблюдается высокая концентрация этого белка, особенно во время цитостатической терапии. Повышение содержания HIF-la может быть связано и с гипоксией клеток, и с потребностью опухолевых тканей в энергоресурсах. Следует отметить, что концентрация HIF-1 а в сыворотке крови у больных с инициальным лейкоцитозом (1-я группа; количество лейкоцитов

более 30x109/л, я=28) во время миелотоксического агранулоцитоза соответствовала 8,8 пг/мл (95% ДИ от 7,8 до 9,8 пг/мл) и была существенно ниже, чем во 2-й группе (количество лейкоцитов менее 30><109/л, «=48) — 18,7 пг/мл (95% ДИ от 17,2 до 20,2 пг/мл).

В связи с тем, что основным субстратом опухоли при острых лейкозах являются бластные клетки, то исследование содержания регуляторных белков в бластных клетках проводилось до лечения и на 3-7 сутки химиотерапии. Затем (во время миелотоксического агранулоцитоза и после выхода из него) исследовали клетки мононуклеарной фракции, выделенные из периферической крови — преимущественно лимфоциты. Так как ЮТ-1а продуцируется ещё и клетками опухоли, то резкое повышение его уровня во время проведения цитостатической терапии, вероятно, связано с противодействием опухоли на стрессовое воздействие. В связи с этим можно предположить, что высокие значения ЮТ-1а создают условия для поддержания развития опухоли, так как НИМ а, усиливая гликолиз, способствует снабжению клеток энергией.

Установлено, что после выхода из миелотоксического агранулоцитоза, когда констатируется полная клинико-гематологическая ремиссия, у большинства больных сохраняется высокая концентрация регуляторных белков, сдерживающая эффективность эритропоэза.

В период ремиссии болезни перед вторым консолидирующим курсом химиотерапии концентрация гемоглобина существенно превышала исходное среднее значение в группе (до лечения) — 118,1 г/л (95% ДИ от 101,1 до 125,1). Количество лейкоцитов было существенно ниже исходного и не отличалось от его значений после первого курса лечения — 4,4*109/л (95% ДИ от 4,1 до 7,7).

Показатели гепцидина, эритропоэтина, ферритина сыворотки и эритроцитов в этот период были существенно ниже по сравнению с дебютом болезни. Перед индукционным курсом химиотерапии и после него средняя концентрация гепцидина была в 4-5 раз ниже исходных значений. С большой степенью вероятности можно утверждать, что содержание гепцидина в условиях уменьшения опухолевого клона адекватно состоянию, связанному с анемией и воспалением.

С учётом результатов исследования регуляторных белков у больных острыми лейкозами во время индукционного курса, определяли изменения исследуемых белков во время второго консолидирующего курса химиотерапии. Наблюдали 25 пациентов, в том числе с острым миелобластным лейкозом — 13, с острым лимфобластным лейкозом —12.

До начала 2-го курса консолидации, по сравнению с дебютом болезни отмечались более низкие значения ферритина сыворотки и эритроцитов, трансферринового рецептора, эритропоэтина, ННМа, гепцидина. Содержание ферритина сыворотки до начала химиотерапии было 850,4 мкг/л (95% ДИ от 823,6 до 877,2), а ферритина эритроцитов — 27,3 мкг/гНЬ (95% ДИ от 26,4 до 28,2), что в 2 раза ниже значений наблюдаемых в дебюте болезни перед индукционным курсом. Среднее содержание трансферринового рецептора до проведения курса химиотерапии было незначительно выше, по сравнению с условной нормой, а в период миелотоксического агранулоцитоза было повышенным до 3,7 мкг/л, и соответствовало снижению гемоглобина. Обнаруженные изменения исследуемых белков не соответствовали ожидаемым, поскольку мы предполагали что их концентрация во время ремиссии заболевания будет соответствовать референсным значениям.

Наиболее значимые изменения по сравнению с дебютом болезни отмечены в содержании гепцидина. Средняя концентрация его значений до проведения химиотерапии была в пределах нормы — 78,9 пг/мл (95% ДИ от 75,5 до 82,3), во время проведения химиотерапии повышалась — 126,2 18,1 пг/мл (95% ДИ от 122,5 до 129,9), затем в период миелотоксического агранулоцитоза несколько снижалась и после восстановления кроветворения сохранялась на уровне 118,5 пг/мл (95% ДИ от 115,3 до 121,7). В целом, концентрация гепцидина сыворотки была в 4-5 раз ниже значений, чем во время индукционного курса. Содержание НПЧа и эритропоэтина уменьшались в 2 и 3,5 раза, соответственно. Как и во время индукционного курса отмечено постепенное увеличение их значений во время проведения химиотерапии и в период миелотоксического агранулоцитоза. Максимальные значения их содержания зафиксированы в период миелотоксического агранулоцитоза. После выхода из миелотоксического агранулоцитоза данные показатели снижались до исходных значений.

Рецидив болезни диагностирован у 25 больных из 94 (27%). Всего обследовано 25 пациентов: среди них 7 пациентов с первично-резистентной формой заболевания; 14 -в период раннего рецидива; и 4 пациента с поздним рецидивом. Средний количество лейкоцитов у больных этой группы составило 11,6* 109/л (95% ДИ от 9,2 до 14,0).

Наибольшее значение сывороточного железа зафиксировано после выхода из миелотоксического агранулоцитоза — 24,8 мкмоль/л (95% ДИ от 23,5 до 26,1). Относительно низкие значения показателя общей железосвязывающей способности сыворотки сохранялось как при рецидиве, так и в период индукционного курса. Содержание ферритина эритроцитов соответствовало 64,8 мкг/гНЬ (95% ДИ от 57,0 до 72,6) — отражение неэффективности эритропоэза. Концентрации эритропоэтина, ЮТ-1а и трансферринового рецептора значительно повышены.

При рецидиве болезни наблюдались выраженные изменения со стороны регуляторных белков: повышение ферритина сыворотки в 10-12 раз; гепцидина в 67 раз.

Следует отметить, что у 12% пациентов в терминальной стадии заболевания были низкие значения ферритина сыворотки и гепцидина. Возможно, такая низкая активность этих белков соответствует лимиту компенсаторных возможностей у больных с рефрактерным течением заболевания и признаком очень плохого прогноза.

При анализе результатов обратили внимание на более низкие значения 1Ь-2, чем во время индукционного курса — 72,2 пг/мл (95% ДИ от 64,8 до 79,6). Его содержание не повышалось даже после восстановления лейкоцитов. В целом, изменения основных цитокинов отличаются от таковых до и во время индукционного курса, отсутствием выраженной реакции со стороны противовоспалительной группы (1Ь-2, 1Ь-10). Одновременно с этим отмечена высокая активность "ПчТ-а.

Резюмируя изложенное в этой главе, отметим, что регуляция эритропоэза у больных острыми лейкозами с большой массой опухоли существенно отличается от таковой в группе сравнения. У пациентов с инициальным лейкоцитозом значения ферритина сыворотки и гепцидина невысокие. Для группы сравнения характерен высокий метаболический уровень регуляторных белков эритропоэза.

Это подтверждается соответствующими прямыми корреляциями ферритина и гепцидина. Результаты сравнения показателей ферритина сыворотки, гепцидина и НПМа в зависимости от массы опухоли стали неожиданными, поскольку предполагалось, что при количестве лейкоцитов более 30x109/л значения этих показателей должны быть выше, чем у больных с количеством лейкоцитов меньше этого порогового уровня.

Результаты анализа содержания гепцидина и ферритина сыворотки позволяют с большой вероятностью полагать, что при острых лейкозах их приоритетной функцией является противодействие воспалительному и пролиферативному процессам, а не гипоксии на фоне глубокой анемии. В условиях воздействия гипоксической гипоксии приоритетным является поддержание адекватной оксигенации тканей путём повышения концентрации гемоглобина. Подтверждённое в нашем исследовании, значительное увеличение концентрации НПМа в дебюте болезни и во время её лечения совпадает с данными, характерными для солидных опухолей [Эетепга О., 2003].

В главе 5 «ЦИТОКИНЫ, ЭНДОРФИН И БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ» изложены результаты изменения этих факторов во взаимосвязи со значениями регуляторных белков эритропоэза.

Цитокины

В соответствии с задачей исследования изучены концентрации следующих основных цитокинов при острых лейкозах: 1Ь-1Р, 1Ъ-2, 11.-6, 1Ь-8, 1Ь-10, ЮТ-а (таблица 5). В исследовании показатель 1Ъ-1р, как фактор первоначального антигенного стимула, до лечения и после него был в пределах установленной нормы. Однако в период проведения химиотерапии существенно повышался.

По полученным данным, можно предположить, что угнетение продукции 1Ь-1Р — результат цитостатического воздействия. В период ремиссии болезни содержание 1Ь-1р сохранялось в пределах референсных значений.

Обращает на себя внимание значительное снижение 1Ь-2 — одного из важнейших цитокинов противовоспалительного ряда. В дебюте болезни его

содержание было почти в 5 раз ниже нормы, а с началом химиотерапии отмечено дальнейшее его снижение.

После лечения, при восстановлении кроветворения показатель также оставался существенно ниже референсных значений. Снижение уровня этого интерлейкина, по-видимому, отражает особенности иммунных реакций при остром лейкозе. Следует отметить что в период ремиссии болезни концентрация 1Ь-2 значительно повышалась.

Таблица 5 — Цитокины (интерлейкины) сыворотки крови при острых лейкозах («=56)

Этапы 1Ь-1Р, пг/мл 1Ь-2, пг/мл 1Ь-6, пг/мл 1Ь-8, пг/мл 1И0, пг/мл

До лечения 12,9 (12,3+13,5) 96,2 (92,3+100,1) 78,4 (70,6+86,2) 230,3 (219,2+241,4) 557,5 (439,8+675,2)

Во время химиотерапии 21,8 (19,6+24,2) 49,7 (46,6+52,8) 165,9 (156,0+175,8) 440,2 (421,3+459,1) 315,9 (299,1+332,7)

Период миелотоксического агранулоцитоза 34,2 (31,0+37,4) 195,2 (179,4+210,6) 95,2 (89,2+101,2) 137,5 (129,1+145,9) 403,9 (387,7+420,1)

После восстановления показателей гемограммы 12,9 (12,3+13,5) 86,9 (82,8+91,0) 97,8 (90,6+105,0) 118,1 (109,3+126,9) 238,8 (226,1+251,5)

Значения у доноров До 15 450-700 До 17 10-20 100-200

Примечания. Результаты представлены в виде М (95% ДИ), где М — среднее; 95% ДИ — 95%-й доверительный интервал; 1Ь-1(5, 1Ь-2, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ы0 — интерлейкины.

Концентрация 1Ь-6 повышена на всем протяжении наблюдения. Самые высокие показатели зафиксированы во время цитостатической терапии, в период миелотоксического агранулоцитоза и после восстановления показателей гемограммы. Концентрация 11.-6 свидетельствует о продолжающемся воспалительном процессе.

Концентрация 1Ь-8 в разные периоды лечения была повышена в 10-20 раз почти у всех больных, а в период ремиссии — снижалась.

Концентрация 1Ь-10 у больных острыми лейкозами повышена в 2-3 раза. Возможно, это связано с необходимостью усиления иммунного ответа, поскольку этот цитокин обладает противовоспалительным и противовирусным действием, и одновременно может ингибировать выработку интерферона. Однако повышение концентрации 1Ь-10 не может компенсировать уменьшение содержания 1Ь-2.

Фактор некроза опухоли (ЮТ-а) относится к цитокинам, отвечающим на первоначальный антигенный стимул. Об этом свидетельствуют результаты анализа содержания ТЫР-а — до восстановления кроветворения его значения оставались в пределах условной нормы (рисунок 6).

химиотерапия ыпелотоксического мпедотексгпиского ягронулоцнтоза агрпиулощнтя

Рисунок 6 — Динамика сывороточного показателя фактора некроза опухоли при острых лейкозах.

Вертикальными метками обозначены 95% доверительные интервалы.

С большой степенью вероятности можно утверждать, что содержание этого цитокина резко повышается только в начале антигенного воздействия (от нескольких часов до 2-3-х суток), запуская активацию всей цитокиновой сети. После чего его концентрация в сыворотке снижается и резко повышается в тканях.

Высокое содержание Т№-а после выхода из периода миелотоксического агранулоцитоза коррелирует с высокими значениями других регуляторных белков (эритропоэтин, гепцидин, ЮТ-1а).

Р-Эндорфин — наиболее активный и полифункциональный представитель эндогенных опиоидных пептидов группы проопиомеланокортина. Концентрацию этого фактора исследовали в связи с тем, что во время болезни организм больных подвергается многофакторному стрессу: экспансия опухолевого клона, эмоциональный фактор (восприятие болезни как обречённости), побочные проявления цитостатической терапии, инфекционные осложнения, болевой синдром. Все перечисленные причины являются триггерами высвобождения р-эндорфина.

На рисунке 7 представлена динамика содержания Р-эндорфина в сыворотке крови и в лейкоцитах больных острыми лейкозами.

41!>.в10те|111п1в| миелотоксического миелотоксического агранулацпот агранулоцточа

Ь-авдорфинвсыворотес крови -й- Ь-эндорф!1К в лейкоцитах

Рисунок 7 — Содержание р-эндорфина в сыворотке крови и лейкоцитах при острых лейкозах.

Как видно, концентрация Р-эндорфина в сыворотке крови у больных острыми лейкозами выше нормы в 1,5-2 раза, но без значительных колебаний. Следует отметить, что и во время клинико-гематологической ремиссии этот показатель был

на высоком уровне. В группе больных с инициальным лейкоцитозом (п=28) в дебюте болезни отмечено высокое содержание p-эндорфина в лейкоцитах, причём во время проведения химиотерапии его концентрация повышается почти вдвое, а при достижении ремиссии возвращается к исходному значению. Вероятно это связано с тем, что воздействие цитостатиков является стресс-фактором, приводящим к высвобождению р-эндорфина.

Недавние исследования установили, что некоторые клетки иммунной системы (Т- и В-лимфоциты, моноциты, макрофаги) во время воспалительного процесса также способны к синтезу Р-эндорфина [Гейн C.B., Тендрякова С.П., 2006]. В этой связи, очень интересными представлялись сопоставления содержания р-эндорфина и факторов регуляции иммунного ответа. В исследовании установлено, что в бластных клетках концентрация HIF-la изменяется аналогично Р-эндорфину (r=0,98; р<0,05). А обратная зависимость обнаружена между р-эндорфином и IL-6 (г=-0,94; р<0,05 ).

Белки теплового шока (шапероны, hsp) — класс белков, основное предназначение которых состоит в восстановлении структуры повреждённых белков, а также образование и диссоциация белковых комплексов. Повышение уровня шаперонов подразумевает усиление защитных и адаптивных свойств клетки. Отмечено, что высокая экспрессия hsp70 на бластных клетках при острых миелоидных лейкозах является плохим прогностическим признаком. В этой связи было проведён сравнительный анализ содержания hsp70 у больных острыми лейкозами в дебюте болезни, во время лихорадки, клинико-гематологической ремиссии и при рецидиве болезни (рисунок 8).

С высокой степенью достоверности можно утверждать, что значительное повышение экспрессии hsp70 происходит только в период лихорадки. В условиях повышения температуры тела из-за инфекционных агентов и опухолевой пролиферации увеличиваются защитные свойства клеток мононуклеарной фракции крови, что, по данным литературы, является фактором неблагоприятного прогноза.

30 -

25

/

^ 20 -

о

10

5

7,07

0

До лечения Вовремя В период Ремиссия Рецидив химиотерапии лихорадки

Рисунок 8 -— Экспрессия hsp70 в бластных клетках и лимфоцитах в разные

периоды болезни.

Фолатные рецепторы. Установлено, что для метаболизма опухолевых клеток необходимо большое количество фолиевой кислоты, поэтому такие клетки содержат в 500 раз больше фолатных рецепторов, по сравнению со здоровыми клетками. Поскольку в научной литературе скудно описана роль фолатных рецепторов при острых лейкозах, то в рамках научной работы проведено исследование этого показателя в мононуклеарной фракции периферической крови. Установлено, что у половины больных были значительно повышены показатели фолатных рецепторов (более 100 пг/мл). В этой же группе значения гемоглобина были ниже на 20 г/л.

Мы провели также анализ концентрации фолатных рецепторов в сравнении с гепцидином и HIF-la без относительно стадии болезни. Было обнаружено, что при нормальных значениях фолатных рецепторов концентрация гепцидина в среднем составлял 120 пг/мл (95% ДИ от 109 до 131), концентрация HIF-la — 10,9 пг/мл (95% ДИ от 8,9 до 12,3). При высокой концентрации фолатных рецепторов эти значения были 228 пг/мл (95% ДИ от 201 до 255) и 25,1 пг/мл (95% ДИ от 23,8 до 27,3), соответственно. Высокие концентрации гепцидина и HIF-la свидетельствуют о степени воспаления и гипоксии.

Резюмируя изложенное в этой главе, отметим, что цитокины играют существенную роль в межклеточных взаимодействиях при развитии воспалительного процесса. Изменения основных цитокинов, ферритина и гепцидина показывают, что регуляция гемопоэза и цитокиновой сети существенно нарушена. Это проявляется в усиленном синтезе ферритина и гепцидина макрофагами, которые активируются разбалансировкой функционирования цитокиновой системы. Причём химиотерапия не восстанавливает их дисбаланс. Содержание Р-эндорфина отражает не только уровень эмоционального стресса, но и процессы пролиферации, кооперации и дифференцировки клеток иммунной системы, установлена связь с содержанием НИМ а и 1Ь-6. Выявлено высокое содержание фолатных рецепторов в мононуклеарной фракции периферической крови, коррелирующее с высокой концентрацией гепцидина и ННМа.

В главе 6 «ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ПЕРЕГРУЗКУ ЖЕЛЕЗОМ» изложены результаты мониторинга показателей метаболизма железа у больных острыми лейкозами, эгоистической анемией и миелодиспластическими синдромами, получающих множественные трансфузии эритроцитной массы. Всем больным проводилось исследование мутаций гена наследственного гемохроматоза НБЕ (С282У и НбЗБ).

По данным литературы известно, что носительство мутаций гена наследственного гемохроматоза НБЕ (С282У и Н630) усугубляет формирование перегрузки организма железом [Полунина Т.Е. и др., 2009, с. 4]. Целью нашей работы было определить приоритетность факторов, влияющих на развитие перегрузки железом у гематологических больных. В связи с этим проанализирована встречаемость мутаций С282У и НбЗО, оценён риск развития перегрузки железом у больных с мутациями гена НРЕ и получающих трансфузии эритроцитной массы,

В группе наблюдения (и=104) мутации С282У и Н630 выявлены в 32 случаях (30,7%). В том числе гетерозиготное носительство мутации НбЗБ — в 25 (24,0%), гомозиготное носительство мутации НбЗБ — в 5 (4,8%), гетерозиготное носительство мутации С282У — в 2 (1,9%), комбинированное носительство по С282У (гетерозиготное) и НбЗЭ (гомозиготное) — в 1 (0,9%). Частота мутаций

гена НРБ приблизительно одинакова при нозологическом распределении: при острых лейкозах — 20 из 64 (31,2%), при апластической анемии — 9 из 31 (29%), при миелодиспластических синдромах (МДС) — 3 из 9 (33%). В группе больных острыми лейкозами гетерозиготными носителями НбЗБ было 16 из 64 (25%), с апластической анемией — 6 из 31 (19%), при МДС — 3 из 9 (33%). Гомозиготное носительство НбЗБ в группе больных острыми лейкозами определили в 4 случаях из 64 (4%) случаях; гетерозиготное носительство С282У — у 1 больного с апластической анемией (3%). Гомозиготных носителей С282У среди обследованных больных не выявлено, а комбинированная мутация по С282У (гетерозиготное) и Н63Б (гомозиготное) подтверждена только у 1 пациента с апластической анемией (3%).

В связи с поставленной задачей определяли ферритин сыворотки крови до трансфузии эритроцитарной массы и после неё. В ряде случаев было отмечено, что на следующий день после трансфузии содержание ферритина сыворотки крови резко увеличивалось, вероятно, в связи с гемолизом эритроцитов. Однако через 710 дней после очередной трансфузии его значение снижалось или даже возвращалось к исходному уровню. При последующих трансфузиях это повторялось. При анализе выявлены своеобразные «качели» с нарастающей амплитудой показателя сывороточного ферритина — основная причина постепенного накопления железа в организме больного.

До лечения были отмечены различия в показателях обмена железа у больных с различными нозологиями. Результаты исследования представлены в таблице 6. У всех больных сывороточный ферритин был резко повышен (в среднем в 7 раз), самые высокие значения отмечены у больных острым лейкозом, что определяется как особенностями опухолевого процесса, так и сопутствующими инфекционно-воспалительными осложнениями и соответствуют литературным данным.

Таблица 6 — Показатели феррокинетики до начала трансфузий эритроцитной массы

Диагноз СФ, мкг/л СЖ, мкмоль/л ОЖСС, мкмоль/л НТЖ, %

Острые лейкозы (п=64) 1075,4 (1020,9-М 129,9) 22,0 (21,7-22,3) 56,1 (55,3-56,9) 48,7 (47,5-49,9)

Апластическая анемия ("=31) 1002,4 (901,1-1103,7) 45,6 (43,9-47,3) 58,3 (57,2-59,4) 77,0 (75,5-78,5)

Миелодиспластический синдром (я=9) 809,6 (646,4+972,8) 31,5 (28,5-34,5) 45,3 (42,3-48,3) 64,3 (60,4-68,2)

Значения у доноров 80-200 12-28 45-75

Примечания. Результаты представлены в виде М (95% ДИ), где М — среднее; 95% ДИ — 95%-й доверительный интервал; СЖ — сывороточное железо; ОЖСС — общая железосвязывающая способность сыворотки; НТЖ — показатель насыщения трансферритина железом.

Для того чтобы оценить вклад каждой последующей трансфузии эритроцитной массы в развитие перегрузки железом расчётным методом определена формула разницы содержания ферритина сыворотки (ДФС): (ф Стах — Ф С,,,/

ДФС= 'п, где ФСта!( — показатель максимального содержания

ферритина сыворотки у больного; ФСтш — минимальный показатель; п — число трансфузий.

В зависимости от наличия или отсутствия мутаций гена НРБ больные разделены на 2 группы. Показатели ферритина сыворотки оценены в зависимости от числа трансфузий. У гетерозиготных носителей Н630, получивших менее 10 трансфузий эритроцитной массы, показатель ферритина сыворотки составлял 1046,1 мкг/л (95% ДИ от 846,7 до 1245,5 мкг/л), а после 20 трансфузий — 2856,0 мкг/л (95% ДИ от 2440,1 до 3272,7 мкг/л). У больных без мутаций гена ШЕ также отмечено достоверное увеличение показателя ферритина сыворотки в зависимости от объёма трансфузионной терапии. Наибольшие значения отмечены у больных, получивших более 20 трансфузий. Как и следовало ожидать, по мере увеличения числа трансфузий увеличиваются и показатели ферритина сыворотки, причём эта

40

зависимость значительно более выражена, чем зависимость от факта подтверждения носительства мутаций гена НБЕ (таблица 7).

Таблица 7 — Показатели сывороточного ферритина в зависимости от количества трансфузий эритроцитной массы и наличия мутаций гена НРБ

Количество трансфузий Без мутаций С мутациями

ФС, мкг/л ДФС, мкг/л ФС, мкг/л ДФС, мкг/л

Менее 10 1271,0 (1162,1-1379,9) 217,4 (202,4+232,4) 1046,1 (955,1 + 1137,1) 644,0 (540,7+747,3)

10-20 1658,1 (1570,4+1745,8) 730,5 (620,7+840,3) 1572,5 (1402,9+1742,1) 1553,1 (1389,4+1716,8)

Более 20 1898,8 (1796,1+2001,5) 1494,5 (1343,7+1645,3) 2856,4 (2631,6+3081,2) 2246,1 (2092,4+2399,8)

Примечания. Результаты представлены в виде М (95% ДИ), где М — среднее; 95% ДИ — 95%-й доверительный интервал; ФС — ферритин сыворотки, ДФС — разница содержания ферритина сыворотки.

Для обобщённой оценки значимости трансфузий эритроцитной массы в накоплении железа, мы оценили изменчивость содержания ферритина сыворотки в зависимости от сроков наблюдения (рисунок 9).

Представленные данные обосновывают, что носительство мутаций гена НРБ ускоряет развитие перегрузки железом. Также установлено, что у 14 больных с относительно редким фенотипом эритроцитов наблюдались более высокие концентрации ферритина сыворотки и различия между показателями ДСФ до и после трансфузии. В связи с этим выделена группа больных с относительно редким фенотипом.

Большинство (84%) реципиентов являются гомозиготными по одному или нескольким антигенам системы резус-фактора (ЯЪ), т.е. содержат в фенотипе сс, ЕЕ, СС и, следовательно, подвержены риску сенсибилизации. Фенотип СсБЕе выявляется в 16% случаев, фенотип СсПее (наименее иммуногенный) — в 32%, другие фенотипы — в 12%.

3000 -2500 -

X

5

i 2000 -

6

5 1500 -I u

| 1000

6

I" 500 -0

Дебют болезни Через 12 месяцев Через 24 месяца —•— Группа без мутации гена - • - Группа носителей мутации гена

Рисунок 9 — Содержание ферритина сыворотки в зависимости от длительности трансфузионной терапии и наличия мутаций гена ИРЕ. Вертикальными метками отмечены 95% доверительные интервалы.

Подбор полностью идентичных донорских эритроцитов пациентам с редкими фенотипами затруднён. Вероятно в связи с этим, у большинства таких больных были обнаружены трансфузионные химеры — наличие в русле нескольких популяций эритроцитов, отличающихся по ряду антигенов.

У больных с трансфузионными химерами и относительно редким фенотипом содержание ферритина сыворотки было больше, чем у больных в соответствующих группах без химер и фенотипами СсБее и СсОЕе. Это также относится к показателям гепцидина и фактора индуцируемого гипоксией (ЮТ-1а), что в свою очередь увеличивает выраженность перегрузки железом. Объяснением может быть то, что при невозможности специфического подбора эритроцитов повышается активность системы мононуклеарных фагоцитов, увеличивается количество иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов, что, в свою очередь, приводит к гемолизу и ускоренной элиминации эритроцитов из кровеносного русла. На тот же феномен у больных МДС указывала в 1999 г. О.Ю. Виноградова. Отсутствие ожидаемого после трансфузии повышения уровня гемоглобина приводит к дополнительным трансфузиям, дополнительной сенсибилизации, усилению

гемолиза и гемосидерозу. Единственным выходом из подобного замкнутого круга может стать только высокоспецифичный подбор компонентов крови и хелаторная терапия.

Резюмируя полученные данные можно с высокой степенью достоверности утверждать, что многократные трансфузии эритроцитной массы ведут к перегрузке организма железом и являются основной ей причиной. Носительство мутаций гена НБЕ сопровождается увеличением накопления железа и является дополнительным фактором развития перегрузки железом у больных острыми лейкозами и апластической анемией. Значимым фактором развития перегрузки железом является погрешность специфического подбора эритроцитной массы для больных с редкими сочетаниями антигенов эритроцитов и искусственно вызванными химерами.

Существенные изменения показателей феррокинетики свидетельствуют о значительных нарушениях системы регуляции эритропоэза при острых лейкозах.

ВЫВОДЫ

1. У больных острыми лейкозами сывороточные показатели белков-регуляторов эритропоэза (ферритина, гепцидина, эритропоэтина, фактора индуцируемого гипоксией) и цитокинов (1Ь-1Ь, 1Ь-2, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ы0, ЮТ-а) отражают зависимость от фазы заболевания (дебют болезни, период химиотерапии, миелотоксического агранулоцитоза и восстановления гемограммы) и исходных характеристик опухолевого процесса. У больных с инициальным лейкоцитозом показатели сывороточного ферритина, гепцидина и ЮТ-1а достоверно ниже чем у больных без лейкоцитоза.

2. В ремиссии острых лейкозов наблюдается существенное снижение содержания гепцидина и нарастание концентрации 1Ь-2, по сравнению с исходными значениями. В рецидиве острых лейкозов регистрируется нарастание сывороточных показателей гепцидина, ЮТ-1а, трансферринового рецептора и снижение концентраций 1Ь-2 и 1Ь-10.

3. Активность Р-эндорфина при острых лейкозах повышена в сыворотке крови и в бластаых клетках. Выявлена прямая корреляционная зависимость этого показателя от ЮТ-1а (г=0,98), а также обратная — от 1Ь-6 (г=-0,94).

4. Экспрессия белков теплового шока (Ьзр70) у больных острыми лейкозами нарастает в период лихорадки и цитостатического воздействия,

5. Основными факторами развития перегрузки железом помимо количества трансфузий эритроцитной массы, является носительство мутаций гена НБЕ, а также наличие редких сочетаний антигенов эритроцитов и искусственно вызванных химер (вследствие погрешностей в подборе эритроцитной массы).

6. Гипоксическая гипоксия у здоровых лиц в условиях высокогорья ассоциируется с развитием адаптивных изменений в содержании гемоглобина, а также сывороточных показателей эритропоэтина и других белков, участвующих в регуляции эритропоэза (повышение ЮТ-1а и р-эндорфины, снижение гепцидина и ферритина).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Сывороточные показатели метаболизма железа, гепцидина, ЮТ-1а, 1Ь-2 и 1Ъ-10 рекомендуется использовать для контроля за эффективностью лечения больных острыми лейкозами и коррекции современных схем биологического воздействия (сроки введения рекомбинантного 1Ь-2).

После трансфузии эритроцитной массы происходит резкое повышение содержания ферритина сыворотки. В связи с этим для мониторинга накопления железа рекомендуется ориентироваться на данный показатель не ранее, чем через 4-6 дней после трансфузии. При многократных трансфузиях эритроцитной массы возникает своеобразный феномен «качелей» с нарастающей амплитудой показателя сывороточного ферритина.

Редкие сочетания антигенов эритроцитов у пациентов с заболеваниями крови являются факторами риска развития перегрузки организма железом. В связи с этим больным с предполагаемой многократной трансфузионной терапией рекомендуется проводить точный подбор эритроцитной массы с учетом редкого фенотипа.

Для дополнительной оценки эффективности трансфузионной терапии у больных острыми лейкозами рекомендуется определение сывороточных концентраций гепцидина и НПЧа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Макешова А.Б., Левина A.A., Мамукова Ю.И. Раимжанов А.Р. Особенности регуляции эритропоэза у жителей высокогорья // Терапевтический архив. 2004. №11. С. 95-97.

2. Макешова А.Б., Исмаилова А.З., Алмерекова A.A., Эралиева М.О. Эритропоэтин и ЭПО-рецепторы // Центрально-Азиатский медицинский журнал. 2007. Т. XIII, прил. 3. С.73-75.

3. Макешова А.Б., Казкжова Т.В., Левина A.A., .Цветаева Н.В. Гепцидин как регулятор гомеостаза железа // Новое в гематологии и трансфузиологии. 2008. №8. С. 22-27.

4. Макешова А.Б., Казюкова Т.В., Левина A.A., Сергеева А.И. Феррокинетика и цитокины в раннем онтогенезе человека // Новое в гематологии и трансфузиологии. 2008. №8. С. 27-35.

5. Левина A.A., Казюкова Т.В., Романова Е.А., Макешова А.Б., Мамукова Ю.И., Сергеева А.И. Регуляция гомеостаза кислорода-фактор, индуцированный гипоксией (HIF) и его значение в гомеостазе кислорода // Педиатрия. 2009. № 4. С. 92-97.

6. Макешова А.Б., Левина A.A., Цибульская М.М., Мамукова Ю.И., Мелюс-Нубаров Н.С., Савченко В.Г. Значение динамического исследования цитокинов в сыворотке крови и лейкоцитах больных острым лейкозом // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 12. С.19-24.

7. Левина A.A., Казюкова Т.В., Романова Е.А., Макешова А.Б., Мамукова Ю.И., Сергеева А.И. Регуляция гомеостаза кислорода-фактор, индуцированный гипоксией (HIF) и его значение в гомеостазе кислорода // Педиатрия. 2009. № 4. С. 92-97.

8. Макешова А.Б., Левина A.A., Мамукова Ю.И., Савченко В.Г. Регуляторные механизмы обмена железа у больных острыми лейкозами // Терапевтический архив. 2009. № 7. С. 16-20.

9. Макешова А.Б., Левина A.A., Цибульская М.М., Мамукова Ю.И., Мелик-Нубаров Н.С., Савченко В.Г. Значение динамического исследования цитокинов в сыворотке крови и лейкоцитах больных острым лейкозом // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 12. С,19-24.

Ю.Макешова А.Б., Эралиева М.О., Раимжанов А.Р., Джакыпбаев O.A. Изменение гепцидина при депрессиях кроветворения в процессе высокогорной климатотерапии // Здравоохранение Кыргызстана. 2009. №2. С. 113-115.

11.Макешова A.B., Левина A.A., Паровичникова E.H., Цибульская М.М., Судариков А.Б., Романова Е.А., Февралева И.С., Мамукова Ю.И., Стремоухова А.Г., Макарова П.М., Головкина Л.Л., Савченко В.Г. Факторы, определяющие развитие перегрузки железом у больных острыми лейкозами и апластической анемией // Терапевтический архив. 2010. № 7. С. 26-29.

12. Макешова А.Б., Левина A.A., Мамукова Ю.И.. Паровичникова E.H.. Савченко В.Г. Регуляция обмена железа при острых лейкозах // Вестник гематологии. 2010. Т. VI, № 2. С. 60.

13.Макешова А.Б., Левина A.A., Мамукова Ю.И., Исмаилова А.З., Эралиева М.О., Раимжанов А.Р. Регуляция эритропоэза у больных с депрессиями кроветворения в процессе горно-климатического лечения // Терапевтический архив. 2010. № 1. С.39-42.

14. Макешова А.Б. Астапова С.Г., Раимжанов А.Р., Цопова И.А., Эралиева М.О. Влияние высокогорной адаптации на некоторые показатели иммунного статуса и первичного гемостаза у больных с депрессиями кроветворения // Центрально-Азиатский медицинский журнал, 2010. Т. XVI, прил. 4. С. 9-12.

15.Макешова А.Б., Левина A.A., Мамукова Ю.И., Паровичникова E.H., Савченко В.Г. Регуляторные механизмы обмена железа при лейкоцитозе в

дебюте заболевания у больных острыми лейкозами // Терапевтический архив. 2011.№ 10. С. 22-27.

16.Макешова А.Б., Эралиева, Левина А.А., Мамукова Ю.И. Динамическое определение цитокинов при апластической анемии и идиопатической тромбоцитопенической пурпуре в процессе воздействия гипоксической гипоксией У/ Клиническая лабораторная диагностика. 2012. № 5. С. 3840.

17.Макешова А.Б., Мамукова Ю.И., Левина А.А., Сысоева Е.П., Эралиева М.О., Савченко В.Г. Динамическое определение бета-эндорфина у гематологических больных // Терапевтический архив. 2012. № 7. С. 22-25.

18.Makesheva А.В., Raimjanov A.R., Tsopova I.A., Astapova S.G., Eralieva M.O. Effect of the high altitude adaptation for some parameter of immunity and primary hemostasis of patients with depression of blood // Avrasya Hematology Kongresi Bildirileri, Ankara. 2011. P.67-71.

19.Makeshova A.B., Levina A. A., Mamukova U.Y., Ermakova T.A., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G. Erythropoiesis regulatory proteins and cytokines in acute leukemia patients // American Society of Hematology (53th ASH Annual Meeting, abstract). 2011.

20. Макешова А.Б., Эралиева, Левина А.А., Мамукова Ю.И., Раимжанов A.P. Особенности эритропоэза в условиях высокогорья и возможности использования гипоксической гипоксии для лечения больных с депрессиями кроветворения // Военно - медицинский журнал. 2013. №7. С 48-45.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

OJI - острые лейкозы

OJIJI - острый лимфобластный лейкоз

OMJI - острый миелобластный лейкоз

HIF- фактор индуцируемый гипоксией

ФС - ферритин сыворотки

ФЭ - ферритин эритроцитов

Tf-трансферрин

TrRec- трансферриновый рецептор СЖ-сывороточное железо ЭПО - эритропоэтин Гп - гепцидин

ГГ -гипоксическая гипоксия FR-рецепторы к фолатам IL- интерлейкин

Hsp 70- (heat -shock proteins 70) белки теплового шока АХВЗ - анемия хронических воспалительных заболеваний. (3-END- Р-эндорфин

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 05.11.2013 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 3 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60